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Protocole pour créer des blessures chroniques chez les souris diabétiques

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Les blessures chroniques sont développées des blessures aigues sur un modèle diabétique de souris en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif après une blessure cutanée pleine épaisseur. La plaie est traitée avec des inhibiteurs pour la catalase et le peroxidase de glutathion, ayant pour résultat la guérison altérée et le développement de biofilm par les bactéries présentes dans le microbiome de peau.

Abstract

Les blessures chroniques se développent à la suite d'une régulation défectueuse dans un ou plusieurs processus cellulaires et moléculaires complexes impliqués dans une bonne guérison. Ils ont un impact de 6,5 millions d'euros et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement. Bien qu'un effort important ait été investi pour comprendre comment les blessures chroniques se développent chez l'homme, des questions fondamentales restent sans réponse. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de souris pour les plaies chroniques diabétiques qui ont de nombreuses caractéristiques des blessures chroniques humaines. En utilisant db/db-/- souris, nous pouvons générer des blessures chroniques en induisant des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie immédiatement après la blessure, en utilisant un traitement unique avec des inhibiteurs spécifiques aux enzymes antioxydantes catalase et peroxidase de glutathion. Ces plaies ont des niveaux élevés de système d'exploitation, développent le biofilm naturellement, deviennent entièrement chroniques dans les 20 jours après le traitement et peuvent rester ouvertes plus pendant plus de 60 jours. Ce nouveau modèle a beaucoup de dispositifs des blessures chroniques diabétiques chez l'homme et peut donc contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont les blessures deviennent chroniques. Il s'agit d'une percée majeure parce que les blessures chroniques chez l'homme causent une douleur et une détresse importantes aux patients et entraînent une amputation si elles ne sont pas résolues. De plus, ces blessures sont très coûteuses et prennent beaucoup de temps à traiter et entraînent une perte importante de revenu personnel pour les patients. Les progrès dans ce domaine d'étude grâce à l'utilisation de notre modèle de plaie chronique peuvent améliorer considérablement les soins de santé pour des millions de personnes qui souffrent de cette maladie débilitante. Dans ce protocole, nous décrivons en détail la procédure pour causer des blessures aigues pour devenir chronique, qui n'a pas été faite avant.

Introduction

La cicatrisation des plaies implique des processus cellulaires et moléculaires complexes qui sont réglés temporellement et spatialement, organisés en étapes séquentielles et qui se chevauchent, qui impliquent de nombreux types de cellules différentes, y compris, mais sans s'y limiter, la réponse immunitaire et le vasculaire système1. Immédiatement après que la peau supporte une blessure, les facteurs et les cellules sanguines s'agrégent au site de la plaie et initient la cascade de coagulation pour former un caillot. Après l'homéostasie est atteint, les vaisseaux sanguins se dilatent pour laisser entrer l'oxygène du site de la plaie, les nutriments, les enzymes, les anticorps et les facteurs chimiotactiques qui chemoattract polymorphonucléocytes pour effacer le lit de blessure de débris étrangers et sécréter des enzymes protéolytiques 2. Les plaquettes activées sécrètent une variété de facteurs de croissance pour stimuler les kératinocytes au bord de la plaie pour réépithéhélier la zone blessée. Les monocytes recrutés sur le site de la plaie se différencient en macrophages qui phagocytose les bactéries et les neutrophiles morts et sécrètent des facteurs supplémentaires pour maintenir la prolifération des kératinocytes et les signaux pro-migrateurs. Dans la phase de prolifération, tandis que la réépithélialisation continue, le nouveau tissu de granulation composé des fibroblastes, des monocytes/macrophages, des lymphocytes, et des cellules endothéliales continuent le processus de reconstruction2. L'angiogenèse est stimulée par la promotion de la prolifération et de la migration des cellules endothéliales, ce qui entraîne le développement de nouveaux vaisseaux. L'épithélialisation et le remodelage de la matrice extracellulaire construisent une barrière contre l'environnement. Comme la plaie guérit et le tissu de granulation évolue en cicatrice, l'apoptose élimine les cellules inflammatoires, les fibroblastes et les cellules endothéliales sans causer de dommages supplémentaires aux tissus. La force de tension du tissu est augmentée par des fibroblastes transformant divers composants de la matrice extracellulaire, comme le collagène, de sorte que le tissu nouvellement formé soit presque aussi fort et flexible que la peau non blessée2.

Toute déviation de cette progression très concertée vers la fermeture des plaies conduit à des blessures altérées et/ou chroniques3. Les blessures chroniques sont caractérisées par l'effort oxydant accru, l'inflammation chronique, la microvasculature endommagée, et la matrice anormale de collagène dans la blessure4. Le stress oxydatif, particulièrement dans la blessure, peut retarder la fermeture de blessure2,5. Lorsque, dans la première étape de la cicatrisation des plaies, la phase inflammatoire devient non réglementée, le tissu hôte assume des dommages importants dus à un afflux continu de cellules inflammatoires5 qui libèrent des enzymes cytotoxiques, une augmentation des radicaux libres d'oxygène, et médiateurs inflammatoires non réglementés, entraînant la mort cellulaire6,7.

Dans ce microenvironnement destructeur, les bactéries qui forment des biofilms tirent parti des nutriments de l'hôte et contribuent aux dommages du tissu hôte2. Ces biofilms sont difficiles à contrôler et à éliminer parce que les substances polymères extracellulaires hydratées composées de protéines, d'ADN, d'ARN et de polysaccharides permettent aux bactéries hébergées à l'intérieur d'être tolérantes aux thérapies antibiotiques conventionnelles et d'éviter le réponse immunitaire innée et adaptative de l'hôte2,8,9.

L'étude des plaies chroniques est cruciale parce qu'elles ont un impact de 6,5 millions de personnes et coûtent 40 milliards de dollars par an aux États-Unis seulement10. Les patients atteints de diabète ont des risques accrus de développer des plaies chroniques qui nécessitent une amputation afin de contenir la propagation de l'infection. Ces patients ont un risque de mortalité de 50% dans les 5 ans de l'amputation qui est attribué au mécanisme de pathophysiologie du diabète11. La relation entre le système immunitaire de l'hôte et le microbiome dans la cicatrisation des plaies est un sujet vital de la recherche en cours parce que les conséquences des blessures chroniques, si elles ne sont pas résolues, comprennent l'amputation et la mort12.

Bien qu'un effort significatif ait été investi dans la compréhension de la façon dont les blessures chroniques se développent chez l'homme, on ne sait toujours pas comment et pourquoi les blessures chroniques se forment. Les expériences visant à étudier les mécanismes de guérison altérée sont difficiles à mener chez l'homme, et les spécialistes de la cicatrisation des plaies ne voient que les patients atteints de plaies chroniques qui ont déjà atteint la chronique pendant des semaines à des mois. Ainsi, les spécialistes sont incapables d'étudier quels processus ont mal tourné qui conduisent la plaie à se développer pour devenir chronique2. Il y a un manque de modèles animaux qui récapitulent la complexité des blessures chroniques humaines. Jusqu'à ce que notre modèle ait été développé, aucun modèle pour des études chroniques de blessure n'a existé.

Le modèle de blessure chronique a été développé chez les souris qui ont une mutation dans le récepteur de leptine (db/db-/-)13. Ces souris sont obèses, diabétiques, et ont altéré la guérison, mais ne développent pas de blessures chroniques14. Les niveaux de glucose sanguin sont en moyenne d'environ 200 mg/dl, mais peuvent atteindre 400 mg/dl15. Lorsque des niveaux élevés de stress oxydatif (OS) dans le tissu de la plaie sont induits immédiatement après la blessure, la plaie devient chronique16. Les plaies db/db-/- sont considérées comme chroniques de 20 jours et restent ouvertes pendant 60 jours ou plus. Biofilm produit par des bactéries peut être vu se développer à partir de trois jours après la blessure; un biofilm mature peut être vu 20 jours après la blessure et persiste jusqu'à la fermeture de la plaie. Les bactéries biofilm-formant que nous trouvons dans ces souris sont également trouvées dans les blessures chroniques diabétiques humaines.

Le stress oxydatif est induit par le traitement des plaies avec deux inhibiteurs des enzymes antioxydantes, la catalase et le peroxidase de glutathion, deux enzymes avec la capacité de décomposer le peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène est une espèce réactive d'oxygène et peut causer des dommages cellulaires par l'oxydation des protéines, des lipides, et de l'ADN. La catalase catalyse la décomposition du peroxyde d'hydrogène en produits chimiques moins nocifs, l'oxygène et l'eau. 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) inhibe la catalase en se liant spécifiquement et de façon covalente au centre actif de l'enzyme, l'inactivant17,18,19. ATZ a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif à la fois in vitro et in vivo par l'inhibition de la catalase20,21,22,23,24. Le peroxidase de glutathion catalyse la réduction du peroxyde d'hydrogène par l'antioxydant, le glutathion, et est une enzyme importante qui protège la cellule contre le stress oxydatif25. L'acide mercaptosuccinique (MSA) inhibe le peroxidase de glutathion en se liant au site actif de sélénocystéine de l'enzyme avec le thiol, l'activant26. MSA a été utilisé pour étudier les effets du stress oxydatif in vitro et in vivo ainsique 20,27,28.

Ce nouveau modèle de blessures chroniques est un modèle puissant à étudier parce qu'il partage plusieurs des mêmes caractéristiques observées dans les plaies chroniques diabétiques humaines, y compris l'inflammation prolongée de l'OS accru et la formation naturelle de biofilm du microbiome de peau. Les blessures ont altéré l'interaction dermale-épidermique, le dépôt anormal de matrice, l'angiogenèse pauvre et la vascularisation endommagée. Les blessures chroniques se développeront chez les souris mâles et femelles, de sorte que les deux sexes peuvent être utilisés pour étudier les plaies chroniques. Par conséquent, le modèle de blessure chronique peut contribuer de manière significative à faire progresser la compréhension fondamentale de la façon dont ces blessures commencent. L'utilisation de ce modèle de plaie chronique peut fournir des réponses à des questions fondamentales sur la façon dont la chronicité est initiée/réalisée grâce à des contributions de la physiologie de la cicatrisation des plaies altérées et du microbiome de l'hôte.

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Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la réglementation fédérale et les politiques et procédures de l'Université de Californie ont été approuvées par l'Université de Californie, Riverside IACUC.

1. Animaux

  1. Utilisez le b6 diabétique et obèse. BKS(D)-Leprdb/J souris pour le modèle de blessure chronique. Les options d'achat comprennent soit des hétérozygotes pour la reproduction, soit des homozygotes directement pour des expériences.
  2. Élever des mâles et des femelles hétérozygotes pour produire des descendants. Seulement un quart de la litière, statistiquement, se développera pour devenir diabétique et obèse(db/db-/-).
  3. Soudre et maison db/db-/- souris avec leurs compagnons de litière 3 semaines après la naissance. Séparer db/db-/- souris de leurs compagnons de litière 5 semaines après la naissance et maison avec d'autres db/db-/- souris jusqu'à ce qu'ils soient 5-6 mois et peuvent être employés pour le modèle chronique de blessure. Pendant ce temps, un microbiome cutané mature et complexe peut se développer.
    REMARQUE : Les souris db/db-/- sont facilement identifiées visuellement des compagnons de litière entre 3-5 semaines d'âge. Les souris db/db-/- sont obèses, sont diabétiques, et seront significativement plus grandes et plus rondes que le type sauvage et les compagnons de litière hétérozygotes. Leur abdomen peut sembler légèrement plus rose et leurs hanches plus grandes. L'augmentation du poids doit être confirmée avant la chirurgie. En outre, il est possible de mesurer des niveaux élevés de glucose dans le sang et le génotype de la souris pour confirmer la mutation dans le récepteur de la leptine.

2. Vivarium et marinerie

  1. Maison db/db-/- souris dans un vivarium conventionnel (pas une barrière/installation spécifique exempte d'agents pathogènes) de sorte qu'une microflore puisse être établie sur la peau des souris db/db-/- Pour modéliser spécifiquement les humains qui souffrent de blessures chroniques, ne prenez pas de précautions particulières pour prévenir l'exposition aux agents pathogènes.
  2. Protégez les cages avec des micro-isolateurs pour minimiser la propagation de l'infection dans le vivarium. Changez de cage deux fois par semaine avec une nouvelle literie et nourrissez les souris avec une chow de vivarium ordinaire. Ne pas autoclave ni la literie ni la nourriture.
  3. Définir la température ambiante entre 21 et 24 oC, avec des fluctuations mineures selon la période de l'année. L'humidité, reflet du climat et de l'emplacement, se situera entre 19 et 70%.

3. Exigences pour le développement des plaies chroniques

  1. Utilisez seulement les souris mâles et femelles qui sont phénotypiquement obèses, diabétiques, et au moins 5-6 mois d'âge pour le développement des blessures chroniques. Le poids de ces souris devrait varier entre 40-80 g, en moyenne autour de 60 g.
  2. N'utilisez pas de souris considérées comme obèses mais pesant moins de 50 g.
    REMARQUE : Toutes les souris mentionnées dans ce protocole passent les qualifications décrites ici à moins qu'autrement notées.

4. Rasage et application de lotion depilatoire

REMARQUE: Enlever les poils indésirables sur le dorsum de la souris avant de blesser. La procédure suivante est effectuée sur des souris vivantes db/db-/- qui ne sont pas sous anesthésie la veille de la chirurgie. Prenez des précautions pour prévenir le stress et les dommages causés à l'animal.

  1. rasage
    1. Placez la souris sur une surface propre et saisissez la base de la queue de la souris avec le pouce et le deuxième doigt pour fixer la position de la souris. La souris peut sauter ou faire des mouvements brusques; si c'est le cas, réagissez rapidement et retirez les tondeuses pour éviter les blessures.
    2. Raser les cheveux de la souris avec une tondeuse à cheveux (Figures 1A, 1B). Placez la lame parallèle à la peau de la souris et raassez tout le dos du cou à la queue, y compris tout autour de la queue, pour permettre une surface assez grande pour placer un pansement transparent (voir Tableau des matériaux). Exécuter légèrement la lame contre la direction de la croissance des cheveux pour la coupe la plus efficace. (Figure 1B).
      1. Ne pas presser la lame profondément dans la peau, car elle peut endommager la peau par des ecchymoses ou des coupures.
  2. Application de lotion dépilatoire
    REMARQUE: Utilisez une lotion dépilatoire pour obtenir une peau très lisse afin que la vinaigrette transparente puisse adhérer fermement.
    1. Tremper la peau de la souris avec de l'eau pour prévenir les brûlures chimiques en appuyant légèrement sur une lingette de papier trempé contre la peau rasée avec assez de pression pour mouiller les cheveux déjà coupés vers le bas contre la peau.
    2. Pendant que la peau est mouillée, frotter légèrement la peau de la souris avec une petite cuillerée de lotion depilatoire (voir Tableau des matériaux) pour 15-20 s (Figures 1C, 1D). Étendre complètement la lotion partout où les cheveux ont été coupés court. Utilisez plus de lotion si la souris est plus grande.
    3. N'appliquez pas de lotion sur les oreilles de la souris, la queue ou n'importe où près du visage. Si la lotion se met sur les oreilles ou la queue, essuyez simplement avec une lingette de papier humide jusqu'à ce qu'elle soit rincée. Si la lotion se met sur le visage de la souris, lavez immédiatement la souris sous le robinet en cours d'exécution ou de l'eau déionisée pour éviter des dommages aux yeux, au nez et à la bouche.
    4. Laissez la lotion réagir avec les cheveux pendant 20-45 s supplémentaires après l'application.
    5. Avant de rincer, vérifiez l'achèvement de la réaction dépilatoire en essuyant légèrement la lotion de la peau à divers endroits (Figure 1E) avec un doigt ganté ou une spatule en métal mince. La réaction est complète si la peau est rose sans la présence de cheveux noirs. Il est préférable de vérifier rapidement que les cheveux ont effectivement été enlevés avant le rinçant que le rinçant prématurément, puis d'avoir à appliquer la lotion à nouveau.
  3. Rinçage
    REMARQUE : Une fois que l'achèvement de la réaction d'épilation a été vérifié, lavez la souris avec le robinet courant ou l'eau déionisée pour enlever la lotion dépilatoire et empêcher des brûlures chimiques.
    1. Placez la souris sur la main gantée gauche et appuyez sur la base de la queue contre la paume avec le pouce gauche pour empêcher la souris de se déplacer. Fermez et redressez le reste des doigts gauches pour empêcher la souris de mordre.
    2. Placez la souris de sorte que la région du visage / tête est loin du flux d'eau et le flux d'eau tiède peut tomber derrière la tête et seulement sur le dos. Frotter rapidement mais doucement le dos de la souris avec la main gantée droite pour laver la lotion.
    3. Une fois que la peau de la souris est exempte de la lotion, essuyez rapidement la souris avec un essuie-tout pour absorber la plupart de l'eau (Figure 1F).
  4. Soins après le rasage et l'épilation
    1. Vérifier et nettoyer toute lotion dépilatoire résiduelle qui peut rester sur les oreilles et la queue avec une lingette de papier humide.
    2. Placez la souris dans sa cage individuelle et placez la cage sur un coussin chauffant (40-45 oC) pendant environ 30 min. La souris doit revenir à un comportement normal, se précipiter autour, et se toiletter dans quelques minutes.
    3. Loger chaque souris dans une cage séparée pendant toute la durée de l'expérience. La peau des souris n'est plus protégée et peut être facilement rayée et mordue par d'autres souris.
    4. Puisque la lotion dépilatoire peut avoir de légers effets irritants qui peuvent interférer avec ou modifier le processus de guérison des plaies, attendre 18-24 h avant la chirurgie pour permettre à la peau de la souris de se calmer et la souris de s'adapter à l'absence de cheveux sur son dos.
  5. Enlever les cheveux de la peau avec pigmentation foncée
    REMARQUE: Certaines db / db- / - souris auront potentiellement des taches sombres dans la peau qui aura des cheveux de plus en plus en arrière plus rapide et plus fort que la peau sans ces taches. (Figure 2A). Ces zones sombres de la peau semblent plus foncées en raison de follicules pileux mi-tardifs et/ ou d'incontinence pigmentaire29,30.
    1. Si des taches foncées sont remarquées, appliquez à nouveau de la lotion dépilatoire, mais seulement dans ces zones, et répétez l'étape 4.2 et 4.3(Figures 2B, 2C).
      REMARQUE: Les taches sombres de la peau poussera les cheveux plus rapidement tout au long de la durée de l'expérience, afin de couper les cheveux courts tous les 3-5 jours, si nécessaire. Un patch ou deux loin de l'emplacement désiré de la plaie est acceptable. Si l'arrière de la souris est considérablement couvert par ces taches sombres, n'utilisez pas cette souris pour le modèle de blessure chronique.

5. Configuration de réactif

REMARQUE: Le développement de blessures chroniques chez db/db-/- souris est accomplie par le traitement avec des inhibiteurs spécifiques pour la catalase et le peroxidase de glutathion, 3-amino-1,2,4-triazole (ATZ) et l'acide mercaptosuccinique (MSA), respectivement16 . La procédure suivante détaille la dose et l'administration de l'analgésie et des inhibiteurs en fonction du poids de la souris.

  1. Injecter le analgésique Buprenex intrapéritonement à 0,05 mg/kg de souris dans le PBS stérile. Injecter un volume de 120 L pour une souris de 60 g environ 30 minutes avant la chirurgie. Administrer une autre dose 6 h après la chirurgie. Une dose supplémentaire peut être administrée au besoin.
  2. Injecter ATZ intraperitoneally à 1 g/kg de souris dans le PBS stérile. Injecter un volume de 480 L pour une souris de 60 g environ 20 minutes avant la chirurgie. Injecter la moitié du volume sur le côté gauche de l'abdomen et l'autre moitié sur le côté droit.
  3. Déposer la MSA topiquement sur la plaie entre le pansement transparent et le tissu de la plaie à 150 mg/kg de souris dans le PBS stérile. Administrer un volume de 60 L pour une souris de 60 g dans les 10 minutes suivant la chirurgie.

6. Chirurgie

REMARQUE : Le succès du modèle chronique de blessure repose sur des conditions non stériles. Ces souris ne sont pas exemptes de germes et sont logées dans un vivarium conventionnel. Le microbiome bactérien qui réside dans la peau est crucial pour l'initiation et le développement ultérieurs de plaies chroniques sur le traitement avec des inhibiteurs des enzymes anti-oxydantes. Par conséquent, la préparation préchirurgicale traditionnelle du site est contre-indiquée.

  1. Injection intrapéritonéale
    1. Fixez la souris sur la partie inclinée de la grille de la cage et maintenez la queue avec la souris confortablement debout avec la tête plus basse que le corps de la souris. Cela garantit que nous essayons de déplacer les organes internes aussi loin du point d'injection possible.
    2. Insérez l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen pour éviter l'injection dans la vessie, ou d'autres organes abdominaux.
    3. Aspirez l'aiguille avant l'injection.
  2. Traitement et anesthésie
    1. Administrer Buprenex 30 min et ATZ 20 min avant la chirurgie, tel que décrit dans les étapes 5.1 et 5.2.
    2. Placez la souris dans un petit contenant en plastique sur un coussin chauffant chaud, comme le montre la figure 3A pendant environ 15 à 20 min. Fournir un soutien thermique avant la procédure protège contre la mortalité potentielle.
    3. Placez une lingette en papier ou un essuie-tout sur le dessus du petit contenant pour mieux contenir la chaleur. La souris doit se calmer au fur et à mesure qu'elle se réchauffe. Figure 3 B montre les matériaux nécessaires à la chirurgie.
    4. Placez la souris dans un récipient fermé qui est relié au vaporisateur d'isoflurane dans le capot chimique si vous utilisez un système ouvert.
    5. Dans un système ouvert, administrer 5% isoflurane pendant 1-2 min à un débit de 2-3.5 L/min. Surveiller continuellement l'état de la souris.
      1. Une fois que la souris est inconsciente ou ne bouge plus, placez la souris sur un coussinet chirurgical blanc et ajustez la tête avec un cône de nez qui est fixé au vaporisateur pour permettre l'administration continue de l'isoflurane pendant la chirurgie.
    6. Dans un système ouvert, administrer 2-3% isoflurane au même débit pendant la chirurgie et ajuster au flux d'isoflurane pour maintenir la profondeur de l'anesthésie.
    7. Minimisez à la fois la concentration et la durée de l'isoflurane administré pendant la chirurgie. db/db -/- Les souris sont très sensibles à l'anesthésie, il est donc préférable de maintenir l'exposition à l'isoflurane à un minimum. Si la souris est toujours réactive après 2 min à 5% isoflurane, fixer le cône de nez et administrer 3-5% isoflurane pour 15-30 s avant de commencer la chirurgie.
      1. Confirmer l'anesthésie appropriée avant de blesser. La profondeur de l'anesthésie est confirmée par le manque de réponse aux stimuli physiques tels que le pincement des orteils. La durée de la souris sous anesthésie inhalée est inférieure à 5 min, donc aucune pommade vétérinaire n'est appliquée sur les yeux.
  3. Blessant
    1. Vaporiser une lingette en papier avec 70 % d'éthanol ou une serviette clinique à l'éthanol et essuyez le dos de la souris pour nettoyer la zone du site de la plaie. Nettoyez la surface de la peau afin que la vinaigrette transparente puisse adhérer fermement, car la poussière de la literie, de la nourriture ou de la peau peut empêcher la vinaigrette de coller correctement (Figure 4A). Ne pas essuyer excessivement, ou il y aura un risque de tuer les bactéries présentes sur la peau.
    2. Déterminer la position du site de la plaie. Le meilleur endroit pour effectuer la blessure est sur le côté dorsal de la souris, centrée et loin des taches de peau avec une pigmentation plus élevée.
      REMARQUE: Nous avons déterminé par expérience que ces souris ne peuvent résister au fardeau d'une blessure.
    3. Créez une plaie dans les 30-45 à l'aide d'un poinçon de biopsie de la peau de 7 mm, d'une pince à épiler et de ciseaux chirurgicaux. Appuyez légèrement sur le poinçon de biopsie sur le site de la plaie désirée et tordre le poinçon autour juste assez profond pour laisser une légère impression du poinçon (Figure 4B). Accise la peau esquissée en tirant vers le haut le centre du poinçon avec des pincettes et en coupant le long du contour avec des ciseaux chirurgicaux (Figures 4C-4E).
    4. Couvrir fermement la plaie de la moitié d'un morceau de pansement transparent (6 cm x 3,5 cm).
    5. Arrêter l'administration de 2% isoflurane à la souris (Figure 4F).

7. Traitement post-chirurgical et rétablissement

  1. Administrer le traitement MSA après la chirurgie est terminée et le pansement transparent est appliqué comme décrit à l'étape 5.3. Déposer mSA sur la zone de la plaie sous le pansement.
  2. Placez la souris dans le petit récipient sur le coussin chauffant pendant 30 min pour aider à la récupération. Une fois que la souris s'est réchauffée, remettez la souris dans sa cage. L'effet de l'isoflurane est temporaire, et la souris devrait se déplacer peu de temps après.
  3. Ne laissez pas les souris sans surveillance ni ne les retournez au vivarium jusqu'à ce que les souris aient retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la charge sternale.
    REMARQUE: L'anesthésie de choix lors du travail avec ces souris est isoflurane précisément en raison de son induction rapide et l'émergence ultérieure de l'anesthésie.
    1. Maison souris qui ont subi une chirurgie individuellement pour éviter une souris interférer avec la blessure chronique d'une autre. Comme indiqué ci-dessus, ils ne retournent pas au vivarium jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis.
  4. Administrer la deuxième dose de Buprenex 6 h après la chirurgie.
  5. Observez attentivement les souris pendant les 48 premiers heures après la chirurgie.
    REMARQUE: La chirurgie, couplée avec les inhibiteurs pour créer la plaie chronique, est très stressant e sur l'animal qui est déjà à la fois diabétique et obèse. Les souris qui survivent les deux premiers jours après la chirurgie survivront habituellement à la durée de l'expérience.

8. Collecte de données, stratégies de survie, manipulation des souris après le vol et conseils supplémentaires

  1. Collecte de données
    1. Prenez des photos dès immédiatement après la chirurgie. Les biofilms sont observés entre 5 et 10 jours après la blessure, et aussi tôt que 3 jours.
    2. Si les bactéries font l'objet de l'analyse, rouler un échange stérile avec une légère pression autour de la plaie pendant 10-15 s. Entreposez l'écouvillon, dans un support de congélation approprié pour la culture ou sec sans aucun support pour l'analyse de séquençage indépendante de la culture, à -80 oC. Recueillir les substances polymères extracellulaires par l'intermédiaire d'une spatule métallique stérile dans un tube de microcentrifuge et entreposer à -80 oC avant l'analyse.
    3. N'administrez pas l'anesthésie à la souris pendant la manipulation pour la collecte de biofilms ou la prise de photos. Au cours de ces procédures, placez un morceau de nourriture devant la souris pour calmer la souris et l'empêcher de s'enfuir. La plupart des souris grimperont sur la nourriture, s'assiémissur et ne bougeront pas.
  2. Comme les infections secondaires et les plaies chroniques ou les ulcères involontaires peuvent se développer si la souris ne bouge pas correctement ou si le pansement n'est pas appliqué correctement, vérifiez périodiquement l'activité de la souris et le côté ventral pour les plaies. La friction entre la peau et la literie humide(db/db-/- les souris sont polyuriques) peut perturber la peau si les cages ne sont pas changées fréquemment.
    REMARQUE : L'accumulation de liquide sous le pansement peut faire perdre à l'adhésif son adhérence et permettre au fluide de fuir. Les cellules mortes de peau, la literie, et la matière fécale peuvent alors coller sur la peau et durcir. Ces taches et agrégats séchés sur la peau doivent être éliminés rapidement pour prévenir une infection secondaire.
  3. Si les souris se tiennent debout ou s'assoient sur leurs pattes postérieures, déplacez ces souris vers une cage où l'accès à la nourriture et à l'eau est beaucoup plus faible. Si la position de la nourriture et de l'eau dans la cage est élevée, la souris peut se tenir debout ou s'asseoir sur ses pattes postérieures pour l'atteindre. La plupart des souris n'auront pas de problème à manger et à boire si elles pouvaient le faire avant la chirurgie, mais il ya une possibilité que certaines souris pourraient retourner sur leur dos. Ces «flippers» peuvent avoir beaucoup de difficulté à se retourner, de sorte qu'ils auront besoin d'aide et d'une surveillance plus poussée.
  4. Laissez la vinaigrette transparente sur la peau jusqu'à 20 jours si la peau est dégagée de débris, de peau écaillère et de cheveux. Si l'un d'eux se produit sur la peau, retirer l'ancien pansement et appliquer une nouvelle pièce.
    1. Pour enlever la vinaigrette, pincez légèrement la peau directement derrière la tête, puis retirez-la de la tête en un seul mouvement lisse.
    2. Pour placer un morceau de pansement en toute sécurité, demandez à la souris de rester aussi immobile que possible. Il est important que la peau soit propre et exempte de cellules mortes et floconneuses, de poussière provenant de la literie et de morceaux de nourriture. Placer puis presser le pansement dans la peau autour de la plaie pour fixer.
    3. Si placer un morceau de nourriture devant la souris ne limite pas ses mouvements, placez la souris sur le dessus de la cage métallique. Une fois que la souris a saisi un rail sur la cage, maintenez la queue aussi près du corps que possible et tirez avec une force minimale. Comme la souris tire vers l'avant le dos s'étirera et redresser abondapour une application facile; placez le pansement solidement à ce point.
    4. Ne réutilisez jamais une vieille vinaigrette. Appliquez toujours un nouveau pansement à l'arrière pour la plus grande adhérence.

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Representative Results

La figure 5 illustre un exemple de blessure sans traitement d'inhibiteurs progressant vers la fermeture de la plaie et une plaie avec le traitement des inhibiteurs progressant vers la chronicité. Le pansement transparent a été laissé en place sur la plaie chronique afin que le biofilm et l'accumulation de liquide puissent être vus.

L'initiation chronique de blessure a lieu en moins de 6 heures et la marge de blessure est visiblement altérée du stress oxydatif. L'évidence histologique de cette marge de blessure indique que le tissu est nécrotique et ne participera pas à la guérison de blessure. Les bactéries biofilm-formant dans la blessure peuvent plus tard employer ce tissu nécrotique comme source des éléments nutritifs et des composants structurels pour produire le biofilm. Une plaie chronique est une plaie qui reste ouverte, agrandie par rapport à la plaie initiale, contient du biofilm (EPS plus bactérien pathogène trouvé dans les plaies chroniques humaines) et prend des mois ou des années à guérir en fonction de la quantité et le contenu du biofilm qui empêche la blessure de la résolution normalement. Dans le modèle des plaies chroniques, la chronicité complète est fixée à 20 jours après la chirurgie parce que les plaies non traitées avec les inhibiteurs se fermera à ce moment -(Figure 5). La guérison prend généralement 60 jours et le temps dépend des bactéries pathogènes primaires présentes dans la plaie. Parfois, les souris peuvent succomber à l'infection lorsque des bactéries plus agressives de formation de biofilms, telles que Pseudomonas, sont prédominantes dans la plaie. Ainsi, une plaie chronique est définie comme une plaie qui ne se refermera pas dans les 20 jours, prend plus de 60 jours pour guérir, et a biofilm présent sur la plaie.

Des différences de sexe ont été trouvées dans divers modèles de diabète, y compris le db/db-/- modèle de souris32,33. Bien que de telles différences existent, nous avons observé que le sexe n'était pas un facteur important dans le développement des blessures chroniques. Les blessures chroniques chez les souris mâles et femelles se développent dans une mesure similaire, de sorte que les deux sexes peuvent être utilisés pour étudier les plaies chroniques. Ainsi, l'utilisation de ce modèle est avantageuse puisque les blessures chroniques humaines peuvent être trouvées sur les patients diabétiques masculins et féminins.

Figure 1
Figure 1 . Processus de rasage et de dépilatoire. (A) La souris avant de se raser. (B) La peau de la souris est rasée pour enlever la plupart des cheveux sur le dos. (C) Une cuillerée de lotion dépilatoire sur le bout d'un doigt. Plus est utilisé si la souris est plus grande. (D) Le dos de la souris est recouvert de lotion dépilatoire et laissé pour réagir. (E) Une spatule est utilisée pour gratter une partie de la lotion pour voir si les cheveux ont été enlevés. La peau rose vif sans aucune présence de cheveux est indicative que l'épilation est complète. (F) La lotion sur le dos est enlevée avec de l'eau courante. La peau de la souris doit être légèrement rose. Ce chiffre a été modifié à partir de Kim et Martins-Green31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 . Enlever les cheveux de plus petites taches de peau foncée. (A) La souris a déjà été traitée une fois et la peau est à nouveau mouillée pour prévenir les brûlures. (B) La lotion depilatoire n'est appliquée que sur le patch de la peau qui est sombre et a les cheveux denses. (C) La lotion est lavée après la réaction pour révéler la tache foncée de la peau sans cheveux. Ce chiffre a été modifié à partir de Kim et Martins-Green31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 . Mise en place de la pré-chirurgie. (A) Les souris qui doivent être blessées sont placées dans de petits récipients en plastique sur un coussin chauffant. (B) Certains des matériaux utilisés en chirurgie sont montrés. Les ciseaux chirurgicaux doivent être tranchants pour s'assurer que la peau n'est pas écrasée lorsqu'elle est coupée. La vinaigrette transparente est coupée en deux. Ce chiffre a été modifié à partir de Kim et Martins-Green31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 . Faire la blessure d'excision. (A) Après que la souris est sous anesthésie, le dos de la souris est essuyé avec 70% d'éthanol une fois. (B) Le poinçon de biopsie de peau est placé sur le dos de la souris et pressé assez fort pour laisser une impression. Le poinçon de biopsie peut être tourné pour faire une incision peu profonde. (C) Le milieu de la zone décrite est pincé avec des pincettes et un ciseaux chirurgicaux pointu est utilisé pour faire l'incision initiale. (D) Les ciseaux chirurgicaux sont manœuvrés pour couper le long du contour fait par le poinçon de biopsie. (E) Une région de la peau décrite par la pompe de biopsie est excisée avec succès. (F) Le pansement transparent est placé sur le dos de la souris et fixé. Ce chiffre a été modifié à partir de Kim et Martins-Green31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 . Photos de blessures. (A) La blessure sur une souris à des moments successifs après la chirurgie comme il progresse dans la chronicité à partir du jour de la chirurgie. Le biofilm peut être vu dès le jour 5 et détecté dès le jour 3. La blessure est entièrement chronique avec le biofilm fort le jour 20. (B) Exemples de blessures chroniques humaines, en particulier les ulcères diabétiques du pied. Ce chiffre a été modifié à partir de Kim et Martins-Green31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Une fois que les blessures chroniques sont créées sur les souris, le modèle peut être utilisé pour étudier les processus de cicatrisation des plaies altérées impliqués dans l'initiation de la chronicité. Le modèle peut également être utilisé pour tester l'efficacité d'un large éventail de produits chimiques et de médicaments qui peuvent inverser le développement des plaies chroniques et une altération de la guérison et conduire à la fermeture des plaies et la guérison. Différents moments après l'début de la chronicité peuvent être étudiés: par exemple, jours 1-5 après la blessure pour le début précoce de la chronicité et les jours 20 et au-delà pour les blessures chroniques pleine force.

Le modèle de blessure chronique est également un modèle puissant pour étudier divers aspects de la guérison des plaies et des complications telles que la biocharge et la cachexie. Bioburden est juste l'une des nombreuses facettes des blessures chroniques qui peuvent être étudiés dans ce modèle, car il affecte également les blessures chroniques humaines. Nos procédures et notre protocole d'utilisation des animaux identifient clairement les symptomologies à surveiller, ainsi qu'un calendrier de surveillance défini. Les animaux identifiés comme morbides, selon des critères approuvés par l'IACUC, sont euthanasiés afin d'éviter des souffrances importantes. De plus, le vétérinaire du campus et le technicien en santé animale sont consultés lorsque certaines symptomologies surviennent et fournissent des conseils de soutien dans l'évaluation des critères.

Les étapes critiques dans le protocole incluent le logement de la db/db-/- souris dans un vivarium conventionnel, enlever des cheveux avec la lotion dépilatoire, et le chauffage avant l'administration d'isoflurane. Le développement des blessures chroniques dans le modèle de blessure chronique repose sur des conditions et des pratiques non stériles. Ces souris ne sont pas exemptes de germes et ne poussent pas dans des vivariums très propres. La microflore qui réside dans la peau est cruciale pour l'initiation et le développement ultérieurs des blessures chroniques sur le traitement avec des inhibiteurs pour les enzymes anti-oxydantes. Ces souris db/db-/doivent être exposées à un environnement qui contient des bactéries, à la fois commensal et pathogènes. Si la peau est nettoyée et désinfectée par l'iode ou d'autres méthodes antiseptiques avant la chirurgie afin de « stériliser » la peau, la plaie peut ne pas devenir chronique. Les bactéries dans le microbiome de peau sont nécessaires pour la formation et le développement du biofilm, et retardent la guérison et la fermeture de blessure. Dans la clinique, la présence de biofilm dans une plaie complique davantage les processus de guérison des plaies et augmente le risque d'amputation chez l'homme si l'infection dans la plaie n'est pas contrôlée.

Enlever les cheveux avec de la lotion dépilatoire est une étape importante pour enlever l'excès de cheveux et permettre à une surface lisse et propre pour la vinaigrette transparente d'adhérer fermement. La lotion dépilatoire utilisée dans ce protocole est un dépilatoire chimique avec de l'aloès ajouté pour minimiser les brûlures. Ce produit est minime en modifiant la morphologie de la peau ainsi que la préservation du microbiome de la peau. Le produit énuméré dans le tableau des matériaux est recommandé sur d'autres produits d'enlèvement des cheveux, y compris les déplacées physiques et mécaniques (cires et épilateurs commerciaux) qui peuvent encore brûler et tirer sur la peau et / ou tuer le microbiome de la peau. Même si ce dépilatoire chimique est physiquement doux, il peut encore irriter la peau légèrement, un effet qui pourrait modifier les processus de guérison des plaies. Ainsi, il est plus efficace d'attendre 18-24 heures avant la chirurgie pour permettre à la peau de récupérer de la procédure et de s'assurer que la peau et la plaie ne sont pas affectés par elle.

Ces souris sont extrêmement dociles et ne répondent pas aux facteurs de stress. Ils sont très faciles à manipuler sans anesthésie. Ils sont assez calmes pour être mis sur une paume ou sur un banc sans s'enfuir. Si la base de la queue de la souris est fixée avec le pouce et le deuxième doigt, la souris ne sera pas en mesure de s'enfuir ou de revenir à mordre en raison de leur grande taille du ventre. Fait important, dans notre expérience, ces souris sont extrêmement sensibles à l'anesthésie, en particulier en ce qui concerne la perte d'homéostasie. Ainsi, en consultation avec notre IACUC, il a été déterminé que la meilleure option est de limiter l'administration anesthésique.

Le but principal de ce modèle est de créer une grande blessure non cicatrisation sur son dos, donc une fois qu'une blessure est faite, tenant une souris conventionnellement pour faire des injections IP de buprenex supplémentaires ou d'autres traitements chimiques périodiquement est impossible. Tenir la souris par la peau dorsale provoque la souris beaucoup d'inconfort et très probablement la douleur si la souris est tenue d'une manière si traditionnelle; ainsi, toute l'injection avec la souris du côté droit vers le haut alors qu'il est debout sur les quatre pieds. D'autres expériences utilisant le db/db-/- souche utilisent ces souris quand ils sont plus jeunes et ne pèsent pas autant, donc la façon traditionnelle d'effectuer une injection IP peut être utilisée. Puisque le modèle de blessure chronique utilise des souris jusqu'à 6 mois d'âge et ces souris peuvent peser jusqu'à 80 g, la méthode conventionnelle n'est pas optimale et peut potentiellement blesser la souris. Nous avons utilisé la méthode décrite ci-dessus pour une souris cette obèse et n'ont pas observé de résultats défavorables lorsqu'il est injecté avec cette méthode avec aspiration réussie.

Auparavant, l'anesthésie injectable comme la kétamine et la xylazine, ont été utilisées; cependant, ils se sont avérés difficiles à utiliser avec db/db-/- souris. Avec un temps d'opération total de moins de 5 minutes, le temps d'induction et de récupération n'était pas nécessaire aux fins de l'expérience. L'isoflurane a été déterminé pour être le meilleur choix d'anesthésie pour cette procédure due à l'administration facile et à la titration, au début et à la récupération rapides, et à la profondeur anesthésique proportionnée. En outre, isoflurane provoque une dépression cardiaque minimale et maintient BP très bien34. Ainsi, un changement majeur dans la procédure pour le modèle chronique de blessure était d'employer l'isoflurane comme anesthésie préférée.

Le chauffage avant la chirurgie est important pour prévenir la mortalité dans les 2-3 jours suivant la chirurgie. Ces souris ont significativement plus basse température corporelle du noyau35 et ne sont pas en mesure de contrôler leur température corporelle de base efficacement en raison de leur manipulation génétique, de sorte qu'une source de chauffage externe est fourni avant la chirurgie pour se protéger contre le baisse supplémentaire de la température corporelle du cœur induite par l'anesthésie. Nous avons évalué le besoin d'un coussin chauffant avant, pendant et après la chirurgie. Il est important de noter que db/db-/- les souris ont des réponses physiologiques inhabituelles. Empiriquement, nous avons constaté que ces souris étaient les plus efficacement protégées par un soutien thermique pré- et post-chirurgical. En remplaçant l'isoflurane comme l'anesthésique, nous avons mesuré et déterminé que la température corporelle centrale n'a pas diminué de manière significative pendant les moins de cinq minutes de chirurgie. Bien que nous ayons trouvé le soutien de la chaleur pré- et post-chirurgicale pour être critique pour ces souris, nous n'avons pas trouvé le soutien chirurgical de chaleur pour avoir un effet. Il convient de noter que le président de l'IACUC a fourni des conseils et surveillé nos tests liés aux effets de température et d'anesthésie. Comme nous communiquons cette méthode, nous trouvons important d'indiquer ce qui est nécessaire pour le succès de la procédure.

Une limitation de l'utilisation de cette méthode pour étudier le développement de biofilms est le fait que les bactéries présentes sur la plaie et la production du biofilm ne sont pas contrôlées. Si une bactérie spécifique de biofilm-formation doit être étudiée, ce modèle peut être utile si le microbiome indigène peut être aboli avant de blesser par l'iode ou d'autres méthodes antiseptiques. En réponse à des niveaux excessifs de stress oxydatif, les bactéries pathogènes clés dans le microbiome de la peau sont stimulées pour initier la formation de biofilms. Dans nos blessures chroniques, les bactéries biofilm-formant incluent, mais ne sont pas limités à, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 Annonces , 39, et diverses Staphylococcus40,41 et Corynebacterium espèces41,42,43,44, 45, qui peuvent tous être trouvés dans les blessures chroniques humaines. Plusieurs études de microbiome de blessure chronique ont été conduites sur des blessures chroniques humaines pour les bactéries39,40,41,43,44,45 , et les champignons46,47 communauté, y compris les enquêtes longitudinales associées à une mauvaise guérison48,49. Des études longitudinales de cette nature peuvent également être suivies par le modèle chronique de blessure.

Il est important de reconnaître que des résultats différents peuvent être obtenus en raison de différences dans les conditions de vivaria, les fournitures et l'équipement, les vendeurs et les colonies sources pour db/db-/- souris. Pour minimiser de telles différences, fourni dans le protocole est la variété exacte de souris et la source qui est employée pour l'expérience chronique de blessure. Pour l'élevage de ces souris, la literie exacte et les marques alimentaires ont été fournies dans le Tableau des matériaux pour limiter la variabilité. Dans nos expériences, nous constatons que le stress oxydatif élevé est nécessaire et suffisant pour créer des blessures chroniques chez ces souris, tant que les souris sont logées dans un vivarium conventionnel et exposées à des bactéries. Les populations et les communautés de bactéries peuvent différer selon la vivaria; cependant, tant qu'une installation sans germes n'est pas utilisée pour loger les souris, elles devraient avoir suffisamment de bactéries, tant commensales que pathogènes, pour résider sur les cheveux et la peau.

Cette méthode de créer des blessures chroniques dans ce protocole est significative pour étudier les blessures chroniques et la guérison altérée de blessure parce que seulement les niveaux d'effort oxydatif sont sensiblement modifiés expérimentalement. Le stress oxydatif est nécessaire pour les processus normaux de guérison desplaies 2. Il est important pour la régulation en temps opportun et un composant crucial dans la fonctionnalité des cellules nécessaires pour la cicatrisation des plaies5. Cependant, lorsque les niveaux de stress oxydatif ne sont pas contrôlés, les espèces réactives d'oxygène peuvent endommager des cellules endothéliales, inhiber la fonctionnalité de kératineocyte, et retarder la fermeture de blessure2,5. Les blessures chroniques humaines ont des niveaux élevés de stress oxydatif50. Le modèle de souris a la glycémie élevée et a déjà augmenté des niveaux de stress oxydatif en raison de sa morbidité. Ces caractéristiques sont partagées avec les humains vivant avec le diabète et fournissent un microenvironnement propice à la chronicité après avoir subi des blessures50. Les humains hébergent également des microbiotes divers et complexes dans de nombreux endroits sur le corps, y compris la peau, de sorte qu'un complexe, mais naturel, microbiome est autorisé à se développer sur la peau de la souris.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs n'ont aucune reconnaissance.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

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Médecine Numéro 151 Cicatrisation des plaies plaie chronique cicatrisation altérée ulcère diabétique du pied stress oxydatif biofilm
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