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Protocolo para criar feridas crônicas em camundongos diabéticos

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

As feridas crônicas são desenvolvidas a partir de feridas agudas em um modelo de mouse diabético induzindo altos níveis de estresse oxidativo após uma ferida cutânea de espessura total. A ferida é tratada com inibidores para catalase e glutationa peroxidase, resultando em comprometimento da cicatrização e desenvolvimento de biofilme por bactérias presentes no microbioma cutâneo.

Abstract

As feridas crônicas se desenvolvem como resultado da regulação defeituosa em um ou mais complexos processos celulares e moleculares envolvidos na cicatrização adequada. Eles impactam ~ 6,5 M pessoas e custo ~ $40B/ano nos EUA sozinho. Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, questões fundamentais permanecem sem resposta. Recentemente, nós desenvolvemos um modelo novo do rato para as feridas crônicas do diabético que têm muitas características de feridas crônicas humanas. Usando DB/DB-/- camundongos, podemos gerar feridas crônicas induzindo altos níveis de estresse oxidativo (os) no tecido da ferida imediatamente após o ferimento, usando um tratamento único com inibidores específicos das enzimas antioxidantes catalase e glutationa peroxidase. Estas feridas têm níveis elevados de OS, desenvolvem o biofilme naturalmente, tornam-se inteiramente crônicos dentro de 20 dias após o tratamento e podem permanecer abertos mais por mais de 60 dias. Este novo modelo tem muitas características de feridas crônicas diabéticas em humanos e, portanto, pode contribuir significativamente para o avanço da compreensão fundamental de como as feridas se tornam crônicas. Este é um avanço importante porque as feridas crônicas nos seres humanos causam a dor e a aflição significativas aos pacientes e conduzem à amputação se não resolvidas. Além disso, essas feridas são muito caras e demoradas para tratar, e levam a perda significativa de renda pessoal para os pacientes. Avanços neste campo de estudo através do uso de nosso modelo de ferida crônica pode melhorar significativamente os cuidados de saúde para milhões que sofrem esta condição debilitante. Neste protocolo, nós descrevemos em grande detalhe o procedimento para causar as feridas agudas para tornar-se crônico, que não foi feito antes.

Introduction

A cicatrização de feridas envolve processos celulares e moleculares complexos que são regulados temporalmente e espacialmente, organizados em estágios seqüenciais e sobrepostos que envolvem muitos tipos de células diferentes, incluindo mas não limitados à resposta imune e à do sistema1. Imediatamente após a pele sustém uma lesão, fatores e células sanguíneas agregado ao local da ferida e iniciar a cascata de coagulação para formar um coágulo. Depois que a homeostase é conseguida, os vasos sanguíneos dilatam-se para deixar no local da ferida o oxigênio, os nutrientes, as enzimas, os anticorpos e os Fatores Quimiotáticos que quimioatraem polymorphonucleocytes para cancelar o leito da ferida de restos extrangeiros e secretam enzimas proteolíticas 2. as plaquetas ativadas secretam uma variedade de fatores de crescimento para estimular os queratinócitos na borda da ferida para re-epitelizar a área ferida. Monócitos recrutados para o local da ferida diferenciam-se em macrófagos que bactérias fagoocitose e neutrófilos mortos e secretam fatores adicionais para manter os sinais proliferativos e pró-migratórios de queratinócitos. Na fase de proliferação, enquanto a re-epitelização continua, novo tecido de granulação composto de fibroblastos, monócitos/macrófagos, linfócitos e células endoteliais continuam o processo de reconstrução2. A angiogênese é estimulada pela promoção da proliferação e migração de células endoteliais, resultando no desenvolvimento de novos vasos. A epitelização e a remodelação da matriz extracelular constroem uma barreira contra o meio ambiente. À medida que a ferida cicatrizar e o tecido de granulação evolui para uma cicatriz, a apoptose elimina células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais sem causar dano tecidual adicional. A resistência à tração do tecido é reforçada por fibroblastos remodelando vários componentes da matriz extracelular, como o colágeno, de modo que o tecido recém-formado é quase tão forte e flexível como a pele não ferida2.

Qualquer desvio desta progressão altamente concertada para o fechamento da ferida leva a feridas danificadas e/ou crônicas3. As feridas crônicas são caracterizadas pelo aumento do estresse oxidativo, inflamação crônica, microvasculatura danificada e matriz de colágeno anormal na ferida4. Estresse oxidativo, especialmente na ferida, pode atrasar o fechamento da ferida2,5. Quando, na primeira fase da cicatrização de feridas, a fase inflamatória torna-se regulamentada, o tecido hospedeiro assume extensos danos devido a um influxo contínuo de células inflamatórias5 que liberam enzimas citotóxicas, um aumento nos radicais livres de oxigênio, e mediadores inflamatórios não regulamentados, resultando em morte celular6,7.

Neste microambiente destrutivo, bactérias formadoras de biofilme aproveitam os nutrientes do hospedeiro e contribuem para o dano do tecido hospedeiro2. Estes biofilmes são difíceis de controlar e remover porque as substâncias poliméricos extracelular hidratadas compor das proteínas, do ADN, do RNA, e dos polisacáridos permitem que as bactérias abrigaram dentro para ser tolerantes às terapias antibióticas convencionais e iludir o resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro2,8,9.

Estudar feridas crônicas é crucial porque impactam ~ 6,5 milhões pessoas e custam ~ $40000000000 por ano nos EUA sozinhos10. Pacientes com diabetes têm aumentado os riscos para o desenvolvimento de feridas crônicas que necessitam de amputação, a fim de conter a propagação da infecção. Estes pacientes têm um risco de mortalidade de 50% dentro de 5 anos da amputação que é atribuída ao mecanismo da patofisiologia do diabetes11. A relação entre o sistema imunológico do hospedeiro e o microbioma na cicatrização de feridas é um tema vital da pesquisa em andamento, pois as conseqüências de feridas crônicas, se não resolvidas, incluem amputação e morte12.

Embora um esforço significativo tenha sido investido na compreensão de como as feridas crônicas se desenvolvem em humanos, ainda não está claro como e por que as feridas crônicas se formam. Experimentos para estudar os mecanismos de cicatrização prejudicada é difícil de conduzir em seres humanos, e os especialistas em cicatrização de feridas só vêem pacientes com feridas crônicas que já atingiram cronicidade por semanas a meses. Assim, os especialistas são incapazes de estudar o que os processos deu errado que levam a ferida a desenvolver para se tornar crônica2. Há uma falta de modelos animais que recapitulam a complexidade das feridas crônicas humanas. Até que nosso modelo estêve desenvolvido, nenhum modelo para estudos crônicos da ferida existiu.

O modelo de ferida crônica foi desenvolvido em camundongos com mutação no receptor de leptina (DB/DB-/-)13. Estes camundongos são obesos, diabéticos, e têm dificuldades de cicatrização, mas não desenvolvem feridas crônicas14. Níveis de glicose no sangue média em torno de 200 mg/dL, mas pode ser tão alto quanto 400 mg/dL15. Quando altos níveis de estresse oxidativo (SO) no tecido da ferida são induzidos imediatamente após o ferimento, a ferida torna-se crônica16. As feridas DB/DB-/- são consideradas crônicas por 20 dias e permanecem abertas por 60 dias ou mais. Biofilme produzido por bactérias pode ser visto desenvolvendo início três dias após o ferimento; um biofilme maduro pode ser visto 20 dias após ferir e persistir até qualquer fechamento da ferida. As bactérias formadoras de biofilme que encontramos nesses camundongos também são encontradas em feridas crônicas diabéticas humanas.

O estresse oxidativo é induzido pelo tratamento das feridas com dois inibidores de enzimas antioxidantes, catalase e glutationa peroxidase, duas enzimas com a capacidade de quebrar o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é uma espécie reativa de oxigênio e pode causar danos celulares através da oxidação de proteínas, lipídios e DNA. Catalase cataliza a decomposição do peróxido de hidrogênio em menos produtos químicos nocivos de oxigênio e água. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) inibe a catalase ligando especificamente e covalentemente ao centro ativo da enzima, inativando-o17,18,19. ATZ tem sido utilizado para estudar os efeitos do estresse oxidativo tanto in vitro como in vivo através da inibição da catalase20,21,22,23,24. A glutationa peroxidase catalisa a redução do peróxido de hidrogênio através do antioxidante, glutationa, e é uma importante enzima que protege a célula contra o estresse oxidativo25. O ácido mercaptosuccinic (MSA) inibe a glutationa peroxidase ligando-se ao local ativo da selenocisteína da enzima com tiol, inativando-o26. A MSA tem sido utilizada para estudar os efeitos do estresse oxidativo in vitro e in vivo , bem como20,27,28.

Este novo modelo de feridas crônicas é um modelo poderoso para estudar, pois compartilha muitas das mesmas características observadas em feridas crônicas diabéticas humanas, incluindo inflamação prolongada do sistema operacional aumentado e formação de biofilme natural do microbioma cutâneo. As feridas têm a interação cutâneo-epidérmica danificada, o depósito anormal da matriz, a angiogênese pobre e o vasculature danificado. As feridas crônicas se desenvolverão em camundongos machos e fêmeas, de modo que ambos os sexos podem ser usados para estudar feridas crônicas. Conseqüentemente, o modelo crônico da ferida pode contribuir significativamente para avançar a compreensão fundamental de como tais feridas começam. Usar este modelo crônico da ferida pode fornecer respostas às perguntas fundamentais sobre como o cronicidade é iniciado/conseguido com as contribuições da fisiologia da cura danificada da ferida e do microbioma do anfitrião.

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Protocol

Todos os experimentos foram concluídos de acordo e conformidade com os regulamentos federais e da Universidade da Califórnia política e procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, Riverside IACUC.

1. o animal

  1. Use diabéticos e obesos B6. BKS (D)-LeprDB/j camundongos para o modelo de ferida crônica. As opções de compra incluem heterozigotos para reprodução ou homozigotos diretamente para experimentos.
  2. Raça heterozygote machos e fêmeas para produzir descendentes. Apenas um quarto da maca, estatisticamente, crescerá para se tornar diabético e obeso (DB/DB-/-).
  3. Wean e casa DB/DB-/- ratos junto com seus littermates 3 semanas após o nascimento. Separe DB/DB-/- camundongos de seus littermates 5 semanas após o nascimento e casa com outros DB/DB-/- camundongos até que eles são 5-6 meses de idade e pode ser usado para o modelo de ferida crônica. Durante este tempo, um microbioma maduro e complexo da pele pode desenvolver-se.
    Nota: os ratos DB/DB-/- são facilmente identificados visualmente a partir de littermates entre 3-5 semanas de idade. O DB/DB-/- camundongos são obesos, são diabéticos, e será significativamente maior e mais redondo do que o tipo selvagem e littermates heterozygous. Seu abdômen pode aparecer ligeiramente Pinker e seus quadris maiores. O aumento do peso deve ser confirmado antes da cirurgia. Além disso, é possível medir altos níveis de glicose no sangue e genótipo do mouse para confirmar a mutação no receptor de leptina.

2. Vivarium e husbandry

  1. Casa DB/DB-/- camundongos em um Biotério convencional (não uma barreira/patógeno específico livre facilidade) para que uma microflora pode ser estabelecida na pele de DB/DB-/- camundongos. Para modelar especificamente os seres humanos que sofrem de feridas crônicas, não tome precauções especiais para evitar a exposição a patógenos.
  2. Proteja as gaiolas com micro isolador tops para minimizar a propagação da infecção dentro do Vivarium. Mude as gaiolas duas vezes por semana com a cama nova e alimente os ratos com o Chow regular do biotério. Não autoclave nem a cama ou o alimento.
  3. Defina a temperatura ambiente para variar entre 21 e 24 ° c, com pequenas flutuações dependendo da época do ano. A humidade, reflectora do clima e da localização, irá variar entre 19 e 70%.

3. requisitos para o desenvolvimento de feridas crônicas

  1. Use apenas camundongos machos e fêmeas que são fenotipicamente obesos, diabéticos, e pelo menos 5-6 meses de idade para o desenvolvimento de feridas crônicas. O peso destes ratinhos deve variar entre 40-80 g, com uma média de cerca de 60 g.
  2. Não use camundongos que são considerados obesos, mas pesar menos de 50 g.
    Nota: todos os ratos referidos neste protocolo passam as qualificações descritas aqui, salvo indicação em contrário.

4. barbear e aplicação de loção depilatória

Nota: remover pêlos indesejados no dorso do mouse antes de ferir. O procedimento a seguir é feito em Live DB/DB-/- camundongos que não estão anestesia no dia anterior à cirurgia. Tome precauções para evitar o stress e o dano ao animal.

  1. Barbear
    1. Coloque o mouse sobre uma superfície limpa e segure a base da cauda do mouse com o polegar e o segundo dedo para fixar a posição do mouse. O rato pode saltar ou fazer movimentos bruscos; Se ele faz, rapidamente responder e puxar para trás os cortadores para evitar ferimentos.
    2. Raspar o cabelo do rato com uma tosquiadeira de cabelo (Figuras 1A, 1B). Posicione a lâmina paralela à pele do mouse e raspar toda a volta do pescoço para a cauda, incluindo toda a volta da cauda, para permitir uma grande área de superfície suficiente para colocar um curativo de filme transparente (ver tabela de materiais). Leve a lâmina contra a direção do crescimento do cabelo para o corte mais eficiente. (Figura 1B).
      1. Não pressione a lâmina profundamente na pele, uma vez que pode danificar a pele por nódoas negras ou corte.
  2. Aplicação de loção depilatória
    Nota: Use loção depilatória para obter uma pele muito lisa para que o curativo transparente pode aderir firmemente.
    1. Mergulhe a pele do rato com água para evitar queimaduras químicas pressionando levemente um papel encharcado limpe contra a pele raspada com pressão suficiente para molhar o cabelo já cortado para baixo contra a pele.
    2. Enquanto a pele está molhada, esfregue levemente a pele do rato com um pequeno montão de loção depilatória (ver tabela de materiais) para 15-20 s (figuras 1C, 1D). Espalhe a loção completamente sobre onde quer que o cabelo foi cortado curto. Use mais loção se o mouse é maior.
    3. Não aplique loção nas orelhas do mouse, cauda, ou em qualquer lugar perto do rosto. Se a loção fica sobre as orelhas ou cauda, Basta limpar com um papel molhado limpe até enxaguar. Se a loção fica na face do rato, lave imediatamente o rato a torneira running ou a água deionizada para impedir dano aos olhos, ao nariz, e à boca.
    4. Deixe a loção para reagir com o cabelo para um adicional de 20-45 s após a aplicação.
    5. Antes deenxaguar, verifique a conclusão da reacção depilatória, enxugando levemente a loção da pele em vários locais (Figura 1E) com um dedo enluvado ou uma espátula metálica fina. A reação é completa se a pele é rosa sem a presença de cabelo preto. É melhor verificar rapidamente que o cabelo foi realmente removido antes de enxaguar do que enxaguando prematuramente e, em seguida, ter que aplicar loção novamente.
  3. Enxaguar
    Nota: uma vez que a conclusão da reação da remoção do cabelo foi verificada, lave o rato com a torneira running ou a água deionizada para remover a loção depilatórios e para impedir queimaduras químicas.
    1. Coloc o rato na mão gloved esquerda e pressione a base da cauda de encontro à palma com o polegar esquerdo para impedir que o rato se mova ao redor. Feche e endireite o resto dos dedos esquerdos para evitar que o rato morda.
    2. Posicione o mouse para que a região da face/cabeça esteja longe do córrego da água e o córrego da água morna possa cair atrás da cabeça e somente na parte traseira. Rapidamente, mas gentilmente esfregar a parte de trás do mouse com a mão direita gloved para lavar afastado a loção.
    3. Uma vez que a pele do mouse está livre da loção, limpe rapidamente o mouse com uma toalha de papel para absorver a maior parte da água (Figura 1F).
  4. Cuidados após o barbear e depilação
    1. Verifique e limpe qualquer loção depilatória residual que pode permanecer nas orelhas e cauda com uma limpeza de papel molhado.
    2. Coloque o mouse de volta em sua gaiola individual e coloque a gaiola em uma almofada de aquecimento (40-45 ° c) por cerca de 30 min. O rato deve retornar ao comportamento normal, scurry ao redor, e o noivo próprio dentro de alguns minutos.
    3. Casa cada rato em uma gaiola separada durante toda a duração do experimento. A pele dos ratos não é mais protegida e pode ser facilmente arranhada e mordida por outros ratos.
    4. Uma vez que a loção depilatória pode ter efeitos irritantes leves que podem interferir com ou alterar o processo de cicatrização de feridas, aguarde 18-24 h antes da cirurgia para permitir que a pele do mouse para acalmar e o mouse para ajustar a falta de cabelo em suas costas.
  5. Removendo o cabelo da pele com pigmentação escura
    Nota: alguns DB/DB-/- camundongos potencialmente terão manchas escuras na pele que terá o cabelo crescendo de volta mais rápido e mais forte do que a pele sem esses patches. (Figura 2A). Estas áreas escuras da pele aparecem mais escuras na cor devido aos folículos de cabelo do estágio do Mid-Late anágena e/ou ao incontinence do pigmento29,30.
    1. Se manchas escuras são notadas, aplique loção depilatória novamente, mas apenas nessas áreas, e repita o passo 4,2 e 4,3 (figuras 2B, 2C).
      Nota: os remendos escuros da pele crescerão o cabelo mais rapidamente durante todo a duração do experimento, assim que Grampeie o cabelo curto cada 3-5 dias, quando necessário. Um remendo ou dois longe da posição desejada da ferida é aceitável. Se a parte de trás do mouse é significativamente coberto por esses patches escuros, não use este mouse para o modelo de ferida crônica.

5. configuração do reagente

Nota: o desenvolvimento de feridas crônicas em camundongos DB/DB-/- é realizado por tratamento com inibidores específicos para catalase e glutationa peroxidase, 3-amino-1, 2,4-triazol (ATZ) e ácido mercaptosuccinic (MSA), respectivamente16 . O procedimento seguinte detalha a dose e a administração da analgesia e dos inibidores baseados no peso do rato.

  1. Injete o analgésico Buprenex via intraperitoneal em 0, 5 mg/kg de rato em PBS estéril. Injete um volume de 120 μL para um rato de 60 g aproximadamente 30 minutos antes da cirurgia. Administrar outra dose 6 h após a cirurgia. Uma dose extra pode ser administrada conforme necessário.
  2. Injete ATZ intraperitonealmente a 1 g/kg de rato em PBS estéril. Injete um volume de 480 μL para um rato de 60 g aproximadamente 20 minutos antes da cirurgia. Injete metade do volume no lado esquerdo do abdômen e a outra metade no lado direito.
  3. Deposite MSA topicamente na ferida entre o curativo transparente e o tecido da ferida em 150 mg/kg de rato em PBS estéril. Administrar um volume de 60 μL para um rato de 60 g dentro de 10 minutos após a cirurgia.

6. cirurgia

Nota: o sucesso do modelo de ferida crônica depende de condições não estéreis. Estes camundongos não são livres de germes e estão alojados em um Vivarium convencional. O microbioma das bactérias que reside na pele é crucial para a iniciação e o desenvolvimento subseqüentes de feridas crônicas em cima do tratamento com os nervos inibidores de enzimas antioxidantes. Portanto, a preparação pré-cirúrgica tradicional do local é contraindicindicada.

  1. Injeção intraperitoneal
    1. Prenda o rato na porção inclinada da cremalheira da gaiola e segure a cauda com o rato confortavelmente de pé com a cabeça mais baixa do que o corpo do rato. Isto assegura-se de que nós tentamos mover os órgãos internos tão faraway do ponto da injeção possível.
    2. Insira a agulha no quadrante inferior direito do abdômen para evitar a injeção na bexiga, ou outros órgãos abdominais.
    3. Aspirar a agulha antes da injecção.
  2. Tratamento e anestesia
    1. Administrar Buprenex 30 min e ATZ 20 min antes da cirurgia, conforme descrito nas etapas 5,1 e 5,2.
    2. Coloque o mouse em um pequeno recipiente de plástico em cima de uma almofada de aquecimento quente, como mostrado na Figura 3a para aproximadamente 15-20 min. fornecer suporte térmico antes do procedimento protege contra a mortalidade potencial.
    3. Coloque um pano de papel ou toalha de papel sobre a parte superior do recipiente pequeno para melhor conter o calor. O rato deve acalmar-se enquanto aquece. Figura 3 B mostra materiais necessários para a cirurgia.
    4. Coloque o mouse em um recipiente fechado que é ligado ao vaporizador isoflurano na capa química se estiver usando um sistema aberto.
    5. Em um sistema aberto, administre 5% de isoflurano por 1-2 min a uma vazão de 2-3,5 L/min. Monitore continuamente o status do mouse.
      1. Uma vez que o mouse está inconsciente ou não mais se movendo, coloque o mouse sobre uma almofada cirúrgica branca e encaixar a cabeça com um cone de nariz que é fixado ao vaporizador para permitir a administração contínua de isoflurano durante a cirurgia.
    6. Em um sistema aberto, administrar 2-3% isoflurano na mesma vazão durante a cirurgia e ajustar ao fluxo de isoflurano para manter a profundidade da anestesia.
    7. Minimize a concentração e a duração do isoflurano administrado durante a cirurgia. DB/DB -/- camundongos são muito sensíveis à anestesia por isso é melhor manter a exposição ao isoflurano a um mínimo. Se o rato ainda estiver responsivo após 2 min a 5% de isoflurano, fixe o cone nasal e administre 3-5% de isoflurano por 15-30 s antes de iniciar a cirurgia.
      1. Confirme a anestesia adequada antes de ferir. A profundidade da anestesia é confirmada pela falta da resposta aos estímulos físicos tais como a pitada forte do dedo do pé. O comprimento do tempo do rato a anestesia inalada está 5 minutos assim que nenhuma pomada do veterinário é aplicada aos olhos.
  3. Ferindo
    1. Pulverize uma limpeza de papel com 70% de etanol ou um towelette de etanol clínico e limpe a parte de trás do mouse para limpar a área do local da ferida. Limpe a superfície da pele para que o curativo transparente possa aderir firmemente, uma vez que a poeira da cama, comida ou pele pode impedir o curativo de furar corretamente (Figura 4A). Não limpe excessivamente, ou haverá um risco de matar as bactérias presentes na pele.
    2. Determine a posição do local da ferida. O melhor lugar para executar a ferida está no lado dorsal do mouse, centrado e longe de manchas de pele com maior pigmentação.
      Nota: nós determinamos pela experiência que estes ratos podem somente suportar a carga de uma ferida.
    3. Crie uma ferida dentro de 30-45 s usando um perfurador da biópsia da pele de 7 milímetros, uns pinças e uma tesoura cirúrgica. Pressione levemente o perfurador da biópsia no local desejado da ferida e torça o perfurador ao redor apenas profundamente bastante para deixar uma impressão ligeira do perfurador (Figura 4B). Extirpar a pele delineada puxando o centro do perfurador com pinças e cortando ao longo do contorno com tesouras cirúrgicas (figuras 4C-4E).
    4. Cubra a ferida firmemente com metade de um pedaço de curativo de filme transparente (6 cm x 3,5 cm).
    5. Parar a administração de 2% de isoflurano para o rato (Figura 4F).

7. tratamento pós-cirúrgico e recuperação

  1. Administrar o tratamento de MSA depois que a cirurgia é completa e o curativo transparente é aplicado como descrito em etapa 5,3. Deposite MSA na área da ferida o curativo.
  2. Coloque o mouse de volta no recipiente pequeno na almofada de aquecimento por 30 min para ajudar com a recuperação. Uma vez que o mouse se aqueceu, coloque o mouse de volta em sua gaiola. O efeito do isoflurano é temporário, e o mouse deve estar se movendo logo em seguida.
  3. Não deixe os ratos desacompanhado nem os retorne ao biotério até que os ratos recuperem a consciência suficiente para manter o recumbency esternal.
    Nota: a anestesia de escolha quando se trabalha com estes camundongos é isoflurano precisamente devido à sua rápida indução e subsequente emergência da anestesia.
    1. Os ratos da casa que se submeteram à cirurgia individualmente para evitar um rato que interfere com a ferida crônica de outro. Como mencionado acima, eles não retornam ao biotério até totalmente recuperado.
  4. Administrar a segunda dose de Buprenex 6 h após a cirurgia.
  5. Observe os ratos cuidadosamente para o primeiro 48 h após a cirurgia.
    Nota: a cirurgia, juntamente com os inibidores para criar a ferida crônica, é muito estressante no animal que já é diabético e obeso. Os camundongos que sobrevivem aos primeiros dias após a cirurgia geralmente sobreviverão à duração do experimento.

8. coleta de dados, estratégias de sobrevivência, manipulação dos ratos após Wounding, e dicas adicionais

  1. Coleta de dados
    1. Tire fotos tão cedo quanto imediatamente após a cirurgia. Biofilmes são observados em qualquer lugar entre 5-10 dias após o ferimento, e tão cedo quanto 3 dias.
    2. Se as bactérias são o foco da análise, role uma troca estéril com pressão clara em torno da ferida para 10-15 s. armazene o cotonete, em um meio de congelação apropriado para cultivo ou seque sem meios para a análise de sequenciamento independente da cultura, a-80 ° c. Colete substâncias poliméricos extracelulares através de uma espátula metálica estéril em um tubo de microcentrífuga e armazene a-80 ° c antes da análise.
    3. Não administrar a anestesia ao rato durante a manipulação para a coleção do biofilme ou a tomada da imagem. Durante estes procedimentos, coloque um pedaço de alimento na frente do mouse para acalmar o mouse para baixo e impedi-lo de fugir. A maioria dos ratos vai subir em cima da comida, sentar-se sobre ele, e não se mover.
  2. Como infecções secundárias e feridas crônicas não intencionais ou úlceras podem se desenvolver se o mouse não estiver se movendo corretamente ou se o curativo não for aplicado corretamente, verifique periodicamente a atividade do mouse e o lado ventral para feridas. A fricção entre a pele e o fundamento molhado (DB/DB-/- ratos é polyuric) pode perturbar a pele se as gaiolas não são mudadas freqüentemente.
    Nota: o acúmulo de fluido o curativo pode fazer com que o adesivo perca sua viscosidade e permita que o fluido vaze. Célula da pele morta, roupa de cama, e matéria fecal pode então furar a pele e endurecer. Estes remendos secos e os agregados na pele devem ser cancelados prontamente para impedir uma infecção secundária.
  3. Se os ratos se levantar ou sentar-se em suas patas traseiras, mova estes ratos para uma gaiola onde o acesso a alimentos e água é muito menor. Se a posição do alimento e da água na gaiola é elevada, o rato pode estar ou sentar-se em suas patas traseiras para alcançá-la. A maioria de ratos não terão um problema comer e beber se poderiam fazê-lo antes da cirurgia, embora haja uma possibilidade que alguns ratos puderam lanç sobre em suas partes traseiras. Estes "nadadeiras" podem ter grande dificuldade em virar para que eles vão precisar de assistência e monitoramento adicional.
  4. Deixe o curativo transparente na pele por até 20 dias se a pele é clara de detritos, pele flakey e cabelo. Se algum destes ocorrer na pele, retire o curativo antigo e aplique uma nova peça.
    1. Para tirar o curativo, levemente apertar a pele diretamente atrás da cabeça, em seguida, puxe o curativo longe da cabeça em um movimento suave.
    2. Para colocar um pedaço de molho em segurança, ter o mouse ficar o mais ainda possível. É importante que a pele está limpa e livre de células mortas escamosa da pele, poeira da cama, e pedaços de comida. Coloque e, em seguida, pressione o curativo na pele ao redor da ferida para fixar.
    3. Se colocar uma parte de alimento na frente do rato não limita seus movimentos, a seguir coloc o rato sobre a gaiola do fio. Uma vez que o rato agarrou um trilho na gaiola, segure a cauda tão perto do corpo quanto possível e puxe com força mínima. Como o mouse puxa para a frente a parte de trás vai esticar e endireitar para fácil aplicação; Coloque o curativo firmemente neste ponto.
    4. Nunca reutilize um curativo antigo. Aplique sempre o novo curativo na parte de trás para obter a maior aderência.

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Representative Results

A Figura 5 mostra um exemplo de uma ferida sem tratamento de nervos inibidores que progridem para o fechamento da ferida e uma ferida com o tratamento de nervos inibidores que progridem para a cronicidade. A limpeza transparente foi deixada no lugar na ferida crônica de modo que o biofilme e a acumulação fluida possam ser vistos.

A iniciação crônica da ferida ocorre em menos de 6 horas e a margem da ferida é visivelmente alterada do estresse oxidativo. A evidência histológica desta margem da ferida revela que o tecido é necrótico e não participará da cicatrização de feridas. As bactérias formadoras de biofilme na ferida podem posteriormente usar este tecido necrótico como uma fonte de nutrientes e componentes estruturais para produzir biofilme. Uma ferida crônica é uma ferida que permanece aberta, ampliada em comparação com a ferida inicial, contém biofilme (EPS mais bactérias patogênicas encontradas em feridas crônicas humanas) e leva meses ou anos para curar dependendo da quantidade e conteúdo do biofilme que previne a ferida de resolver normalmente. No modelo da ferida crônica, a cronicidade completa é definida para > 20 dias após a cirurgia, pois as feridas não tratadas com os inibidores fechará por esse tempo (Figura 5). A cicatrização normalmente leva > 60 dias e o tempo depende das bactérias patogénicas primárias presentes na ferida. Às vezes, os camundongos podem sucumbir à infecção quando bactérias formadoras de biofilme mais agressivas, como Pseudomonas, predominam na ferida. Assim, uma ferida crônica é definida como uma ferida que não vai fechar dentro de 20 dias, leva mais de 60 dias para curar, e tem biofilme presente na ferida.

Diferenças sexuais foram encontradas em vários modelos de diabetes, incluindo o DB/DB-/- mouse modelo32,33. Embora existam diferenças, observamos que o sexo não é um fator significativo no desenvolvimento de feridas crônicas. Feridas crônicas em camundongos machos e fêmeas desenvolvem-se a uma extensão semelhante, portanto, ambos os sexos podem ser usados para estudar feridas crônicas. Assim, utilizar este modelo é vantajoso desde que as feridas crônicas humanas podem ser encontradas em pacientes masculinos e fêmeas do diabético.

Figure 1
Figura 1 . Processo de barbear e depilatório. (A) o ratoantes de fazera barba. (B) a pele do mouse é raspada para remover a maior parte do cabelo na parte de trás. (C) um montão de loção depilatória na ponta de um dedo. Mais é usado se o mouse é maior. (D) a parte traseira do rato é coberta com a loção depilatórios e deixada para reagir. (E) uma espátula é usada para raspar algumas das loção para ver se o cabelo foi removido. Pele rosa brilhante, sem qualquer presença de cabelo é indicativo de que a remoção do cabelo está completa. (F) a loção na parte de trás é removida com água corrente. A pele do rato deve ser ligeiramente rosa. Este número foi modificado de Kim e Martins-Green31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Removendo o cabelo de manchas menores de pele escura. (A) o rato já foiTratado uma veze a pele está molhada novamente para evitar queimaduras. (B) loção depilatória só é aplicado sobre o remendo da pele que é escuro e tem cabelos densos. (C) a loção é lavada após a reação para revelar o remendo escuro da pele sem cabelo. Este número foi modificado de Kim e Martins-Green31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Pré-cirurgia configurada. (A) os camundongos que devem ser feridos são colocados em pequenos recipientes plásticos em cima de uma almofada de aquecimento. (B) alguns dos materiais utilizados na cirurgia são mostrados. A tesoura cirúrgica precisa ser afiada para garantir que a pele não é esmagado quando cortado. O curativo transparente é cortado ao meio. Este número foi modificado de Kim e Martins-Green31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Fazendo a ferida da excisão. (A) depois que o mouse está anestesia, a parte de trás do mouse é limpa com 70% de etanol uma vez. (B) o perfurador da biópsia da pele é coloc na parte traseira do rato e pressionado duramente bastante para deixar uma impressão. O perfurador da biópsia pode ser girado para fazer uma incisão rasa. (C) o meio da área esboçada é comprimido com pinças e uma tesoura cirúrgica afiada é usada para fazer a incisão inicial. (D) as tesouras cirúrgicas são manobradas para cortar ao longo do contorno feito pelo perfurador da biópsia. (E) uma região da pele esboçada pela bomba da biópsia é extirpada com sucesso. (F) o curativo transparente é posicionado na parte de trás do mouse e fixado. Este número foi modificado de Kim e Martins-Green31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Fotos de feridas. (A) a feridaem um ratoem épocas sucessivas após a cirurgia como progride na cronicidade que começa no dia da cirurgia. O biofilme pode ser visto tão cedo quanto o dia 5 e detectado tão cedo quanto o dia 3. A ferida é totalmente crônica com biofilme forte no dia 20. (B) exemplos de feridas crônicas humanas, especificamente úlceras do pé diabético. Este número foi modificado de Kim e Martins-Green31. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Uma vez que as feridas crônicas são criadas nos camundongos, o modelo pode ser usado para estudar os processos de cicatrização de feridas envolvidas no início da cronicidade. O modelo também pode ser usado para testar a eficácia de uma ampla gama de produtos químicos e drogas que podem reverter o desenvolvimento de feridas crônicas e cicatrização prejudicada e levar ao fechamento da ferida e cicatrização. Os pontos de tempo diferentes após o início da cronicidade podem ser estudados: por exemplo, dias 1-5 após o ferimento para o início adiantado da cronicidade e dos dias 20 e além para feridas crônicas da força cheia.

O modelo de ferida crônica também é um modelo poderoso para estudar vários aspectos da cicatrização de feridas e complicações como Bioburden e caquexia. Bioburden é apenas uma das muitas facetas de feridas crônicas que podem ser estudadas neste modelo, pois também afeta feridas crônicas humanas. Nossos procedimentos e protocolo de uso animal identificam claramente a sintomologia a ser monitorada, juntamente com um cronograma de monitoramento definido. Os animais identificados como mórbidos, com base nos critérios aprovados pela IACUC, são eutanasiados para evitar sofrimento significativo. Além disso, o veterinário universitário e o técnico de saúde animal são consultados quando determinadas sintomologias surgem e fornecem orientação de suporte na avaliação dos critérios.

As etapas críticas dentro do protocolo incluem a carcaça o DB/DB-/- ratos em um Vivarium convencional, removendo o cabelo com loção depilatórios, e o aquecimento antes da administração do isoflurano. O desenvolvimento de feridas crônicas no modelo de ferida crônica depende de condições e práticas não estéreis. Estes camundongos não são livres de germes e não crescem em vivariums muito limpos. A microflora que reside na pele é crucial para a iniciação subseqüente e o desenvolvimento de feridas crônicas em cima do tratamento com nervos inibidores para enzimas anti-oxidantes. Estes DB/DB-/- camundongos devem ser expostos a um ambiente que contenha bactérias, tanto comensais como patogênicas. Se a pele é limpa e dis-infectados com iodo ou outros métodos anti-séptico antes da cirurgia, a fim de "esterilizar" a pele, a ferida pode não se tornar crônica. As bactérias no microbioma da pele são necessárias para a formação e desenvolvimento de biofilme, e retardar a cicatrização e fechamento da ferida. Na clínica, a presença de biofilme em uma ferida complica ainda mais os processos de cicatrização de feridas e aumenta o risco de amputação em humanos se a infecção na ferida não for controlada.

Removendo o cabelo com loção depilatória é um passo importante para remover o excesso de cabelo e permitir uma superfície lisa e limpa para o curativo transparente para aderir firmemente. A loção depilatória utilizada neste protocolo é um produto químico depilatório com Aloe adicionado para minimizar queimaduras. Este produto é mínimo em alterar a morfologia da pele, bem como preservar o microbioma da pele. O produto listado na tabela de materiais é recomendado sobre outros produtos de remoção de pêlos, incluindo depilatórios físicos e mecânicos (ceras e depiladores comerciais) que podem queimar e rebocar a pele e/ou matar o micróbio da pele. Mesmo que este depilatório químico é fisicamente gentil, ele ainda pode irritar a pele ligeiramente, um efeito que poderia alterar os processos de cicatrização de feridas. Assim, é mais eficaz esperar 18-24 horas antes da cirurgia para permitir que a pele recupere-se do procedimento e assegure-se de que a pele e a ferida não estejam afetadas por ela.

Estes camundongos são extremamente dóceis e não responsivos aos estressores. Eles são muito fáceis de manusear sem anestesia. Eles são calmos o suficiente para colocar em uma palma ou em cima de um banco sem fugir. Se a base da cauda do mouse é fixado com o polegar eo segundo dedo, o mouse não será capaz de fugir ou voltar a morder devido ao seu tamanho grande barriga. É importante ressaltar que, em nossa experiência, esses camundongos são extremamente sensíveis à anestesia, especialmente no que se refere à perda da homeostase. Assim, em consulta com o nosso IACUC, determinou-se que a melhor opção é limitar a administração anestésica.

O principal objetivo deste modelo é criar uma grande ferida de corações em suas costas, então uma vez que uma ferida é feita, segurando um mouse convencionalmente para fazer injeções de IP de Buprenex adicional ou outros tratamentos químicos periodicamente é impossível. Segurando o mouse pela pele dorsal faz com que o mouse um monte de desconforto e muito possivelmente dor se o mouse é realizada de forma tão tradicional; assim, toda a injeção com o lado direito do mouse para cima enquanto ele está de pé em todos os quatro pés. Outros experimentos utilizando o DB/DB-/- Strain usam esses camundongos quando são mais jovens e não pesam tanto, portanto, a maneira tradicional de realizar uma injeção de IP pode ser usada. Desde que o modelo crônico da ferida utiliza ratos até 6 meses da idade e estes ratos podem pesar até 80 g, o método convencional não é óptimo e pode potencial ferir o rato. Nós utilizamos o método descrito acima para um rato este obeso e não observamos nenhuns resultados adversos quando injetados com este método com aspiração bem sucedida.

Anteriormente, utilizou-se anestesia injetável como cetamina e xilazina; no entanto, eles se mostraram difíceis de usar com DB/DB-/- MICE. Com um tempo de operação total de menos de 5 minutos, a indução e o tempo de recuperação longos não eram necessários para os propósitos do experimento. O isoflurano foi determinado como a melhor escolha da anestesia para este procedimento devido à fácil administração e titulação, início rápido e recuperação, e profundidade anestésica adequada. Além disso, o isoflurano provoca depressão cardíaca mínima e mantém a PA muito bem34. Assim, uma grande mudança no procedimento para o modelo de ferida crônica foi o uso de isoflurano como a anestesia preferida.

O aquecimento antes da cirurgia é importante para prevenir a mortalidade nos 2-3 dias após a cirurgia. Estes ratos têm significativamente menor temperatura corporal do núcleo35 e não são capazes de controlar a sua temperatura corporal central efetivamente devido à sua manipulação genética, de modo que uma fonte de aquecimento externa é fornecida antes da cirurgia para proteger contra o queda adicional na temperatura corporal do núcleo induzida pela anestesia. Nós avaliamos a necessidade para uma almofada de aquecimento antes, durante, e após a cirurgia. É importante notar que DB/DB-/- camundongos têm respostas fisiológicas incomuns. Empirically, nós encontramos estes ratos para ser protegidos o mais eficazmente com sustentação de calor pre-e borne-cirúrgica. Ao substituir o isoflurano como anestésico, medimos e determinamos que a temperatura corporal central não se soltava significativamente durante os menos de cinco minutos de cirurgia. Quando nós tivermos encontrado o apoio de calor pre-e borne-cirúrgico ser crítico para estes ratos, nós não encontramos a sustentação de calor cirúrgica para ter um efeito. Deve-se notar que a cadeira IACUC forneceu orientação e monitorou nossos testes relacionados à temperatura e efeitos anestésicos. Como estamos comunicando esse método, achamos importante indicar o que é necessário para o sucesso do procedimento.

Uma limitação de utilizar este método para estudar o desenvolvimento de biofilme é o fato de que as bactérias presentes na ferida e produzindo o biofilme não são controladas. Se uma bactéria formadora de biofilme específica deve ser estudada, este modelo pode ser útil se o microbioma nativo pode ser abolido antes de ferir ou através de iodo ou outros métodos anti-séptico. Em resposta a níveis excessivos de estresse oxidativo, as principais bactérias patogênicas no microbioma cutâneo são estimuladas para iniciar a formação de biofilme. Em nossas feridas crônicas, bactérias formadoras de biofilme incluem, mas não se limitam a, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 , 39, e várias espécies de Staphylococcus40,41 e Corynebacterium 41,42,43,44, 45, todos os quais podem ser encontrados em feridas crônicas humanas. Vários estudos de microbioma de feridas crônicas foram conduzidos em feridas crônicas humanas para as bactérias39,40,41,43,44,45 , e fungos46,47 Comunidade, incluindo levantamentos longitudinais associados à má cicatrização48,49. Os estudos longitudinais desta natureza podem igualmente ser seguidos completamente com o modelo crônico da ferida.

É importante reconhecer que diferentes resultados podem ser obtidos devido a diferenças nas condições de vivaria, suprimentos e equipamentos, vendedores e colônias de origem para camundongos DB/DB-/- . Para minimizar tais diferenças, fornecido no protocolo é a variedade exata dos ratos e a fonte que é usada para o experimento crônico da ferida. Para o pecuária destes ratos, as marcas exatas do fundamento e do alimento foram fornecidas na tabela dos materiais para limitar a variabilidade. Em nossos experimentos, achamos que o alto estresse oxidativo é necessário e suficiente para criar feridas crônicas nesses camundongos, contanto que os camundongos estejam alojados em um Biotério convencional e expostos a bactérias. Populações de bactérias e comunidades podem diferir com vivaria; Entretanto, contanto que uma facilidade germe-livre não seja usada para abrigar os ratos, devem ter bastante bactérias, comensais e patogénicos, para residir no cabelo e na pele.

Este método de criação de feridas crônicas neste protocolo é significativo para o estudo de feridas crônicas e cicatrização de feridas prejudicada porque apenas os níveis de estresse oxidativo são significativamente alterados experimentalmente. Estresse oxidativo é necessário para processos normais de cicatrização de feridas2. É importante para a regulação oportuna e um componente crucial na funcionalidade das células necessárias para a cicatrização de feridas5. No entanto, quando os níveis de estresse oxidativo não são controlados, as espécies reativas de oxigênio podem danificar as células do endothelia, inibir a funcionalidade de queratinócitos e atrasar o fechamento da ferida2,5. As feridas crônicas humanas têm altos níveis de estresse oxidativo50. O modelo do camundongo tem alta glicemia e já aumentou os níveis de estresse oxidativo devido à sua morbidade. Estas características são compartilhadas com os seres humanos que vivem com diabetes e fornecem um microambiente propício para a cronicidade após a lesão de sustentação50. Os seres humanos também hospedam microbiota diversificada e complexa em muitos locais no corpo, incluindo a pele, de modo que um complexo, mas natural, microbioma é permitido desenvolver na pele do mouse.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores não têm agradecimentos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

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