Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Protokoll for å skape kroniske sår i diabetiker mus

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Kroniske sår er utviklet fra akutte sår på en diabetiker musemodell ved å indusere høye nivåer av oksidativt stress etter en full-tykkelse hud såret. Såret er behandlet med hemmere for catalase og glutation peroksidase, noe som resulterer i nedsatt healing og biofilm utvikling av bakterier tilstede i huden mikrobiomet.

Abstract

Kroniske sår utvikles som følge av defekt regulering i en eller flere komplekse cellulære og molekylære prosesser som er involvert i riktig helbredelse. De påvirker ~ 6,5 M mennesker og koster ~ $40B/Year i USA alene. Selv om en betydelig innsats har blitt investert i å forstå hvordan kroniske sår utvikles hos mennesker, forblir fundamentale spørsmål ubesvart. Nylig har vi utviklet en roman mus modell for diabetiker kroniske sår som har mange egenskaper av menneskelige kroniske sår. Ved hjelp av DB/DB-/- mus, kan vi generere kroniske sår ved å indusere høye nivåer av oksidativt stress (OS) i sår vevet umiddelbart etter såret, ved hjelp av en en gangs behandling med hemmere som er spesifikke for antioksidant enzymer catalase og glutation peroksidase. Disse sårene har høye nivåer av OS, utvikle biofilm naturlig, bli fullt kronisk innen 20 dager etter behandling og kan forbli åpen mer i mer enn 60 dager. Denne romanen modellen har mange funksjoner av diabetiker kroniske sår hos mennesker og derfor kan bidra betydelig til å fremme grunnleggende forståelse av hvordan sårene blir kroniske. Dette er et stort gjennombrudd fordi kroniske sår hos mennesker forårsaker betydelig smerte og nød til pasienter og føre til amputasjon hvis uløst. Videre disse sårene er svært kostbart og tidkrevende å behandle, og føre til betydelig tap av personlig inntekt til pasienter. Fremskritt i dette feltet av studien gjennom bruk av våre kroniske sår modellen kan betydelig bedre helsetjenester for millioner som lider under denne ødeleggende tilstand. I denne protokollen, beskriver vi i stor detalj prosedyren for å forårsake akutte sår å bli kronisk, som ikke har blitt gjort før.

Introduction

Sår helbredelse innebærer komplekse cellulære og molekylære prosesser som er timelig og romlig regulert, organisert i sekvensiell og overlappende stadier som involverer mange forskjellige celletyper, inkludert men ikke begrenset til immunresponsen og den vaskulære system1. Umiddelbart etter at huden opprettholder en skade, faktorer og blodceller samlet til såret området og starte den blødnings Cascade å danne en blodpropp. Etter homeostase oppnås, blodkarene dilate å slippe inn i såret området oksygen, næringsstoffer, enzymer, antistoffer og chemotactic faktorer som chemoattract polymorphonucleocytes å fjerne såret seng av fremmede rusk og skiller proteolytiske enzymer 2. aktiverte blodplater skiller ut en rekke vekstfaktorer for å stimulere keratinocytter ved sårkanten for å re-epithelialize det sårede området. Monocytter rekruttert til såret stedet differensiere til makrofager som fagocyttere bakterier og døde nøytrofile og skiller flere faktorer for å opprettholde Keratinocyte proliferativ og Pro-trekk signaler. I sprednings fasen, mens re-epithelialization fortsetter, ny granulering vev sammensatt av fibroblaster, monocytter/makrofager, lymfocytter, og endothelial celler fortsette gjenoppbyggingen prosessen2. Angiogenese stimuleres ved å fremme endothelial celle spredning og migrasjon, noe som resulterer i ny fartøy utvikling. Epithelialization og ombygging av ekstracellulære matrise konstruere en barriere mot miljøet. Som såret helbreder og granulering vev utvikler seg til et arr, apoptose eliminerer inflammatoriske celler, fibroblaster, og endothelial celler uten å forårsake ytterligere vevsskade. Strekk styrken av vevet forsterkes av fibroblaster remodeling ulike komponenter av ekstracellulære matrise, som kollagen, slik at den nyopprettede vevet er nesten like sterk og fleksibel som unwounded hud2.

Eventuelle avvik fra denne svært samordnet progresjon mot sår lukking fører til nedsatt og/eller kroniske sår3. Kroniske sår er karakterisert ved økt oksidativt stress, kronisk betennelse, skadet microvasculature, og unormal kollagen matrise i såret4. Oksidativt stress, spesielt i såret, kan forsinke sår lukking2,5. Når, i den første fasen av såret healing, den inflammatoriske fase blir uregulert, forutsetter verten vev omfattende skader på grunn av en kontinuerlig tilstrømning av inflammatoriske celler5 som slipper cytotoksisk enzymer, en økning i frie oksygen radikaler, og uregulert inflammatoriske meglere, noe som resulterer i celle død6,7.

I denne destruktive mikromiljøet, biofilm-forming bakterier dra nytte av vert næringsstoffer og bidra til skaden av verten tissue2. Disse biofilm er vanskelige å kontrollere og fjerne fordi hydrert ekstracellulære polymer stoffer bestående av proteiner, DNA, RNA, og polysakkarider gjør at bakterier næret innen å være tolerant for konvensjonell antibiotika behandling og unngå vertens medfødte og adaptive immunrespons2,8,9.

Studere kroniske sår er avgjørende fordi de påvirker ~ 6 500 000 mennesker og koster ~ $40 000 000 000 per år i USA alene10. Pasienter med diabetes har økt risiko for å utvikle kroniske sår som krever amputasjon for å inneholde spredning av smitte. Disse pasientene har en 50% dødelighet risiko innen 5 år av amputasjon som er tilskrevet den patofysiologi mekanismen for diabetes11. Forholdet mellom vertens immunsystem og mikrobiomet i såret healing er et viktig tema for pågående forskning fordi konsekvensene av kroniske sår, hvis uløst, inkluderer amputasjon og død12.

Selv om en betydelig innsats har vært investert i å forstå hvordan kroniske sår utvikle seg hos mennesker, er det fortsatt uklart hvordan og hvorfor kroniske sår form. Eksperimenter for å studere mekanismer for nedsatt helbredelse er vanskelig å utføre i mennesker, og sår healing spesialister bare se pasienter med kroniske sår som allerede har nådd kronisitet i uker til måneder. Dermed spesialister er ikke i stand til å studere hvilke prosesser gikk galt som fører til at såret til å utvikle seg til å bli kronisk2. Det er en mangel på dyremodeller som recapitulate kompleksiteten av menneskelige kroniske sår. Inntil vår modell ble utviklet, fantes ingen modell for kroniske sår studier.

Den kroniske sår modellen ble utviklet i mus som har en mutasjon i leptin reseptor (DB/DB-/-)13. Disse musene er overvektige, diabetiker, og har nedsatt helbredelse, men ikke utvikle kroniske sår14. Blodsukkernivået gjennomsnittlig rundt 200 mg/dL, men kan være så høyt som 400 mg/dL15. Når høye nivåer av oksidativt stress (OS) i sår vevet blir indusert umiddelbart etter såret, blir såret kronisk16. DB/DB-/- sår anses kronisk av 20 dager og forblir åpen for 60 dager eller mer. Biofilm produsert av bakterier kan sees utvikle begynnelsen tre dager etter såret; en moden biofilm kan sees 20 dager etter såret og vedvarer til enten såret nedleggelse. Den biofilm bakterier vi finner i disse musene er også funnet i Human diabetiker kroniske sår.

Oksidativt stress er indusert ved å behandle sårene med to hemmere av antioksidant enzymer, catalase og glutation peroksidase, to enzymer med kapasitet til å bryte ned hydrogen peroxide. Hydrogenperoksid er en reaktiv oksygen arter og kan forårsake cellulær skade gjennom oksidasjon av proteiner, lipider og DNA. Catalase katalyserer nedbryting av hydrogen peroxide i mindre skadelige kjemikalier oksygen og vann. 3-amino-1, 2, 4-for (ATZ) hemmer catalase ved binding spesielt og covalently til det aktive sentrum av enzymet, inaktivere det17,18,19. ATZ har blitt brukt til å studere virkningene av oksidativt stress både in vitro og in vivo gjennom hemming av catalase20,21,22,23,24. Glutation peroksidase katalyserer reduksjon av hydrogen peroxide gjennom antioksidant, glutation, og er et viktig enzym som beskytter cellen mot oksidativt stress25. Mercaptosuccinic acid (MSA) hemmer glutation peroksidase ved binding til selenocysteine aktive området av enzymet med tiolderivat, inaktivere det26. MSA har blitt brukt til å studere virkningene av oksidativt stress in vitro og in vivo samt20,27,28.

Denne romanen modell av kroniske sår er en kraftig modell for å studere fordi den deler mange av de samme funksjonene observert i humant diabetiker kroniske sår, inkludert langvarig betennelse fra økt OS og naturlig biofilm dannelse fra huden mikrobiomet. Sårene har nedsatt dermal-epidermal interaksjon, unormal matrise deponering, dårlig angiogenese og skadet blodkar. Kroniske sår vil utvikle seg i både mannlige og kvinnelige mus, slik at begge kjønn kan brukes til å studere kroniske sår. Derfor kan den kroniske sår modellen bidra vesentlig for å fremme grunnleggende forståelse av hvordan slike sår begynner. Ved hjelp av denne kroniske sår modellen kan gi svar på grunnleggende spørsmål om hvordan kronisitet initieres/oppnås gjennom bidrag fra fysiologi av nedsatt sår helbredelse og mikrobiomet av verten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble gjennomført i samsvar og overholdelse av føderale forskrifter og University of California politikk og prosedyrer er godkjent av University of California, Riverside IACUC.

1. dyr

  1. Bruk diabetiker og obese B6. BKS (D)-LeprDB/J mus for kronisk såret modellen. Kjøpsalternativene omfatter enten heterozygotes for avl eller homozygoter direkte for eksperimenter.
  2. Breed heterozygot menn og kvinner til å produsere avkom. Bare en fjerdedel av kullet, statistisk, vil vokse til å bli diabetiker og overvektige (DB/DB-/-).
  3. Avvenne og huset DB/DB-/- mus sammen med sine littermates 3 uker etter fødselen. Separate DB/DB-/- mus fra sine littermates 5 uker etter fødselen og hus med andre DB/DB-/- mus til de er 5-6 måneder gammel og kan brukes for den kroniske såret modellen. I løpet av denne tiden, en moden og kompleks hud mikrobiomet kan utvikle seg.
    Merk: DB/DB-/- mus er lett identifiseres visuelt fra littermates mellom 3-5 ukers alder. DB/DB-/- mus er overvektige, er diabetiker, og vil bli betydelig større og avrundet enn den ville typen og heterozygot littermates. Deres mage kanskje komme lett Pinker og deres HIPS større. Økt vekt bør bekreftes før operasjonen. Dessuten er det mulig å måle høye nivåer av glukose i blodet og genotype musen for å bekrefte mutasjonen i leptin reseptoren.

2. vivarium og husdyrhold

  1. House DB/DB-/- mus i en konvensjonell vivarium (ikke en barriere/spesifikke patogen gratis anlegg), slik at en mikroflora kan etableres på huden av DB/DB-/- mus. Til spesielt modell mennesker som lider av kroniske sår, ikke ta spesielle forholdsregler for å hindre eksponering for patogener.
  2. Beskytt burene med mikro isolator topper for å minimere spredningen av smitte i vivarium. Endre burene to ganger uke med ny bedding og mate det mus med stamgjest vivarium Chow. Ikke autoklav enten sengetøy eller mat.
  3. Sett romtemperatur til å variere mellom 21 og 24 ° c, med mindre svingninger avhengig av årstid. Fuktigheten, reflekterende av klima og plassering, vil variere mellom 19 og 70%.

3. krav til utvikling av kroniske sår

  1. Bruk bare mannlige og kvinnelige mus som er phenotypically obese, diabetiker, og minst 5-6 måneders alder for utvikling av kroniske sår. Vekten av disse musene bør variere mellom 40-80 g, i snitt rundt 60 g.
  2. Ikke bruk mus som betraktes som overvektige, men veier mindre enn 50 g.
    Merk: alle mus nevnt i denne protokollen passere kvalifikasjoner beskrevet her, med mindre annet er angitt.

4. barbering og påføring av riktige lotion

Merk: Fjern uønsket hår på antecubital av musen før såret. Følgende prosedyre er gjort på Live DB/DB-/- mus som ikke er under anestesi dagen før operasjonen. Ta forholdsregler for å hindre stress og skade på dyret.

  1. Barbering
    1. Plasser musen på en ren overflate og grip foten av halen av musen med tommelen og andre fingeren for å sikre posisjonen til musen. Musen kan hoppe eller gjøre plutselige bevegelser; Hvis den does, rask reagere og trekke tilbake det avklipt å forhindre skaden.
    2. Barbere håret av musen med en hårklipper (tall 1a, 1B). Plasser bladet parallelt med huden på musen og barbere hele ryggen fra nakken til halen, inkludert alle rundt halen, for å muliggjøre et stort nok overflateareal til å plassere en gjennomsiktig film dressing (se tabell over materialer). Lett kjøre bladet mot retning av hår vekst for de mest effektive kutt. (Figur 1B).
      1. Ikke trykk bladet dypt inn i huden, siden det kan skade huden ved blåmerker eller skjæring.
  2. Påføring av riktige lotion
    Merk: Bruk riktige lotion for å få en veldig glatt hud, slik at den gjennomsiktige dressing kan holde fast.
    1. Sug huden på musen med vann for å hindre kjemiske brannskader ved å trykke lett på en gjennomvåt papir tørk mot den barberte huden med nok trykk til å fukte allerede klippe håret ned mot huden.
    2. Mens huden er våt, lett gni huden på musen med en liten porsjon av riktige lotion (se tabell over materialer) for 15-20 s (tallene 1C, 1d). Spre lotion helt over hvor håret har blitt kuttet kort. Bruk mer lotion Hvis musen er større.
    3. Ikke Påfør lotion på ørene av musen, halen, eller hvor som helst i nærheten av ansiktet. Hvis lotion får på ørene eller halen, bare tørk av med en våt papir tørke til skylling. Hvis lotion kommer på forsiden av musen, umiddelbart vaske musen under rennende trykk eller deionisert vann for å hindre skade på øyne, nese og munn.
    4. La lotion reagere med håret for en ekstra 20-45 s etter påføring.
    5. Før skylling, sjekk fullføringen av riktige reaksjonen ved lett å tørke bort lotion fra huden på forskjellige steder (figur 1E) med en hansker finger eller en tynn metallspatel. Reaksjonen er komplett hvis huden er rosa uten tilstedeværelse av svart hår. Det er best å raskt sjekke at håret faktisk har blitt fjernet før skylling enn skylling for tidlig og deretter å måtte bruke lotion igjen.
  3. Skylling
    Merk: Når fullføringen av hår fjernings reaksjonen har blitt verifisert, vask musen med rennende trykk eller deionisert vann for å fjerne riktige lotion og forhindre kjemiske brannskader.
    1. Plasser musen på venstre hansker hånd og trykk på undersiden av halen mot håndflaten med venstre tommel for å hindre musen fra å bevege seg rundt. Lukk og rett resten av venstre fingrene for å hindre at musen fra bite.
    2. Plasser musen slik at ansiktet/hodet regionen er borte fra strømmen av vann og strømmen av lunkent vann kan falle bak hodet og bare på baksiden. Raskt, men forsiktig gni baksiden av musen med høyre hansker hånden for å vaske bort lotion.
    3. Når huden på musen er fri for lotion, raskt tørke av musen med et papir håndkle til å absorbere det meste av vannet (figur 1F).
  4. Care etter barbering og hårfjerning
    1. Kontroller og rengjør eventuelle rester riktige lotion som kan forbli på ørene og halen med en våt papir tørke.
    2. Plasser musen tilbake i sin individuelle buret og plassere buret på en varmepute (40-45 ° c) i ca 30 min. Musa skal gå tilbake til normal oppførsel, Lurvet rundt, og stelle seg i løpet av noen få min.
    3. Huset hver mus i et eget bur gjennom hele varigheten av eksperimentet. Huden på musene er ikke lenger beskyttet og kan lett riper og bitt av andre mus.
    4. Siden riktige lotion kan ha små irriterende effekter som kan forstyrre eller endre såret helbredelsesprosessen, vent 18-24 h før operasjonen slik at musen huden til å roe ned og musen til å justere til mangelen på håret på ryggen.
  5. Fjerne hår fra huden med mørk pigmentering
    Merk: noen DB/DB-/- mus vil potensielt ha mørke flekker i huden som vil ha håret vokser tilbake raskere og sterkere enn huden uten disse patcher. (Figur 2A). Disse mørke områder av huden vises mørkere i fargen på grunn av mid-sent anagen scenen hårsekkene og/eller pigment inkontinens29,30.
    1. Hvis mørke flekker er lagt merke til, Påfør riktige lotion igjen, men bare i disse områdene, og gjenta trinn 4,2 og 4,3 (tall 2b, 2C).
      Merk: den mørke flekker av huden vil vokse håret raskere gjennom hele varigheten av eksperimentet, så klippet håret kort hver 3-5 dager, når det er nødvendig. En patch eller to unna ønsket plassering av såret er akseptabelt. Hvis baksiden av musen er betydelig dekket av disse mørke flekker, ikke bruk denne musen for den kroniske såret modellen.

5. reagens oppsett

Merk: utvikling av kroniske sår i DB/DB-/- mus oppnås ved behandling med spesifikke hemmere for catalase og glutation peroksidase, 3-amino-1, 2, 4-for (ATZ) og mercaptosuccinic acid (MSA), henholdsvis16 . Følgende prosedyre detaljer dosen og administrering av analgesi og hemmere basert på vekten av musen.

  1. Injiser smertestillende Buprenex intraperitonealt ved 0,05 mg/kg mus i steril PBS. Injiser et volum på 120 μL for en 60 g mus ca. 30 min før operasjonen. Administrer en annen dose 6 timer etter operasjonen. En ekstra dose kan gis etter behov.
  2. Injiser ATZ intraperitonealt ved 1 g/kg mus i steril PBS. Injiser et volum på 480 μL for en 60 g mus ca. 20 min før operasjonen. Injiser halvparten av volumet på venstre side av buken og den andre halvparten på høyre side.
  3. Innskudd MSA lokalt på såret mellom den gjennomsiktige dressing og sår vevet på 150 mg/kg mus i steril PBS. Administrer et volum på 60 μL for en 60 g mus i løpet av 10 min etter operasjonen.

6. kirurgi

Merk: effekten av den kroniske sår modellen er avhengig av ikke-sterile forhold. Disse musene er ikke bakterie-fri og er plassert i en konvensjonell vivarium. Bakteriene mikrobiomet som ligger i huden er avgjørende for den påfølgende initiering og utvikling av kroniske sår ved behandling med hemmere av antioksidant enzymer. Derfor er tradisjonell pre-kirurgisk utarbeidelse av nettstedet kontraindikert.

  1. Intraperitoneal injeksjon
    1. Fest musen på skrå del av buret rack og hold halen med musen komfortabelt stående med hodet lavere enn kroppen av musen. Dette sikrer at vi forsøker å flytte de indre organene så langt unna injeksjonsstedet som mulig.
    2. Sett nålen i nedre høyre kvadrant av magen for å unngå injeksjon i blæren, eller andre abdominal organer.
    3. Aspirer nålen før injeksjon.
  2. Behandling og anestesi
    1. Administrer Buprenex 30 min og ATZ 20 min før operasjonen, som beskrevet i trinn 5,1 og 5,2.
    2. Plasser musen i en liten plastbeholder på toppen av en varm oppvarming pad som vist i Figur 3a for ca 15-20 min. gi varme støtte før prosedyren beskytter mot potensiell dødelighet.
    3. Plasser en papir tørke eller papir håndkle over toppen av den lille beholderen for å bedre inneholde varmen. Musen skal roe ned som det varmer. Figur 3 B viser materialer som er nødvendige for kirurgi.
    4. Plasser musen i en lukket beholder som er koblet til isoflurane fordamper i den kjemiske panseret hvis du bruker et åpent system.
    5. I et åpent system, administrere 5% isoflurane for 1-2 min med en strømningshastighet på 2-3.5 L/min. kontinuerlig overvåke statusen til musen.
      1. Når musen er bevisstløs eller ikke lenger beveger seg, plasserer du musen på en hvit kirurgisk pad og passer hodet med en nese kjegle som er festet til fordamper for å tillate kontinuerlig administrering av isoflurane under operasjonen.
    6. I et åpent system, administrere 2-3% isoflurane ved samme strømningshastighet under operasjonen og justere til flyten av isoflurane for å opprettholde dybden av anestesi.
    7. Minimer både konsentrasjonen og varigheten av isoflurane administrert under operasjonen. DB/DB -/- mus er svært følsomme for anestesi så det er best å holde isoflurane eksponering til et minimum. Hvis musen er fremdeles forståelsesfull etter 2 min for 5% isoflurane, sikre nesen kjegle og administrere 3-5% isoflurane for 15-30 s tidligere igangsetting kirurgi.
      1. Bekreft riktig bedøvelsen før såret. Dybden av anestesi er bekreftet av mangel på respons på fysiske stimuli som sterk tå knipe. Lengden på tiden av musen under inhalert anestesi er under 5 min slik at ingen veterinær salve påføres øynene.
  3. Såret
    1. Spray en papir tørke med 70% etanol eller en klinisk etanol våtserviett og tørk baksiden av musen for å rense området av såret området. Rengjør overflaten av huden slik at den gjennomsiktige dressing kan holde fast, siden støv fra sengetøy, mat eller hud kan hindre at bandasjen stikker skikkelig (Figur 4A). Ikke tørk overdrevet, eller det vil være en risiko for å drepe bakterier tilstede på huden.
    2. Bestem plasseringen av såret området. Det beste stedet å utføre såret er på rygg side av musen, sentrert og vekk fra flekker av huden med høyere pigmentering.
      Merk: vi har bestemt av erfaring at disse musene kan bare tåle byrden av ett sår.
    3. Lag et sår innen 30-45 s ved hjelp av en 7 mm hud biopsi punch, pinsett og kirurgisk saks. Trykk lett på biopsi punch på ønsket sårstedet og vri punch rundt akkurat dypt nok til å forlate et svakt inntrykk av punch (Figur 4B). Avgiftsdirektoratet den skisserte huden ved å trekke opp midten av punch med pinsett og skjære langs omrisset med kirurgisk saks (tall 4c-4e).
    4. Dekk såret fast med halvparten av et stykke gjennomsiktig film dressing (6 cm x 3,5 cm).
    5. Stopp administrering av 2% isoflurane til musen (Figur 4F).

7. etter operasjonen behandling og gjenoppretting

  1. Administrere behandling av MSA etter at operasjonen er fullført og den gjennomsiktige bandasjen brukes som beskrevet i trinn 5,3. Depositum MSA på såret området under dressing.
  2. Plasser musen tilbake i den lille beholderen på varmeputen i 30 min for å hjelpe til med utvinning. En gang musa har varmet opp, putte musa rygg inne dens bur. Effekten av isoflurane er midlertidig, og musen skal flytte rundt kort tid etterpå.
  3. Ikke la mus uten tilsyn eller returnere dem til vivarium før musene har fått nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
    Merk: anestesi av valget når du arbeider med disse musene er isoflurane nettopp på grunn av sin raske induksjon og påfølgende fremveksten av anestesi.
    1. House mus som har gjennomgått kirurgi individuelt for å unngå en mus forstyrrer den kroniske såret av en annen. Som nevnt ovenfor, kommer de ikke tilbake til vivarium før de er fullstendig gjenopprettet.
  4. Administrer den andre dosen av Buprenex 6 timer etter operasjonen.
  5. Observer musene nøye for første 48 h etter operasjonen.
    Merk: operasjonen, kombinert med hemmere å opprette kronisk såret, er svært stressende på dyret som allerede er både diabetiker og obese. Mus som overlever de første par dagene etter operasjonen vil vanligvis overleve varigheten av eksperimentet.

8. data innsamling, Survival Strategies, håndtering av mus etter såret, og flere tips

  1. Data innsamling
    1. Ta bilder så tidlig som umiddelbart etter operasjonen. Biofilm observeres hvor som helst mellom 5-10 dager etter såret, og så tidlig som 3 dager.
    2. Hvis bakteriene er fokus for analyse, rull en steril swap med lett trykk rundt såret for 10-15 s. Oppbevar pinnen, i et egnet fryse medium for dyrking eller tørr uten noen medier for kultur uavhengig sekvensering analyse, ved-80 ° c. Samle ekstracellulære polymer stoffer via en steril metallspatel inn i et mikrosentrifugen rør og oppbevar ved-80 ° c før analyse.
    3. Ikke administrere anestesi til musen under håndtering for biofilm samling eller ta bilder. I løpet av disse prosedyrene, plasserer et stykke mat foran musen for å roe musen ned og hindre den fra å kjøre av. De fleste mus vil klatre på toppen av maten, sitte på den, og ikke flytte.
  2. Som sekundære infeksjoner og utilsiktede kroniske sår eller magesår kan utvikle seg hvis musen ikke er riktig bevegelse eller hvis bandasjen ikke er brukt riktig, periodisk sjekke aktiviteten av musen og ventrale side for sår. Friksjon mellom huden og vått sengetøy (DB/DB-/- mus er polyuric) kan forstyrre huden hvis burene ikke endres ofte.
    Merk: Fluid buildup Under dressing kan føre til at limet mister sin klebrige og la væsken lekke. Dead Skin celle, sengetøy og avføring kan deretter holde seg på huden og stivne. Disse tørkede flekker og aggregater på huden bør tømmes omgående for å hindre en sekundær infeksjon.
  3. Hvis musene står eller sitter på bakbena, flytte disse musene til et bur der tilgang til mat og vann er mye lavere. Hvis posisjonen av mat og vann i buret er høy, kan musen stå eller sitte på bakbena for å nå det. De fleste mus vil ikke ha et problem å spise og drikke hvis de kunne gjøre det før operasjonen, men det er en mulighet for at noen mus kan snu over på ryggen. Disse "svømmeføttene" kan ha store vanskeligheter med å snu, slik at de vil trenge assistanse og videre overvåking.
  4. La den gjennomsiktige dressing på huden i opptil 20 dager hvis huden er klar av rusk, flakey hud og hår. Hvis noen av disse oppstår på huden, fjerne den gamle dressing og Påfør et nytt stykke.
    1. Å ta av dressing, lett klype huden rett bak hodet, deretter trekke dressing bort fra hodet i en jevn bevegelse.
    2. For å plassere et stykke dressing på sikkert, har musen forblir så stille som mulig. Det er viktig at huden er ren og fri for eksentrisk døde hudceller, støv fra sengetøy, og biter av mat. Plasser og trykk deretter bandasjen inn i huden rundt såret for å sikre.
    3. Hvis du plasserer et stykke mat foran musen begrenser ikke sine bevegelser, og plasser deretter musen på toppen av wire buret. Når musen har grepet en skinne på buret, hold halen så nær kroppen som mulig og trekk med minimal kraft. Som musen trekker frem ryggen vil strekke og rette for enkel påføring; Plasser bandasjen sikkert på dette punktet.
    4. Aldri gjenbruk en gammel dressing. Påfør alltid ny dressing på baksiden for størst vedheft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser et eksempel på et sår uten behandling av hemmere framover mot sår lukking og et sår med behandling av hemmere framover mot kronisitet. Den gjennomsiktige bandasjen har stått på plass på den kroniske såret slik at biofilm og væske akkumulering kan sees.

Kronisk sår initiering finner sted på mindre enn 6 timer og såret margin er synlig endret fra oksidativt stress. Histologiske bevis på dette såret margin avslører at vevet er nekrotisk og vil ikke delta i såret helbredelse. Den biofilm bakterier i såret kan senere bruke denne nekrotisk vev som en kilde til næringsstoffer og strukturelle komponenter til å produsere biofilm. Et kronisk sår er et sår som forblir åpent, forstørret i forhold til det første såret, inneholder biofilm (EPS pluss sykdomsfremkallende bakteriell funnet i menneskelige kroniske sår) og tar måned eller år å helbrede, avhengig av mengden og innholdet i biofilm som hindrer såret fra å løse normalt. I den kroniske sår modellen, full kronisitet er satt til > 20 dager etter operasjonen fordi sårene ikke behandlet med hemmere vil stenge på denne tiden (figur 5). Healing tar vanligvis > 60 dager og tiden avhenger av den primære patogene bakterier tilstede i såret. Noen ganger kan musene gi etter for smitte når mer aggressive biofilm bakterier, som Pseudomonas, dominerer i såret. Således er en kronisk såret definert som et sår som ikke vil stenge innen 20 dager, tar mer enn 60 dager å helbrede, og har biofilm tilstede på såret.

Sex forskjeller har blitt funnet i ulike diabetes modeller, inkludert DB/DB-/- Mouse modell32,33. Mens slike forskjeller eksisterer, har vi observert sex å ikke være en betydelig faktor i utviklingen av kroniske sår. Kroniske sår i mannlige og kvinnelige mus utvikle seg til en lignende grad, slik at begge kjønn kan brukes til å studere kroniske sår. Dermed utnytte denne modellen er fordelaktig siden menneskelige kroniske sår kan bli funnet på både mannlige og kvinnelige diabetiker pasienter.

Figure 1
Figur 1 . Barbering og riktige prosess. (A) musa før barbering. (B) huden på musen er barbert for å fjerne det meste av håret på baksiden. (C) en porsjon av riktige lotion på tuppen av en finger. Mer brukes hvis musen er større. (D) baksiden av musen er dekket med riktige lotion og venstre for å reagere. (E) en slikkepott brukes til å skrape av noen av lotion for å se om håret er fjernet. Bright rosa hud uten noen tilstedeværelse av hår er veiledende at hårfjerning er fullført. (F) lotion på baksiden er fjernet med rennende vann. Huden på musen skal være litt rosa. Dette tallet har blitt modifisert fra Kim og Martins-Green31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Fjerner hår fra mindre flekker av mørk hud. (A) musen har allerede blitt behandlet en gang og huden er våt igjen for å hindre brannskader. (B) riktige lotion påføres kun på plasteret av hud som er mørkt og har tett hår. (C) lotion vaskes av etter reaksjonen å avdekke mørke flekk av huden uten hår. Dette tallet har blitt modifisert fra Kim og Martins-Green31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Pre-kirurgi satt opp. (A) musene som skal bli såret er plassert i små plastbeholdere på toppen av en varmepute. (B) noen av materialene som brukes i kirurgi, vises. Den kirurgiske saks må være skarp for å sikre at huden ikke er knust når kuttet. Den gjennomsiktige dressing er skåret i to. Dette tallet har blitt modifisert fra Kim og Martins-Green31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Gjør det forbruker skade såret. (A) etter at musen er under anestesi, er baksiden av musen tørkes med 70% etanol gang. (B) huden biopsi punch er plassert på baksiden av musen og trykket hardt nok til å forlate et inntrykk. Den biopsi punch kan roteres for å gjøre et grunt snitt. (C) midten av det disponerte området er klemt med pinsett og en skarp kirurgisk saks brukes til å gjøre det første snittet. (D) kirurgisk saks er manøvrerte å skjære langs omrisset gjort av biopsi punch. (E) en region av huden skissert av biopsi pumpen er vellykket excised. (F) den gjennomsiktige bandasjen er plassert på baksiden av musen og sikret. Dette tallet har blitt modifisert fra Kim og Martins-Green31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Bilder av sår. (A) såret på en mus på etterfølgende ganger etter operasjonen som det utvikler seg til kronisitet starter på Operasjonsdagen. Biofilm kan sees så tidlig som dag 5 og oppdaget så tidlig som dag 3. Såret er fullt kronisk med sterk biofilm på dag 20. (B) eksempler på menneskelige kroniske sår, spesielt diabetiker fot magesår. Dette tallet har blitt modifisert fra Kim og Martins-Green31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når kroniske sår er opprettet på mus, kan modellen brukes til å studere nedsatt sår healing prosesser involvert i initiering av kronisitet. Modellen kan også brukes til å teste effekten av et bredt spekter av kjemikalier og stoffer som kan reversere kroniske sår utvikling og nedsatt helbredelse og føre til sår lukking og helbredelse. Ulike tidspunkt etter utbruddet av kronisitet kan bli studert: eg, dager 1-5 etter såret for tidlig utbruddet av kronisitet og dager 20 og utover for full styrke kroniske sår.

Den kroniske såret modellen er også en kraftig modell for å studere ulike aspekter av såret healing og komplikasjoner som bioburden og cachexia. Bioburden er bare ett av mange fasetter av kroniske sår som kan bli studert i denne modellen, som det også påvirker menneskelige kroniske sår. Våre prosedyrer og Animal use Protocol identifiserer tydelig symptomene som skal overvåkes, sammen med en definert overvåknings plan. Dyr identifisert som sykelig, basert på IACUC godkjente kriterier, er euthanized for å unngå betydelig lidelse. Dessuten, det campus veterinarian og dyr sunnhet tekniker er konsultert når bestemt symptomologies fremkomme og skaffe hjelper guide inne vurderingen av kriterier.

Kritiske skritt i protokollen inkluderer bolig DB/DB-/- mus i en konvensjonell vivarium, fjerne hår med riktige lotion, og oppvarming før isoflurane administrasjon. Utviklingen av kroniske sår i den kroniske sår modellen er avhengig av ikke-sterile forhold og praksis. Disse musene er ikke bakterie-fri og vokser ikke i veldig ren vivariums. Mikroflora som ligger i huden er avgjørende for den påfølgende initiering og utvikling av kroniske sår ved behandling med hemmere for antioksidant enzymer. Disse DB/DB-/- mus må utsettes for et miljø som inneholder bakterier, både Commensal og patogene. Hvis huden er rengjort og dis-smittet med jod eller andre antiseptiske metoder før kirurgi for å "sterilisere" huden, kan såret ikke bli kronisk. Bakteriene i huden mikrobiomet er nødvendig for dannelse og utvikling av biofilm, og forsinke healing og sår lukking. I klinikken kompliserer tilstedeværelsen av biofilm i et sår ytterligere sår helbredelses prosessene og øker risikoen for amputasjon hos mennesker hvis infeksjonen i såret ikke er kontrollert.

Fjerne hår med riktige lotion er et viktig skritt for å fjerne overflødig hår og la en glatt og ren overflate for den gjennomsiktige dressing å holde fast. Den riktige lotion som brukes i denne protokollen er en kjemisk riktige med ekstra Aloe for å minimere brannskader. Dette produktet er minimal i å endre morfologi av huden samt bevare huden mikrobiomet. Produktet som er oppført i tabellen av materialer er anbefalt over andre hårfjerning av produkter, inkludert fysiske og mekaniske hårfjerning (voks og kommersielle epilators) som kan videre brenne og slepe på huden og/eller drepe huden mikrobiomet. Selv om denne kjemiske riktige er fysisk skånsom, kan det fortsatt irritere huden litt, en effekt som kan endre såret healing prosesser. Dermed er det mest effektivt å vente 18-24 timer før operasjonen for å tillate huden å komme seg fra prosedyren og sikre at huden og såret ikke påvirkes av det.

Disse musene er ekstremt føyelig og ikke-responsive til stressfaktorer. De er veldig lett å håndtere uten anestesi. De er rolige nok til å plassere på en håndflate eller på toppen av en benk uten å kjøre bort. Hvis undersiden av halen av musen er sikret med tommelen og andre finger, vil musen ikke være i stand til å løpe vekk eller vende tilbake for å bite på grunn av deres store mage størrelse. Viktigere, i vår erfaring, disse musene er svært følsomme for anestesi, spesielt i tilknytning til tap av homeostase. Således, i samråd med vår IACUC, ble det fastslått at det beste alternativet er å begrense anestesi administrasjon.

Hovedformålet med denne modellen er å skape et stort unhealing sår på ryggen, så når et sår er gjort, holder en mus konvensjonelt å lage IP-injeksjoner av ekstra buprenex eller andre kjemiske behandlinger med jevne mellomrom er umulig. Holde musen ved rygg huden fører til at musen mye ubehag og ganske muligens smerte Hvis musen er holdt på en slik tradisjonell måte; Dermed, all injeksjon med musen rett side opp mens den står på alle fire føtter. Andre eksperimenter utnytte DB/DB-/- belastning bruke disse musene når de er yngre og ikke veie så mye, derfor den tradisjonelle måten å utføre en IP-injeksjon kan brukes. Siden kronisk såret modellen utnytter mus opp til 6 måneders alder og disse musene kan veie opp til 80 g, den konvensjonelle metoden er ikke optimal og kan potensielt skade musen. Vi har benyttet metoden beskrevet ovenfor for en mus denne overvektige og har ikke observert noen negative resultater når injisert med denne metoden med vellykket aspirasjon.

Tidligere ble injiserbare anestesi som ketamin og xylazine, brukt; de viste seg imidlertid å være vanskelige å bruke med DB/DB-/- mus. Med en total Driftstid på mindre enn 5 minutter, den lange induksjon og utvinning tid var ikke nødvendig i forbindelse med eksperimentet. Isoflurane var fast bestemt på å være det beste valget av anestesi for denne prosedyren på grunn av enkel administrasjon og titrering, rask debut og utvinning, og tilstrekkelig bedøvelse dybde. Også, isoflurane forårsaker minimal hjerte depresjon og opprettholder BP svært godt34. Så, en stor endring i prosedyren for den kroniske såret modellen var å bruke isoflurane som foretrukket anestesi.

Oppvarmingen før operasjonen er viktig for å forebygge dødelighet i 2-3 dager etter operasjonen. Disse musene har betydelig lavere kjerne kroppstemperatur35 og er ikke i stand til å kontrollere sin kjernetemperatur effektivt på grunn av deres genetiske manipulasjon, så en ekstern oppvarmings kilde er gitt før operasjonen for å beskytte mot ekstra fall i kjernen kroppstemperatur indusert av anestesi. Vi har vurdert behovet for en varmepute før, under og etter operasjonen. Det er viktig å merke seg at DB/DB-/- mus har uvanlige fysiologiske responser. Empirisk har vi funnet disse musene å være mest effektivt beskyttet med pre-og post-kirurgisk varme støtte. Ved å erstatte isoflurane som bedøvelse, målte vi og fastslått at kjernen kroppstemperaturen ikke faller betydelig i løpet av mindre enn fem minutter med kirurgi. Mens vi har funnet pre-og post-kirurgisk varme støtte for å være kritisk for disse musene, har vi ikke funnet kirurgisk varme støtte å ha en effekt. Det bør bemerkes at IACUC Chair gitt veiledning og overvåket våre tester knyttet til temperatur og bedøvelse effekter. Som vi kommuniserer denne metoden, finner vi det viktig å indikere hva som er nødvendig for suksessen av prosedyren.

En begrensning av å utnytte denne metoden for å studere biofilm utvikling er det faktum at bakteriene til stede på såret og produsere biofilm ikke er kontrollert. Hvis en bestemt biofilm bakterie skal bli studert, kan denne modellen være nyttig hvis de innfødte mikrobiomet kan bli avskaffet før såret enten gjennom jod eller andre antiseptiske metoder. I respons til overdreven nivåer av oksidativt stress, stimuleres viktige patogene bakterier i huden mikrobiomet for å initiere biofilm formasjon. I våre kroniske sår, biofilm-forming bakterier inkluderer, men er ikke begrenset til, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 for alle , 39, og ulike Staphylococcus40,41 og Corynebacterium arter41,42,43,44, 45, som alle finnes i menneskelige kroniske sår. Flere kroniske sår mikrobiomet studier har blitt utført på menneskelige kroniske sår for bakterien39,40,41,43,44,45 , og sopp46,47 samfunnet, inkludert langsgående undersøkelser knyttet til dårlig healing48,49. Langsgående studier av denne art kan også følges gjennom med den kroniske såret modellen.

Det er viktig å erkjenne at ulike resultater kan oppnås på grunn av forskjeller i vivaria forhold, forsyninger og utstyr, leverandører og kilde kolonier for DB/DB-/- mus. For å minimere slike forskjeller, gitt i protokollen er nøyaktig mus variasjon og kilde som brukes for den kroniske sår eksperimentet. For husdyrhold av disse musene, den nøyaktige sengetøy og mat merker har blitt gitt i tabellen av materialer for å begrense variasjon. I våre eksperimenter, finner vi at høy oksidativt stress er nødvendig og tilstrekkelig til å skape kroniske sår i disse musene, så lenge musene er plassert i en konvensjonell vivarium og utsatt for bakterier. Bakterie populasjoner og lokalsamfunn kan avvike med vivaria; men så lenge en bakterie-fri anlegget ikke brukes til å huse mus, bør de ha nok bakterier, både Commensal og patogene, å oppholde seg på hår og hud.

Denne metoden for å skape kroniske sår i denne protokollen er viktig å studere kroniske sår og nedsatt sår healing fordi bare oksidativt stress er betydelig endret eksperimentelt. Oksidativt stress er nødvendig for normale sår helbredende prosesser2. Det er viktig for rettidig regulering og en viktig komponent i funksjonaliteten til cellene som er nødvendige for sår helbredelse5. Men når nivåene av oksidativt stress ikke er kontrollert, kan reaktive oksygen arter skade endothelia celler, hemme Keratinocyte funksjonalitet, og forsinke såret nedleggelse2,5. Human kroniske sår har høye nivåer av oksidativt stress50. Muse modellen har høyt blodsukker og allerede økte nivåer av oksidativt stress på grunn av sykelighet. Disse egenskapene er delt med mennesker som lever med diabetes og gi en mikromiljøet som bidrar til kronisitet etter opprettholde skade50. Mennesker også vert mangfoldig og komplekse bakterieflora på mange steder på kroppen, inkludert huden, så en kompleks, men naturlig, mikrobiomet er lov til å utvikle seg på huden av musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekreftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

Medisin sår helbredelse kronisk sår nedsatt helbredelse diabetisk fot sår oksidativt stress biofilm
Protokoll for å skape kroniske sår i diabetiker mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter