Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Протокол для создания хронических ран у диабетических мышей

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Хронические раны развиваются из острых ран на диабетической модели мыши, вызывая высокий уровень окислительного стресса после полной толщины кожной раны. Рана лечится ингибиторами для каталазы и глутатиона пероксидазы, в результате чего нарушения заживления и развития биопленки бактериями, присутствующими в микробиоме кожи.

Abstract

Хронические раны развиваются в результате дефектной регуляции в одном или нескольких сложных клеточных и молекулярных процессах, участвующих в правильном заживлении. Они влияют на людей в размере 6,5 млн евро и обходятся в 40 млрд евро в год только в США. Хотя значительные усилия были вложены в понимание того, как хронические раны развиваются у людей, фундаментальные вопросы остаются без ответа. Недавно мы разработали новую модель мыши для диабетических хронических ран, которые имеют много характеристик человеческих хронических ран. Использование db/db-/- мышей, мы можем генерировать хронические раны, вызывая высокий уровень окислительного стресса (ОС) в раневой ткани сразу после ранения, используя одноразовое лечение ингибиторами, специфичными для антиоксидантных ферментов каталазы и глутатион пероксидаза. Эти раны имеют высокий уровень ОС, развивать биопленку естественно, становятся полностью хроническими в течение 20 дней после лечения и может оставаться открытым более чем на 60 дней. Эта новая модель имеет много особенностей диабетических хронических ран у людей и, следовательно, может внести значительный вклад в продвижение фундаментального понимания того, как раны становятся хроническими. Это большой прорыв, потому что хронические раны у людей вызывают значительную боль и страдания пациентов и привести к ампутации, если нерешенными. Кроме того, эти раны являются очень дорогими и отнимают много времени для лечения, и привести к значительной потере личного дохода для пациентов. Достижения в этой области исследования с помощью нашей хронической модели раны может значительно улучшить здравоохранение для миллионов людей, которые страдают в соответствии с этим изнурительным состоянием. В этом протоколе мы подробно описываем процедуру причинения острых ран, чтобы стать хроническими, чего раньше не делалось.

Introduction

Заживление ран включает в себя сложные клеточные и молекулярные процессы, которые временно и пространственно регулируются, организованы в последовательных и перекрывающихся стадиях, которые включают в себя множество различных типов клеток, включая, но не ограничиваясь иммунным ответом и сосудистыми система1. Сразу же после того, как кожа выдерживает травмы, факторы и кровяные клетки агрегируются в месте раны и инициировать каскад коагуляции, чтобы сформировать сгусток. После гомеостаза кровеносные сосуды удаляется, чтобы впустить в рану участок кислорода, питательных веществ, ферментов, антител и хемотактических факторов, которые хемопривлекательные полиморфонуклеоциты, чтобы очистить раневое ложе иностранного мусора и выделяют протеолитические ферменты 2. Активированные тромбоциты выделяют различные факторы роста, чтобы стимулировать кератиноциты на краю раны, чтобы повторно эпителиализировать раненый участок. Моноциты, завербованные в рану, дифференцируются в макрофаги, которые бактерии фагоцитов и мертвые нейтрофилы и выделяют дополнительные факторы для поддержания пролиферативного и промиграторного сигнала кератиноцитов. В фазе распространения, в то время как реэпителиализация продолжается, новая ткань гранулирования, состоящая из фибробластов, моноцитов / макрофагов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток, продолжает процесс восстановления2. Ангиогенез стимулируется путем поощрения пролиферации эндотелиальных клеток и миграции, что приводит к разработке новых судов. Эпителилиизация и реконструкция внеклеточной матрицы подоравлетокружающе барьер против окружающей среды. Как рана заживает и гранулирования ткани развивается в шрам, апоптоз устраняет воспалительные клетки, фибробласты, и эндотелиальные клетки, не вызывая дополнительного повреждения тканей. Прочность ткани усиливается за счет фибробластов, реконструирующих различные компоненты внеклеточной матрицы, таких как коллаген, так что вновь сформированная ткань почти такая же сильная и гибкая, как и невредичная кожа2.

Любое отклонение от этого высоко согласованного прогрессирования к замыкания ран приводит к нарушениям и/или хроническим ранам3. Хронические раны характеризуются повышенным окислительным стрессом, хроническим воспалением, поврежденным микроваскуляром и аномальной коллагеновой матрицей в ране4. Оксидативный стресс, особенно в ране, может задержать закрытиераны2,5. Когда на первом этапе заживления ран воспалительные фазы становятся нерегулируемыми, ткань хозяина предполагает значительный ущерб из-за постоянного притока воспалительных клеток5, которые высвобождают цитотоксические ферменты, увеличение свободных кислородных радикалов и нерегулируемых воспалительных посредников, приводящих к гибели клеток6,7.

В этой разрушительной микросреде биопленкообразующие бактерии используют питательные вещества хозяина и способствуют повреждению ткани хозяина2. Эти биопленки трудно контролировать и удалять, потому что гидратированные внеклеточные полимерные вещества, состоящие из белков, ДНК, РНК и полисахаридов, позволяют бактериям, укрытым внутри, быть терпимыми к обычной антибиотикотерапии и уклоняться от врожденный и адаптивный иммунный ответ хозяина2,8,9.

Изучение хронических ран имеет решающее значение, поскольку они влияют на 6,5 миллионов человек и стоят 40 миллиардов фунтов стерлингов в год только в США10. Пациенты с диабетом имеют повышенный риск развития хронических ран, которые требуют ампутации, с тем чтобы сдержать распространение инфекции. Эти пациенты имеют 50% риск смертности в течение 5 лет ампутации, что связано с патофизиологией механизм диабета11. Взаимосвязь между иммунной системой хозяина и микробиом в заживлении ран является жизненно важной темой текущих исследований, потому что последствия хронических ран, если не решены, включают ампутацию и смерть12.

Хотя значительные усилия были вложены в понимание того, как хронические раны развиваются у людей, до сих пор неясно, как и почему образуются хронические раны. Эксперименты по изучению механизмов нарушения заживления трудно проводить у человека, а специалисты по заживлению ран видят только пациентов с хроническими ранами, которые уже достигли хроники в течение нескольких недель и месяцев. Таким образом, специалисты не в состоянии изучить, какие процессы пошли не так, что привести рану развиваться, чтобы стать хроническим2. Существует отсутствие моделей животных, которые резюмируют сложность человеческих хронических ран. До тех пор, пока наша модель не была разработана, никакой модели для хронических исследований ран не существовало.

Хроническая модель раны была разработана у мышей, которые имеют мутацию в рецепторе лептина(db/db-/-)13. Эти мыши страдают ожирением, диабетом, и имеют нарушения исцеления, но не развиваются хронические раны14. Уровень глюкозы в крови в среднем около 200 мг/дл, но может достигать 400 мг/дл15. При высоком уровне окислительного стресса (ОС) в раневой ткани индуцируют сразу после ранения, рана становится хронической16. Db/db-/- раны считаются хроническими на 20 дней и остаются открытыми в течение 60 дней или более. Биопленка, производимая бактериями, начинаетразвиваться через три дня после ранения; зрелый биопленку можно увидеть через 20 дней после ранения и сохраняется до тех пор, пока либо замыкания раны. Биопленкообразующие бактерии, которые мы находим у этих мышей, также встречаются в хронических ранах диабетиков человека.

Оксидативный стресс индуцируется путем лечения ран с двумя ингибиторами антиоксидантных ферментов, каталазы и глутатиона пероксидазы, два фермента с возможностью расщеплять перекись водорода. Перекись водорода является реактивным видом кислорода и может вызвать повреждение клеток в результате окисления белков, липидов и ДНК. Каталаза катализа катализа разложения перекиси водорода в менее вредных химических веществ кислорода и воды. 3-Амино-1,2,4-триазол (АТЗ) ингибирует каталазу, связывая конкретно и ковалентно к активному центру фермента, инактивируя его17,18,19. АТЗ был использован для изучения последствий окислительного стресса как в пробирке и in vivo через ингибирование каталазы20,21,22,23,24. Глутатион пероксидаза катализа сокращение перекиси водорода через антиоксидант, глутатион, и является важным ферментом, который защищает клетку от окислительного стресса25. Меркаптосуччиновая кислота (MSA) ингибирует глутатион пероксидазы путем связывания с селеноцистена активного участка фермента с тиол, инактивируя его26. MSA был использован для изучения последствий окислительного стресса in vitro и in vivo, а также20,27,28.

Эта новая модель хронических ран является мощной моделью для изучения, поскольку она разделяет многие из тех же особенностей наблюдается в человека диабетической хронических ран, в том числе длительное воспаление от увеличения ОС и естественного образования биопленки из микробиома кожи. Раны имеют нарушение кожно-эпидермального взаимодействия, аномальные матричные осаждения, плохой ангиогенез и поврежденные сосуды. Хронические раны будут развиваться как у мужчин, так и у самок мышей, поэтому оба пола могут быть использованы для изучения хронических ран. Таким образом, хроническая модель раны может внести значительный вклад в углубление фундаментального понимания того, как такие раны начинаются. Использование этой хронической модели раны может дать ответы на фундаментальные вопросы о том, как хроника инициируется / достигается за счет вклада от физиологии нарушения заживления ран и микробиом хозяина.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты были завершены в соответствии с федеральными правилами и политикой и процедурами Калифорнийского университета, утвержденными Калифорнийским университетом в Риверсайдском iacUC.

1. Зверь

  1. Используйте диабетические и ожирениеb B6. BKS (D)-Leprdb/J мышей для хронической модели раны. Варианты покупки включают либо гетерозиготы для разведения, либо гомозиготы непосредственно для экспериментов.
  2. Порода гетерозигот мужчин и женщин для производства потомства. Только четверть помета, статистически, будет расти, чтобы стать диабетической и ожирением(db/db-/-).
  3. Wean и дом db/db-/- мыши вместе со своими littermates 3 недели после рождения. Отдельные db/db-/- мыши от их littermates 5 неделей после рождения и дом с другими db/db-/- мышами до тех пор пока они не будут 5-6 месяцев старых и не могут быть использованы для хронической модели раны. За это время может развиться зрелый и сложный микробиом кожи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: db/db-/- мыши легко идентифицируются визуально от littermates между 3-5 неделями времени. DB/db-/- мыши страдают ожирением, диабетик, и будет значительно больше и круглее, чем дикий тип и гетерозиготные littermates. Их живот может появиться немного розовее и бедра больше. Повышенный вес должен быть подтвержден до операции. Кроме того, можно измерить высокий уровень глюкозы в крови и генотип мыши, чтобы подтвердить мутацию в рецепторе лептина.

2. Вивариум и мужство

  1. Дом db/db-/- мыши в обычном vivarium (не барьер/специфически патоген свободно средство) так НОП микрофлора можно установить на коже db/db-/- мышей. Специально моделировать людей, которые страдают от хронических ран, не принимайте особых мер предосторожности, чтобы предотвратить воздействие патогенных микроорганизмов.
  2. Защитите клетки с микро-изолататор вершины, чтобы свести к минимуму распространение инфекции в виварии. Меняйте клетки два раза в неделю с новыми постельными принадлежностями и кормите мышей регулярными вивариовыми чау. Не автоклавировать ни постельные принадлежности или продукты питания.
  3. Установите комнатную температуру в диапазоне от 21 до 24 градусов по Цельсию, с незначительными колебаниями в зависимости от времени года. Влажность, отражающая климат и местоположение, будет варьироваться от 19 до 70%.

3. Требования к развитию хронических ран

  1. Используйте только мужские и женские мыши, которые фенотипически страдают ожирением, диабетом, и по крайней мере 5-6 месяцев для развития хронических ран. Вес этих мышей должен варьироваться в пределах 40-80 г, в среднем около 60 г.
  2. Не используйте мышей, которые считаются ожирением, но весят менее 50 г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все мыши, упомянутые в этом протоколе, проходят описанные здесь квалификации, если не указано иное.

4. Бритье и применение депилативного лоточного

ПРИМЕЧАНИЕ: Удалить нежелательные волосы на низшей части мыши перед ранением. Следующая процедура проводится на живых db/db-/- мышей, которые не находятся под наркозом за день до операции. Примите меры предосторожности, чтобы предотвратить стресс и вред животному.

  1. Бритья
    1. Поместите мышь на чистую поверхность и сцепление основания хвоста мыши с большим и вторым пальцем, чтобы обеспечить положение мыши. Мышь может прыгать или делать резкие движения; если это произойдет, быстро реагировать и отодвинуть клиперы, чтобы предотвратить травму.
    2. Бритье волосы мыши с клипера для волос(рисунки 1A, 1B). Расположите лезвие параллельно коже мыши и побрить всю спину от шеи до хвоста, в том числе все вокруг хвоста, чтобы обеспечить достаточно большую площадь поверхности, чтобы разместить прозрачную пленку повязку (см. Таблица материалов). Слегка запустить лезвие против направления роста волос для наиболее эффективного разреза. (Рисунок 1B).
      1. Не нажимайте лезвие глубоко в кожу, так как это может повредить кожу синяками или резкой.
  2. Применение депилативного лосьона
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте депиляционный лосьон, чтобы получить очень гладкую кожу, так что прозрачная повязка может придерживаться твердо.
    1. Замочите кожу мыши с водой, чтобы предотвратить химические ожоги, слегка нажав пропитанной бумаги протрите против бритой кожи с достаточным давлением, чтобы намочить уже стрижку вниз против кожи.
    2. В то время как кожа мокрая, слегка протрите кожу мыши с небольшой dollop из депилаториевлось лосьон (см. Таблица материалов) для 15-20 с(рисунки 1C, 1D). Распространение лосьон полностью там, где волосы были прерваны. Используйте больше лосьона, если мышь больше.
    3. Не наносите лосьон на уши мыши, хвоста или где-либо рядом с лицом. Если лосьон попадает на уши или хвост, просто протрите влажной бумажной салфеткой до промывки. Если лосьон попадает на лицо мыши, немедленно мыть мышь под запущенным краном или деионизированной воды, чтобы предотвратить повреждение глаз, носа и рта.
    4. Оставьте лосьон реагировать с волосами для дополнительных 20-45 s после нанесения.
    5. Перед промывкой, проверить завершение депиляционной реакции, слегка вытирая лосьон из кожи в различных местах (Рисунок 1E) с перчаточной пальцем или тонким металлическим шпателем. Реакция полна если кожа розовая без присутсвия черных волос. Лучше всего быстро проверить, что волосы на самом деле были удалены до промывки, чем промыть преждевременно, а затем того, чтобы применить лосьон снова.
  3. Промывки
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения реакции удаления волос была проверена, мыть мышь с запущенным краном или деионизированной воды, чтобы удалить депиляционный лосьон и предотвратить химические ожоги.
    1. Поместите мышь на левую руку в перчатках и нажмите на основание хвоста к ладони большим пальцем левой руки, чтобы мышь не двигалась. Закройте и выпрямите остальные левые пальцы, чтобы мышь не кусаться.
    2. Расположите мышь таким образом, чтобы область лица/головы была вдали от потока воды, а поток теплой воды может отставать от головы и только на спине. Быстро, но осторожно руб задней мыши с правой рукой в перчатках, чтобы смыть лосьон.
    3. После того, как кожа мыши свободна от лосьона, быстро протрите мышь бумажным полотенцем, чтобы поглотить большую часть воды(Рисунок 1F).
  4. Уход после бритья и удаления волос
    1. Проверьте и очистите любой остаточный депилационный лосьон, который может остаться на ушах и хвосте с мокрой бумажной салфеткой.
    2. Поместите мышь обратно в свою индивидуальную клетку и поместите клетку на грелку (40-45 градусов по Цельсию) в течение примерно 30 минут. Мышь должна вернуться к нормальному поведению, снуют вокруг, и жених себя в течение нескольких минут.
    3. Размещать каждую мышь в отдельной клетке на протяжении всего эксперимента. Кожа мышей больше не защищена и может быть легко поцарапан и укусил других мышей.
    4. Так как депиляционный лосьон может иметь небольшие раздражающие эффекты, которые могут помешать или изменить процесс заживления ран, подождите 18-24 ч до операции, чтобы мышь кожи успокоиться и мыши, чтобы приспособиться к отсутствию волос на спине.
  5. Удаление волос из кожи с темной пигментации
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые db/db-/- мыши потенциально будут иметь темные пятна в коже, которые будут иметь волосы, растущие быстрее и сильнее, чем кожа без этих пятен. (Рисунок 2А). Эти темные области кожи появляются темнее по цвету из-за середины позднего анагена стадии волосяных фолликулов и / или пигмента недержания29,30.
    1. Если темные пятна заметили, применять депиляционный лосьон снова, но только в этих областях, и повторить шаг 4.2 и 4.3(Рисунки 2B, 2C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Темные участки кожи будут расти волосы быстрее на протяжении всего эксперимента, так клип волосы короткие каждые 3-5 дней, когда это необходимо. Патч или два от желаемого места раны является приемлемым. Если задняя часть мыши значительно покрыта этими темными пятнами, не используйте эту мышь для хронической модели раны.

5. Установка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Развитие хронических ран у дб/дб-/- мышей достигается путем лечения специфическими ингибиторами для каталазы и глутатионовой пероксидазы, 3-амино-1,2,4-триазол (АТЗ) и меркаптосуччиновой кислоты (MSA), соответственно16 . Следующая процедура детализирует дозу и введение анальгезии и ингибиторов на основе веса мыши.

  1. Вводят обезболивающее Buprenex интраперитонево при 0,05 мг/кг мыши в стерильных PBS. Введите объем 120 л для мыши 60 г примерно за 30 минут до операции. Администрирование другой дозы 6 ч после операции. Дополнительная доза может быть предоставлена по мере необходимости.
  2. Впрыскивать АТЗ интраперитонеально при 1 г/кг мыши в стерильных PBS. Введите объем 480 л для мыши 60 г примерно за 20 минут до операции. Введите половину объема на левой стороне живота, а другая половина на правой стороне.
  3. Депозит MSA местно на рану между прозрачной повязкой и раневой ткани на 150 мг/кг мыши в стерильных PBS. Администрирование объема 60 зл для мыши 60 г в течение 10 минут после операции.

6. Хирургия

ПРИМЕЧАНИЕ: Успех хронической модели раны зависит от нестерильных условий. Эти мыши не без микробов и размещены в обычной виварии. Микробиом бактерий, который находится в коже имеет решающее значение для последующего начала и развития хронических ран при лечении ингибиторами антиоксидантных ферментов. Поэтому традиционная предоперационная подготовка участка противопоказана.

  1. Интраперитонеальная инъекция
    1. Закрепите мышь на наклонной части стойки клетки и удерживайте хвост с мышью удобно стоя с головой ниже, чем тело мыши. Это гарантирует, что мы пытаемся переместить внутренние органы, как далеко от точки инъекции возможно.
    2. Вставьте иглу в нижний правый квадрант живота, чтобы избежать инъекций в мочевой пузырь или другие органы брюшной полости.
    3. Аспирируй иглу перед инъекцией.
  2. Лечение и анестезия
    1. Администрирование Buprenex 30 мин и АТЗ 20 мин до операции, как описано в шагах 5.1 и 5.2.
    2. Поместите мышь в небольшой пластиковый контейнер поверх теплой грелкой, как показано на рисунке 3А в течение примерно 15-20 мин. Обеспечение тепловой поддержки до процедуры защищает от потенциальной смертности.
    3. Поместите бумажную салфетку или бумажное полотенце поверх небольшого контейнера, чтобы лучше содержать тепло. Мышь должна успокоиться, как она нагревается. Рисунок 3 B показывает материалы, необходимые для операции.
    4. Поместите мышь в закрытый контейнер, который подключен к изофлуранительи в химическом капоте при использовании открытой системы.
    5. В открытой системе вводят 5% изофлуран в течение 1-2 мин при скорости потока 2-3,5 л/мин. Постоянно следите за состоянием мыши.
      1. После того, как мышь без сознания или больше не движется, поместите мышь на белой хирургической площадке и подходят голову с носом конус, который крепится к испарителю, чтобы непрерывное введение изофруран во время операции.
    6. В открытой системе, управлять 2-3% изофруран с той же скоростью потока во время операции и приспособиться к потоку изофлюран для поддержания глубины анестезии.
    7. Минимизировать как концентрацию, так и продолжительность изолюрани, вводимого во время операции. db/db -/- мыши очень чувствительны к анестезии, поэтому лучше держать изофруран воздействия до минимума. Если мышь по-прежнему реагировать после 2 мин на 5% изофлуран, обеспечить конус носа и управлять 3-5% изофлуран для 15-30 с до начала операции.
      1. Подтвердите надлежащую анестезию перед ранением. Глубина анестезии подтверждается отсутствием реакции на физические раздражители, такие как сильный щепотка. Продолжительность мыши под ингаляционной анестезией составляет менее 5 мин, поэтому на глаза не наносится ветеринарная мазь.
  3. Ранив
    1. Спрей бумаги протрите 70% этанола или клинической этанол полотенце и протрите задней мыши, чтобы очистить область раны сайта. Очистите поверхность кожи, чтобы прозрачная повязка может придерживаться твердо, так как пыль от постельных принадлежностей, продуктов питания или кожи может предотвратить заправку от прилипания должным образом (Рисунок 4A). Не протирайте чрезмерно, или будет риск убить бактерии, присутствующие на коже.
    2. Определите положение места раны. Лучшее место для выполнения раны находится на стороне сонливки мыши, по центру и вдали от пятен кожи с более высокой пигментации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы определили по опыту, что эти мыши могут выдержать только бремя одной раны.
    3. Создайте рану в пределах 30-45 с с помощью 7 мм биопсии кожи удар, пинцет и хирургические ножницы. Слегка нажмите биопсии удар на желаемое место раны и скрутить удар вокруг только достаточно глубоко, чтобы оставить небольшое впечатление от удара (Рисунок 4B). Акциз очерченной кожи, потянув вверх по центру пунш с пинцетом и резки вдоль контура с хирургическими ножницами (Рисунки 4C-4E).
    4. Накройте рану прочно половиной кусочка прозрачной пленки (6 см х 3,5 см).
    5. Остановить администрирование 2% изофлуран к мыши(Рисунок 4F).

7. Послеоперационное лечение и восстановление

  1. Администрирование лечения MSA после операции завершена и прозрачный соус применяется, как описано в шаге 5.3. Депозит MSA на рану области под соусом.
  2. Поместите мышь обратно в небольшой контейнер на грелке в течение 30 минут, чтобы помочь с восстановлением. Как только мышь прогреется, положите мышь обратно в клетку. Эффект изофлюрани является временным, и мышь должна двигаться вокруг вскоре после этого.
  3. Не оставляйте мышей без присмотра и не возвращайте их в вивариум до тех пор, пока мыши не обретают достаточное сознание для поддержания строгого затишья.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия выбора при работе с этими мышами является изолюран именно из-за его быстрой индукции и последующего появления из анестезии.
    1. Дом мышей, которые подверглись операции индивидуально, чтобы избежать одной мыши вмешательства в хроническую рану другой. Как указывалось выше, они не возвращаются в вивариум до полного выздоровления.
  4. Администрирование второй дозы Buprenex 6 ч после операции.
  5. Внимательно наблюдайте за мышами в течение первых 48 ч после операции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Операция, в сочетании с ингибиторами для создания хронической раны, очень напряженный на животное, которое уже как диабетической и ожирением. Мыши, которые выживают первые пару дней после операции, как правило, выжить продолжительность эксперимента.

8. Сбор данных, стратегии выживания, обработка мышей после ранения, и дополнительные советы

  1. Сбор данных
    1. Сфотографируйте уже сразу после операции. Биопленки наблюдаются где-то через 5-10 дней после ранения, и уже в 3 дня.
    2. Если бактерии находятся в центре внимания анализа, рулон стерильный своп с легким давлением вокруг раны в течение 10-15 с. Храните тампон, в соответствующих морозильных носителей для культивирования или сухой без каких-либо средств массовой информации для культуры независимого анализа секвенирования, на -80 градусов по Цельсию. Соберите внеклеточные полимерные вещества с помощью стерильного металлического шпателя в микроцентрифуговую трубку и храните при -80 градусов по Цельсию перед анализом.
    3. Не вводите анестезию к мыши во время обработки для сбора биопленки или съемки. Во время этих процедур, поместите кусок пищи перед мышью, чтобы успокоить мышь вниз и предотвратить его от убегая. Большинство мышей будет подниматься на вершине пищи, сидеть на нем, и не двигаться.
  2. Как вторичные инфекции и непреднамеренные хронические раны или язвы могут развиваться, если мышь не правильно движется или если повязка не применяется правильно, периодически проверяйте активность мыши и брюшной стороны на язвы. Трение между кожей и мокрыми постельными принадлежностями(db/db-/- мыши полюрик) может нарушить кожу, если клетки не меняются часто.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Накопление жидкости под соусом может привести к клею потерять свою липкость и позволить жидкости течь. Мертвые клетки кожи, постельные принадлежности, и фекалии могут придерживаться на кожу и затвердеть. Эти сухие участки и агрегаты на коже должны быть очищены быстро, чтобы предотвратить вторичную инфекцию.
  3. Если мыши стоят или сидят на задних лапах, переместите этих мышей в клетку, где доступ к пище и воде значительно ниже. Если положение пищи и воды в клетке высокое, мышь может стоять или сидеть на задних лапах, чтобы добраться до нее. Большинств мыши не будут иметь проблему еды и выпивать если они смогли сделать так перед хирургией, то хотя возможность что некоторые мыши могли перевернуть сверх на их задние части. Эти "флипперы" могут испытывать большие трудности с переворачивание, поэтому им потребуется помощь и дальнейший мониторинг.
  4. Оставьте прозрачную повязку на коже на срок до 20 дней, если кожа очищена от мусора, шелушии кожи и волос. Если какой-либо из них происходят на коже, удалить старую повязку и применить новый кусок.
    1. Чтобы снять повязку, слегка ущипнуть кожу прямо за головой, а затем вытащить повязку от головы одним плавным движением.
    2. Чтобы поместить кусок соуса на надежно, есть мышь остаться как можно по-прежнему, как это возможно. Важно, чтобы кожа была чистой и свободной от шелушащих омертветельных клеток кожи, пыли от постельных принадлежностей и кусочков пищи. Место, а затем нажмите соусом в кожу вокруг раны, чтобы обеспечить.
    3. Если размещение куска пищи перед мышью не ограничивает ее движения, то поместите мышь на верхнюю часть проволочного клетки. После того, как мышь схватила рельс на клетке, держать хвост как можно ближе к телу, как это возможно и тянуть с минимальной силой. По мере того как мышь вытягивает вперед задняя часть протянет и выпрямит для легкого применения; место соуснадежно в этой точке.
    4. Никогда не повторно использовать старую повязку. Всегда нанесите новый соус на спину для наибольшего сливки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 5 показан пример раны без лечения ингибиторов, идущих к закрытию раны, и рана с лечением ингибиторов, прогрессирующих в направлении хроническости. Прозрачная повязка была оставлена на месте на хронической раны, так что биопленка и накопление жидкости можно увидеть.

Хроническая инициация ран происходит менее чем за 6 часов, и раневой край заметно изменяется от окислительного стресса. Гистологические данные этой раневой поля показывают, что ткань некротическая и не будет участвовать в заживлении ран. Биопленка-образующих бактерий в рану может позже использовать эту некротические ткани в качестве источника питательных веществ и структурных компонентов для производства биопленки. Хроническая рана раны, которая остается открытой, увеличенной по сравнению с первоначальной раны, содержит биопленку (EPS плюс патогенные бактериальные найдены в человеческих хронических ран) и занимает месяц или годы, чтобы залечить в зависимости от количества и содержания биопленки, что предотвращает раны от решения нормально. В хронической модели раны, полная хроника установлена на 20 дней после операции, потому что раны, не обработанные ингибиторами закроется к этому времени(Рисунок 5). Исцеление обычно занимает 60 дней, и время зависит от первичных патогенных бактерий, присутствующих в ране. Иногда мыши могут поддаться инфекции, когда более агрессивные биопленки формирования бактерий, таких как Pseudomonas, преобладают в рану. Таким образом, хроническая рана определяется как рана, которая не закроется в течение 20 дней, занимает более 60 дней, чтобы залечить, и имеет биопленку присутствует на рану.

Различия в поле были найдены в различных мочеисоотшных моделях, включая db/db-/- модель мыши32,33. Хотя такие различия существуют, мы наблюдаем, что секс не является существенным фактором в развитии хронических ран. Хронические раны у мышей мужского и женского пола развиваются в одинаковой степени, поэтому оба пола могут быть использованы для изучения хронических ран. Таким образом, использование этой модели является выгодным, поскольку человеческие хронические раны могут быть найдены на мужчин и женщин больных сахарным диабетом.

Figure 1
Рисунок 1 . Бритье и депиляционный процесс. (A) Мышь перед бритьем. (B) Кожа мыши побрился, чтобы удалить большую часть волос на спине. (C) Кукла из депилаториев лосьон на кончике пальца. Больше используется, если мышь больше. (D) Задняя часть мыши покрыта депиляционным лосьоном и оставлена реагировать. (E) Шпатель используется, чтобы соскребать некоторые из лосьона, чтобы увидеть, если волосы были удалены. Ярко-розовая кожа без присутствия волос свидетельствует о завершении удаления волос. (F) лосьон на спине удаляется с проточной водой. Кожа мыши должна быть слегка розовой. Эта цифра была изменена из Ким и Мартинс-Зеленый31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 . Удаление волос из небольших пятен темной кожи. (A) Мышь уже была обработана один раз и кожа влажная снова для того чтобы предотвратить ожоги. (B) Депилационный лосьон наносится только на участок кожи, который темный и имеет густые волосы. (C) лосьон смывается после реакции, чтобы выявить темный участок кожи без волос. Эта цифра была изменена из Ким и Мартинс-Зеленый31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 . Предоперационная установка. (A) Мыши, которые должны быть ранены помещаются в небольшие пластиковые контейнеры на верхней части грелки. (B) Некоторые из материалов, используемых в хирургии показаны. Хирургические ножницы должны быть острыми, чтобы кожа не была раздавлена при разрезе. Прозрачная повязка разрезана пополам. Эта цифра была изменена из Ким и Мартинс-Зеленый31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 . Изготовление иссечения раны. (A) После того, как мышь находится под наркозом, задняя часть мыши вытирается 70% этанола один раз. (B) Удар биопсии кожи помещается на задней части мыши и нажата достаточно сильно, чтобы оставить впечатление. Биопсия удар может быть повернут, чтобы сделать мелкий разрез. (C) Середина изложенной области ущипнул с пинцетом и острый хирургический ножница используется, чтобы сделать первоначальный разрез. (D) Хирургические ножницы маневрируют, чтобы сократить вдоль контура, сделанного биопсии удар. (E) Область кожи, очерченная биопсией насос успешно вырезаны. (F) Прозрачная повязка расположена на задней части мыши и закреплена. Эта цифра была изменена из Ким и Мартинс-Зеленый31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 . Фотографии ран. (A) Рана на мыши в последующие времена после операции, как она прогрессирует в хронику, начиная с дня операции. Биопленку можно увидеть уже в 5-й день и обнаружить уже в 3-м дне. Рана полностью хроническая с сильной биопленкой на 20-й день. (B) Примеры человеческих хронических ран, в частности, диабетической язвы стопы. Эта цифра была изменена из Ким и Мартинс-Зеленый31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

После того, как хронические раны создаются на мышах, модель может быть использована для изучения нарушенных процессов заживления ран, участвующих в инициировании хроники. Модель также может быть использована для проверки эффективности широкого спектра химических веществ и препаратов, которые могут обратить вспять хроническое развитие раны и нарушения заживления и привести к замыканию ран и заживлению. Различные временные точки после начала хроники могут быть изучены: например, дни 1-5 после ранения для раннего начала хроники и дней 20 и за ее пределами для полной силы хронических ран.

Хроническая модель раны также является мощной моделью для изучения различных аспектов заживления ран и осложнений, таких как биобремаии и кахексии. Биобремения является лишь одним из многих аспектов хронических ран, которые могут быть изучены в этой модели, так как она также влияет на хронические раны человека. Наши процедуры и Протокол об использовании животных четко идентифицируют симптомологию, которая будет контролироваться, наряду с определенным графиком мониторинга. Звери, идентифицированные как болезненные, на основе утвержденных МАКУК критериев, усыпляются во избежание значительных страданий. Кроме того, кампус ветеринарии и животных техник консультации, когда определенные симптомы возникают и обеспечить поддержку руководства в оценке критериев.

Критические шаги в рамках протокола включают корпус db/db-/- мышей в обычной виварии, удаление волос с депилационным лосьоном, и отопление до введения изофруран. Развитие хронических ран в хронической модели ран ы зависит от нестерильных состояний и практики. Эти мыши не без микробов и не растут в очень чистых вивариумах. Микрофлора, которая находится в коже имеет решающее значение для последующего начала и развития хронических ран при лечении ингибиторами для антиоксидантных ферментов. Эти db/db-/- мыши должны подвергаться воздействию среды, которая содержит бактерии, как сопутствующие, так и патогенные. Если кожа очищается и дезинфицирована йодом или другими антисептическими методами до операции, чтобы «стерилизовать» кожу, рана не может стать хронической. Бактерии в микробиоме кожи необходимы для формирования и развития биопленки, а также задерживают заживление и замыкание ран. В клинике наличие биопленки в ране еще больше усложняет процессы заживления ран и повышает риск ампутации у человека, если инфекция в ране не контролируется.

Удаление волос с депиляционным лосьоном является важным шагом для удаления лишних волос и позволяют гладкой и чистой поверхности для прозрачной повязки придерживаться твердо. Депиляционный лосьон, используемый в этом протоколе, представляет собой химическое депиляцию с добавлением алоэ для минимизации ожогов. Этот продукт является минимальным в изменении морфологии кожи, а также сохранение микробиома кожи. Продукт, перечисленный в таблице материалов рекомендуется по сравнению с другими продуктами удаления волос, в том числе физические и механические депилаторы (воски и коммерческие эпиляторы), которые могут далее сжигать и буксир на коже и / или убить микробиом кожи. Несмотря на то, что это химическое депиляции физически нежный, он все еще может раздражать кожу немного, эффект, который может изменить процессы заживления ран. Таким образом, наиболее эффективно ждать 18-24 часов до операции, чтобы кожа оправиться от процедуры и обеспечить кожу и рану не влияет на него.

Эти мыши чрезвычайно послушны и не реагируют на стрессоры. С ним очень легко обращаться без анестезии. Они достаточно спокойны, чтобы разместить на ладони или на верхней части скамейки, не убегая. Если основание хвоста мыши закреплено большим и вторым пальцем, мышь не сможет убежать или повернуть назад, чтобы укусить из-за их большого размера живота. Важно, по нашему опыту, эти мыши чрезвычайно чувствительны к анестезии, особенно в связи с потерей гомеостаза. Таким образом, в консультации с нашим МАКУК было решено, что лучшим вариантом является ограничение анестезии.

Основная цель этой модели заключается в создании большой незаживающий раны на спине, так как только рана производится, держа мышь условно, чтобы сделать IP инъекции дополнительных buprenex или других химических процедур периодически невозможно. Держа мышь за содвистой кожей вызывает у мыши много дискомфорта и, вполне возможно, боль, если мышь проводится в такой традиционной манере; таким образом, все инъекции с помощью мыши правой стороны вверх, пока она стоит на всех четырех ногах. Другие эксперименты с использованием db/db-/- штамм использовать эти мыши, когда они моложе и не весят столько, поэтому традиционный способ выполнения инъекции ИС может использоваться. Так как хроническая модель раны использует мышей до 6 месяцев, и эти мыши могут весить до 80 г, обычный метод не является оптимальным и потенциально может повредить мыши. Мы использовали метод, описанный выше для мыши этого ожирения и не наблюдали каких-либо неблагоприятных исходов при введении с этим методом с успешным стремлением.

Ранее использовалась инъекционная анестезия, такая как кетамин и ксилазин; однако, они оказались трудными в использовании с db/db-/- мышей. При общем времени работы менее 5 минут, долгое время индукции и восстановления не было необходимости для целей эксперимента. Isoflurane был определен, чтобы быть лучшим выбором анестезии для этой процедуры из-за легкого введения и титрования, быстрого начала и восстановления, и адекватной анестезии глубины. Кроме того, изолюран вызывает минимальную сердечную депрессию и поддерживает ВР очень хорошо34. Таким образом, основным изменением в процедуре хронической модели раны было использование изолюран в качестве предпочтительной анестезии.

Отопление перед операцией важно для предотвращения смертности в течение 2-3 дней после операции. Эти мыши имеют значительно более низкую температуру тела сердечника35 и не способны контролировать их температуру тела сердечника эффектно из-за их генетической манипуляции, поэтому внешний источник топления обеспечен перед хирургией для того чтобы защитить против дополнительное снижение температуры основного тела, вызванное анестезией. Мы оценили потребность в грелке до, во время и после операции. Важно отметить, что db/db-/- мыши имеют необычные физиологические реакции. Эмпирически, мы обнаружили, что эти мыши наиболее эффективно защищены с до- и послеоперационной тепловой поддержки. Заменив изофлуран в качестве анестезии, мы измерили и определили, что температура тела ядра не значительно снизилась в течение менее чем пяти минут операции. Хотя мы обнаружили, до- и после хирургического тепловой поддержки, чтобы иметь решающее значение для этих мышей, мы не нашли хирургической тепловой поддержки, чтобы иметь эффект. Следует отметить, что Председатель МАКУК давал рекомендации и контролировал наши тесты, связанные с температурой и анестезиологическим действием. По мере того как мы связываем этот метод, мы находим его важным показать что необходимо для успеха процедуры.

Ограничение использования этого метода для изучения развития биопленки является тот факт, что бактерии, присутствующие на рану и производство биопленки не контролируются. Если изучить конкретную биопленку, эту модель может быть полезна, если родной микробиом может быть отменен до ранения либо с помощью йода, либо с помощью других антисептических методов. В ответ на чрезмерный уровень окислительного стресса, ключевые патогенные бактерии в микробиоме кожи стимулируются, чтобы инициировать образование биопленки. В наших хронических ран, биопленка формирования бактерий включают, но не ограничиваются, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 , 39, и различные стафилококк40,41 и Corynebacterium видов41,42,43,44, 45, все из которых можно найти в человеческих хронических ран. Несколько хронических исследований микрофлоры раны были проведены на человека хронические раны для бактерий39,40,41,43,44,45 , и грибы46,47 сообщества, в том числе продольные обследования, связанные с плохим исцелением48,49. Продольные исследования такого рода также могут быть продолжены с помощью хронической модели раны.

Важно признать, что различные результаты могут быть получены из-за различий в условиях vivaria, поставок и оборудования, поставщиков и источников колоний для db/db-/- мышей. Чтобы свести к минимуму такие различия, предусмотренные в протоколе является точное разнообразие мышей и источник, который используется для хронического эксперимента раны. Для животноводства этих мышей, точные постельные принадлежности и пищевые бренды были предоставлены в таблице материалов, чтобы ограничить изменчивость. В наших экспериментах, мы находим, что высокий окислительный стресс необходим и достаточно, чтобы создать хронические раны у этих мышей, до тех пор, как мыши размещены в обычной виварии и подвергаются воздействию бактерий. Популяции бактерий и общины могут отличаться от виварии; однако, до тех пор, как зародыш-бесплатный объект не используется для размещения мышей, они должны иметь достаточно бактерий, как commensal и патогенных, чтобы проживать на волосах и коже.

Этот метод создания хронических ран в этом протоколе имеет важное значение для изучения хронических ран и нарушения заживления ран, потому что только уровни окислительного стресса значительно изменены экспериментально. Оксидативный стресс необходим для нормальных процессов заживления ран2. Это важно для своевременного регулирования и важнейшим компонентом в функциональности клеток, необходимых для заживления ран5. Однако, когда уровни окислительного стресса не контролируются, реактивные виды кислорода могут повредить клетки эндтеплии, подавлять функциональность кератиноцитов, и задерживать закрытиераны 2,5. Человеческие хронические раны имеют высокий уровень окислительного стресса50. Модель мыши имеет высокий уровень глюкозы в крови и уже повышенный уровень окислительного стресса из-за его заболеваемости. Эти характеристики совместно с людьми, живущими с диабетом и обеспечить микросреду благоприятной для хроники после поддержания травмы50. Люди также размещают разнообразные и сложные микробиоты во многих местах на теле, в том числе кожи, так что сложный, но естественный, микробиом разрешено развиваться на коже мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы не имеют подтверждений.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

Медицина Выпуск 151 Заживление ран хроническое ранение нарушение заживления диабетическая язва стопы окислительный стресс биопленка
Протокол для создания хронических ран у диабетических мышей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter