Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

פצעים כרוניים מפותחים פציעות חריפה על מודל עכבר סוכרתית על ידי גרימת רמות גבוהות של לחץ חמצוני לאחר פצע מלאה בעובי עורית. הפצע מטופל במעכבי לקטלאז ולperoxidase גלוטתיון, והתוצאה היא ריפוי לקוי ופיתוח של ביו, על ידי חיידקים המצויים במיקרובידום העור.

Abstract

פצעים כרוניים מתפתחים כתוצאה מרגולציה פגומה בתהליכים סלולריים ומולקולריים מורכבים, המעורבים בריפוי נאות. הם משפיעים על ~ 6.5 M אנשים ועלות ~ $40B/שנה בארה ב בלבד. למרות שמאמץ משמעותי הושקע בהבנת האופן שבו מתפתחים פצעים כרוניים בבני אדם, שאלות עקרוניות נותרו ללא מענה. לאחרונה, פיתחנו מודל העכבר הרומן עבור פצעים כרוניים סוכרתית שיש להם מאפיינים רבים של פצעים כרוניים אנושית. באמצעות db/db-/- עכברים, אנחנו יכולים ליצור פצעים כרוניים על ידי גרימת רמות גבוהות של מתח חמצוני (OS) ברקמת הפצע מיד לאחר פצעו, באמצעות טיפול חד פעמי עם מעכבי ספציפיים אנזימים נוגדי חמצון הקטלאז ו peroxidase גלוטתיון. פצעים אלה יש רמות גבוהות של מערכת ההפעלה, לפתח באופן טבעי ביוilm, להיות כרונית לחלוטין בתוך 20 ימים לאחר הטיפול יכול להישאר פתוח יותר עבור יותר מ 60 ימים. מודל זה הרומן יש תכונות רבות של פצעים כרוניים סוכרתית בבני אדם ולכן יכול לתרום באופן משמעותי כדי לקדם את ההבנה הבסיסית של איך פצעים הופכים כרוניים. זוהי פריצת דרך גדולה כי פצעים כרוניים בבני אדם לגרום לכאב ומצוקה משמעותיים לחולים והתוצאה קטיעה אם לא פתורות. כמו-כן, פצעים אלה יקרים מאוד וצורכים זמן רב לטיפול, ומובילים לאובדן משמעותי של הכנסה אישית למטופלים. התקדמויות בתחום זה של המחקר באמצעות השימוש במודל הפצע הכרוני שלנו יכול לשפר באופן משמעותי את טיפול בריאות עבור מיליונים הסובלים תחת מצב זה מתישה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט רב את ההליך לגרום פצעים חריפה להיות כרונית, אשר לא נעשה בעבר.

Introduction

ריפוי הפצע כרוך תהליכים סלולריים ומולקולריים מורכבים, כי הם זמניות ו מרחב מוסדר, מאורגן בשלבים רציפים וחופפים הכרוכים סוגים רבים של תאים שונים, כולל אך לא מוגבל לתגובה החיסונית ואת כלי הדם מערכת1. מיד לאחר שהעור מקיים פציעה, גורמים ותאי דם מצטברים לאתר הפצע ומפעילים את מדרג קרישת הדם כדי ליצור קריש דם. לאחר הומאוסטזיס מושגת, כלי הדם מתרחבים כדי להכניס את הפצע באתר חמצן, חומרים מזינים, אנזימים, נוגדנים גורמים כימוכאוטקטיק למשוך פולימנוקלציטים כדי לנקות את המיטה הפצע של פסולת זרים להפריש אנזימים פרוטקליפה 2. טסיות מופעל מפרישות מגוון של גורמי גדילה כדי לעורר את keratinocytes בקצה הפצע כדי האפיתל מחדש את האזור הפצוע. מונוולוציטים גויס הפצע באתר להבדיל לתוך מקרופאגים אשר בקטריה phagocytose מתים נויטרופילים להפריש גורמים נוספים כדי לשמור על מתרבים keratinocyte ו פרו-נדידה אותות. בשלב התפשטות, בעוד הרקמה מחדש ממשיכה, רקמת גרטולזה חדש מורכב של פיברופיצוצים, מונוציטים/מקרופאגים, לימפוציטים, ותאי האנדותל להמשיך את תהליך השיקום2. אנגיוגנזה מגורה על ידי קידום התפשטות והגירה של תאי האנדותל, והתוצאה היא פיתוח כלי חדש. אפיתל ושיפוץ של מטריקס החילוץ לבנות מחסום נגד הסביבה. כאשר הפצע מרפא ורקמות הגרטולציות מתפתחת לתוך צלקת, אפופטוזיס מבטלת תאים דלקתיים, פיברותקיעות, ותאי אנדותל מבלי לגרום נזק נוסף לרקמות. חוזק מתיחה של הרקמה מוגברת על ידי שיפוץ מרכיבים שונים של מטריצה החילוץ, כמו קולגן, כך הרקמה החדשה שנוצר הוא כמעט חזק וגמיש כמו עור בלתי מושפע2.

כל סטייה מהתקדמות זו מאוד כלפי הסגר הפצע מוביל לקויי ו/או פצעים כרוניים3. פצעים כרוניים מאופיינים לחץ חמצוני מוגבר, דלקת כרונית, פגום microvascuלטורה, ומטריצה קולגן נורמלי בפצע4. לחץ חמצוני, במיוחד בפצע, יכול לעכב את סגירת הפצע2,5. כאשר, בשלב הראשון של ריפוי הפצע, השלב הדלקתי הופך בלתי מבוקר, הרקמה המארחת מניח נזק נרחב עקב זרם רציף של תאים דלקתיים5 שחרור אנזימים ציטוטוקסיים, עלייה ברדיקלים חופשיים חמצן, ו , מתווכים דלקתיים לא מפוקחים. וכתוצאה מכך מוות תאים6,7

בסביבת מיקרו הרסנית זו, חיידקים יוצרי בקטריה לנצל החומרים המזינים מארחים לתרום לנזק של רקמת המארח2. ביואילאמים אלה קשה לשלוט ולהסיר משום חומרים פולימרים מסירות מתוך המורכב של חלבונים, DNA, RNA, ו פוליסכדים מאפשר חיידקים הרעמנים בתוך להיות סובלני טיפולים אנטיביוטי קונבנציונלי להתחמק ה המארח של הפונדקאי ואת התגובה החיסונית מסתגלת2,8,9.

לימוד פצעים כרוניים הוא חיוני כי הם השפעה ~ 6,500,000 אנשים ועלות ~ $40,000,000,000 בשנה בארה ב בלבד10. חולים עם סוכרת הגדילו את הסיכונים לפיתוח פצעים כרוניים הדורשים קטיעה כדי להכיל את התפשטות הזיהום. למטופלים אלה יש 50% תמותה הסיכון בתוך 5 שנים של קטיעה כי הוא מיוחס מנגנון pathפסיולוגיה של סוכרת11. הקשר בין המערכת החיסונית של המארח לבין מיקרובידום בריפוי הפצע הוא נושא חיוני של מחקר שוטף, כי השלכות של פצעים כרוניים, אם לא מזוהים, כוללים קטיעה ומוות12.

למרות שמאמץ משמעותי הושקע בהבנת האופן שבו מתפתחים פצעים כרוניים בבני אדם, עדיין לא ברור כיצד ומדוע פצעים כרוניים יוצרים. ניסויים לחקר מנגנוני הריפוי לקויי קשה לנהל בבני אדם, והפצע מומחים ריפוי רק לראות חולים עם פצעים כרוניים שכבר הגיעו המתעד במשך שבועות חודשים. לכן, מומחים אינם מסוגלים ללמוד מה התהליכים השתבש להוביל את הפצע להתפתח להיות כרונית2. יש חוסר במודלים של בעלי חיים אשר לכידה של המורכבות של פצעים כרוניים אנושיים. עד שהמודל שלנו פותח, לא היה. מודל למחקרים כרוניים בפצע

מודל הפצע כרונית פותחה בעכברים כי יש מוטציה בקולטן לפטין (db/db-/-)13. עכברים אלה הם שמנים, סוכרתית, יש לקויי ריפוי, אבל לא לפתח פצעים כרוניים14. רמת הגלוקוז בדם בממוצע סביב 200 mg/dL, אבל יכול להיות גבוה כמו 400 mg/dL15. כאשר רמות גבוהות של לחץ חמצוני (OS) ברקמת הפצע הם המושרה מיד לאחר פצעו, הפצע הופך כרונית16. Db/db-/- פצעים נחשבים כרוניים על ידי 20 ימים ונשארים פתוחים במשך 60 ימים או יותר. ביוilm המיוצר על ידי חיידקים ניתן לראות מתפתח מתחיל שלושה ימים לאחר פציעתו; ביוilm בוגר ניתן לראות 20 יום לאחר פציעתו ונמשך עד לסגירת הפצע. החיידק היוצר של הביוilm שאנו מוצאים בעכברים האלה נמצא גם בפצעים כרוניים של האדם.

מתח חמצוני נגרמת על ידי טיפול בפצעים עם שני מעכבי של אנזימים נוגדי חמצון, קטלאז ו peroxidase גלוטתיון, שני אנזימים עם היכולת לשבור חמצן מימן. תחמוצת המימן הוא מינים חמצן תגובתי יכול לגרום נזק הסלולר דרך חמצון של חלבונים, שומנים, ו-DNA. קטלאז מזרז את הפירוק של חמצן מימן לתוך כימיקלים מזיקים פחות חמצן ומים. 3-אמינו -1, 2, 4-triazole (עץ) מעכב קטלאז על ידי קשירה באופן ספציפי ומלא למרכז הפעיל של האנזים, הפעלת אותו17,18,19. עץ שימש כדי לחקור את ההשפעות של לחץ חמצוני הן בתוך מבחנה ב vivo דרך עיכוב של קטלאז20,21,22,23,24. גלוטתיון peroxidase מזרז את הפחתת מי חמצן דרך נוגדי חמצון, גלוטתיון, והוא אנזים חשוב המגן על התא נגד לחץ חמצוני25. חומצה מרקוטוקסינית (מס א) מעכבת גלוטתיון peroxidase על ידי קשירה לאתר הפעיל של האנזים הכולל את האנזימים באמצעות הפעלה זו, שאינה מפעילה26. מס ' א נעשה שימוש כדי ללמוד את ההשפעות של לחץ חמצוני בתוך מבחנה ב vivo כמו גם20,27,28.

זה מודל הרומן של פצעים כרוניים הוא מודל רב עוצמה ללמוד כי זה מניות רבות מאותן תכונות שנצפו בפצעים כרוניים סוכרתית האדם, כולל דלקת ממושכת מערכת הפעלה מוגברת והיווצרות ביוilm טבעי מ-microbiome העור. הפצעים לקויי המגע העורי-באפידרמיס, תצהיר מטריצה חריגה, אנגיוגנזה עני והוא ניזוק. פצעים כרוניים יתפתחו בעכברים זכריים ונקביים, כך שניתן יהיה להשתמש בשני המינים כדי ללמוד פצעים כרוניים. לכן, מודל הפצע הכרוני יכול לתרום באופן משמעותי לקידום ההבנה הבסיסית של אופן התחלת הפצעים. שימוש זה מודל הפצע כרונית יכול לספק תשובות לשאלות בסיסיות על איך המתעד הוא יזם/מושגת באמצעות תרומות מן הפיזיולוגיה של ריפוי פצע לקוי ואת המיקרובידום של המארח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים הושלמו בהתאם וציות לתקנות פדרליות ומדיניות ונהלים באוניברסיטת קליפורניה אושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד IACUC.

1. בעלי חיים

  1. השתמש סוכרת ושמנים B6. BKS (D)-Leprdb/J עכברים עבור מודל הפצע כרונית. אפשרויות הרכישה כוללות גם הטרוזיטים לרבייה או הומוזיטים ישירות לניסויים.
  2. גזע הטרוזינים זכרים ונקבות לייצר צאצאים. רק רבע המלטה, סטטיסטית, יגדל להיות סוכרתית ושמנים (db/db-/-).
  3. לגמול והבית db/db-/- עכברים יחד עם חבריהם לכיתה 3 שבועות לאחר הלידה. נפרדים db/db-/- עכברים מחבריהם לחדר 5 שבועות לאחר הלידה והבית עם db אחרים/db-/- עכברים עד שהם 5-6 חודשים והוא יכול לשמש למודל הפצע כרונית. במהלך הזמן הזה, מיקרובידום עור בוגר ומורכב יכול להתפתח.
    הערה: db/db-/- עכברים מזוהים בקלות מבחינה חזותית בין שבועות 3-5 של גיל. Db/db- עכברים הם שמנים, הם סוכרתית, ו יהיה גדול משמעותית ועגול יותר מאשר סוג פראי ו heterozygous התאומות. הבטן שלהם עשויה להיראות מעט מנקר והירכיים שלהם גדול יותר. יש לאשר משקל מוגבר לפני הניתוח. גם, ניתן למדוד רמות גבוהות של גלוקוז בדם גנוטיפ העכבר כדי לאשר את המוטציה בקולטן לפטין.

2. וvivarium וגידול

  1. בית db/db-/- עכברים בתוך יבר קונבנציונאלי (לא מחסום/מתקן ספציפי הפתוגן חינם) כך מיקרופלורה ניתן להקים על העור של db/db-/- עכברים. במיוחד לדגם בני אדם הסובלים מפציעות כרוניות, אינם נוקטים באמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע חשיפה לפתוגנים.
  2. להגן על הכלובים עם צמרות מיקרו מבודדים כדי למזער את התפשטות הזיהום בתוך vivarium. לשנות את הכלובים פעמיים בשבוע עם מצעים חדשים ולהאכיל את העכברים עם צ'או ויובינום רגיל. אין להקלבים על המצעים או על האוכל.
  3. הגדר את טמפרטורת החדר לטווח בין 21 ל -24 ° c, עם תנודות קלות בהתאם לזמן השנה. הלחות, רפלקטיבית של האקלים והמיקום, יהיה טווח בין 19 ו 70%.

3. דרישות לפיתוח פצעים כרוניים

  1. השתמש רק בעכברים זכר ונקבה כי הם פנופי בדרך כלל, סוכרת, ולפחות 5-6 חודשים של גיל להתפתחות של פצעים כרוניים. המשקל של עכברים אלה צריך להשתנות בין 40-80 g, בממוצע סביב 60 g.
  2. אין להשתמש בעכברים שנחשבים להשמנת יתר, אך שוקלים פחות מ-50 g.
    הערה: כל העכברים הנזכרים בפרוטוקול זה מעבירים את הכישורים המתוארים כאן אלא אם צוין אחרת.

4. גילוח ויישום של תחליב להסרת שיער

הערה: הסרת שיער לא רצוי על הדורסום של העכבר לפני שפצעו. ההליך הבא נעשה על live db/db-/- עכברים שאינם נמצאים תחת הרדמה יום לפני הניתוח. נקוט באמצעי זהירות כדי למנוע לחץ ולפגוע בחיה.

  1. גילוח
    1. מניחים את העכבר על משטח נקי לאחוז את הבסיס של זנב העכבר עם האגודל ואת האצבע השנייה כדי לאבטח את המיקום של העכבר. העכבר יכול לקפוץ או לעשות תנועות פתאומיות; אם כן, להגיב במהירות ולמשוך לאחור את הקוצץ כדי למנוע פציעה.
    2. לגלח את השיער של העכבר עם קוצץ שיער (דמויות 1A, 1A). הצב את הלהב במקביל לעור העכבר וגלח את כל הגב מהצוואר אל הזנב, כולל סביב הזנב, כדי לאפשר שטח גדול מספיק כדי למקם את הסרט השקוף (ראה לוח חומרים). הפעל בקלילות את הלהב כנגד כיוון צמיחת השיער לחיתוך היעיל ביותר. (איור 1B).
      1. אל תלחץ על הלהב עמוק לתוך העור, שכן הוא עלול לגרום נזק לעור על ידי חבלות או חיתוך.
  2. הגשת תחליב להסרת שיער
    הערה: השתמש בתחליב דפילציה כדי לקבל עור חלק מאוד, כך שהחבישה השקופה יכולה לדבוק בחוזקה.
    1. להשרות את העור של העכבר עם מים כדי למנוע כוויות כימיות על ידי לחיצה קלה על מנגב נייר שטוף העור מגולח עם מספיק לחץ כדי להרטיב את השיער לחתוך כבר למטה נגד העור.
    2. בעוד העור רטוב, בקלות לשפשף את העור של העכבר עם לגזום קטן של קרם דפילציה (ראה טבלת חומרים) עבור 15-20 s (דמויות 1c, 1c). הפיצו את התחליב לגמרי. לכל מקום שהשיער התקצר השתמש בתחליב יותר אם העכבר גדול יותר.
    3. אין למרוח תחליב על האוזניים של העכבר, הזנב או בכל מקום קרוב לפנים. אם התחליב מקבל על האוזניים או הזנב, פשוט לנגב עם מחיקה נייר רטוב עד שטיפה. אם התחליב מקבל על פני העכבר, מיד לשטוף את העכבר תחת הפעלת ברז או מים מאוהים כדי למנוע נזק לעיניים, אף, ומפה.
    4. להשאיר את תחליב להגיב עם השיער עבור 20-45 נוספים לאחר היישום.
    5. לפני השטיפה, בדוק את השלמת התגובה המידתית על ידי ניגוב קל של התחליב מהעור במיקומים שונים (איור 1E) באצבע כדורית או במרית מתכת דקה. התגובה הושלמה אם העור הוא ורוד ללא נוכחות של שיער שחור. עדיף לבדוק במהירות כי השיער הוסר למעשה לפני שטיפה מאשר שטיפה מוקדם יותר ולאחר מכן להחיל קרם שוב.
  3. שטיפה
    הערה: לאחר השלמת התגובה להסרת שיער אומתה, לשטוף את העכבר עם ריצה ברז או מים מאוהים כדי להסיר את תחליב דפילציה ולמנוע כוויות כימיות.
    1. הניחו את העכבר על היד הימנית השמאלית ולחצו על הבסיס של הזנב כנגד כף היד עם האגודל השמאלי כדי למנוע מהעכבר לנוע מסביב. סגור ויישר את שאר האצבעות השמאלית כדי למנוע מהעכבר לנשוך.
    2. הצב את העכבר כך שאזור הפנים/הראש הרחק מזרם המים והזרם של מים פושרים יכול ליפול מאחורי הראש ורק מאחור. מהר אבל לשפשף בעדינות את החלק האחורי של העכבר עם היד הימנית הנכונה כדי לשטוף את התחליב.
    3. לאחר העור של העכבר הוא חופשי של תחליב, לנגב במהירות את העכבר עם מגבת נייר כדי לקלוט את רוב המים (איור 1F).
  4. טיפול לאחר גילוח והסרת שיער
    1. בדקו ונקו כל תחליב שיורית שעשוי להישאר על האוזניים והזנב באמצעות מחיקת נייר רטובה.
    2. מניחים את העכבר בכלוב הבודד שלו ומניחים את הכלוב על משטח חימום (40-45 ° c) במשך כ -30 דקות. העכבר צריך לחזור להתנהגות נורמלית, מתרוצצים, ואת החתן עצמו בתוך כמה דקות.
    3. הבית כל עכבר בכלוב נפרד לאורך כל תקופת הניסוי. העור של העכברים הוא כבר לא מוגן והוא יכול להיות בקלות שרוט וננשך על ידי עכברים אחרים.
    4. מאז קרם דפילציה יכול להיות אפקטים מעצבן קל שעלולים להפריע או לשנות את תהליך הריפוי הפצע, לחכות 18-24 h לפני הניתוח כדי לאפשר לעור העכבר להירגע ואת העכבר כדי להתאים את העדר שיער בגב.
  5. הסרת שיער מעור עם פיגמנטציה כהה
    הערה: כמה db/db-/ עכברים יהיה פוטנציאל להיות טלאים כהים בעור כי יהיה שיער גדל בחזרה מהר יותר מאשר העור ללא טלאים אלה. (איור 2א). האזורים הכהים האלה של העור מופיעים כהה יותר בצבע בשל באמצע מאוחר בשלב השיער אנאגן זקיקי ו/או פיגמנטבריחת בעיות 29,30.
    1. אם מבחינים במדבקות כהות, החילו שוב קרם החלקה, אך רק באזורים אלה, וחזור על שלב 4.2 ו-4.3 (איורים 2B, 2B).
      הערה: כתמי העור הכהים יגדלו שיער מהר יותר במהלך הניסוי, כך שהסרטון יהיה קצר כל 3-5 ימים, כאשר הדבר יידרש. תיקון או שניים הרחק מהמיקום הרצוי של הפצע מקובל. אם החלק האחורי של העכבר מכוסה באופן משמעותי על ידי אלה טלאים כהים, לא להשתמש בעכבר על מודל הפצע כרונית.

5. התקנה מגיב

הערה: התפתחות פצעים כרוניים בdb/db/- עכברים מושגת על ידי טיפול עם מעכבי ספציפיים לקטלאז והגלוטתיון peroxidase, 3-אמינית -1, 2, 4-triazole (עץ) וחומצה מרקוטוסואית (מס א), בהתאמה16 . הפרוצדורה הבאה מפרטת את המינון והניהול של כאבים ומעכבי המבוססים על משקל העכבר.

  1. הכנס את משככי הכאבים בופריקס intraperitoneally ב 0.05 מ"ג/ק"ג ב-PBS מעוקר. הכנס נפח של 120 μL עבור עכבר 60 g כ 30 דקות לפני הניתוח. . מינון נוסף של 6 שעות לאחר הניתוח ניתן לקבל מנה נוספת לפי הצורך.
  2. הכנס את עץ intraperitoneally ב 1 ג/ק"ג העכבר ב-PBS סטרילי. הכנס נפח של 480 μL עבור עכבר 60 g כ 20 דקות לפני הניתוח. הכנס חצי מעוצמת הקול בצד שמאל של הבטן והחצי השני בצד ימין.
  3. הפקדה מס א למריחה על הפצע בין הרוטב השקוף לבין רקמת הפצע ב 150 מ"ג/ק"ג בעכבר PBS סטרילי. ניהול נפח של 60 μL עבור עכבר 60 g בתוך 10 דקות לאחר הניתוח.

6. כירורגיה

הערה: הצלחת מודל הפצע הכרוני נשענת על תנאים שאינם סטריליים. עכברים אלה אינם חיידקים, הם שוכנו vivarium קונבנציונאלי. החיידק מיקרובידום השוכן בעור הוא חיוני עבור חניכה הבאים ופיתוח של פצעים כרוניים על הטיפול עם מעכבי של אנזימים נוגדי חמצון. לכן, ההכנה טרום הניתוח המסורתית של האתר היא קונטרה-המצוין.

  1. הזרקת הצפק פנימי
    1. לאבטח את העכבר על חלק משופע של מדף הכלוב להחזיק את הזנב עם העכבר בנוחות עומד עם הראש נמוך יותר מאשר בגוף של העכבר. הדבר מבטיח שננסה להזיז את האיברים הפנימיים הרחק מנקודת ההזרקה האפשרית.
    2. הכנס את המחט ברבע הימני התחתון של הבטן כדי למנוע הזרקה לתוך שלפוחית השתן, או אברי הבטן אחרים.
    3. . מרוב המחט לפני הזריקה
  2. טיפול והרדמה
    1. מנהל בופריקס 30 דקות ו-"עץ" 20 דקות לפני הניתוח, כפי שמתואר בשלבים 5.1 ו 5.2.
    2. מניחים את העכבר במיכל פלסטיק קטן על גבי משטח חימום חם כפי שמוצג באיור 3a עבור כ 15-20 דקות. מתן תמיכה בחום לפני ההליך מגן מפני תמותה פוטנציאלית.
    3. מניחים מגבונים או נייר מגבת מעל החלק העליון של המיכל הקטן כדי להכיל טוב יותר את החום. העכבר צריך להירגע כפי שהוא מתחמם. איור 3 ב מראה חומרים הנחוצים לניתוח.
    4. הניחו את העכבר במיכל סגור המחובר אל מכשיר האידוי של isofלוריאן בכיפה הכימית אם משתמשים במערכת פתוחה.
    5. במערכת פתוחה, ניהול 5% isofלפני 1-2 דקות בקצב זרימה של 2-3.5 L/min. לפקח ברציפות את מצב העכבר.
      1. פעם העכבר הוא מחוסר הכרה או לא זז עוד, למקם את העכבר על משטח כירורגי לבן ולהתאים את הראש עם חרוט אף כי הוא מאובטח כדי לאפשר הממשל מתמשך של isof, במהלך הניתוח.
    6. במערכת פתוחה, ניהול 2-3% isofלוריאן באותו קצב זרימה במהלך הניתוח ולהתאים לזרימת isof, כדי לשמור על עומק של הרדמה.
    7. מזער הן את הריכוז ואת משך הזמן של isof, המנוהל במהלך הניתוח. db/db -/- עכברים רגישים מאוד להרדמה כך שעדיף לשמור על החשיפה של isof, למינימום. אם העכבר עדיין מגיב לאחר 2 דקות ב-5% isofלאנה, לאבטח את חרוט האף ולנהל 3-5% isofלאנה עבור 15-30 s לפני תחילת הניתוח.
      1. אשר את ההרדמה הנכונה לפני פציעתו. עומק ההרדמה מאושר על ידי חוסר תגובה גירויים פיזיים כגון צביטה חזקה בבוהן. אורך הזמן של העכבר תחת הרדמה שאפה הוא מתחת 5 דקות כך לא משחה וטרינר מוחל על העיניים.
  3. ופצעו
    1. רסס לנגב נייר עם 70% אתנול או האתנול מטליות קליני ולנגב את החלק האחורי של העכבר כדי לנקות את האזור של הפצע באתר. נקו את פני העור כך שהחבישה השקופה יכולה לדבוק בחוזקה, מאחר שאבק מהמצעים, המזון או העור יכולים למנוע את החבישה מלדבוק כראוי (איור 4א). לא לנגב מוגזם, או יהיה סיכון להרוג את החיידקים נוכח על העור.
    2. . קבע את מיקום אתר הפציעה המקום הטוב ביותר לבצע את הפצע הוא בצד השני של העכבר, ממורכז והרחק מכתמים של העור עם פיגמנטציה גבוהה יותר.
      הערה: קבענו מהניסיון שעכברים אלה יכולים לעמוד רק בעול של פצע אחד.
    3. צור פצע בתוך 30-45 s באמצעות מעטפת 7 מ"מ העור ביופסיה, מלקחיים וכירורגי מספריים. לחצו בקלילות את הפונץ ' ביופסיה אל אתר הפצע הרצוי ולסובב את האגרוף סביב רק עמוק מספיק כדי להשאיר רושם קל של הפונץ ' (איור 4ב). בלו את העור המחולק על ידי משיכת מרכז הפונץ ' עם מלקחיים וחיתוך לאורך קו המתאר עם מספריים כירורגיים (דמויות 4C-4C).
    4. לכסות את הפצע בחוזקה עם חצי פיסת הסרט שקוף ההלבשה (6 ס"מ x 3.5 ס מ).
    5. להפסיק את הניהול של 2% isofלפני העכבר (איור 4F).

7. טיפול לאחר ניתוח והתאוששות

  1. מנהל טיפול מס א אחרי הניתוח הושלם והחבישה השקופה מיושמת כמתואר בשלב 5.3. הפקדה מס א לאזור הפצע. מתחת לתחבושת
  2. מניחים את העכבר חזרה במיכל קטן על משטח החימום עבור 30 דקות כדי לעזור עם התאוששות. ברגע שהעכבר התחמם, החזר את העכבר לכלוב שלו. והעכבר אמור להסתובב. זמן קצר לאחר מכן
  3. אין להשאיר עכברים ללא השגחה ולא להחזיר אותם לוייונום עד שלעכברים יש הכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה משנית.
    הערה: ההרדמה של הבחירה כאשר העבודה עם העכברים האלה היא isofלוריאן בדיוק בשל אינדוקציה מהירה שלה הופעתה הבאה מן ההרדמה.
    1. עכברים הבית שעברו ניתוח באופן אינדיבידואלי כדי למנוע עכבר אחד להתערב עם הפצע הכרוני של אחר. כפי שנאמר לעיל, הם אינם חוזרים אל הוויבינום עד התאוששות מלאה.
  4. לנהל את המינון השני של בופריקס 6 שעות לאחר הניתוח.
  5. שימו לב עכברים בקפידה על 48 h הראשון לאחר הניתוח.
    הערה: הניתוח, ביחד עם מעכבי ליצור את הפצע כרונית, הוא מלחיץ מאוד את החיה כי הוא כבר חולה סוכרת וגם שמנים. עכברים שישרדו את הימים הראשונים לאחר הניתוח ישרדו בדרך כלל את משך הניסוי.

8. איסוף נתונים, אסטרטגיות הישרדות, טיפול בעכברים לאחר פציעתו וטיפים נוספים

  1. איסוף נתונים
    1. צלם תמונות מוקדם יותר מיד לאחר הניתוח. ביוגיאמים נצפו בכל מקום בין 5-10 ימים לאחר פציעתו, ומוקדם ככל שלושה ימים.
    2. אם החיידקים הם המוקד של ניתוח, רול להחליף סטרילי עם לחץ באור סביב הפצע עבור 10-15 s. לאחסן את הספוגית, בתוך מדיית המקפיא המתאים עבור culturing או יבש ללא כל מדיה לניתוח רצף בלתי תלוי התרבות, ב-80 ° c. איסוף חומרים פולימריים מסחטות באמצעות מרית מתכת סטרילית לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ולאחסן ב-80 ° צ' לפני הניתוח.
    3. אין לנהל הרדמה לעכבר במהלך הטיפול עבור אוסף ביוilm או לקיחת תמונה. במהלך הליכים אלה, המקום פיסת מזון מול העכבר כדי להרגיע את העכבר ולמנוע ממנו לברוח. רוב העכברים לטפס על האוכל, לשבת על זה, ולא לזוז.
  2. כמו זיהומים משניים, פצעים כרוניים כרונית או כיבים יכול להתפתח אם העכבר אינו נע כראוי או אם ההלבשה אינה מיושמת כראוי, מדי פעם לבדוק את הפעילות של העכבר ואת הצד הגחוני לפצעים. חיכוך בין העור לבין מצעים רטובים (db/db/- עכברים הם פולישתן) יכול להפריע את העור אם הכלובים לא שונו לעתים קרובות.
    הערה: הצטברות נוזלים מתחת לחבישה עלולה לגרום לדבק לאבד את הדביקות ולאפשר לנוזל לדלוף. תא עור מתים, מצעים, וחומר צואה יכול להיצמד לעור והרדן. אלה טלאים ואגרגטים מיובשים על העור יש לנקות מיד כדי למנוע זיהום משני.
  3. אם העכברים עומדים או יושבים על רגליהם האחוריות, להעביר את העכברים האלה לכלוב שבו הגישה למזון ולמים הוא הרבה יותר נמוך. אם מיקום המזון והמים בכלוב גבוה, העכבר עלול לעמוד או לשבת על רגליו האחוריות כדי להגיע אליו. רוב העכברים לא תהיה בעיה לאכול ולשתות אם הם יכולים לעשות זאת לפני הניתוח, אם כי יש אפשרות כי עכברים מסוימים עלולים להתהפך על גבם. "הפליפרים" האלה עשויים להיות בעלי קושי רב להסגיר את עצמם, כך שהם יזדקקו לסיוע ולניטור נוסף.
  4. להשאיר את הרוטב שקוף על העור עד 20 ימים אם העור הוא ברור של פסולת, עור מפתח ושיער. אם אחד מאלה להתרחש על העור, להסיר את הרוטב הישן ולהחיל חלק חדש.
    1. כדי להוריד את הרוטב, לצבוט קלות את העור ישירות מאחורי הראש, ולאחר מכן למשוך את הרוטב הרחק מהראש בתנועה אחת חלקה.
    2. כדי לשים פיסת ההלבשה על הנייר היטב, יש לשמור על העכבר ככל האפשר. חשוב שהעור נקי וחופשי מתאי עור מתים, אבק מהמצעים ופיסות מזון. מקום ואז ללחוץ את התחבושת לתוך העור סביב הפצע כדי לאבטח.
    3. אם הצבת פיסת מזון מול העכבר לא להגביל את תנועותיו, ואז למקם את העכבר על גבי כלוב התיל. פעם העכבר תפס מעקה על הכלוב, להחזיק את הזנב קרוב לגוף ככל האפשר ולמשוך עם כוח מינימלי. כמו העכבר מושך קדימה האחורי יהיה למתוח וליישר עבור יישום קל; מניחים את הרוטב מאובטח בשלב זה.
    4. . לעולם אל תשתמשו שוב ברוטב ישן תמיד להחיל ההלבשה החדשה בגב הדבקה הגדול ביותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 5 מתאר דוגמה של פצע ללא טיפול מעכבי מתקדם לעבר סגירת הפצע פציעה עם טיפול מעכבי מתקדם לקראת הכרובית. החבישה השקופה נותרה במקומה על הפצע הכרוני, כך שניתן יהיה לראות את הצטברות הנוזלים וההצטברות.

טקס חניכה כרונית מתרחש בתוך פחות מ 6 שעות ואת שולי הפצע שונה בעליל מפני לחץ חמצוני. הראיות היסטולוגית של שולי הפצע מגלה כי הרקמה היא נקרוטיק ולא ישתתף בריפוי הפצע. החיידק היוצר של הבקטריה בפצע יכול לאחר מכן להשתמש ברקמת נמק זו כמקור של חומרים מזינים ורכיבים מבניים להפקת ביוilm. פצע כרוני הוא פצע שנשאר פתוח, המורחב בהשוואה לפצע הראשוני, מכיל ביוilm (בקטריות בתוספת פתוגניים שנמצאו בפצעים כרוניים אנושיים) ולוקח חודשים או שנים להחלים בהתאם לכמות ולתוכן של הביוilm המונע הפצע מפתרון כרגיל. במודל הפצע כרונית, המתעד המלא מוגדר ל> 20 ימים לאחר הניתוח, כי הפצעים שלא טופלו עם מעכבי ייסגר בזמן הזה (איור 5). הריפוי בדרך כלל לוקח > 60 ימים והזמן תלוי חיידקים פתוגניים העיקרי נוכח הפצע. לפעמים העכברים עלולים להיכנע לזיהום כאשר חיידקים היוצרים אגרסיבי יותר, כמו פסאודומונס, הם שולטים בפצע. כך, פצע כרוני מוגדר כפצע שלא ייסגר בתוך 20 ימים, לוקח יותר מ 60 ימים כדי לרפא, ויש לו ביוilm נוכח על הפצע.

הבדלים מין נמצאו במודלים סוכרת שונים, כולל db/db-/ עכבר דגם32,33. בעוד הבדלים כאלה קיימים, יש לנו שנצפו סקס לא להיות גורם משמעותי בהתפתחות של פצעים כרוניים. פצעים כרוניים בעכברים זכריים ונקביים מתפתחים במידה דומה, כך שניתן להשתמש בשני המינים כדי ללמוד פצעים כרוניים. כך, ניצול מודל זה הוא יתרון מאז פצעים כרוניים אנושית ניתן למצוא הן בחולי סוכרת זכר ונקבה.

Figure 1
איור 1 . . תהליך גילוח והליך להסרת שיער (א) העכבר לפני הגילוח. (ב) העור של העכבר מגולח כדי להסיר את רוב השיער בגב. (ג) לגזום של תחליב מהסרת על קצה אצבע. משתמשים ביותר אם העכבר גדול יותר. (ד) החלק האחורי של העכבר מכוסה בתחליב דפילציה ושמאלה כדי להגיב. (ה) מרית משמשת לגרד חלק מהתחליב כדי לראות אם השיער הוסר. עור ורוד בהיר ללא כל נוכחות של שיער מעיד כי הסרת שיער הושלמה. (ו) התחליב בגב מוסר מים זורמים. העור של העכבר צריך להיות מעט ורוד. דמות זו השתנתה מקים ומרטין גרין31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . הסרת שיער מכתמים קטנים יותר של עור כהה. (א) העכבר כבר טופל פעם אחת העור רטוב שוב כדי למנוע כוויות. (ב) תחליב להסרת שיער מיושם רק על גבי העור החשוך והוא בעל השיער הצפוף. (ג) התחליב נשטף לאחר התגובה כדי לחשוף את הטלאי הכהה של העור ללא שיער. דמות זו השתנתה מקים ומרטין גרין31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . . הגדרת טרום-ניתוח (א) העכברים הנפגעים מונחים במכולות פלסטיק קטנות על גבי משטח חימום. (ב) חלק מהחומרים המשמשים בניתוח מוצגים. מספריים כירורגית צריך להיות חד כדי להבטיח כי העור לא נמחץ כאשר חותכים. הרוטב השקוף נחתך לשניים. דמות זו השתנתה מקים ומרטין גרין31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . . מכין את הפצע באמצעות הריתה (א) לאחר העכבר נמצא תחת הרדמה, החלק האחורי של העכבר נמחק עם 70% אתנול פעם אחת. (ב) אגרוף ביופסיה העור ממוקם על גבו של העכבר ולחץ מספיק קשה כדי להשאיר רושם. אגרוף ביופסיה ניתן לסובב כדי לעשות חתך רדוד. (ג) מרכז האזור המוקף בפינצטה הוא צבט בעזרת מלקחיים ומספריים כירורגיים חדים משמשים לחיתוך ראשוני. (ד) מספריים כירורגית מתמרן לחתוך לאורך המתאר שנעשו על ידי פונץ ' ביופסיה. (ה) אזור העור המתואר על ידי משאבת הביופסיה הוא הצליח בהצלחה. (ו) החבישה השקופה ממוקמת בגב העכבר ומאובטחת. דמות זו השתנתה מקים ומרטין גרין31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 . . תמונות של פצעים (א) הפצע על העכבר בזמנים רצופים לאחרהניתוחכפי שהוא מתקדם לתוך כותבי התחלה ביום הניתוח. ביוilm ניתן לראות מוקדם ככל היום 5 וזוהה מוקדם ככל היום 3. הפצע כרוני לגמרי עם. ביוilm חזק ביום 20 (ב) דוגמאות של פצעים כרוניים אנושיים, במיוחד כיבים ברגל סוכרתית. דמות זו השתנתה מקים ומרטין גרין31. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לאחר פציעות כרוניות נוצרות על העכברים, המודל יכול לשמש כדי ללמוד תהליכים ריפוי בפצע לקוי המעורבים בייזום של כותבי. המודל יכול לשמש גם כדי לבדוק את היעילות של מגוון רחב של כימיקלים ותרופות שיכולים להפוך את התפתחות הפצע כרונית וריפוי לקוי ולגרום לסגירת הפצע וריפוי. נקודות זמן שונות לאחר התחלתה של כותבי ניתן ללמוד: לדוגמה, ימים 1-5 לאחר פציעתו לתחילת מוקדם של כותבי וימים 20 ומעבר לחוזק מלא פצעים כרוניים.

מודל הפצע כרונית הוא גם מודל רב עוצמה כדי ללמוד היבטים שונים של ריפוי הפצע וסיבוכים כגון bioburden ו cachexia. Bioburden הוא רק אחד היבטים רבים של פצעים כרוניים שניתן ללמוד במודל זה, כפי שהוא משפיע גם על פצעים כרוניים אנושית. הנהלים שלנו ופרוטוקול השימוש בבעלי חיים מזהים בבירור את הסימפטומים הניתנים למעקב, יחד עם לוח זמנים מוגדר לניטור. בעלי חיים שזוהו כחולניות, בהתבסס על הקריטריונים המאושרים של IACUC, מורדמים על מנת למנוע סבל משמעותי. בנוסף לכך, הוטרינר וטרינר לבריאות הקמפוס מתיידדים כאשר סימפטומים מסוימים מופיעים ומספקים הדרכה תומכת בהערכת קריטריונים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול כוללים את הדיור db/db/-עכברים ב- vivarium קונבנציונאלי, הסרת שיער עם תחליב depilis, וחימום לפני מינהל isofלוריאן. התפתחות פצעים כרוניים במודל הפצע כרונית מסתמך על תנאים שאינם סטריליים ושיטות. עכברים אלה אינם חיידקים חינם, לא לגדול vivariums נקי מאוד. מיקרופלורה השוכנת בעור היא חיונית לייזום ופיתוח של פצעים כרוניים על הטיפול במעכבי לאנזימים נוגדי חמצון. אלה db/db-/- עכברים חייבים להיות חשופים לסביבה המכילה חיידקים, שניהם הקומנד, ו פתוגניים. אם העור מתנקה ומלא-נגוע ביוד או שיטות אנטיספטיות אחרות לפני הניתוח כדי "לעקר" את העור, הפצע לא יכול להיות כרוני. החיידק במיקרובידום העור הינו הכרחי להיווצרות ולפיתוח של הביוilm, ולעיכוב הריפוי וסגירת הפצע. במרפאה, הנוכחות של ביוilm בפצע עוד מסבך את תהליכי הריפוי בפצע ומגבירה את הסיכון לקטיעה בבני אדם אם הזיהום בפצע אינו נשלט.

הסרת שיער עם תחליב דפילציה הוא צעד חשוב כדי להסיר שיער עודף לאפשר משטח חלקה ונקי עבור הרוטב שקוף לדבוק בחוזקה. תחליב ההסרת החומר המשמש בפרוטוקול זה הוא הליך משתמש כימי עם אלוורה שנוספו לצמצום כוויות. מוצר זה הוא מינימלי לשנות את המבנה של העור, כמו גם שמירה על מיקרובידום העור. המוצר הרשום בטבלה של חומרים מומלץ על פני הסרת שיער מוצרים אחרים, כולל מרכך פיזיים ומכניים (שעוות ומסחרי אפימטורים) שיכול לצרוב עוד יותר ולמשוך על העור ו/או להרוג את העור microbiome. למרות שהסרת החומר הכימי היא עדינה פיזית, היא עדיין יכולה לגרות את העור מעט, השפעה שיכולה לשנות את תהליכי הריפוי של הפצע. לכן, זה היעיל ביותר לחכות 18-24 שעות לפני הניתוח כדי לאפשר לעור להתאושש מההליך ולהבטיח את העור ואת הפצע אינם מושפעים ממנו.

העכברים האלה מאוד צייתנים. ואינם מגיבים לתוקפים קל מאוד לטפל בהם ללא הרדמה. הם רגועים מספיק כדי להניח על כף יד או מעל ספסל מבלי לברוח. אם הבסיס של זנב העכבר מאובטח עם האגודל אצבע שנייה, העכבר לא יוכל לברוח או לחזור לנשוך בשל גודל הבטן הגדולה שלהם. חשוב מכך, בניסיון שלנו, עכברים אלה רגישים מאוד להרדמה, במיוחד כפי שהוא מתייחס לאובדן של הומאוסטזיס. לפיכך, בהתייעצות עם IACUC שלנו, נקבע כי האפשרות הטובה ביותר היא להגביל את מינהל ההרדמה.

המטרה העיקרית של מודל זה היא ליצור פצע בלתי מרפא גדול על גבו, כך שפעם אחת הפצע נעשה, מחזיק עכבר מקובל לעשות זריקות IP של buprenex נוספים או טיפולים כימיים אחרים מעת לעת הוא בלתי אפשרי. החזקת העכבר על ידי העור הגב גורמת לעכבר הרבה אי-נוחות ואולי די כאב אם העכבר מוחזק בצורה כזאת מסורתית; כך, כל הזרקה עם העכבר בצד ימין למעלה בזמן שהוא עומד על כל ארבע הרגליים. ניסויים אחרים ניצול db/db-/- זן להשתמש בעכברים אלה כאשר הם צעירים יותר לא שוקלים כמו הרבה, ולכן הדרך המסורתית של ביצוע הזרקת IP עשוי לשמש. מאז מודל הפצע כרונית מנצל עכברים עד 6 חודשים של גיל ועכברים אלה יכולים לשקול עד 80 g, השיטה המקובלת היא לא אופטימלית והוא יכול פוטנציאלי לפגוע בעכבר. יש לנו שימוש בשיטה שתוארה לעיל עבור עכבר זה מהשמנת יתר לא הבחינו כל התוצאות לוואי כאשר הוזרק עם שיטה זו עם שאיפה מוצלחת.

בעבר, שימשו הרדמה להזרקה כגון קטמין ו-xylazine; עם זאת, הם הוכיחו קשה לשימוש עם db/db/- עכברים. עם זמן פעולה מוחלט של פחות מ 5 דקות, זמן רב השראה התאוששות לא היה צורך למטרות של הניסוי. Isofלאנה היה נחוש להיות הבחירה הטובה ביותר של הרדמה עבור הליך זה בשל קל מינהל, titration, התחלה מהירה והתאוששות, ועומק הרדמה נאותה. כמו כן, isofלאנה גורם דיכאון לב מינימלי ושומר BP מאוד טוב34. אז, שינוי משמעותי בהליך למודל הפצע הכרוני היה להשתמש isofלאנה כמו הרדמה המועדפת.

החימום לפני הניתוח חשוב למניעת תמותה ב2-3 הימים שלאחר הניתוח. עכברים אלה יש להקטין באופן משמעותי את טמפרטורת הגוף ליבה35 והם לא מסוגלים לשלוט בטמפרטורת הגוף הליבה שלהם ביעילות בשל מניפולציה גנטית שלהם, כך מקור חימום חיצוני מסופק לפני הניתוח כדי להגן מפני ה ירידה נוספת בטמפרטורת הגוף הליבה הנגרמת על ידי הרדמה. העריכו את הצורך במשטח חימום לפני, במהלך, ואחרי הניתוח. חשוב לציין כי db/db/- עכברים יש תגובות פיסיולוגיים יוצאי דופן. באופן אמפירי, מצאנו את העכברים האלה כדי להיות מוגנים בצורה היעילה ביותר עם תמיכה בחום טרום וכירורגי. על ידי החלפת isofלאנה כמו הרדמה, אנו מדדו וקבע כי טמפרטורת הגוף הליבה לא ירידה משמעותית במהלך פחות מחמש דקות של ניתוח. בעוד מצאנו את התמיכה מראש לאחר ניתוח חום להיות קריטי עבור עכברים אלה, לא מצאנו תמיכה בחום כירורגי כדי להיות השפעה. יצוין כי הכסא IACUC סיפק הדרכה ופיקוח על המבחנים שלנו הקשורים לטמפרטורה ואפקטים הרדמה. כאשר אנו מתקשרים לשיטה זו, אנו מוצאים שחשוב לציין מה נחוץ להצלחת ההליך.

הגבלה של ניצול שיטה זו לחקר התפתחות ביו, היא העובדה שהחיידקים המצויים על הפצע והפקת החיידק אינם נשלטים. אם החיידק היוצר של הביוilm מסוים הוא ללמוד, מודל זה עשוי להיות שימושי אם ניתן לבטל את microbiome יליד לפני שפצעו או דרך יוד או שיטות חיטוי אחרות. בתגובה רמות מוגזמת של לחץ חמצוני, חיידקים פתוגניים מפתח במיקרובידום העור מגורה ליזום היווצרות ביוilm. בפצעים הכרוניים שלנו, החיידק היוצר של הביוilm כולל, אך אינם מוגבלים, הפסאודומונס aeruginosa36,37,38,39, enterobacter cloacae37, 38 , 39, ושונות סטייהילוקוקוס40,41 ומינים corynebacterium 41,42,43,44, 45, כולם ניתן למצוא פצעים כרוניים אנושית. כמה מחקרים כרוניים מיקרובידום הפצע נערכו על פצעים כרוניים אנושית עבור החיידקים39,40,41,43,44,45 , ופטריות46,47 הקהילה, כולל סקרים האורך הקשורים לריפוי עניים48,49. מחקרים האורך של הטבע הזה יכול להיות גם אחריו עם מודל הפצע כרונית.

חשוב להכיר בכך שתוצאות שונות עשויות להתקבל עקב הבדלים בתנאים vivaria, אספקה וציוד, ספקים ומושבות מקור עבור db/db- עכברים. כדי למזער הבדלים כאלה, שסופקו בפרוטוקול הוא מגוון העכברים המדויק מקור המשמש לניסוי הפצע כרונית. לצורך הטיפול בעכברים אלה, מותגי המצעים והמזון המדויקים סופקו בטבלת החומרים כדי להגביל את השונות. בניסויים שלנו, אנו מוצאים כי לחץ חמצוני גבוה הוא הכרחי ומספיק כדי ליצור פצעים כרוניים בעכברים האלה, כל עוד העכברים שוכנו יבר קונבנציונאלי חשוף חיידקים. אוכלוסיות של חיידקים וקהילות עשויות להיות שונות עם vivaria; עם זאת, כל עוד מתקן נטול חיידקים אינו משמש לבית העכברים, הם צריכים מספיק חיידקים, הן השערות והן פתוגניים, לשכון על השיער והעור.

שיטה זו של יצירת פצעים כרוניים בפרוטוקול זה הוא משמעותי כדי ללמוד פצעים כרוניים וריפוי פצע לקוי, כי רק רמות הלחץ חמצוני משתנים באופן משמעותי. לחץ חמצוני נדרש עבור תהליכים נורמליים ריפוי הפצע2. חשוב עבור רגולציה בזמן ומרכיב מכריע בפונקציונליות של תאים הנחוצים לריפוי הפצע5. עם זאת, כאשר רמות של מתח חמצוני לא נשלט, מינים חמצן מגיב יכול לפגוע בתאי אנדותליה, לעכב את הפונקציונליות keratinocyte, ולעכב את סגירת הפצע2,5. פצעים כרוניים אנושית יש רמות גבוהות של לחץ חמצוני50. מודל העכבר יש גלוקוז בדם גבוה ומוגברת כבר רמות של מתח חמצוני בשל התחלואה שלה. מאפיינים אלה משותפים עם בני אדם החיים עם סוכרת ולספק מיקרוסביבה מסיע כותבי לאחר שקיים פציעה50. בני אדם גם לארח microbiota מגוונת ומורכבת במקומות רבים על הגוף, כולל העור, כך מורכב, אבל טבעי, microbiota מותר לפתח על העור של העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

. למחברים אין תודות

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

רפואה סוגיה 151 פצע ריפוי פצע כרוני ריפוי לקוי כיב ברגל סוכרתית מתח חמצוני ביוilm
פרוטוקול יצירת פצעים כרוניים עכברים סוכרתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter