Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Muntliga bakterieinfektion och Shedding i Drosophila melanogaster

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

Det här protokollet beskriver metoder att muntligen avslöja och infektera bananflugan Drosophila melanogaster med bakteriella patogener, och för att mäta antalet smittsamma bakterier skjul efter tarm infektion. Vidare beskriver vi effekten av immun mutanter på flyga överlevnad efter oral bakteriell infektion.

Abstract

Bananflugan Drosophila melanogaster är en av de bästa utvecklade modell av infektion och medfödd immunitet. Medan de flesta arbete har fokuserat på systemiska infektioner, har det ökat senaste intresset mekanismerna i gut immunkompetens till patogener, som kräver metoder att muntligen infektera flugor. Här presenterar vi ett protokoll för att muntligen avslöja enskilda flyger till en opportunistisk bakterie patogen (Pseudomonas aeruginosa) och en naturlig bakterie patogen av D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en robust metod för att exponera manliga och kvinnliga flyger till dessa patogener. Vi tillhandahåller representativa resultat visar överlevnad fenotyper, mikrob laster och bakteriell shedding, som är relevanta för studien av heterogenitet i patogener överföring. Slutligen, vi bekräfta att Dianas mutanter (saknar skyddande peritrophic matrisen i tarmepitelet) och njuta av mutanter (saknar en funktionell immunbrist (IMD) väg), Visa ökad mottaglighet för oral bakterieinfektion. Detta protokoll, beskriver därför en robust metod att infektera flugor med oralt intag av infektion, som kan förlängas till studiet av en mängd genetiska och miljömässiga källor till variation i tarmen infektion resultat och bakteriell överföring.

Introduction

Bananflugan (kallas även vinäger fluga), D. melanogaster, har flitigt använts som modellorganism för infektion och immunitet mot olika patogener1,2. Detta arbete har erbjudit grundläggande insikter i de fysiologiska konsekvenserna av infektion och även var banbrytande i nysta upp de molekylära vägar som underliggande värd immunsvaret mot parasitoid, bakteriell, svamp och virala infektioner. Denna kunskap är inte bara användbart för att förstå medfödda immunsvaret hos insekter och andra ryggradslösa djur, men eftersom många av de immunologiska mekanismerna är evolutionärt bevarade mellan insekter och däggdjur, Drosophila också har sporrat upptäckten av stora immunologiska mekanismer i däggdjur, inklusive människor3.

De flesta arbete på Drosophila infektion och immunitet har fokuserat på systemiska infektioner, med inympning metoder som levererar patogener direkt in i kroppen av insekten genom injektion eller sjukdom4,5,6. Fördelen med dessa metoder att tillåta leveransen av en kontrollerad infektiös dos är tydlig och stöds av en stor mängd arbete på systemiska infektioner. Dock förvärvas många naturligt förekommande bakteriella patogener av D. melanogaster genom utfodring på ruttnande organiskt material där tarmen immunkompetens spelar en betydande roll i värd försvar7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. experiment som sysselsätter systemiska infektioner gå förbi dessa försvar, och, därför, ger en helt annan bild av hur insekter montera försvar mot naturliga patogener. Detta är särskilt relevant om syftet med arbetet är att testa förutsägelser om ekologi och evolution av infektion, där användningen av naturliga patogener och rutter av infektion är viktigt16,17. Senaste arbete har belyst hur vägen patogener ett avsevärt påverkar sjukdomen resultatet18,19, framkallar distinkta immun vägar20,21, kan avgöra den skyddande effekten av ärvde endosymbionts16, och kan även spela en viktig roll i utvecklingen av värd försvar17.

En annan anledning att anställa orala administreringsvägar infektion är att det tillåter utredningen av variationen i patogener överföring genom att mäta bakteriell shedding under fekal utsöndring efter oral infektion22,23, 24. förståelse källorna till värd heterogenitet i sjukdomsspridning utmanande i naturliga populationer25,26, men mäta komponenter av överföring, såsom patogen shedding, under kontrollerade laboratorieförhållanden villkor erbjuder en användbar alternativt tillvägagångssätt27. Genom utfodring flugor bakterier och mäta bakteriell shedding under olika genetiska och miljömässiga sammanhang i kontrollerade experimentella förhållanden, är det möjligt att identifiera källor till variation i överföringen bland värdar.

Här beskriver vi ett protokoll för oralt infekterar D. melanogaster med bakteriella patogener, och för kvantifiering av bakterietillväxt och sprider som följer (figur 1). Vi beskriver detta protokoll på två Pseudomonas bakterier: en virulent stam av opportunistiska patogener P. aeruginosa (PA14), och en mindre virulent stam av naturligt flyga patogen P. entomophila. Pseudomonads är vanliga gramnegativa bakterier med ett brett spektrum, infekterar insekter, nematoder, växter och ryggradsdjur, och finns i de flesta miljöer4,6. Enteriska infektion i Drosophila av P. aeruginosa och P. entomophila resulterar i patologi till intestinal epitel12,13,14,15, 28. Medan vi fokuserar på dessa två bakteriella patogener, kan metoderna som beskrivs här i princip gälla någon bakterie patogen sevärdheter med smärre ändringar. Efter oral exponering, vi mäter efter infektion överlevnad, och mäta den mikrob belastningen inom enskilda flugor och livskraftig mikrober skjul i miljön, uttryckt i kolonibildande enheter (CFUs). Slutligen, eftersom tarmen immunkompetens resultat från en kombination av epiteliala barriären och humorala svar, vi mäter också överlevnaden av fluglinor där dessa försvar störs. Specifikt, Drosocrystallin (Mattias) mutanter har tidigare visat sig vara mer mottagliga för oral bakteriell infektion på grund av ett utarmat peritrophic matris i gut29. Vi mäter också överlevnad i en Relish (Rel) mutant som hindras från att producera antimikrobiella peptider mot gramnegativa bakterier via IMD väg30.

Protocol

1. behålla flugor

  1. Upprätthålla flugor i 23 mL plast injektionsflaskor innehållande 7 mL nygjorda Lewis medium (modifierad från referens31; 1 L triple destilleras H2O, 6,1 g agar, 93,6 g brunt socker, 68 g majs, 18.7 g omedelbar jäst, 15 mL Tegosept anti-svamp medel) i kuvöser på 25 ± 1 ° C, i en 12 h:12 cykel h ljus: mörk med ~ 60% luftfuktighet. Anslut rören med icke absorberande bomull ull.
  2. Överföra 20 – 30 vuxna till en ny mat-injektionsflaska, med omedelbar, torr jäst tillsätts ytan, i 2 – 3 dagar så att äggläggningen sker efter varje 14 dagar. Efter denna tidsperiod, se till att äggen är synliga på ytan av maten. Ta bort vuxna flugor.
    Obs: Detta håller flugor i injektionsflaskorna som enda generation, åldersmatchade populationer.
  3. Lämna äggen att utvecklas.
    Obs: Vid 25 ° C, vuxna flugor börjar eclose från puppor på dag 11 och fortsätta över dagar 12 – 14.

2. Förbered experimentella flugor

  1. Samla ägg av överordnade generation i en befolkning/embryo samling bur på en 75 mL apple-agar tallrik (1 L tredubbel 30 g agar, 330 mL äppeljuice, 33 g sackaros, destillerat H2O, 7 mL Tegosept svamphämmande agent) med jäst klistra in spridning (blanda torrjäst med vatten till en jordnötssmör-liknande konsistens). Lägga till vatten-indränkt bomullstuss i buren för att ge fukt.
    Obs: För att undvika störande effekter som orsakas av skillnader i larval uppfödning densitet, det är viktigt att experimentella flugor i olika flaskor föds upp i liknande tätheter. Ovanstående steg utförs för att undvika störande effekter.
  2. Inkubera under 24 h vid 25 ° C i en 12 h:12 h ljus: mörk cykel tills äggläggningen skett. Om det finns för få ägg efter 24 h, ge tillvänjning längre. Ersätter apple-agar plattor och tillåter äggläggningen sker för en ytterligare 24 h.
  3. Ta ägg-lastad apple-agar plattor från befolkningen buren. Ta bort återstående jäst pastan och eventuella döda flugor från ägarns yta.
  4. Dränka ägarn i 20 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och försiktigt rubba ägg från den apple-agar med en fin pensel. Medan upphängd i PBS, överföra äggen till en 50 mL centrifugrör och lämna i 5 min så äggen sjunker till botten.
    Obs: De flesta ägg finns på den yttre kanten av agar.
  5. Ta bort genom att skära botten 4 mm av en p1000 filtrerade pipettspetsen och använda pipettspetsen Rita 1 mL lösning, tas från botten av de 50 mL centrifugröret. Överför detta till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och låt sedimentera.
    Obs: När pipettering upp äggen, snapin-releasing kolven är effektivare än en mild release.
  6. Ta bort genom att skära botten 4 mm av en p20 filtrerade pipettspetsen. Ställ pipetten till en önskad volym och dra från botten av mikrocentrifug röret.
    Obs: Med praxis, en volym på 5 µL innehåller ungefär 100 ägg.
  7. Fördela de insamlade ägg på maten och lämna dem att utveckla för den nödvändiga mängden tid.

3. bakteriell kultur

  1. För att växa P. entomophila och P. aeruginosa kulturer, Inokulera 10 mL Luria-Bertani (LB) buljong med 100 µL av en fryst bakteriell lager vid 30 ° C (P. entomophila) och 37 ° C (P. aeruginosa), respektive. Skaka på 150 rpm över natten. Se till att den bakteriella kulturen når fasen mättnad.
  2. Att se till de bakterier som används för att vaccinera flugor i den exponentiella fasen och snabbt replikera, Inokulera övernattning kulturen in i en ny subkultur, av en önskad volym, följande morgon. Se till att det före inokulatet är 10% av den totala volymen av subkultur kultur.
    Obs: Oral infektion kräver hög. Det är därför nödvändigt att växa en betydande mängd av bakterieodling så att tillräckligt inympning kultur kan produceras för önskad dos och experimentella storlek. Beräkna hur mycket subkultur som behövs för att producera de nödvändiga infektiösa doser med hjälp av ekvation MsVs = MjagVjag, där M representerar en kultur är optiska densitet mäts vid 600 nm (OD600) värde och V representerar dess volym. Nedsänkta bokstäver avse huruvida kulturen används som en subkultur (s) eller en infektiös dos (i).
  3. Väx denna subkultur i en 2 L kolv i en volym så att subkulturens yta faller (mest) strax ovanför början av kolvens lutning. Fyll inte över detta märke eftersom det kommer att hämma tillväxten av bakterier.
  4. Se till bakterier i denna subkultur i exponentiell fas genom att mäta OD varje 30 min.
    Obs: Detta inträffar efter 3 – 5 h, där subkulturen når en OD600 mellan 0,6 – 0,8.
  5. Häll lika stora volymer av denna subkultur över 50 mL centrifugrör och snurra subkultur vid 2500 x g i 15 minuter vid 4 ° C till pellet bakterierna. När pelleterats, ta bort och sedan snurra supernatanten igen vid villkoren ovan för att bekräfta borttagningen av den stora majoriteten av bakterier.
    Obs: En pellet av försumbar storlek (mindre än 1 mm i höjd) bekräftar detta.
  6. Kombinera de bakteriella pelletarna av separata rören genom åter avbryta dem i 5 mL subkultur supernatanten och kombinera dessa lösningar i en enda 50 mL tub. Snurra denna koncentrerade kultur vid 2500 x g i 15 minuter vid 4 ° C till pellet bakterierna.
  7. Avlägsna supernatanten och slamma den slutliga bakterier pelleten i sackaroslösning i vatten 5%. Kontrollera OD och justera till önskad infektiös dos (OD600 = 100 för P. entomophila8 och OD600 = 25 för P. aeruginosa16,28), genom att åter avbryta pellets i 5% sackaroslösning vatten till volymen som krävs.
    Obs: Mängden 5% sackaroslösning vatten tillsättas kan beräknas med hjälp av ekvation i steg 3.2.1 (MsVs = MjagVjag).

4. oralt infekterar flugor

  1. För att säkerställa oral infektion, svälta flugor för 2-4 h före exponering för bakterier genom att överföra flugorna till standard agar injektionsflaskor (1 L triple destilleras H2O, 20 g agar, 84 g brunt socker, 7 mL Tegosept svamphämmande agent).
  2. Förbereda infektion injektionsflaskor medan flugor är att vara svalt. Göra en Pseudomonas infektion injektionsflaska genom pipettering 500 µL av standard socker agar i locket av en 7 mL prov tub och låt den torka. Lägg en skiva av filterpapper i locket och Pipettera 100 µL av bakteriekultur direkt på filtret skiva. För kontroll infektioner, ersätta den bakteriella kulturen med samma volym av 5% sackaroslösning vatten på pappersfiltret.
  3. Lägga till enstaka flugor till provet röret och lämnar för 18 – 24 h.
  4. Att bekräfta oral infektion, först ytan-sterilisera flugorna omedelbart efter bakteriell exponering, genom att placera dem i 100 µL av 70% etanol för 20 – 30 s. bort etanol och tillsätt 100 µL av triple destillerat vatten för 20 – 30 s innan du tar bort vattnet. Tillsätt 100 µL av 1 x PBS och homogenisera i farten.
  5. Överföra Homogenatet till den översta raden i en plattan med 96 brunnar och lägga 90 µL 1 x PBS till varje brunn nedan.
  6. Seriellt späd detta prov för att skilja mellan ett utbud av CFU värden. Ta 10 µL av Homogenatet i högsta väl och tillsätt detta till brunnen nedan. Upprepa proceduren med andra väl, överföra 10 µL till tredje, och så vidare, för så många seriella utspädningar som krävs.
    Obs: Det är viktigt att nya pipettspetsar används för varje uppsättning utspädningar.
  7. Tallrik i seriespädningar på en LB näringsagar plate i 5 µL droppar, att säkerställa att alla droppar förblir diskret.
  8. Inkubera plattorna LB Agar övernattning på 30 ° C och 37 ° C i P. entomophila och P. aeruginosa, respektive och räkna synliga CFUs.
    Obs: Medan Drosophila gut mikrober kräver skilda anaerob tillväxt villkorar, kan selektivt medium, exempelvis Pseudomonas isolering Medium (PIM), användas för att kontrollera endast Pseudomonas CFUs räknas.
  9. Beräkna antalet CFUs per fly genom att räkna antalet kolonier närvarande vid seriell utspädning där 10 – 60 CFUs syns tydligt. Multiplicera sedan med spädningsfaktorn närvarande för att beräkna antalet bakterier per fly.
  10. Utföra statistiska analyser. Vid behov, omvandla CFUs per fly till en normalfördelning. Gör detta genom log-omvandling. När omvandlas, använda generaliserade linjära modeller (GLMs)30,31,32 att testa hur behandlingsgrupperna skiljer sig i CFUs per fly (med allmänt tillgänglig statistisk programvarupaket såsom R33).
    Obs: Återstående flyga Homogenatet kan användas för att mäta genuttryck genom kvantitativa omvänd Transkription (RT-qPCR) PCR-analys. Fixa Homogenatet i 50 µL av RNA isolering reagens, extrahera RNA och kvantifiera specifika immuna genen titrar av RT-qPCR (se t.ex., Gupta och Vale16 för ett detaljerat protokoll). Uttrycket av specifika immuna genen avskrifter bör normaliseras till avskrift nivåer av en städning gen (dvs., rp49) och uttrycks som ett veck förändras i förhållande till kontroll flugor med hjälp av de 2−ΔΔCt metod31, 32,33,34.

5. inspelning arvsrätt efter infektion

  1. Infektera flugor muntligen enligt steg 4,2.
  2. Överför den infekterade eller kontroll flugor från deras respektive infektion injektionsflaskor i standard Lewis injektionsflaskor och hålla i en inkubator vid 25 ° C i en 12 h:12 h ljus-mörker cykel (eller önskad villkor). Håll flugor tills de är döda.
  3. Räkna antalet levande eller döda flugor i varje injektionsflaska varje dag eller så ofta som krävs.
  4. Överföra flugorna till nya flaskor varje 5 dagar för att undvika flugorna fastnar i maten.
  5. Presentera dessa data som Kaplan-Meier (KM) överlevnadskurvor eller medelvärde ± SE proportionell överlevnad tomter. För att analysera effekten av flera faktorer och/eller deras respektive interaktioner med varandra använder ett statistiska paket (exempelvis paketet ”överlevnad” R33) att köra en överlevnadsanalys såsom Cox proportionella riskmodell modell35.

6. mätning av bakteriehalten

  1. Vid önskad tidpunkt, överföra en enda infekterade fluga till en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör.
  2. Yta sterilisera flugorna som beskrivs i steg 4,4.
  3. Homogenisera i farten och kvantifiera bakteriehalten använda protokollet beskrivs i steg 4,5 – 4.10.

7. Mät bakteriell Shedding

  1. Mäta avgivande tillsammans med den inre belastningen.
  2. Efter infektion, överföra enstaka flugor till 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller ~ 50 µL av Lewis medium för 24 h.
  3. Ta bort flugorna för inre belastning mätning (se steg 6) och tvätta rören med 100 µL av 1 x PBS av vortexa tungt för 3 s.
  4. Mäta CFUs i denna tvätt av plätering på LB näringsagar med samma protokoll som beskrivs i steg 4.6-4.8.
  5. Efter infektion, överföra enstaka flugor till 1,5 mL mikrocentrifugrör som innehåller ~ 50 µL av Lewis medium för 24 h.
  6. Överföra flugorna till nya mikrocentrifugrör innehållande ~ 50 µL av Lewis medium för en ytterligare 24 h. Tvätta förorenade rören med 100 µL av 1 x PBS genom vortexa tungt för 3 s.
  7. Mäta CFUs i denna tvätt av plätering på LB näringsagar använder samma protokoll som beskrivs i steg 4.6-4.8.
  8. Upprepa steg 7,2 och 7,3 och rekord flyga mortalitet vid varje överföring.

Representative Results

Här presenterar vi belysande resultat från experiment där D. melanogaster oralt var smittad med P. aeruginosa eller P. entomophila. Figur 2 visar den framgångsrika oral infektionen av flugor efter ett 12 h eller 24 h exponeringsperioden till bakteriekulturer OD600 = 25 och 100 för P. aeruginosa (figur 2A) och P. entomophila (figur 2B C), respektive. Figur 2B illustrerar vikten av att använda en mer koncentrerad kultur av P. entomophila, framgår av ökat bakteriehalten när flugor utsätts för bakteriekulturer av större optiska täthet. Manliga och kvinnliga Oregon R (OreR) flugor avmarkera P. aeruginosa infektion i samma takt (figur 3) och sprida samma antal P. aeruginosa CFUs (figur 4A). När infekterade med P. entomophila emellertid, manliga och kvinnliga OreR flugor skiljer sig i antalet bakterier skjul, på ett sätt som ändras över tid (figur 4B). Hanar och honor dör av P. aeruginosa (figur 5A) och P. entomophila (figur 5B) i olika takt. Vi ser också att Mattias mutanter (som saknar skyddande peritrophic matrisen i tarmepitelet) och Relish mutanter (som saknar en funktionell IMD immun väg), visar minskad överlevnad efter P. entomophila och P. aeruginosa oral infektion (figur 5 c).

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt av protokoll för mätning av överlevnad, sprider och interna bakteriehalten efter oral infektion på Drosophila melanogaster. En illustration av 3 potentiella experiment efter oral infektion av D. melanogaster. Mäta 'överlevnad' genom överföring av enstaka flugor till injektionsflaskor och registrera sin infekterade livslängd. Mäta 'utgjuta' genom att överföra enstaka flugor till 1,5 mL mikrocentrifugrör med 50 µL av Lewis medium i den gemensamma jordbrukspolitiken. Efter 24 h i röret, bort flugan och vortex röret med 100 µL av 1 x PBS. Ta bort och plattan här lösningen på LB näringsagar att beräkna bakteriell blodsutgjutelse. Mäta blodsutgjutelse i samma fluga längdriktningen, genom överföring av flugor till färska rör med Lewis medium i den gemensamma jordbrukspolitiken efter 24 h, och tvättning och plätering nu förorenade röret. En fluga 'inre belastning' kan mätas genom att en infekterad flyga, ytliga sterilisering det, och homogenisering det innan slutligen plätering Homogenatet på LB näringsagar. Detta kan utföras efter avgivande har mätts för att beräkna hur den 'inre belastning' och shedding korrelat. De flyga bild som används i denna figur ritades ursprungligen av B. Nuhanen36. Författarna har ändrat det att följa det exempel Kaplan-Meier-kurva som tas från Wikimedia Commons37. Alla andra illustrationer är original. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: infektiös dos av bakterier efter oral infektion. (A) smittsam dos av manliga och kvinnliga Oregon-R flyger efter exponering för en P. aeruginosa kultur (OD600 = 25) för 12 h. Medelvärde och SE beräknades från 3 hanar och 3 honor. (B) infektiös dos av outcrossed vildtyp honor efter exponering för en av fyra P. entomophila kulturer (OD600 = 100, 75, 50 och 25) eller styra 5% sackaroslösning under 24 h. Statistiska skillnaden mellan (F3,76 = 18.567, p < 0,001) i infektionssjukdomar dosen mellan exponering behandlingar betecknas med olika bokstäver ovanför barer. Medel beräknades från 5 flugor för OD600 = 0 dos och 18-20 för alla andra doser. (C) infektionssjukdomar dosen av manliga och kvinnliga Oregon-R flyger efter exponering för P. entomophila kultur (OD600 = 100) för 24 h. Medelvärde och SE beräknades från 20 män och 20 kvinnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Inre P. aeruginosa belastning i flugor efter oral infektion. Medelvärde ± SE bakteriehalten av manliga och kvinnliga Oregon-R flyger efter oral infektion med P. aeruginosa (OD600 = 25) upp till 168 h efter infektion. Medelvärde och SE för varje tidpunkt beräknas från 3 individer. En fluga inre bakteriehalten avsevärt förändras över tid (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: bakteriell shedding efter oral infektion. (A) P. aeruginosa skjul av samma flugorna används i figur 3, upp till 120 h efter infektion. Medelvärde och SE beräknades från 3 hanar och 3 honor. (B) P. entomophila skjul av manliga och kvinnliga Oregon-R flyger efter oral infektion med P. entomophila (OD600 = 100) upp till 120 h efter infektion. Medelvärde och SE beräknades från 34 män och 38 kvinnor. För både P. aeruginosa och P. entomophila, antalet CFUs skjul av en fluga avsevärt ändras över tid (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: överlevnad av flugor efter oral bakterieinfektion. Kaplan-Meier (KM) överlevnadskurvor av (A) Oregon-R manlig och kvinnlig flyger efter oral infektion med P. aeruginosa (OD600 = 25) eller styra 5% sackaroslösning. Kurvan KM överlevnad beräknades från 4 injektionsflaskor med 20 flugor per behandlingsgrupp. (B) OreR manliga och kvinnliga flyger efter oral infektion med P. entomophila (OD600 = 100). Kurvan KM överlevnad beräknades från 4 enda kontroll flugor och 34 infekterade flugor för både män och kvinnor. (C) immun mutanter: Mattias (Drosocrystallin-peritrophic matrix mutant) och Rel (Relish-IMD mutant), utsätts för P. entomophila (Pe), P. aeruginosa (Pa14) eller en kontroll 5% sackaroslösning. Alla infekterade grupper dör betydligt snabbare än kontrollen flugor (p < 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi presenterar ett protokoll för tillförlitligt oralt infekterar D. melanogaster med bakteriella patogener. Vi fokuserar på P. aeruginosa och P. entomophila, men detta protokoll kan enkelt anpassas till aktivera infektion av andra bakteriearter, t.ex., Serratia marcescens7. Viktiga aspekter av detta protokoll kommer att variera mellan bakteriearter. Följaktligen bör den effektivaste infektiös dos, motsvarande virulens och värd genotyp känslighet alla vara ansedd och idealiskt testas i pilotstudier. Utsätta flyger till bakteriekulturer av en rad optiska densiteter och mäta deras smittsam dos och överlevnad är en lämplig utgångspunkt vid arbete med nya bakteriearter eller fluglinor.

Protokollstegen flyga såsom svält före utfodring och åter uppskjutande bakteriell pellets i 5% sackaroslösning vardagsmat i oral infektion och öka tillförlitligheten av bakteriell infektion under exponering7,8, 9 , 10. det är dock viktigt att notera att under exponering, flugor i huvudsak lever på en yta av bakterieodling. Håller på att gå på denna kultur, kommer bakterier fastna på flugans yta, särskilt på nagelbanden eller runt den borst24. Dessa epicuticular bakterier, återspeglar inte en framgångsrik enteriska infektion men fortfarande kan upptäckas av flyga homogenisering och plätering. För att minska risken för falsklarm, är det viktigt att ytan sterilisera flugor genom nedsänkning i 70% etanol för upp till 1 min.

När man överväger bakteriell shedding priser, är oral infektion viktigt. Antalet patogener en värd utsläpp i miljön är ofta svårt att mäta och den interna belastningen tas ofta som en proxy för svårighetsgraden av infektion och därför överföring26,27. Mäta bakteriehalten tillsammans med bakteriell shedding tillåter en undersökning av förhållandet mellan dessa två viktiga komponenter i sjukdom svårighetsgrad och spridning38. En begränsning med metoden presenteras är att testmetoder inre bakteriehalten av flugor kräver destruktiva provtagning. Detta gör att det är svårt att undersöka longitudinella trender av patogen tillväxt och platsförmedling inom en och samma individ. Det är dock möjligt att övervinna denna begränsning av destruktivt provtagning kohorter av individer i olika skeden av infektion, under antagandet att den genomsnittliga mikrob belastningen i varje kohort återspeglar längsgående patogen dynamiken inom varje given enskilda. Bakteriella sprider inte lider av samma begränsningar, och vi erbjuder exempel på hur shedding kan kvantifieras i ett tvärsnittsurvalet eller längsled för att utreda hur shedding ändras inom en individ över tid.

Många värd och patogen drag fastställa gemensamt en individs benägenhet att överföra sjukdomen25,26,39. Medan betydelsen av dessa egenskaper sannolikt varierar mellan värd-patogen system, är shedding sannolikt en avgörande betydelse för fekal-oral överföring. Förmågan att mäta bakteriell shedding öppnar möjlighet att testa detta antagande. Att ha kännetecknas värd-patogen dynamik i en önskad panel av fluglinor, kunde praktiker oralt infektera individer, och placera dem tillsammans med icke-infekterade, mottagliga värd under sin smittsamma perioder. Dessa 'mottagare' flugor kan sedan analyseras för interna bakteriehalten vid olika tidpunkter som ett sätt att direkt mäta överföringen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av en strategisk award från Wellcome Trust för centrum för immunitet, infektion och Evolution (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant referens nr 095831). PFV stöddes av ett Branco Weiss stipendium (https://brancoweissfellowship.org/) och en förbundskanslerns gemenskap (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ stöddes av doktorand NERC E3 DTP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14, (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68, (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3, (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11, (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310, (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98, (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284, (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9, (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82, (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10, (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5, (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495, (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6, (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283, (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372, (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9, (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7, (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108, (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192, (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24, (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186, (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15, (3), 186-192 (2012).
Muntliga bakterieinfektion och Shedding i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter