Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Protokoll för att skapa kroniska sår hos diabetiska möss

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Kroniska sår utvecklas från akuta sår på en diabetiker musmodell genom att inducera höga nivåer av oxidativ stress efter en full-tjocklek kutan sår. Såret behandlas med hämmare för katalas och glutationperoxidas, vilket resulterar i försämrad läkning och biofilm utveckling av bakterier som finns i huden microbiome.

Abstract

Kroniska sår utvecklas som ett resultat av bristfällig reglering i en eller flera komplexa cellulära och molekylära processer som är involverade i korrekt läkning. De påverkar ~ 6,5 miljoner människor och kostar ~ $40B/Year i USA ensam. Även om en betydande ansträngning har investerats i att förstå hur kroniska sår utvecklas hos människor förblir grundläggande frågor obesvarade. Nyligen utvecklade vi en ny musmodell för diabetiska kroniska sår som har många egenskaper hos mänskliga kroniska sår. Med hjälp av db/DB-/- möss, kan vi generera kroniska sår genom att inducera höga halter av oxidativ stress (OS) i såret vävnaden omedelbart efter sårande, med en engångs behandling med hämmare som är specifika för antioxidant enzymer katalas och glutathionperoxidas. Dessa sår har höga nivåer av OS, utveckla biofilm naturligt, bli helt kronisk inom 20 dagar efter behandling och kan förbli öppen mer för mer än 60 dagar. Denna roman modell har många funktioner av diabetiska kroniska sår hos människor och därför kan bidra avsevärt till att främja grundläggande förståelse för hur sår blir kroniska. Detta är ett stort genombrott eftersom kroniska sår hos människor orsakar betydande smärta och ångest till patienter och resultera i amputation om olösta. Dessutom är dessa sår mycket dyra och tidskrävande att behandla, och leda till betydande förlust av personlig inkomst till patienter. Framsteg inom detta område av studier genom användning av vår kroniska sår modell kan avsevärt förbättra vården för miljoner som lider under detta handikappande tillstånd. I detta protokoll beskriver vi i detalj förfarandet för att orsaka akuta sår för att bli kroniska, vilket inte har gjorts tidigare.

Introduction

Sårläkning involverar komplexa cellulära och molekylära processer som är temporally och rumsligt reglerade, organiserade i sekventiella och överlappande stadier som involverar många olika celltyper, inklusive men inte begränsat till immunförsvaret och den vaskulära system1. Omedelbart efter att huden upprätthåller en skada, faktorer och blodkroppar aggregera till såret platsen och initiera koagulationskaskaden för att bilda en propp. Efter homeostas uppnås, blodkärlen vidga att släppa in på såret platsen syre, näringsämnen, enzymer, antikroppar och kemotaktisk faktorer som chemoattract polymorfonukleocyter att rensa såret sängen av främmande skräp och utsöndrar proteolytiska enzymer 2. aktiverade trombocyter utsöndrar en mängd tillväxtfaktorer för att stimulera keratinocyterna vid sårkanten för att åter epitelialisera det sårade området. Monocyter rekryteras till såret platsen differentieras till makrofager som fagocytos bakterier och döda neutrofiler och utsöndrar ytterligare faktorer för att upprätthålla keratinocyter proliferativa och Pro-flyttande signaler. I spridningen fas, medan re-epitelisering fortsätter, ny granulering vävnad består av fibroblaster, monocyter/makrofager, lymfocyter, och endotelceller fortsätta återuppbyggnadsprocessen2. Angiogenes stimuleras genom att främja endotelcellproliferation och migration, vilket resulterar i ny fartygs utveckling. Epithelialization och Remodeling av den extracellulära matrisen konstruera en barriär mot miljön. När såret läker och granulering vävnad utvecklas till ett ärr, apoptos eliminerar inflammatoriska celler, fibroblaster, och endotelceller utan att orsaka ytterligare vävnadsskada. Den draghållfasthet av vävnaden förstärks av fibroblaster remodeling olika komponenter i den extracellulära matrisen, som kollagen, så att den nybildade vävnaden är nästan lika stark och flexibel som osårad hud2.

Varje avvikelse från denna mycket samordnade progression mot sår stängning leder till nedsatt och/eller kroniska sår3. Kroniska sår kännetecknas av ökad oxidativ stress, kronisk inflammation, skadad mikrovaskulatur, och onormal kollagen matris i såret4. Oxidativ stress, särskilt i såret, kan fördröja sår stängning2,5. När, i det första stadiet av sårläkning, den inflammatoriska fasen blir oreglerad, den mottagande vävnaden förutsätter omfattande skador på grund av en kontinuerlig tillströmning av inflammatoriska celler5 som frigör cytotoxiska enzymer, en ökning av fria syreradikaler, och oreglerade inflammatoriska mediatorer, vilket resulterar i celldöd6,7.

I denna destruktiva mikromiljö, biofilmbildande bakterier dra nytta av värd näringsämnen och bidra till skadan av värd vävnad2. Dessa biofilmer är svåra att kontrollera och ta bort eftersom de hydrerade extracellulära polymera ämnen som består av proteiner, DNA, RNA, och polysackarider gör bakterier hyste inom att vara tolerant mot konventionella antibiotika terapier och kringgå värdens medfödda och adaptiva immunsvar2,8,9.

Studerar kroniska sår är avgörande eftersom de påverkar ~ 6 500 000 personer och kostnad ~ $40 000 000 000 per år i USA ensam10. Patienter med diabetes har ökade risker för att utveckla kroniska sår som kräver amputation för att innehålla smittspridning. Dessa patienter har en 50% dödlighet risk inom 5 år av amputation som tillskrivs patofysiologi mekanismen för diabetes11. Förhållandet mellan värdens immunförsvar och mikrobiomen i sårläkning är ett viktigt ämne för pågående forskning eftersom konsekvenserna av kroniska sår, om olösta, inkluderar amputation och död12.

Även om en betydande ansträngning har investerats i att förstå hur kroniska sår utvecklas hos människor, är det fortfarande oklart hur och varför kroniska sår bildas. Experiment för att studera mekanismerna för nedsatt läkning är svårt att genomföra hos människor, och sårläkning specialister bara se patienter med kroniska sår som redan har nått kronicitet i veckor till månader. Sålunda, specialister är oförmögna att studera vilka processer gick fel som leder såret att utvecklas för att bli kronisk2. Det finns en brist på djurmodeller som recapitulate komplexiteten av mänskliga kroniska sår. Tills vår modell utvecklades, ingen modell för kroniska sår studier existerade.

Den kroniska sårmodellen utvecklades hos möss som har en mutation i Leptin-receptorn (db/DB-/-)13. Dessa möss är feta, diabetiker, och har nedsatt läkning men inte utveckla kroniska sår14. Blodglukosnivåer genomsnitt runt 200 mg/dL, men kan vara så hög som 400 mg/dL15. När höga halter av oxidativ stress (OS) i såret vävnaden induceras omedelbart efter sårande, blir såret kronisk16. Db/DB-/- sår anses kroniska av 20 dagar och förbli öppen för 60 dagar eller mer. Biofilm produceras av bakterier kan ses utveckla början tre dagar efter att ha skadade; en mogen biofilm kan ses 20 dagar efter sårande och kvarstår tills antingen sår stängning. De biofilmbildande bakterier vi hittar i dessa möss finns också i mänskliga diabetiska kroniska sår.

Oxidativ stress induceras genom att behandla såren med två hämmare av antioxidant enzymer, katalas och glutationperoxidas, två enzymer med kapacitet att bryta ner väteperoxid. Väteperoxid är en reaktiv syreradikaler och kan orsaka cellulära skador genom oxidation av proteiner, lipider, och DNA. Katalas katalyserar nedbrytningen av väteperoxid i mindre skadliga kemikalier syre och vatten. 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) hämmar katalas vid bindning specifikt och kovalent till aktivet centrerar av enzymet som inaktiverar det17,18,19. ATZ har använts för att studera effekterna av oxidativ stress både in vitro och in vivo genom hämning av katalas20,21,22,23,24. Glutathione peroxidas katalyserar minskningen av väteperoxid genom antioxidant, glutation, och är ett viktigt enzym som skyddar cellen mot oxidativ stress25. Merkaptobärnstenssyra (MSA) hämmar glutationperoxidas genom bindning till selenocystein aktiva platsen för enzymet med tiol, inaktiverar det26. MSA har använts för att studera effekterna av oxidativ stress in vitro och in vivo samt20,27,28.

Denna roman modell av kroniska sår är en kraftfull modell för att studera eftersom den delar många av samma funktioner som observerats i mänskliga diabetiska kroniska sår, inklusive långvarig inflammation från ökad OS och naturliga biofilm bildas från huden microbiome. Såren har försämrad dermal-epidermal interaktion, onormal mat ris deposition, dålig angiogenes och skadad vasculature. Kroniska sår kommer att utvecklas i både manliga och kvinnliga möss, så båda könen kan användas för att studera kroniska sår. Därför kan den kroniska sårmodellen bidra avsevärt till att främja grundläggande förståelse för hur sådana sår börjar. Med hjälp av denna kroniska sår modell kan ge svar på grundläggande frågor om hur kronicitet initieras/uppnås genom bidrag från fysiologi nedsatt sårläkning och mikrobiomet av värden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla experiment har slutförts i enlighet med och efterlevnad av Federal lagstiftning och University of California policy och förfaranden har godkänts av University of California, Riverside IACUC.

1. djur

  1. Använd diabetiker och feta B6. BKS (D)-Leprdb/j möss för den kroniska sårmodellen. Köpoptioner inkluderar antingen heterozygoter för avel eller homozygoter direkt för experiment.
  2. Föder heterozygot hanar och honor för att producera avkomma. Endast en fjärdedel av kullen, statistiskt, kommer att växa för att bli diabetiker och feta (db/DB-/-).
  3. Wean och House db/DB-/- möss tillsammans med sina littermates 3 veckor efter födseln. Separata db/DB-/- möss från deras littermates 5 veckor efter födseln och hus med andra db/DB-/- möss tills de är 5-6 månader gamla och kan användas för den kroniska såret modellen. Under denna tid, en mogen och komplex hud mikrobiomet kan utvecklas.
    Märka den db/DB-/- musen är lätt kännemärke visuellt från littermates emellan 3-5 vecken av ålder. Db/DB-/- möss är feta, är diabetiker, och kommer att vara betydligt större och rundare än den vilda typ och heterozygot littermates. Deras buk kan tyckas något Pinker och deras höfter större. Ökad vikt bör bekräftas före operationen. Också, det är möjligt att mäta höga halter av glukos i blodet och genotyp musen för att bekräfta mutationen i Leptin receptorn.

2. Vivarium och djurhållning

  1. House db/DB-/- möss i en konventionell Vivarium (inte en barriär/specifik patogen fri anläggning) så att en mikroflora kan fastställas på huden hos db/DB-/- möss. För att specifikt modellera människor som lider av kroniska sår, inte vidta särskilda försiktighetsåtgärder för att förhindra exponering för patogener.
  2. Skydda burar med Micro isolator toppar för att minimera spridningen av infektion inom Vivarium. Byt burar två gånger i veckan med nya sängkläder och mata möss med regelbunden Vivarium Chow. Autoklavera inte heller sängkläder eller mat.
  3. Ställ in rumstemperatur till mellan 21 och 24 ° c, med smärre variationer beroende på års tid. Fuktigheten, reflekterande av klimatet och plats, kommer att variera mellan 19 och 70%.

3. krav för utveckling av kroniska sår

  1. Använd endast manliga och kvinnliga möss som är fenotypiskt feta, diabetiker, och minst 5-6 månaders ålder för utveckling av kroniska sår. Vikten av dessa möss bör variera mellan 40-80 g, i genomsnitt runt 60 g.
  2. Använd inte möss som anses feta men väger mindre än 50 g.
    Obs: alla möss som avses i detta protokoll klarar de kvalifikationer som beskrivs här om inget annat anges.

4. rakning och applicering av depilatory lotion

Obs: ta bort oönskat hår på dorsum av musen innan du skadade. Följande procedur görs på Live db/DB-/- möss som inte är under anestesi dagen före operationen. Vidta försiktighetsåtgärder för att förhindra stress och skada på djuret.

  1. Rakning
    1. Placera musen på en ren yta och greppa basen av svansen på musen med tummen och andra fingret för att säkra positionen av musen. Musen kan hoppa eller göra plötsliga rörelser; om den gör det, snabbt reagera och dra tillbaka Clippers för att förhindra skador.
    2. Raka håret på musen med en hårklippare (figurerna 1a, 1b). Placera bladet parallellt med huden på musen och raka hela ryggen från halsen till svansen, inklusive runt svansen, för att möjliggöra en tillräckligt stor yta för att placera en transparent film dressing (se tabell över material). Lätt köra bladet mot riktningen av hårväxten för den mest effektiva snittet. (Figur 1B).
      1. Tryck inte på bladet djupt in i huden, eftersom det kan skada huden genom blåmärken eller skärning.
  2. Applicering av hårborttagningsmedel lotion
    Obs: Använd hårborttagningsmedel lotion för att få en mycket slät hud så att den genomskinliga dressing kan fästa ordentligt.
    1. Blöt huden på musen med vatten för att förhindra kemiska brännskador genom att lätt trycka på en dränkt papper torka mot den rakade huden med tillräckligt tryck för att blöta den redan klippa håret ner mot huden.
    2. Medan huden är våt, lätt gnugga huden på musen med en liten klick av hårborttagningsmedel lotion (se tabell över material) för 15-20 s (figur 1c, 1d). Sprid lotion helt över varhelst håret har klippts kort. Använd mer lotion om musen är större.
    3. Applicera inte lotion på öronen av musen, svans, eller någonstans i närheten av ansiktet. Om lotion får på öronen eller svansen, helt enkelt torka med en våt papper torka tills sköljning. Om lotion får på ansiktet av musen, omedelbart tvätta musen under rinnande kran eller avjoniserat vatten för att förhindra skador på ögon, näsa och mun.
    4. Låt lotion att reagera med håret för en ytterligare 20-45 s efter applicering.
    5. Innan sköljningen, kontrollera slutförandet av den hårborttagnings reaktionen genom att lätt torka bort lotion från huden på olika platser (figur 1E) med ett handskar finger eller en tunn metall spatel. Reaktionen är klar om huden är rosa utan närvaro av svart hår. Det är bäst att snabbt kontrollera att håret faktiskt har avlägsnats innan sköljning än sköljning för tidigt och sedan behöva applicera lotion igen.
  3. Sköljning
    Anmärkning: när slutförandet av hårborttagning reaktionen har verifierats, tvätta musen med rinnande kran eller avjoniserat vatten för att ta bort den hårborttagningsmedel lotion och förhindra kemiska brännskador.
    1. Placera musen på vänster handskar hand och tryck på basen av svansen mot handflatan med vänster tumme för att förhindra musen från att flytta runt. Stäng och räta ut resten av vänster fingrar för att förhindra att musen biter.
    2. Placera musen så att ansiktet/huvudregionen är borta från strömmen av vatten och strömmen av ljummet vatten kan falla bakom huvudet och endast på baksidan. Snabbt men försiktigt gnugga baksidan av musen med rätt handskar hand att tvätta bort lotion.
    3. När huden på musen är fri från lotion, snabbt torka av musen med en pappershandduk för att absorbera det mesta av vattnet (figur 1F).
  4. Vård efter rakning och hårborttagning
    1. Kontrollera och rengör eventuell kvarvarande hårborttagnings lotion som kan finnas kvar på öronen och svansen med en våt pappers tork.
    2. Placera musen tillbaka i sin individuella bur och placera buren på en värmedyna (40-45 ° c) i ca 30 min. Musen ska återgå till normalt beteende, springa runt, och brudgummen själv inom några minuter.
    3. Hus varje mus i en separat bur under hela experimentet. Huden på möss är inte längre skyddad och kan lätt repas och biten av andra möss.
    4. Eftersom hårborttagningsmedel lotion kan ha små irriterande effekter som kan störa eller förändra sårläkningsprocessen, vänta 18-24 h före operationen för att låta musen huden att lugna ner och musen för att anpassa sig till bristen på hår på ryggen.
  5. Ta bort hår från huden med mörk pigmentering
    Obs: vissa db/DB-/- möss kommer potentiellt ha mörka fläckar i huden som kommer att få håret att växa tillbaka snabbare och starkare än huden utan dessa fläckar. (Figur 2a). Dessa mörka områden av huden verkar mörkare i färgen på grund av mitten av sena anagen skede hårsäckar och/eller pigment inkontinens29,30.
    1. Om mörka fläckar märks, applicera hårborttagnings lotion igen, men bara i dessa områden, och upprepa steg 4,2 och 4,3 (figur 2b, 2C).
      Obs: de mörka fläckar av huden kommer att växa hår snabbare under hela experimentet, så Klipp håret kort varje 3-5 dagar, när det behövs. Ett plåster eller två bort från den önskade placeringen av såret är acceptabelt. Om baksidan av musen är betydligt täckt av dessa mörka fläckar, Använd inte denna mus för den kroniska såret modellen.

5. inställning av reagens

Anmärkning: utvecklingen av kroniska sår i db/DB-/- möss åstadkoms genom behandling med specifika hämmare för katalas och glutationperoxidas, 3-amino-1, 2, 4-triazol (ATZ) och merkaptobärninisyra (MSA), respektive16 . Följande procedur specificerar dos och administrering av analgesi och hämmare baserat på vikten av musen.

  1. Injicera smärtan smärtstillande buprenex intraperitonealt vid 0,05 mg/kg mus i steril PBS. Injicera en volym på 120 μL för en 60 g mus ungefär 30 min före operationen. Administrera ytterligare en dos 6 h efter operationen. En extra dos kan ges vid behov.
  2. Injicera ATZ intraperitonealt vid 1 g/kg mus i steril PBS. Injicera en volym på 480 μL för en 60 g mus cirka 20 min före operationen. Injicera halva volymen på vänster sida av buken och den andra halvan på höger sida.
  3. Insättning MSA lokalt på såret mellan transparent dressing och såret vävnad vid 150 mg/kg mus i steril PBS. Administrera en volym på 60 μL för en 60 g mus inom 10 min efter operationen.

6. kirurgi

Anmärkning: framgången för den kroniska såret modellen förlitar sig på icke-sterila förhållanden. Dessa möss är inte bakteriefria och är inrymt i en konventionell Vivarium. Bakterien mikrobiomet som finns i huden är avgörande för den efterföljande initiering och utveckling av kroniska sår vid behandling med hämmare av antioxidant enzymer. Därför är traditionell prekirurgisk beredning av webbplatsen kontraindikerad.

  1. Intraperitoneal injektion
    1. Fäst musen på vinklad del av bur rack och håll svansen med musen bekvämt stående med huvudet lägre än kroppen av musen. Detta säkerställer att vi försöker flytta de inre organen så långt bort från insprutningspunkten som möjligt.
    2. För in nålen i nedre högra kvadranten av buken för att undvika injektion i urinblåsan, eller andra buk organ.
    3. Aspirera nålen före injektionen.
  2. Behandling och anestesi
    1. Administrera Buprenex 30 min och ATZ 20 min före operationen, enligt beskrivningen i steg 5,1 och 5,2.
    2. Placera musen i en liten plastbehållare ovanpå en varm värmedyna som visas i figur 3a för ca 15-20 min. att ge värme stöd före ingreppet skyddar mot potentiell dödlighet.
    3. Placera ett papper torka eller pappershandduk över toppen av den lilla behållaren för att bättre innehålla värmen. Musen ska lugna ner när den värmer. Figur 3 B visar material som behövs för kirurgi.
    4. Placera musen i en sluten behållare som är ansluten till isofluran spridare i den kemiska huven om du använder ett öppet system.
    5. I ett öppet system, administrera 5% isofluran för 1-2 min vid en flödeshastighet av 2-3.5 L/min. kontinuerligt övervaka musens status.
      1. När musen är medvetslös eller inte längre rör sig, Placera musen på en vit kirurgisk pad och passa huvudet med en näsa kon som är säkrad till spridare att kontinuerlig administrering av isofluran under operationen.
    6. I ett öppet system, administrera 2-3% isofluran vid samma flöde under operationen och anpassa sig till flödet av isofluran att bibehålla djupet av anestesi.
    7. Minimera både koncentrationen och varaktigheten av isofluran administrerat under operationen. db/DB -/- möss är mycket känsliga för anestesi så det är bäst att hålla isofluran exponering till ett minimum. Om musen är fortfarande lyhörd efter 2 min vid 5% isofluran, säkra näsan konen och administrera 3-5% isofluran för 15-30 s innan kirurgi.
      1. Bekräfta ordentlig anestetization innan du skadade. Djupet av anestesi bekräftas av bristande respons på fysiska stimuli såsom stark tå nypa. Längden av tiden av musen under inhalerad anestesi är under 5 min så ingen vet salva appliceras på ögonen.
  3. Skadade
    1. Spraya ett papper torka med 70% etanol eller en klinisk etanol servett och torka av baksidan av musen för att rengöra området av såret webbplats. Rengör hudens yta så att den genomskinliga dressingen kan fästa ordentligt, eftersom damm från strö, mat eller hud kan förhindra att förbandet fastnar ordentligt (figur 4A). Torka inte överdrivet, eller det kommer att finnas en risk för att döda bakterierna som finns på huden.
    2. Bestäm placeringen av sår platsen. Det bästa stället att utföra såret är på dorsala sidan av musen, centrerad och bort från fläckar av hud med högre pigmentering.
      Notera: vi har genom erfarenhet fastställt att dessa möss bara tål bördan av ett sår.
    3. Skapa ett sår inom 30-45 s med en 7 mm hudbiopsi Punch, pincett och kirurgisk sax. Tryck lätt på biopsin Punch på önskad sår plats och vrid Punch runt bara tillräckligt djupt för att lämna ett litet intryck av Punch (figur 4B). Punktskatten på den beskrivna huden genom att dra upp mitten av Punch med pincett och skära längs skissera med kirurgisk sax (figurerna 4c-4E).
    4. Täck såret stadigt med hälften av en bit transparent film dressing (6 cm x 3,5 cm).
    5. Avbryt administreringen av 2% isofluran till musen (figur 4F).

7. behandling och återhämtning efter operationen

  1. Administrera MSA-behandling efter operationen är slutförd och det genomskinliga förbandet appliceras enligt beskrivningen i steg 5,3. Deponera MSA på sårområdet under förbandet.
  2. Placera musen tillbaka i den lilla behållaren på värmedyna för 30 min för att hjälpa till med återhämtning. När musen har värmde upp, sätta musen tillbaka i sin bur. Effekten av isofluran är tillfällig, och musen bör flytta runt kort därefter.
  3. Lämna inte möss utan uppsikt eller returnera dem till Vivarium förrän mössen har återfått tillräckligt medvetande för att bibehålla sternala recumbency.
    Obs: anestesi val när du arbetar med dessa möss är isofluran just på grund av dess snabba induktion och efterföljande uppkomst från anestesi.
    1. Hus möss som har genomgått kirurgi individuellt för att undvika en mus stör den kroniska såret av en annan. Som nämnts ovan, återgår de inte till Vivarium förrän helt återhämtat sig.
  4. Administrera den andra dosen av Buprenex 6 h efter operationen.
  5. Observera mössen noggrant under de första 48 h efter operationen.
    Obs: operationen, tillsammans med inhibitorer för att skapa det kroniska såret, är mycket stressande på djuret som redan är både diabetiker och feta. Möss som överlever de första par dagar efter operationen kommer vanligtvis överleva varaktigheten av experimentet.

8. data insamling, överlevnadsstrategier, hantering av möss efter skadade, och ytterligare tips

  1. Data insamling
    1. Ta bilder så tidigt som omedelbart efter operationen. Biofilmer observeras någonstans mellan 5-10 dagar efter att ha skadade, och så tidigt som 3 dagar.
    2. Om bakterierna är i fokus för analys, rulla en steril swap med lätt tryck runt såret för 10-15 s. Förvara pinnen, i ett lämpligt frysmaterial för odling eller torr utan media för kulturoberoende sekvenserings analys, vid-80 ° c. Samla in extracellulära polymera ämnen via en steril metallspatel i ett microcentrifugerör och förvara vid-80 ° c före analys.
    3. Administrera inte anestesi till musen under hantering för biofilm samling eller bildtagning. Under dessa procedurer, placera en bit mat framför musen för att lugna ner musen och förhindra att den rinner av. De flesta möss kommer att klättra ovanpå maten, sitta på den, och inte flytta.
  2. Som sekundära infektioner och oavsiktliga kroniska sår eller sår kan utvecklas om musen inte är korrekt rörliga eller om förbandet inte appliceras på rätt sätt, regelbundet kontrollera aktiviteten av musen och den ventrala sidan för sår. Friktion mellan huden och våta sängkläder (db/DB-/- möss är polyuric) kan störa huden om burarna inte ändras ofta.
    Obs: vätska uppbyggd under förbandet kan orsaka limmet att förlora sin klibbighet och låta vätskan att läcka. Dead Skin cell, sängkläder, och avföring kan sedan fastna på huden och härda. Dessa torkade fläckar och aggregat på huden bör rensas snabbt för att förhindra en sekundär infektion.
  3. Om mössen står eller sitter på bakbenen, flytta dessa möss till en bur där tillgång till mat och vatten är mycket lägre. Om positionen för mat och vatten i buren är hög, kan musen stå eller sitta på bakbenen för att nå den. De flesta möss kommer inte att ha ett problem att äta och dricka om de kunde göra det innan operationen, men det finns en möjlighet att vissa möss kan vända på ryggen. Dessa "Flippers" kan ha stora svårigheter att vända så de kommer att behöva hjälp och ytterligare övervakning.
  4. Lämna den genomskinliga dressingen på huden i upp till 20 dagar om huden är klar för skräp, flakey hud och hår. Om någon av dessa inträffar på huden, ta bort den gamla dressing och tillämpa en ny pjäs.
    1. För att ta av dressingen, lätt nypa huden direkt bakom huvudet, dra sedan förbandet bort från huvudet i en smidig rörelse.
    2. För att placera en bit dressing på säkert, har musen stanna så fortfarande som möjligt. Det är viktigt att huden är ren och fri från flagnande döda hudceller, damm från strö, och bitar av mat. Placera och tryck sedan på förbandet i huden runt såret för att säkra.
    3. Om placeringen av en bit mat framför musen inte begränsar dess rörelser, placera sedan musen ovanpå trådburen. När musen har greppat en skena på buren, håll svansen så nära kroppen som möjligt och dra med minimal kraft. Som musen drar framåt ryggen kommer att sträcka och räta för enkel applicering; Placera förbandet säkert på denna punkt.
    4. Återanvänd aldrig en gammal dressing. Applicera alltid nytt förband på ryggen för största vidhäftning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 visar ett exempel på ett sår utan behandling av inhibitorer som fortskrider mot sår stängning och ett sår med behandling av inhibitorer som går mot chronicitet. Det genomskinliga förbandet har lämnats kvar på det kroniska såret så att bio film och vätskeansamling kan ses.

Kronisk sår initiering sker på mindre än 6 timmar och sår marginalen är synligt förändrad från oxidativ stress. Histologiska belägg för detta sår marginalen avslöjar att vävnaden är nekrotisk och kommer inte att delta i sårläkning. Den biofilm-bildande bakterier i såret kan senare använda denna nekrotisk vävnad som en källa till näringsämnen och strukturella komponenter för att producera biofilm. Ett kroniskt sår är ett sår som förblir öppet, förstorat i jämförelse med det initiala såret, innehåller bio film (EPS plus patogena bakterier som finns i mänskliga kroniska sår) och tar månad eller år att läka beroende på mängden och innehållet i biofilmen som förhindrar såret från att lösa normalt. I den kroniska såret modellen, full kronicitet är inställd på att > 20 dagar efter operationen eftersom sår som inte behandlats med inhibitorer kommer att stänga vid denna tid (figur 5). Healing tar normalt > 60 dagar och tiden beror på de primära patogena bakterierna som finns i såret. Ibland kan mössen ge efter för infektion när mer aggressiva biofilmbildande bakterier, såsom Pseudomonas, dominerar i såret. Sålunda, ett kroniskt sår definieras som ett sår som inte kommer att stänga inom 20 dagar, tar mer än 60 dagar att läka, och har bio film närvarande på såret.

Könsskillnader har hittats i olika diabetes modeller, inklusive db/DB-/- musmodell32,33. Även om sådana skillnader finns, har vi observerat sex att inte vara en viktig faktor i utvecklingen av kroniska sår. Kroniska sår hos manliga och kvinnliga möss utvecklas i liknande utsträckning, så båda könen kan användas för att studera kroniska sår. Således, utnyttja denna modell är fördelaktigt eftersom mänskliga kroniska sår kan hittas på både manliga och kvinnliga diabetespatienter.

Figure 1
Figur 1 . Rakning och hårborttagnings process. (A) musen före rakning. (B) huden på musen är rakad för att ta bort det mesta av håret på bak. (C) en klick av hårborttagnings lotion på spetsen av ett finger. Mer används om musen är större. (D) bak på musen är täckt med hårborttagningsmedel lotion och vänster för att reagera. (E) en spatel används för att skrapa bort en del av lotion för att se om håret har avlägsnats. Ljust rosa hud utan någon närvaro av hår är vägledande att hårborttagning är klar. F) lotion på ryggen avlägsnas med rinnande vatten. Huden på musen ska vara något rosa. Denna siffra har modifierats från Kim och Martins-Green31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Ta bort hår från mindre fläckar av mörk hud. (A) musen har redan behandlats en gång och huden är våt igen för att förhindra brännskador. (B) hårborttagningsmedel lotion appliceras endast på plåstret av hud som är mörkt och har täta håret. (C) lotion tvättas bort efter reaktionen för att avslöja den mörka fläck av hud utan hår. Denna siffra har modifierats från Kim och Martins-Green31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Pre-kirurgi inrättas. (A) de möss som ska såras placeras i små plastbehållare ovanpå en värmedyna. (B) några av de material som används i kirurgi visas. Den kirurgiska saxen måste vara skarp för att säkerställa att huden inte krossas när den skärs. Den genomskinliga dressingen skärs i hälften. Denna siffra har modifierats från Kim och Martins-Green31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Att göra excision såret. (A) när musen är under anestesi, är bak på musen torkas med 70% etanol en gång. (B) hudbiopsi Punch placeras på bak med musen och pressas tillräckligt hårt för att lämna ett intryck. Biopsin Punch kan roteras för att göra ett grunt snitt. (C) mitten av det beskrivna området kläs med pincett och en skarp kirurgisk sax används för att göra det initiala snittet. (D) den kirurgiska saxen manövreras för att skära längs konturerna som gjorts av biopsi punch. (E) en region av hud som beskrivs av biopsi pumpen är framgångsrikt excised. Fdet genomskinliga förbandet är placerat på bak med musen och säkras. Denna siffra har modifierats från Kim och Martins-Green31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Bilder av sår. (A) såret på en mus på varandra följande gånger efter operationen som det fortskrider till kronicitet börjar på operationsdagen. Biofilm kan ses så tidigt som dag 5 och upptäcks så tidigt som dag 3. Såret är helt kroniskt med stark biofilm på dag 20. (B) exempel på mänskliga kroniska sår, speciellt diabetiska fotsår. Denna siffra har modifierats från Kim och Martins-Green31. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När kroniska sår skapas på möss, kan modellen användas för att studera försämrad sårläkning processer inblandade i inledningen av chronicity. Modellen kan också användas för att testa effekten av ett brett spektrum av kemikalier och läkemedel som kan vända kronisk sårutveckling och försämrad läkning och leda till sår stängning och läkning. Olika tidpunkter efter uppkomsten av kronicitet kan studeras: t. ex., dagar 1-5 efter sårande för tidig debut av kronicitet och dagar 20 och därefter för full styrka kroniska sår.

Den kroniska sårmodellen är också en kraftfull modell för att studera olika aspekter av sårläkning och komplikationer som bioburden och cachexia. Bioburden är bara en av många aspekter av kroniska sår som kan studeras i denna modell, eftersom det också påverkar mänskliga kroniska sår. Våra procedurer och djur användnings protokoll tydligt identifiera symptomologi som skall övervakas, tillsammans med en definierad övervakning schema. Djur som identifierats som sjuklig, baserat på IACUC godkända kriterier, är euthanized för att undvika betydande lidande. Dessutom konsulteras Campus veterinären och djur hälso teknikern när vissa symptomologier uppkommer och ger stödjande vägledning vid bedömning av kriterier.

Kritiska steg i protokollet inkluderar bostäder db/DB-/- möss i en konventionell Vivarium, ta bort hår med hårborttagningslotion, och uppvärmning innan isofluran administration. Utvecklingen av kroniska sår i den kroniska sårmodellen förlitar sig på icke-sterila förhållanden och praxis. Dessa möss är inte bakteriefria och växer inte i mycket rena vivariums. Mikrofloran som finns i huden är avgörande för den efterföljande initiering och utveckling av kroniska sår vid behandling med hämmare för antioxidant enzymer. Dessa db/DB-/- möss måste exponeras för en miljö som innehåller bakterier, både kommensaler och patogena. Om huden rengörs och dis-infekterade med jod eller andra antiseptiska metoder före operationen för att "sterilisera" huden, såret kan inte bli kronisk. Bakterierna i huden mikrobiomet är nödvändiga för bildandet och utvecklingen av biofilm, och fördröja läkning och sår stängning. På kliniken kompliserar närvaron av biofilm i ett sår ytterligare sårläknings processerna och ökar risken för amputation hos människor om infektionen i såret inte kontrolleras.

Ta bort håret med hårborttagningsmedel lotion är ett viktigt steg för att ta bort överflödigt hår och ge en slät och ren yta för transparent dressing att fästa ordentligt. Den hårborttagningsmedel lotion som används i detta protokoll är en kemisk hårborttagningsmedel med tillsatt Aloe för att minimera brännskador. Denna produkt är minimal i att förändra morfologin av huden samt bevara huden microbiome. Den produkt som anges i tabellen av material rekommenderas framför andra hår att ta bort produkter, inklusive fysiska och mekaniska borttagningsmedel (vaxer och kommersiella epilators) som kan ytterligare bränna och bogserbåt på huden och/eller döda huden microbiome. Även om denna kemiska hårborttagningsmedel är fysiskt skonsam, kan den fortfarande irritera huden något, en effekt som kan förändra sårläknings processerna. Sålunda, det är mest effektivt att vänta 18-24 timmar före operationen för att tillåta huden att återhämta sig från förfarandet och se till att huden och såret inte påverkas av det.

Dessa möss är extremt fogliga och icke-lyhörd för stressorer. De är mycket lätta att hantera utan anestesi. De är lugna nog att placera på en handflata eller ovanpå en bänk utan att springa iväg. Om basen av svansen på musen är säkrad med tummen och andra fingret, kommer musen inte att kunna springa iväg eller vända tillbaka för att bita på grund av deras stora magen storlek. Viktigt, i vår erfarenhet, dessa möss är extremt känsliga för anestesi, särskilt eftersom det gäller förlust av homeostas. Således, i samråd med vår IACUC, det bestämdes att det bättre alternativet är att begränsa bedövningsmedel administration.

Det huvudsakliga syftet med denna modell är att skapa en stor unhealing sår på ryggen, så när ett sår görs, hålla en mus konventionellt för att göra IP-injektioner av ytterligare buprenex eller andra kemiska behandlingar regelbundet är omöjligt. Håller musen av dorsala huden orsakar musen en hel del obehag och ganska möjligen smärta om musen hålls på ett sådant traditionellt sätt; Således, alla injektion med musen höger sida upp medan den står på alla fyra fötterna. Andra experiment som utnyttjar db/DB-/- stam använda dessa möss när de är yngre och inte väger så mycket, därför det traditionella sättet att utföra en IP-injektion kan användas. Eftersom den kroniska sårmodellen använder möss upp till 6 månaders ålder och dessa möss kan väga upp till 80 g, är den konventionella metoden inte optimal och kan potentiellt skada musen. Vi har utnyttjat den metod som beskrivs ovan för en mus här feta och har inte observerat några negativa resultat när injiceras med denna metod med framgångsrik aspiration.

Tidigare, injicerbar anestesi såsom ketamin och xylazin, användes; emellertid, de visade sig vara svåra att använda med db/DB-/- möss. Med en total drifttid på mindre än 5 minuter var den långa induktions-och återhämtningstiden inte nödvändig för experimentets syften. Isofluran var fast besluten att vara det bättre valet av anestesi för detta förfarande på grund av enkel administration och titrering, snabbt insättande och återhämtning, och adekvat anestesidjup. Också, isofluran orsakar minimal hjärt depression och upprätthåller BP mycket väl34. Så, en stor förändring i förfarandet för den kroniska såret modellen var att använda isofluran som önskad anestesi.

Uppvärmningen före operationen är viktigt för att förhindra dödlighet i 2-3 dagar efter operationen. Dessa möss har signifikant lägre kroppstemperatur35 och kan inte kontrollera sin kroppstemperatur effektivt på grund av sin genetiska manipulation, så en extern värmekälla ges före operationen för att skydda mot ytterligare droppe i kärnan kroppstemperatur induceras av anestesi. Vi har bedömt behovet av en värmedyna före, under och efter operationen. Det är viktigt att notera att db/DB-/- möss har ovanliga fysiologiska svar. Empiriskt har vi funnit dessa möss som mest effektivt skyddas med pre-och post-kirurgisk värme stöd. Genom att ersätta isofluran som bedövningsmedel, mätte vi och fastställde att kroppstemperaturen inte minskade signifikant under mindre än fem minuter av kirurgi. Medan vi har funnit pre-och post-kirurgisk värme stöd för att vara kritisk för dessa möss, vi har inte funnit kirurgisk värme stöd för att ha en effekt. Det bör noteras att IACUC stolen gav vägledning och övervakade våra tester relaterade till temperatur och bedövningsmedel effekter. När vi kommunicerar denna metod finner vi det viktigt att ange vad som är nödvändigt för att förfarandet ska lyckas.

En begränsning av att utnyttja denna metod för att studera biofilm utveckling är det faktum att bakterierna som finns på såret och producerar biofilmen inte kontrolleras. Om en specifik biofilm-bildande bakterie ska studeras, denna modell kan vara användbart om den infödda mikrobiomet kan avskaffas innan de skadade antingen genom jod eller andra antiseptiska metoder. Som svar på höga nivåer av oxidativ stress, viktiga patogena bakterier i huden mikrobiomet stimuleras att initiera biofilm formation. I våra kroniska sår, biofilm-bildande bakterier inkluderar, men är inte begränsade till, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 , 39, och olika Staphylococcus40,41 och Corynebacterium arter41,42,43,44, 45, som alla kan hittas i mänskliga kroniska sår. Flera kroniska sår mikrobiomet studier har utförts på mänskliga kroniska sår för bakterierna39,40,41,43,44,45 , och svampar46,47 gemenskapen, inklusive longitudinella undersökningar i samband med dålig läkning48,49. Longitudinella studier av detta slag kan också följas upp med den kroniska sårmodellen.

Det är viktigt att erkänna att olika resultat kan erhållas på grund av skillnader i Vivaria villkor, leveranser och utrustning, leverantörer och källkolonier för db/DB-/- möss. För att minimera sådana skillnader, som anges i protokollet är den exakta möss sort och källa som används för det kroniska såret experimentet. För skötseln av dessa möss, de exakta sängkläder och livsmedel varumärken har tillhandahållits i tabellen av material för att begränsa variationen. I våra experiment, finner vi att hög oxidativ stress är nödvändig och tillräcklig för att skapa kroniska sår i dessa möss, så länge som mössen är inhysta i en konventionell Vivarium och utsätts för bakterier. Bakterier populationer och samhällen kan skilja sig med Vivaria; men så länge som en bakteriefria anläggning inte används för att hus möss, bör de ha tillräckligt med bakterier, både kommensaler och patogena, att bosätta sig på hår och hud.

Denna metod för att skapa kroniska sår i detta protokoll är betydande för att studera kroniska sår och försämrad sårläkning eftersom endast oxidativa stressnivåer är betydligt förändrad experimentellt. Oxidativ stress krävs för normala sårläknings processer2. Det är viktigt för snabb reglering och en viktig komponent i funktionaliteten hos celler som är nödvändiga för sårläkning5. Men när nivåerna av oxidativ stress inte kontrolleras, reaktiva syreradikaler kan skada koppla celler, hämma keratinocyter funktionalitet, och fördröja sår stängning2,5. Mänskliga kroniska sår har höga halter av oxidativ stress50. Musmodellen har högt blodsocker och redan ökade nivåer av oxidativ stress på grund av dess morbiditet. Dessa egenskaper delas med människor som lever med diabetes och ger en mikromiljö gynnsam för kronicitet efter att ha fått skada50. Människor också värd olika och komplexa bakterieflora på många platser på kroppen, inklusive huden, så en komplex, men naturligt, mikrobiomet är tillåtet att utveckla på huden på musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna har inga erkännanden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

Medicin sårläkning kroniskt sår försämrad läkning Diabetiskt fotsår oxidativ stress biofilm
Protokoll för att skapa kroniska sår hos diabetiska möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter