Summary
慢性創傷は、全厚の皮下創傷の後に高レベルの酸化ストレスを誘発することによって、糖尿病マウスモデルの急性創傷から発症する。創傷は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの阻害剤で治療され、皮膚微生物叢に存在する細菌による治癒およびバイオフィルムの発達を損なう結果生じる。
Abstract
慢性創傷は、適切な治癒に関与する1つ以上の複雑な細胞および分子プロセスにおける不完全な調節の結果として発症する。彼らは約6.5Mの人々に影響を与え、米国だけで〜$40B/年の費用がかかります。ヒトにおける慢性創傷の発症方法を理解するために多大な努力がなされているが、根本的な疑問は未解決のままである。最近では、ヒト慢性創傷の多くの特徴を持つ糖尿病性慢性創傷の新しいマウスモデルを開発した。db/--マウスを用いて、創傷直後に創傷組織に高レベルの酸化ストレス(OS)を誘導し、抗酸化酵素に特異的な阻害剤を用いた1回限りの治療を用いて、慢性創傷を生成することができる。グルタチオンペルオキシダーゼ。これらの創傷は、高レベルのOSを持ち、バイオフィルムを自然に開発し、治療後20日以内に完全に慢性になり、60日以上開いたままにすることができます。この新しいモデルは、ヒトにおける糖尿病性慢性創傷の多くの特徴を有し、したがって、創傷が慢性になる方法の基本的な理解を進めることに大きく貢献できる。これは、ヒトの慢性創傷が患者に重大な痛みや苦痛を引き起こし、未解決の場合は切断をもたらすため、大きなブレークスルーです。さらに、これらの創傷は治療に非常に高価で時間がかかり、患者の個人所得の大幅な損失につながります。私たちの慢性創傷モデルの使用を通じて研究のこの分野の進歩は、この衰弱状態の下で苦しむ何百万人もの医療を大幅に改善することができます。このプロトコルでは、急性創傷を慢性化させる手順を詳細に説明しますが、これはこれまで行われていません。
Introduction
創傷治癒は、時間的および空間的に調節される複雑な細胞および分子プロセスを含み、免疫応答および血管に限定されない多くの異なる細胞タイプを含む多くの異なる細胞タイプを含む連続的かつ重なり合う段階で組織されるシステム1.皮膚が傷害を持続した直後に、因子および血液細胞は創傷部位に凝集し、凝固カスケードを開始して血栓を形成する。恒常性が達成された後、血管は、異物の創傷床をクリアし、プロテオ分解酵素を分泌するために多形態性細胞を化学的に引き付ける創傷部位酸素、栄養素、酵素、抗体および化学的要因に入るように拡張する。2.活性化血小板は、傷部のケラチノサイトを刺激するために様々な成長因子を分泌し、傷部を再上皮化させる。創傷部位に募集された単球は、食細胞細胞細菌と死んだ好中球を循環させるマクロファージに分化し、ケラチノサイト増殖およびプロ渡虫シグナルを維持するための追加因子を分泌する。増殖段階では、再上皮化が続く間、線維芽細胞、単球/マクロファージ、リンパ球、および内皮細胞からなる新しい造粒組織が再建プロセス2を継続する。血管新生は、内皮細胞の増殖および移動を促進することによって刺激され、新しい血管発達をもたらす。細胞外マトリックスの上皮化および改造は、環境に対する障壁を構築する。創傷が治癒し、造粒組織が瘢痕に進化するにつれて、アポトーシスは、追加の組織損傷を引き起こすことなく、炎症細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を排除する。組織の引張強度は、コラーゲンのような細胞外マトリックスの様々な成分を改造する線維芽細胞によって増強され、新たに形成された組織が傷ついていない皮膚2とほぼ同じくらい強く、柔軟であるようにする。
創傷閉鎖に向かうこの高度に協調した進行からの逸脱は、障害および/または慢性創傷3につながる。慢性創傷は、酸化ストレスの増加、慢性炎症、損傷した微小血管系、および創傷4における異常なコラーゲンマトリックスによって特徴付けられる。酸化ストレスは、特に創傷において、創傷閉鎖2、5を遅らせることができる。創傷治癒の第1段階において、炎症期が調節されなくなると、宿主組織は細胞傷害性酵素を放出する炎症細胞5の連続的な流入による広範な損傷を想定し、フリー酸素ラジカルの増加、無秩序な炎症メディエーターは、細胞死6、7をもたらす。
この破壊的な微小環境では、バイオフィルム形成細菌は宿主栄養素を利用し、宿主組織2の損傷に寄与する。これらのバイオフィルムは、タンパク質、DNA、RNA、および多糖類からなる水和された細胞外高分子物質が、従来の抗生物質療法に耐性を有し、回避できるため、制御および除去が困難である。ホストの生来性および適応免疫応答2、8、9。
慢性創傷の研究は、米国だけで年間650万人に影響を与え、年間400億ドルの費用がかかるため、非常に重要です。糖尿病患者は、感染の広がりを抑えるために切断を必要とする慢性創傷を発症するリスクが高まっている。これらの患者は、糖尿病11の病態生理学メカニズムに起因する切断の5年以内に50%の死亡リスクを有する。創傷治癒における宿主の免疫系とマイクロバイオームとの関係は、慢性創傷の結果が未解決の場合、切断および死亡12を含むため、進行中の研究の重要なトピックである。
ヒトにおける慢性創傷がどのように発症するかを理解するために多大な努力がなされているが、慢性創傷がどのように形成されるのか、またその理由は依然として不明である。障害のある治癒のメカニズムを研究する実験はヒトでは行うことが困難であり、創傷治癒の専門家は、すでに数週間から数ヶ月間慢性に達している慢性創傷を有する患者だけを見る。したがって、専門家は、慢性2になるために創傷を開発するために導くプロセスが間違っていたかを研究することができません。ヒトの慢性創傷の複雑さを要約する動物モデルの欠如がある。我々のモデルが開発されるまで、慢性創傷研究のためのモデルは存在しなかった。
慢性創傷モデルは、レプチン受容体(db/db-/--)13に変異を有するマウスで開発された。これらのマウスは肥満、糖尿病、治癒を損なっているが、慢性創傷14を発症しない。血糖値は平均約200 mg/dL, しかし、400 mg/dL15と高くすることができます.創傷組織中の高レベルの酸化ストレス(OS)が創傷直後に誘発されると、創傷は慢性16になる。db//-創傷は20日までに慢性と見なされ、60日以上開いたままである。細菌によって産生されるバイオフィルムは、創傷の3日後に発症するのを見ることができる。成熟したバイオフィルムは、創傷後20日後に見ることができ、どちらかの創傷閉鎖まで持続する。これらのマウスで見つかったバイオフィルム形成細菌は、ヒト糖尿病性慢性創傷にも見られる。
酸化ストレスは、抗酸化酵素、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの2つの阻害剤、過酸化水素を分解する能力を有する2つの酵素で創傷を治療することによって誘導される。過酸化水素は活性酸素種であり、タンパク質、脂質、DNAの酸化を通じて細胞損傷を引き起こす可能性があります。カタラゼは、過酸化水素の分解を有害性の低い化学物質に触媒酸素と水にします。3-アミノ-1,2,4-トリアゾール(ATZ)は、酵素の活性中心に特異的かつ共生的に結合することによってカタラーゼを阻害し、それを不活性化する17、18、19。ATZは、カタラゼ20、21、22、23、24の阻害を通じてインビトロとインビボの両方の酸化ストレスの効果を研究するために使用されています。グルタチオンペルオキシダーゼは、抗酸化剤、グルタチオンを介した過酸化水素の還元を触媒し、酸化ストレスから細胞を保護する重要な酵素である25。メルカプトスチシン酸(MSA)は、チオールと酵素のセレノシステイン活性部位に結合することによりグルタチオンペルオキシダーゼを阻害し、それを不活性化する26。MSAは、インビトロおよびインビボにおける酸化ストレスの影響を研究するために使用されてきただけでなく、20 、27、28.
慢性創傷のこの新しいモデルは、増加したOSからの長期炎症や皮膚微生物叢からの自然なバイオフィルム形成を含む、ヒト糖尿病性慢性創傷で観察される同じ特徴の多くを共有するので、研究する強力なモデルです。創傷は、真皮表皮相互作用、異常なマトリックス沈着、血管新生の不良および血管系の損傷を損なった。慢性創傷は、男性と女性の両方のマウスで発症するので、両方の男女が慢性創傷を研究するために使用することができます。したがって、慢性創傷モデルは、そのような創傷がどのように始まるかの基本的な理解を進めるのに大きく寄与することができる。この慢性創傷モデルを使用すると、創傷治癒障害の生理学と宿主のマイクロバイオームからの寄与を通じて、慢性がどのように開始/達成されるかについての基本的な質問に対する答えを提供できる。
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Protocol
すべての実験は、連邦規制に従って完了し、カリフォルニア大学のポリシーと手順は、カリフォルニア大学リバーサイドIACUCによって承認されています。
1. 動物
- 糖尿病と肥満 B6 を使用します。.慢性創傷モデル用BKS(D)-Leprdb/Jマウス。購入オプションには、繁殖のためのヘテロジゴットまたは実験用のホモ接着物のいずれかが含まれます。
- 子孫を産み出すためにヘテロジゴットの雄と雌を繁殖させる。統計的には、ゴミの四分の一だけが糖尿病と肥満に成長します(db/db-/--)。
- 生後3週間のごみと一緒に、ウィーンとハウスdb/db-/-マウス。生後5週間のごみから別々のdb/db-/-マウスを、生後5~6ヶ月になるまで他のdb/db-/-マウスと共に、慢性創傷モデルに使用することができる。この間、成熟した複雑な皮膚マイクロバイオームが発症する可能性があります。
注:db//--マウスは、生後3~5週間の間のごみから容易に視覚的に同定される。db-/-マウスは肥満であり、糖尿病であり、野生のタイプおよびヘテロジゴウスのリッターメートよりも有意に大きく、丸みを帯びるだろう。彼らの腹部はわずかにピンク色に見え、腰が大きく見えることがあります。増加した体重は、手術前に確認する必要があります。また、血液中の高レベルのグルコースを測定し、マウスを遺伝子型化してレプチン受容体の変異を確認することができる。
2. ビバリウムと畜産
- 従来のビバリウム(バリア/特異的病原体フリー施設ではない)におけるハウスdb/db-/-マウスを、db/db-/-マウスの皮膚上に微生物叢を確立できるようにする。慢性創傷に罹患したヒトを具体的にモデル化するには、病原体への曝露を防ぐために特別な予防措置を講じないようにする。
- バイバリウム内の感染の広がりを最小限に抑えるために、マイクロアイソレータトップでケージを保護します。新しい寝具で週に2回ケージを変更し、定期的なビバリウムチョウでマウスを養います。寝具や食べ物をオートクレーブしないでください。
- 室温を21~24°Cの範囲に設定し、年の時期に応じてわずかな変動を行います。湿度は、気候と場所を反映し、19と70%の間の範囲になります。
3. 慢性創傷の発症要件
- 慢性創傷の発症には、通常肥満、糖尿病、および少なくとも5〜6ヶ月の生後5~6ヶ月の雄マウスと雌マウスのみを使用してください。これらのマウスの重量は40〜80gの間で変化し、平均は約60gである。
- 肥満と見なされるが体重が50g未満のマウスは使用しないでください。
注:このプロトコルで言及されているすべてのマウスは、特に断りのない限り、ここで説明する修飾に合格する。
4. 脱毛ローションの削り方と応用
注:傷つける前に、マウスのドーサム上の不要な髪を取り除きます。以下の手順は、手術前日に麻酔下にない生きたdb/db-/-マウスで行われる。動物にストレスや危害を防ぐための予防措置を取ってください。
- シェービング
- マウスをきれいな面に置き、マウスの尾の付いた部分を親指と 2 本目の指でつかみ、マウスの位置を固定します。マウスがジャンプしたり、突然の動きをする可能性があります。もしそうなら、すぐに反応し、怪我を防ぐためにバリカンを引き戻します。
- ヘアバリカンでマウスの毛を剃ります(図1A,1B)。ブレードをマウスの皮膚に平行に配置し、首から尾まで背中全体を剃り、透明なフィルムドレッシングを配置するのに十分な大きな表面積を可能にします(材料の表を参照)。最も効率的なカットのための髪の成長の方向に対してブレードを軽く実行します。(図1B)。
- ブレードを皮膚に深く押し込まないように、打撲傷や切り傷によって皮膚に損傷を与える可能性があります。
- 脱毛ローションの塗布
注:透明なドレッシングがしっかりと付着できるように、脱毛ローションを使用して非常に滑らかな肌を得ます。- 既に切り取った髪を皮膚に濡らすのに十分な圧力で、濡れた紙の拭き取りを軽く押し付け、化学的な火傷を防ぐために、マウスの皮膚を水で浸します。
- 皮膚が濡れながら、15-20s(図1C、1D)の脱毛ローションの小さな人形でマウスの皮膚を軽くこする(材料の表を参照)。髪が短く切られたところはどこでもローションを完全に広げなさい。マウスが大きい場合は、より多くのローションを使用してください。
- マウス、尾、または顔の近くの場所にローションを適用しないでください。ローションが耳や尾に付着した場合は、すすくなるまで濡れた紙で拭くだけで拭きます。ローションがマウスの顔に当たったら、直ちに蛇口や脱イオン水の下でマウスを洗い、目、鼻、口の損傷を防ぎます。
- 塗布後、追加の20-45sのために髪と反応する化物を残します。
- すすい前に、手袋をした指や薄い金属のへらで、様々な場所(図1E)で皮膚からローションを軽く拭き取り、脱毛反応の完了を確認してください。黒髪の存在なしに皮膚がピンクの場合、反応は完了します。早すぎるよりすすいでから、もう一度ローションを塗るよりも、髪が実際に取り除かれたことを素早く確認することをお楽しみください。
- 洗浄
注:脱毛反応の完了が確認されたら、マウスをランニングタップまたは脱イオン水で洗い、脱毛ローションを除去し、化学的な火傷を防ぎます。- マウスを左手袋の手に置き、左手の親指で尻尾のベースを押して、マウスが動き回らないようにします。マウスが噛み付かないように、左指の残りの部分を閉じてまっすぐにします。
- 顔/頭の領域が水の流れから離れ、ぬるま湯の流れが頭の後ろにあり、背中にのみ落ちるようにマウスを配置します。素早く、しかし穏やかに右手袋の手でマウスの背中をこすり、ローションを洗い流します。
- マウスの皮膚にローションが無くなったら、ペーパータオルで素早く拭き取り、水の大部分を吸収します(図1F)。
- シェービングや脱毛後のお手入れ
- 濡れた紙拭きで耳と尾に残る残留脱毛ローションを確認し、清掃してください。
- マウスを個々のケージに戻し、ケージを加熱パッド(40~45°C)に約30分間置きます。マウスは通常の動作に戻り、数分以内にその動作に戻り、周りを走り回り、グルーミングを行う必要があります。
- 実験の期間中、各マウスを別々のケージに入れておきます。マウスの皮膚はもはや保護されず、他のマウスによって容易に引っ掻かれたり噛まれたりすることができる。
- 脱毛ローションは、創傷治癒プロセスを妨げたり変更したりするわずかな刺激効果を有する可能性があるため、手術前に18〜24時間待って、マウスの皮膚が落ち着き、マウスが背中の毛の欠如に適応できるようにします。
- 暗い色素沈着で皮膚から髪を取り除く
注:一部のdb/db-/-マウスは、これらのパッチなしで皮膚よりも速く、より強く成長する髪を持つ皮膚に暗いパッチを持つ可能性があります。(図2A)。皮膚のこれらの暗い領域は、中間後期アナゲン段階の毛包および/または色素失禁29、30のために色が暗く見える。- 暗いパッチが気付いた場合は、再び脱毛ローションを適用しますが、これらの領域でのみ、ステップ4.2と4.3(図2B、2C)を繰り返します。
注:皮膚の暗い斑点は、実験の期間を通じてより速く髪を成長させるので、必要に応じて、3〜5日ごとに短い髪をクリップします。創傷の所望の位置からパッチまたは2つ離れて許容される。マウスの背面がこれらの暗いパッチで有意に覆われている場合は、慢性創傷モデルにこのマウスを使用しないでください。
- 暗いパッチが気付いた場合は、再び脱毛ローションを適用しますが、これらの領域でのみ、ステップ4.2と4.3(図2B、2C)を繰り返します。
5. 試薬のセットアップ
注:db//-マウスにおける慢性創傷の発症は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ、3-アミノ-1、2、4-トリアゾール(ATZ)およびメルカプトスチシン酸(MSA)に対する特異的阻害剤による治療によって、それぞれ16.以下の手順では、マウスの重量に基づいて鎮鎮薬および阻害剤の投与量および投与を詳細に示す。
- 無菌PBSに0.05mg/kgマウスで痛み止めブプレネックスを腹腔内に注入する。手術前に60gマウスに120μLの体積を約30分間注入する。手術後6時間の別の用量を投与する。必要に応じて余分な用量を与えてもよい。
- 無菌PBSに1g/kgマウスでATZを食後に注入する。手術前に60gマウスに480 μLの体積を約20分間注入します。腹部の左側に体積の半分を注入し、右側に残りの半分を注入します。
- MSAを無菌PBSで150mg/kgマウスで透明なドレッシングと創傷組織との間の創傷に多発的に堆積させる。手術後10分以内に60gマウスに対して60μLの体積を投与する。
6. 手術
注:慢性創傷モデルの成功は非滅菌条件に依存する。これらのマウスは無菌ではなく、従来のビバリウムに収容される。皮膚に存在する細菌マイクロバイオームは、抗酸化酵素の阻害剤による治療時の慢性創傷のその後の開始および発症に重要である。したがって、サイトの従来の外科的前調製は、逆示される。
- 米皮注射
- ケージラックの傾斜部分にマウスを固定し、マウスの本体よりも頭を低くして快適に立って、尾を保持します。これにより、内臓を可能な限り注射点から遠ざけようとします。
- 膀胱や他の腹部器官への注射を避けるために、腹部の右下の象限に針を挿入します。
- 注射の前に針を吸引する。
- 治療と麻酔
- ステップ5.1および5.2に記載されているように、手術前にBuprenex 30分とATZ 20分を投与する。
- 図 3Aに示すように、暖かい加熱パッドの上に小さなプラスチック製の容器にマウスを置き、約 15 ~ 20 分間、手順の前に熱サポートを提供すると、潜在的な死亡率を防ぎます。
- 小さな容器の上に紙拭き取りタオルまたはペーパータオルを置き、熱を抑えます。マウスは暖かくなるにつれて落ち着くはずです。図 3Bは手術に必要な材料を示す。
- 開いたシステムを使用する場合は、化学フードのイソファリン気化器に接続されている密閉容器にマウスを置きます。
- オープンシステムでは、2-3.5 L/minの流量で1〜2分間5%のイソファランを投与し、マウスの状態を継続的に監視します。
- マウスが意識不明または動かなくなったら、白い外科用パッドにマウスを置き、手術中にアイソフランの連続投与を可能にするために気化器に固定された鼻コーンで頭部をフィットさせます。
- オープンシステムでは、手術中に同じ流量で2〜3%のイソファランを投与し、麻酔の深さを維持するためにイソファルランの流れに適応する。
- 手術中に投与されたイソファランの濃度と持続時間の両方を最小限に抑える。db/db-/-マウスは麻酔に非常に敏感なので、イソフラン暴露を最小限に抑えるのが最善です。マウスが5%のイソファランで2分後にまだ応答している場合は、鼻コーンを確保し、手術を開始する前に15〜30sの3-5%のイソファランを投与する。
- 傷つける前に適切な麻酔を確認してください。麻酔の深さは、強いつま先のピンチなどの物理的な刺激に対する応答の欠如によって確認される。吸入麻酔下のマウスの時間の長さは5分以下なので、目には獣医のチントは適用されません。
- 負傷
- 70%のエタノールまたは臨床エタノールタオルで紙拭き取りをスプレーし、傷部位の領域をきれいにするためにマウスの背面を拭きます。透明なドレッシングがしっかりと付着できるように肌の表面をきれいにし、寝具、食べ物、皮膚からのほこりがきちんと付着するのを防ぐことができます(図4A)。過度に拭かないようにするか、皮膚に存在する細菌を殺す危険性があります。
- 創傷部位の位置を決定する。創傷を行う最良の場所は、マウスの後部側にあり、より高い色素沈着を持つ皮膚のパッチから中心に離れている。
注:我々は、これらのマウスは、1つの創傷の負担に耐えることができる経験によって決定しました。 - 7 mmの皮膚生検パンチ、ピンセットおよび外科はさみを使用して30-45 sの内の傷を作成する。生検パンチを所望の創傷部位に軽く押し付け、パンチのわずかな印象を残すのに十分な深さの周りにパンチをねじります(図4B)。ピンセットでパンチの中心を引き上げ、外科はさみで輪郭を切ることによって輪郭を描く皮膚を切除する(図4C-4E)。
- 透明フィルムドレッシング(6 cm x 3.5 cm)の半分で傷をしっかりと覆います。
- マウスに対する2%のイソファランの投与を停止する(図4F)。
7. 手術後の治療と回復
- 手術後のMSA治療を管理し、ステップ5.3に記載されているように透明なドレッシングが適用されます。MSAをドレッシングの下の創傷部に堆積させる。
- 回復に役立つ30分間、加熱パッドの小さな容器にマウスを戻します。マウスがウォームアップしたら、マウスをケージに戻します。イソファランの効果は一時的であり、マウスはまもなく動き回るはずです。
- マウスが胸骨の回復を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置したり、ビバリウムに戻したりしないでください。
注:これらのマウスで作業する場合の選択の麻酔は、その迅速な誘導およびその後の麻酔からの出現のために正確にイソファランである。- 別のマウスの慢性創傷を妨害する1匹のマウスを避けるために個別に手術を受けた家のマウス。前述のように、それらは完全に回復するまでビバリウムに戻らない。
- 手術後6時間のブプレネックスの2回目の用量を投与する。
- 手術後の最初の48時間はマウスを注意深く観察してください。
注:手術は、慢性創傷を作成するための阻害剤と相まって、すでに糖尿病と肥満の両方である動物に非常にストレスです。手術後の最初の数日を生き残るマウスは、通常、実験の持続時間を生き残ります。
8. データ収集、生存戦略、傷後のマウスの取り扱い、その他のヒント
- データ収集
- 手術直後に早く写真を撮る。バイオフィルムは、創傷後5〜10日の間、および早くも3日の間にどこでも観察される。
- 細菌が分析の焦点である場合は、10-15 s. 綿棒を保存するための適切な冷凍庫媒体に、培養に依存しないシーケンシング分析のための培養または乾燥のための適切な冷凍庫媒体に、-80 °Cで、創傷の周りの軽い圧力で無菌スワップをロールします。無菌金属へらを介して細胞外高分子物質をマイクロ遠心管に集め、分析前に-80°Cで保存します。
- バイオフィルムの収集や撮影の取り扱い中にマウスに麻酔を投与しないでください。これらの手順の間に、マウスを落ち着かせ、それが逃げるのを防ぐために、マウスの前に食べ物の一部を置きます。ほとんどのマウスは食べ物の上に登り、その上に座り、動かない。
- マウスが適切に動いていない場合や、ドレッシングが正しく適用されていない場合は、二次感染や意図しない慢性創傷や潰瘍が発症する可能性があるので、定期的にマウスと腹部側の活動をチェックして傷がないか確認してください。皮膚と濡れ寝具(db/db-/-マウスは多尿)との間の摩擦は、ケージが頻繁に変更されない場合、皮膚を乱す可能性があります。
注:ドレッシングの下の流体の蓄積は、接着剤が粘着性を失い、液体が漏れることを可能にする可能性があります。死んだ皮膚細胞、寝具、および大腿骨物質は、皮膚に固執し、硬化することができます。これらの乾燥したパッチと皮膚の凝集体は、二次感染を防ぐために速やかにクリアする必要があります。 - マウスが後ろ足で立ったり座ったりする場合は、これらのマウスをケージに移動し、食物と水へのアクセスがはるかに低くなります。ケージ内の食べ物と水の位置が高い場合、マウスは後ろ足で立ったり座って到達したりすることがあります。ほとんどのマウスは、手術前に飲むのに問題はありませんが、一部のマウスが背中にひっくり返る可能性があります。これらの「フリッパー」は、彼らが支援とさらなる監視を必要とするので、ひっくり返すのに大きな困難を持っているかもしれません。
- 皮膚が破片、フレーク状の皮膚および髪の毛がはっきりしている場合は、皮膚に透明なドレッシングを最大20日間放置します。皮膚にこれらのいずれかが発生した場合は、古いドレッシングを削除し、新しい作品を適用します。
- ドレッシングを脱ぐには、頭の後ろの皮膚を軽くつまみ、ドレッシングを頭から引き離します。
- ドレッシングをしっかりと置くために、マウスをできるだけ静かに保つ。皮膚が清潔で、フレーク状の死んだ皮膚細胞、寝具からのほこり、および食べ物の断片から自由であることが重要です。ドレッシングを入れて、傷の周りの皮膚に入れて固定します。
- マウスの前に食べ物を置いて動きを制限しない場合は、ワイヤーケージの上にマウスを置きます。マウスがケージのレールをつかんだら、尾をできるだけ体に近づけ、最小限の力で引っ張ります。マウスが前方に引くと、背中が伸びてまっすぐにして簡単に塗布できます。この時点でドレッシングをしっかりと置きます。
- 古いドレッシングを再利用しないでください。常に最大の接着のために背中に新しいドレッシングを適用します。
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Representative Results
図5は、創傷閉鎖に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷および慢性に向かって進行する阻害剤の治療を伴う創傷の例を示す。透明なドレッシングは、バイオフィルムと流体の蓄積が見られるように、慢性創傷に所定の位置に残されています。
慢性創傷開始は6時間未満で行われ、創傷マージンは酸化ストレスから目に見えて変化する。この創傷マージンの組織学的証拠は、組織が壊死であり、創傷治癒に関与しないことを明らかにする。創傷中のバイオフィルム形成細菌は、後でこの壊死組織を栄養素および構造成分の供給源として使用してバイオフィルムを製造することができる。慢性創傷は、最初の創傷と比較して拡大されたままの創傷であり、バイオフィルム(EPS+ヒト慢性創傷に見られる病原性細菌)を含み、予防するバイオフィルムの量と含有量に応じて治癒するのに1ヶ月または数年かかる。正常に解決する傷。慢性創傷モデルでは、阻害剤で治療されていない創傷は、この時間までに閉じるので、完全な慢性は手術後20日に設定されます(図5)。治癒には通常60日かかり、時間は創傷に存在する原発性病原性細菌に依存する。シュードモナスのようなより積極的なバイオフィルム形成細菌が創傷に優勢な場合、マウスは感染に屈することがある。したがって、慢性創傷は、20日以内に閉じない創傷として定義され、治癒に60日以上かかり、創傷にバイオフィルムが存在する。
性差は、db/db-/-マウスモデル32、33を含む様々な糖尿病モデルで発見されている。このような違いが存在する一方で、我々は、慢性創傷の発症において重要な要因ではないことを性を観察した。雄マウスと雌マウスの慢性創傷は同様の程度に発症するので、両方の性別を使用して慢性創傷を研究することができます。したがって、このモデルを利用することは、ヒトの慢性創傷が男性および女性の糖尿病患者の両方で見出すことができるので有利である。
図 1.シェービングと脱毛プロセス。(A)剃る前のマウス。(B)マウスの皮膚は、背中の毛のほとんどを取り除くために剃る。(C)指先の脱毛ローションの人形。マウスが大きい場合は、より多くが使用されます。(D)マウスの背面は脱毛ローションで覆われ、反応するために左に置きます。(E)へらは、髪が取り除かれたかどうかを確認するために、ローションの一部を掻き取るために使用されます。髪の毛の存在のない明るいピンクの肌は、脱毛が完了していることを示しています。(F)裏のローションは流水で取り除きます。マウスの皮膚はわずかにピンク色にする必要があります。この図は、キムとマーティンスグリーン31から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.暗い肌の小さなパッチから髪を削除します。(A)マウスは既に一度治療を受けており、火傷を防ぐために皮膚が再び濡れるとき。(B)脱毛ローションは、暗く、髪の毛が密な皮膚のパッチにのみ適用されます。(C)ローションは反応後に洗い流され、毛のない皮膚の暗い斑を明らかにする。この図は、キムとマーティンスグリーン31から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.手術前のセットアップ。(A)傷を負うマウスは、加熱パッドの上に小さなプラスチック容器に入れられる。(B)手術に使用する材料の一部を示す。外科的はさみは、切られたときに皮膚が押しつぶされないようにするために鋭くする必要があります。透明なドレッシングを半分にカットします。この図は、キムとマーティンスグリーン31から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.切除傷を作る(A)マウスが麻酔下にある後、マウスの背中を70%のエタノールで一度拭く。(B)皮膚生検パンチは、マウスの背面に置かれ、印象を残すのに十分強く押されます。生検パンチは浅い切開を作るために回転させることができる。(C)輪郭を描いた領域の中央はピンセットでつままれ、鋭い外科はさみを使って初期切開を行う。(D)外科用はさみは、生検パンチによって作られた輪郭に沿って切断するために操縦される。(E)生検ポンプによって概説された皮膚の領域が正常に取り除かれた。(F)透明なドレッシングはマウスの背面に配置され、固定されています。この図は、キムとマーティンスグリーン31から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.傷の写真(A)手術当日から慢性に進行する手術後、マウスの創傷が連続して起き上がった。バイオフィルムは、5日目の早い時期に見ることができ、早ければ3日目に検出される。創傷は20日目に強いバイオフィルムと完全に慢性である。(B)ヒト慢性創傷、特に糖尿病性足潰瘍の例。この図は、キムとマーティンスグリーン31から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウスに慢性創傷が作成されると、このモデルは、慢性の開始に関与する創傷治癒過程の障害を研究するために使用することができる。このモデルはまた、慢性創傷の発達を逆転させ、治癒を損ない、創傷の閉鎖および治癒につながる広範囲の化学物質および薬物の有効性をテストするために使用することができる。慢性の発症後の異なる時間ポイントを研究することができます:例えば、慢性の早期発症のために創傷後1〜5日、および完全な強さの慢性創傷のために20日以降。
慢性創傷モデルはまた、創傷治癒および生体負担および液位症などの合併症の様々な側面を研究するための強力なモデルである。バイオ負担は、人間の慢性創傷にも影響を与えるため、このモデルで研究できる慢性創傷の多くの面の1つに過ぎません。当社の手順と動物使用プロトコルは、定義されたモニタリングスケジュールと共に、監視する症状を明確に識別します。IACUC承認基準に基づいて罹患死と同定された動物は、重大な苦しみを避けるために安楽死させる。また、特定の症状が発生した場合には、キャンパス獣医と動物衛生技術者に相談し、基準の評価に関する支援的なガイダンスを提供します。
プロトコル内の重要なステップには、従来のビバリウムにdb/db-/-マウスを収容し、脱毛ローションで毛髪を除去し、イソファラン投与前に加熱することが含まれる。慢性創傷モデルにおける慢性創傷の発症は、非滅菌状態および慣行に依存する。これらのマウスは無菌ではなく、非常にきれいなビバリウムでは成長しません。皮膚に存在する微生物叢は、抗酸化酵素の阻害剤による治療時の慢性創傷のその後の開始および発症に重要である。これらのdb/db-/-マウスは、共生および病原性の両方の細菌を含む環境にさらされなければならない。皮膚を「殺菌」するために、手術前にヨウ素またはその他の消毒方法で皮膚を洗浄し、感染解除した場合、創傷は慢性にならないことがある。皮膚マイクロバイオーム中の細菌は、バイオフィルムの形成および発達に必要であり、治癒および創傷閉鎖を遅らせる。診療所では、創傷中のバイオフィルムの存在は、創傷治癒プロセスをさらに複雑にし、創傷の感染が制御されない場合、ヒトにおける切断のリスクを増加させる。
脱毛ローションで髪を取り除くことは、余分な髪を取り除き、透明なドレッシングがしっかりと付着するための滑らかで清潔な表面を可能にする重要なステップです。このプロトコルで使用される脱毛ローションは、火傷を最小限に抑えるためのアロエを添加した化学脱毛剤である。この製品は、皮膚の形態を変更するだけでなく、皮膚のマイクロバイオームを維持する最小限です。材料の表に記載されている製品は、皮膚をさらに燃焼し、引っ張ったり、皮膚のマイクロバイオームを殺すことができる物理的および機械的脱毛剤(ワックスおよび市販のエピレータ)を含む他の毛髪除去製品よりも推奨されます。この化学脱毛は物理的に穏やかであるにもかかわらず、それはまだわずかに皮膚を刺激することができ、創傷治癒プロセスを変更する可能性のある効果。したがって、皮膚が処置から回復し、皮膚および創傷がそれによって影響を受けないようにするために、手術の18-24時間前に待つのが最も効果的である。
これらのマウスは非常におとなしく、ストレスに反応しない。彼らは麻酔なしで扱うのは非常に簡単です。彼らは逃げずに手のひらやベンチの上に置くのに十分な穏やかです。マウスの尾の付け根を親指と2本目の指で固定すると、大きな腹の大きさでマウスが逃げたり、噛み付いたりできなくなります。重要なことに、私たちの経験では、これらのマウスは麻酔に非常に敏感であり、特に恒常性の喪失に関連する。したがって、我々のIACUCと協議して、より良い選択肢は麻酔投与を制限することに決定した。
このモデルの主な目的は、背中に大きな治癒のない創傷を作成することですので、創傷が作られたら、従来マウスを保持して、追加のブプレネックスまたは他の化学的処理のIP注射を定期的に行うことは不可能です。後部皮膚でマウスを保持すると、マウスがそのような伝統的な方法で保持されている場合、多くの不快感と非常に可能性のある痛みを引き起こします。したがって、マウスを右上に持つすべての注射は、4 フィートすべてに立っている間に行います。db//-株を利用した他の実験は、これらのマウスが若く、重さがあまりない場合に使用するため、IPインジェクションを行う従来の方法を使用する場合があります。慢性創傷モデルは生後6ヶ月までのマウスを利用し、これらのマウスは80gまでの重量を量ることができるので、従来の方法は最適ではなく、潜在的にマウスを傷つける可能性があります。我々は、この肥満のマウスのために上記の方法を利用しており、成功した吸引でこの方法を注入した場合、任意の有害な結果を観察していません.
以前は、ケタミンやキシラジンなどの注射麻酔が用いられた。しかし、db/db-/-マウスでは使用が困難であることが判明しました。総動作時間が5分未満の場合、実験の目的に長い誘導と回収時間は必要なかった。イソファランは、容易な投与および滴定、急速な発症および回復、および十分な麻酔深さのために、この処置のための麻酔のよりよい選択であると判断された。また、イソフランは最小限の心臓うつ病を引き起こし、BPを非常によく維持します 34.したがって、慢性創傷モデルの手順における大きな変化は、好ましい麻酔としてイソフルランを使用することにした。
手術前の加熱は、手術後2~3日で死亡を予防するために重要です。これらのマウスは、コア体温が著しく低く、遺伝子操作によりコア体温を効果的に制御できないため、手術前に外部加熱源を設け、保護する。麻酔によって誘発されるコア体温の追加の低下。手術前、手術中、手術後の加熱パッドの必要性を評価しました。db-/-マウスは異常な生理的応答を有することに注意することが重要です。経験的に、これらのマウスは、手術前および手術後の熱サポートによって最も効果的に保護されていることがわかった。イソファランを麻酔薬に置き換えることで、5分未満の手術でコア体温が有意に低下しないことを測定し、判断した。これらのマウスにとって外科的および後の熱サポートが重要であることが分かりましたが、外科的熱支持が効果を発揮することは見出されていません。IACUCの椅子は指導を提供し、温度および麻酔効果に関連する私たちのテストを監視することに留意すべきである。この方法を通信するうえで、手順の成功に必要なものを示す必要があることがわかります。
バイオフィルムの開発を研究するためにこの方法を利用する限界は、創傷に存在する細菌が制御されていないという事実である。特定のバイオフィルム形成細菌を研究する場合、このモデルは、ヨウ素または他の消毒方法を介して創傷する前に天然のマイクロバイオームを廃止することができる場合に有用でありうる。酸化ストレスの過剰なレベルに応答して、皮膚微生物叢の主要な病原性細菌は、バイオフィルム形成を開始するために刺激される。当社の慢性創傷において、バイオフィルム形成細菌は、これらに限定されないが、シュードモナス・エルギノーサ36、37、38、39、エンテロバクター・クローカエ37、38歳,39、および様々なブドウ球菌40、41およびコリネバクテリウム種41、42、43、44、45は、そのすべてがヒトの慢性創傷で見つけることができる。いくつかの慢性創傷マイクロバイオーム研究は、細菌39、40、41、43、44、45のヒト慢性創傷に対して行われている。、および真菌46、47コミュニティ、貧しい治癒に関連する縦方向の調査を含む48、49。この性質の縦方向の研究はまた、慢性創傷モデルを通して続けることができます。
db//-マウスのビバリア条件、供給、機器、ベンダー、およびソースコロニーの違いにより、異なる結果が得られる可能性があることを認識することが重要です。このような違いを最小限に抑えるために、プロトコルに提供される、慢性創傷実験に使用される正確なマウスの多様性および供給源である。これらのマウスの飼育については、変動を制限するために、正確な寝具と食品ブランドが材料の表に提供されています。我々の実験では、マウスが従来のビバリウムに収容され、細菌にさらされる限り、これらのマウスに慢性創傷を作り出すのに高い酸化ストレスが必要であり、十分であることがわかった。細菌の集団とコミュニティは、ビバリアと異なる場合があります。しかし、無菌の施設がマウスを収容するために使用されない限り、彼らは毛髪と皮膚に存在するのに十分な細菌(共生および病原性の両方)を持っている必要があります。
このプロトコルで慢性創傷を作成するこの方法は、酸化ストレスレベルのみが実験的に有意に変化するため、慢性創傷および創傷治癒障害を研究するために重要である。酸化ストレスは、正常な創傷治癒プロセス2に必要である。創傷治癒に必要な細胞の機能性において、タイムリーな調節および重要な成分5のために重要である。しかしながら、酸化ストレスのレベルが制御されない場合、活性酸素種は内皮細胞に損傷を与え、ケラチノサイト機能を阻害し、創傷閉鎖2、5を遅延させる。ヒト慢性創傷は、酸化ストレスの高レベル50を有する。マウスモデルは、高血糖値を有し、すでにその罹患率による酸化ストレスのレベルを増加させる。これらの特性は、糖尿病と共に生活するヒトと共有され、傷害50を維持した後の慢性化を助長する微小環境を提供する。ヒトはまた、皮膚を含む身体の多くの場所で多様で複雑な微生物叢をホストするので、複雑であるが、自然な、微生物叢は、マウスの皮膚上で開発することが許可されている。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
著者は謝辞を持っていません。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
70% ethanol | |||
Kimwipes | |||
Tweezers | |||
Sharp surgical scissors | |||
Thin metal spatula | |||
Tubing | |||
Mouse nose cone | |||
Gloves | |||
small plastic containers |
References
- Singer, A. J., Clark, R. A. F.
Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999). - Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
- MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
- Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
- Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
- Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
- Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
- Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P.
Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005). - Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
- James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
- Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
- Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
- Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
- Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
- Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
- Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
- Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
- Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
- Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
- Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
- Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
- Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
- Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
- Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
- Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
- Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
- Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
- Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
- Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
- Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
- Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
- Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
- Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
- Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
- Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
- Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
- Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
- Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
- Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
- Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
- Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).