Summary
Cette étude présente une procédure validée et optimisée pour l’isolement et la culture de cellules stromales endométriales humaines pour mener l’essai in vitro décidualisation avec. En outre, cette étude fournit une méthode détaillée pour efficacement défiant un gène spécifique à l’aide de siARN dans les cellules du stroma endométriales humains.
Abstract
La différenciation des cellules stromales endomètre humaines (CSEh) de fibroblastes-comme l’aspect en decidua sécrétoire est une transformation nécessaire pour l’implantation de l’embryon dans la muqueuse utérine de l’utérus maternel. Décidualisation incorrecte a été établie comme une cause de racine d’échec d’implantation et ultérieures déni d’embryon précoce. Comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est donc avantageux d’améliorer le taux de naissances avec succès. In vivo études de décidualisation artificielle limitent souvent due à des dilemmes éthiques associées à la recherche humaine, ainsi que des complications translationnelles dans des modèles animaux. Ainsi, des essais in vitro par culture de cellules primaires servent souvent pour explorer la modulation de décidualisation via les hormones. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’isolement des CSEh et ultérieure décidualisation artificielle par l’intermédiaire de la supplémentation d’hormones dans le milieu de culture. En outre, cette étude fournit une méthode bien conçue pour knockdown aucun gène d’intérêt en utilisant la base de lipides siARN transfections. Ce protocole permet l’optimisation de la pureté de la culture mais aussi de rendement produit, maximisant ainsi la possibilité d’utiliser ce modèle comme une méthode fiable pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents décidualisation et la quantification ultérieure des agents sécrétés par les cellules du stroma endométriales decidualized.
Introduction
Entre les étapes de la puberté et la ménopause, les femmes en âge de procréer subissent des cycles mensuels de prolifération endométriale hormone réglementés, différenciation et excrétion ultérieure en vue de la grossesse dans un processus appelé menstruation1 ,2. Ces modifications physiques de l’endomètre humain sont nécessaires pour l’implantation de l’embryon appropriée dans la paroi utérine1. Modifications de l’endomètre, y compris les adaptations morphologiques et biochimiques, sont effectuent tout au long du cycle menstruel par l’intermédiaire des hormones stéroïdes ovariens oestrogène et la progestérone (P4)3,4,5. Dans la phase proliférative (ou folliculaire), œstrogène préovulatoire niveaux augmentation, initiant l’épaississement de l’endomètre. Après l’ovulation, la phase sécrétoire (ou lutéale) favorise une augmentation significative des concentrations de P4, induisant la transformation morphologique des cellules du stroma endométriales (ESC) de fibroblastes-comme l’aspect des arrondis, les cellules épithéliales déciduale dans un processus appelé décidualisation4,6. Décidualisation incorrecte a été établie comme des causes profondes pour échec d’implantation et ultérieures début embryon fausse couche4,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est avantageuse pour le diagnostic et le traitement de la perte précoce de la grossesse.
Actuellement, plusieurs méthodes sont utilisées pour examiner les effets sous-jacents de décidualisation sur les cellules du stroma endométriales. In vivo, l’utérus de souris peut être induite artificiellement pour décidualisation via une stimulation mécanique (c.-à-d., grattage) ou injection dans un utérus hormonalement apprêtée9d’huile. Distincte de l’homme, cette stimulation synthétique favorise la différenciation de la lumière utérine en offrant l’apparence de la présence de blastocyste, une étape qui est requise pour l’ouverture de décidualisation rongeurs10,11. En conséquence, en raison de complications translationnelles associées à des modèles animaux et les dilemmes éthiques qui entourent en vivo basé des études chez l’homme, modèles de décidualisation basée sont étudiés avec plus de succès in vitro.
Dans cette étude, les sujets sont recrutés par le placement de publicités dans les deux journaux locaux en anglais et en espagnol. Sujets identifiés comme des candidats appropriés pour cette étude sont présentées rencontrer le coordonnateur de la recherche, dans lequel une divulgation complète des risques potentiels sont discutés. Lors de la confirmation d’une compréhension complète des risques potentiels, le consentement des sujets est atteint sous forme écrite et verbale. Consentement du sujet inclut la permission de (1) subissent une phlébotomie (2) durablement de leurs tissus à des fins de recherches futures et (3) d’accord pour la création de cultures primaires d’après des échantillons de tissus prélevés. Après consentement, les sujets reçoivent un formulaire à remplir dans lequel auto-identification permise d’ethnie et/ou le droit de non-divulgation. Une visite ultérieure est prévue pour atteindre la biopsie de l’endomètre basée sur le cycle menstruel du sujet. Volontaires recrutés pour cette étude reflètent les deux la démographie ethnique et raciale de la région métropolitaine de Saint-Louis, répertoriés par le recensement 2012 et n’impliquant pas la participation d’une population vulnérable, y compris les femmes enceintes, les fœtus, les embryons, enfants de moins de 18 ans d’âge, ou d’autres groupes vulnérables. Conditions d’admissibilité à la participation à la collecte d’échantillons de biopsie incluent (1) être âgés de 18 à 45 ans (2) ayant des cycles menstruels réguliers (25 à 32 jours) (3) n’ayant aucun grossesse actuelle ou l’utilisation de contraceptifs hormonaux/intra-utérine périphérique pendant 30 jours précédant l’inscription (4) n’ayant aucun courante infection vaginale ou les maladies sexuellement transmissibles (5) vu aucun traitements antibiotiques actuels et (6) n’ayant aucun courant frottis de Pap.
Dans cette étude, les cellules stromales endométriales humaines (CSEh) sont cultivées et artificiellement induits in vitro la décidualisation par lorsqu’il s’agit d’hormones (estradiol (E2), l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) et adénosine cyclique de subir monophosphate cyclique (AMPc)) au milieu. Dans cette méthode, le degré de décidualisation est modifié basée sur le nombre total de jours de traitement hormonal. Parallèlement à la réorganisation du cytosquelette, la supplémentation hormonale induit des adaptations biochimiques dans lequel les cellules déciduale expérience sécrétoire qualités2,4. L’expression des gènes de hallmark, tels que la prolactine (PRL) et la protéine de liaison d’insuline-like growth factor 1 (IGFBP1), peut être utilisée pour confirmer et quantifier le degré de CSEh décidualisation5,12, 13 , 14. ce qui est important, la viabilité de ce protocole pour mener de précipitation spécifique de gène est également démontrée.
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Protocol
Toutes les biopsies de l’endomètre humain recueillies pour cette étude ont été obtenus de l’Université de Washington à St. Louis, Département d’obstétrique et gynécologie à l’aide de l’Institutional Review Board (IRB) a approuvé le formulaire de consentement.
1. préparation
- Préparer 500 mL de 1 x de Hank Balanced Salt Solution (HBSS) en ajoutant 100 U/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine à la bouteille contenant de médias (plus référencée comme HBSS + support).
- Préparer 500 mL de milieu d’Eagle modifié de Dulbecco : mélange de nutriments F-12 (DMEM/F12), avec le rouge de phénol, L-glutamine et l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 15 mM 4 (HEPES) en ajoutant 1 % solution antibiotique-antimycosiques (la concentration finale est 100 U/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine et 0,25 µg/mL Fungizone) aux médias contenant bouteille (plus référencée comme les milieux d’isolement CSEh).
- Préparer 500 mL de DMEM/F12 avec rouge de phénol, de L-glutamine et 15 mM HEPES en ajoutant 10 % sérum bovin fœtal (SVF), 1 x Na2HCO3et 1 % la pénicilline (10 000 U/mL) et à la streptomycine (10 000 µg/mL) (Pen Strep) aux médias contenant bouteille (plus référencé en tant que média de CSEh).
- Préparer 500 mL de milieu de sérum réduit avec la L-Glutamine, 2,4 g/L de bicarbonate de sodium et HEPES avec 2 % charbon dépouillé sérum de veau fœtal (csFBS) et 1 % Pen Strep aux médias contenant bouteille (encore appelé décidualisation Media).
- Préparer 500 mL de phénol rouge gratuit DMEM/F12 en ajoutant 2 % de charbon de bois dépouillé de sérum de veau fœtal (csFBS) dans les médias contenant bouteille (plus référencée comme médias de changement).
- Préparer 10 nM estradiol (E2), acétate de médroxyprogestérone 1 µM (MPA) et 50 µM adénosine monophosphate cyclique (AMPc) dans un tube conique polypropylène 15 mL et ajouter à une 2 mL par puits aliquote de médias de décidualisation préalablement préparée pour in vitro dosage de décidualisation (plus référencé comme support de la CBE).
- Préparer 50 mL de gel médias avec 90 % de SVF et 10 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) dans un tube conique polypropylène de 50 mL (plus référencé comme support de congélation).
- Les peser 25 mg de collagénase et 5 mg de DNase I dans un tube en polypropylène 50 mL conique et conserver à-20 ° C.
2. Acquisition de biopsie de l’endomètre humain
- Obtenir des échantillons de biopsie de l’endomètre humain recueillis lors de la phase proliférative (jour 9 - 12 jours) du cycle menstruel de la clinique de la CISR a approuvé à HBSS.
- Laver des biopsies avec 1 mL de préchauffée à 37 ° C HBSS + moyennes et secouez légèrement pour enlever l’excès sanguin et de la muqueuse.
3. isolement de cellules stromales endométriales humaines (CSEh)
Remarque : Cette procédure d’isolement est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.
- Transférer la biopsie avec une pince stérilisée dans un tube à centrifuger conique de polypropylène 50 mL contenant 10 mL HBSS fraîches.
- Centrifuger la biopsie à la température ambiante à 500 g pendant 90 s.
- Si les ruptures de culot cellulaire, re-spin la biopsie à 2 000 x g pendant 90 s.
- Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et lavage avec 10 mL de 37 ° C préchauffé les milieux d’isolement de CSEh suivies par centrifugation à 500 g pendant 90 s.
- Retirez le support à l’aide d’une pipette de 1 mL et vigoureusement ajouter 3 mL de frais milieux d’isolement de CSEh pour déloger la biopsie.
- Décanter la biopsie dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de milieux d’isolement de CSEh.
- Émincer la biopsie en tant que petits morceaux possible à l’aide de #5 pinces et ciseaux fine point droit pendant environ 20 minutes.
- Préparer la DNase I et enzymes collagénase en ajoutant 10 mL de milieux d’isolement CSEh à pré-pesés DNase I (0,5 mg/mL) et collagénase (2,5 mg/mL). Mélanger avec la pipette.
- Pipette de coupe les échantillons de tissus à l’aide d’une pipette de 1 mL dans un nouveau tube polypropylène conique de 50 mL. Laver avec 7 mL de milieux d’isolement CSEh et ajouter dans le tube en polypropylène pour acquérir l’ensemble de l’échantillon.
- Centrifuger l’échantillon à la température ambiante à 800 x g pendant 2 min. Retirez délicatement le surnageant de pipette.
- Filtrer la DNase collagénase solution par le biais de 0,2 µm filtre et j’ai attachés à la seringue de 10 mL directement sur pellet.
- Vortexer pendant 10 s pour remettre en suspension les granulés.
- Digérer au bain-marie à 37 ° C pendant 1,5 h, vortex pour 10 s soigneusement toutes les 10 min, jusqu'à ce que le tissu est digéré.
- Filtrer l’échantillon à travers une passoire de cellule 40 µm empilés sur un tube en polypropylène 50 mL conique pour éliminer les cellules épithéliales et les débris tissulaires.
Remarque : Les cellules du stroma sont dans le tube en polypropylène 50 mL conique. - Centrifuger le tube polypropylène conique de 50 mL à 800 g pendant 2,5 min à température ambiante. Retirez délicatement le surnageant avec une pipette de 1 mL.
- Resuspendre le culot dans 10 mL de milieux d’isolement de CSEh.
- Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et puis remettre en suspension les cellules dans 6 mL de CSEh Media et pipette avant et arrière pour mélanger.
- Couche lentement sur 3 mL de média gradient de densité pour les cellules resuspendues afin de séparer les cellules restantes de sang des cellules stromales, en veillant à ne pas mélanger les couches.
- Centrifuger le tube de 15 mL en polypropylène à 400 g pendant 30 min à température ambiante.
- Collecter 5 mL du surnageant dans un nouveau tube en polypropylène 50 mL et ajouter une supplémentaire 5 mL CSEh Media pour remettre en suspension les cellules.
- Centrifuger à 800 g pour 2,5 min à température ambiante, suivie de la suppression du liquide surnageant et ajout de 6 mL de milieu de CSEh. Vortex l’échantillon de 10 s et mélanger en pipettant également, avance et retour 5 fois.
- Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension à un tube de microtubes de 1,5 mL pour la numération des cellules.
- Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tache cellulaire aliquote et mélanger avec la pipette. Charger de 10 µL de l’aliquote et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Plaque de cellules dans une fiole appropriée dépend du nombre de cellules total dans 15 mL de milieu de CSEh.
- Si le nombre total de cellules est inférieur à 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 25 cm avec 6 mL de CSEh Media. Si le nombre total de cellules est plus de 1 million, plaque de toutes les cellules dans ballon 75 cm avec 15 mL de CSEh Media.
- La culture des cellules dans un incubateur à CO 5 %2 à 37 ° C pendant au moins 6 h pour assurer l’adhérence de la cellule appropriée et changer les médias en médias CSEh.
- Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
- Changer les CSEh médias tous les deux jours.
- Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
- Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
- Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.
- Une fois CSEh devenir confluente de 80 à 90 %, les cellules de transfert de 25 cm à 75 cm flacon ou d’une fiole de 75 cm à trois flacons de 75 cm.
NOTE : CSEh peut être congelé et stocké pour un usage ultérieur en ce moment d’expérimentation future.
4. gel et de dégel CSEh
- Aspirer les médias de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA.
- Incuber dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2-3 min à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules se déloger de la fiole.
- Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
- Centrifuger à 800 g pour 2,5 min et aspirer le surnageant.
- Identifier les tubes gel avec lignée cellulaire, la date et le numéro de passage.
- Resuspendre le culot dans 5 mL de gel de médias.
- Aliquote 1 mL de la CSEh remises en suspension dans chaque tubes tube et transfert pour congélateur-80 ° C.
- Transfert des tubes à l’azote liquide dans les 24 heures.
NOTE : Si vous voulez décongeler des cellules dans un avenir immédiat, stocker des cellules congelées à-80 ° C pendant un mois. - Pour dégeler les CSEh Préchauffer CSEh médias pendant 20 min.
- Ajoutez 8 mL de médias de CSEh préchauffé dans ballon 25 cm.
- Extraire le tube de gel de la cuve d’azote liquide ou de-80 ° C et plonger le tube dans le bain-marie à 37 ° C pendant 1 à 2 min à dégeler les cellules.
- Transférer les CSEh décongelé dans une fiole jaugée de 25 cm avec les médias de CSEh et incuber dans une étuve à2 CO 5 % pendant une nuit à 37 ° C.
- Lendemain, changer les médias CSEh et attendre 2 ou 3 jours jusqu'à ce que les CSEh deviennent confluente et cellules de transfert dans ballon 75 cm tel que décrit ci-après dans le Protocole N° 5.
- Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
- Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
- Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.
5. culture de cellules Stromal endométrial humaines (CSEh)
Remarque : Cette procédure Culturing s’effectue dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.
- Préchauffer les CSEh Media à 37 ° C au bain-marie pendant 20-30 min.
- Aspirer les médias du flacon et ajouter de l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,25 % trypsine (EDTA) (mL 1 flacon de 25 cm ou 2 mL pour ballon 75 cm).
- Incuber dans un incubateur à CO 5 %2 à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
- Tapotez doucement les parois du ballon pour déloger les cellules restantes. Ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger bien en pipettant également, avant et arrière.
- Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans les médias de CSEh.
- Ajouter 15 mL pour flacon de 25 cm ou 45mL pour 75 cm ballon (15 mL chaque).
- Ajouter 5 mL ou 15 mL de suspension de cellules dans chaque fiole 25 cm ou 75 cm respectivement.
- Culture le CSEh isolé dans un 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant une période de 3 à 5 jours jusqu'à ce que les cellules forment une monocouche atteindre 80-90 % confluence dans un ballon plaqué.
- Changer les CSEh médias tous les deux jours.
- Médias de CSEh chaud dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min.
- Aspirer les médias de la fiole et ajouter des supports neufs de CSEh dans le ballon (volume de travail : 8 ou 16 mL par flacon de 25 cm ou 75 cm respectivement).
- Placer le ballon dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que la confluence de 80 à 90 % est atteint.
6. humain l’endomètre Stromal Cell (CSEh) placage et Transfection de siARN
Remarque : Cette procédure de transfection est effectuée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.
- Aspirer les CSEh Media de la fiole de 75 cm et ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA de 0,25 %.
- Incuber dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 2-3 min jusqu'à ce que les cellules déloger.
- Une fois que les cellules sont délogés du flacon, ajouter 7 mL de CSEh Media et mélanger doucement en pipettant également, vers l’avant et inverser 5 fois.
- Ajouter le mélange de cellules dans un tube en polypropylène 50 mL conique et centrifuger à 800 x g pendant 2,5 min à température ambiante. Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 10 mL de CSEh Media.
Remarque : Si les cellules de plus d’une fiole de placage, tout simplement augmenter le volume de CSEh Media. - Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Aliquote 10 µL de cellules remises en suspension dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Ajouter 10 µL de 0,4 % le bleu Trypan tacher à cellule aliquote et mélanger en pipettant également vers l’avant et inverser.
- Plaque de 0,8 x 105 cellules par puits dans les plaques 6 puits. Après deux jours, les cellules devraient être anastomosé de 60 à 70 % pour la transfection optimale.
- Pour chaque échantillon de transfection de siARN, préparer des complexes à l’aide de siARN (60 nanomoles) au réactif de transfection.
- Diluer 5 µL de réactif de transfection dans 150 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
- Diluer 60 nanomoles de siARN dans 100 µL de médias libres sériques réduites et incuber pendant 5 min.
- Après 5 minutes, combiner des siARN dilué avec la solution de réactif de transfection dilué et mélanger doucement en pipettant également vers l’avant et inverser 5 fois.
Remarque : Si transfectants un ou plusieurs siARN dans plusieurs puits, préparer un mélange maître dans 10 mL tubes en polystyrène. - Incuber les complexes réactif siARN-transfection pendant 5 min à température ambiante.
- Durant cette incubation, ajouter 1 mL de médias de changement à chaque puits.
- Après 5 min d’incubation, centrifuger les tubes à 500 g pendant 2 min recueillir de solution et ajouter les 250 µL de complexes de réactif de siARN-transfection dans chaque cupule contenant des cellules et des médias.
- Mélanger en poussant doucement et incuber les cellules à 37° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 5 h.
- Après 5 h, remplacez les médias médias CSEh.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % pendant 2 jours en vue d’un essai in vitro décidualisation avec.
7. essai in Vitro décidualisation avec
Remarque : Cette analyse est réalisée dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique.
- Préparer les médias CBE avant d’entreprendre le traitement de décidualisation in vitro , tel que décrit dans Camden et al. 3 (voir 1.6).
- Aspirer les médias de la post-48 heure ligne transfectée de CSEh incubé à l’étape 6.16.
- Ajouter 2 mL d’EPC multimédia dans chaque puits.
Note : comme un contrôle, laisser un jeu de cellules non traité avec les médias de la CBE. Au lieu de cela, ajouter 2 mL de CSEh Media dans les puits de contrôle. - Incuber les cellules dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 6 jours.
- Modifier les médias CBE toutes les 48 heures.
- Réchauffer et préparer les milieux de l’EPC dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15-20 min.
- Aspirer les médias du puits et ajouter les supports neufs CBE.
- Replacez la plaque dans le 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.
- Modifier les médias CBE toutes les 48 heures.
- Après le sixième jour, analyser l’étendue de la décidualisation de cellules stromales via ELISA et qRT-PCR (comme décrit ci-dessous).
8. validation de décidualisation In Vitro utilisant la PCR Quantitative en temps réel (qRT-PCR)
Note : qRT-PCR est complétée comme décrit dans Kommagani et al.10.
- Isoler l’ARN total de CSEh utilisant le protocole d’un kit d’isolation d’ARN disponible dans le commerce.
- Analyser la quantité de RNA et de la pureté (un260/a280) utilisant un NanoDrop ou une méthode similaire, comme décrit dans Elias-Garcia et al.15.
- Synthétiser des ADNc de 1 µg d’ARN total via un protocole de kit de transcription inverse disponibles dans le commerce.
- Exécutez une réaction qRT-PCR comme décrit dans un protocole de kit qRT-PCR disponibles dans le commerce.
- Effectuer la réaction en utilisant un mélange de maître de la PCR en temps réel disponibles dans le commerce et sondes de gènes spécifiques ainsi que les réglages de système interne (18 s, PRLet IGFBP1).
9. validation de décidualisation In Vitro utilisant ELISA
- Quantifier le taux de prolactine sécrétée partir du support de culture de tissus utilisant un kit de prolactine ELISA disponible dans le commerce.
10. validation de décidualisation In Vitro utilisant la coloration de la phalloïdine.
- Insérer les lamelles stériles dans chaque puits d’une plaque bien 12.
- Répétez les étapes 6.1-6.5.
- Plaque de 0,8 x 105 cellules par puits d’une plaque bien 12.
- Incuber les cellules dans 5 % CO2 incubateur à 37 ° C pendant 2 jours.
- Aspirer les médias.
- Répétez les étapes 7.3 à 7.4.
- Fixer les cellules à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante pendant 30 min.
- Aspirer la solution de fixation et laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
- Ajouter 0,1 % éther de phényle surfactant non ionique polyéthylèneglycol tert-octyl dans du PBS pendant 5 min pour les cellules fixes pour augmenter la perméabilité.
- Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
- Ajouter 100 µL de solution de la phalloïdine par lamelle et laisser incuber à température ambiante pendant 90 min.
- Préparer la dilution de 1/100 dans du PBS d’utiliser une solution mère de phalloïdine dans 1 unité par 5 µL.
- Laver 3 fois avec 1 mL de PBS de 5 min chacun.
- Monter les diapositives avec support de montage contenant 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI).
- Observer les cellules en utilisant un microscope confocal.
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Representative Results
Décidualisation CSEh culture
Après isolement, cellules du stroma endométriales humains sont cultivés à une formation monocouche avec confluence de 80 à 90 % et induite pour in vitro décidualisation en traitant avec 10 nM E2, 1µm MPA et cAMP de 50 µM (CBE). Changements morphologiques associées en vitro décidualisation sont visualisées à la Figure 1 a. À la décidualisation, CSEh subissent réarrangement du cytosquelette des cellules allongées, fibroblastiques en cellules épithélioïdes arrondies. Ainsi, la phalloïdine coloration a été effectuée pour confirmer la réorganisation du cytosquelette durant la décidualisation CSEh. Phalloïdine est un peptide bicyclique hautement sélectif, qui est utilisé pour colorer des filaments d’actine, ainsi visualiser le réarrangement du cytosquelette conforme en vitro décidualisation (Figure 1 b).
À six jours de traitements CBE post, CTR et taux d’ARNm IGFBP1 ont été évaluées au moyen qRT-PCR afin de confirmer le degré de décidualisation (Figure 2 a). PRL et IGFBP1 niveaux ont augmenté considérablement par rapport à la CSEh traité avec le véhicule de contrôle (p < 0,001). Changements biochimiques liés à la décidualisation ont également été évaluées par le biais de la quantification des niveaux PRL sécrétées dans le milieu de culture (Figure 2 b). Conformes aux niveaux de transcription, PRL niveaux étaient très élevées dans la CBE cultivées CSEh par rapport au contrôle (p < 0,001).
Les effets de l’abrogation des gènes spécifiques sur les modifications moléculaires et cellulaires de décidualisation CSEh ont été simulés par SRC-2 comme gène candidat (Figure 3). Après 48 heures de la transfection avec contrôle ou siRNA SRC-2 , CSEh ont été cultivés en pendant 6 jours dans les médias de la CBE. SiARN contrôle transfectées CSEh a démontré des changements cellulaires et moléculaires compatibles avec décidualisation appropriée, y compris un changement morphologique des pavés et des niveaux de transcription accrue des marqueurs de décidualisation PRL et IGFBP1. Comme prévu, avec SRC-2 siARN knockdown, CSEh sont resté fibroblastique en apparence par rapport à des siARN contrôle transfectées CSEh (Figure 3 a). Conformément à ce changement cellulaire, PRL et transcription IGFBP1 ont sensiblement diminué au sein de la SRC-2 siARN transfectés CSEh, indiquant un déraillement survenu en programmation de décidualisation avec précipitation SRC-2 (* **p < 0,001). SRC-2 niveaux de transcription ont été diminuées dans SRC-2 siARN transfectés CSEh comparativement pour contrôler des siARN, indiquant un silençage génique efficace avec notre méthode (***p < 0,001) (Figure 3 b).
Figure 1 : Des changements cellulaires des cellules stromales endométriales humaines pendant à la vitro décidualisation. CSEh ont été isolées et cultivées pendant six jours dans des milieux contenant soit véhicule ou E2, MPA et cAMP (CBE). A) cellule images illustrant les changements dans la morphologie cellulaire de fibroblastique à cellules épithélioïdes. B) phalloïdine colorées des images des CSEh illustrant les changements cytosquelettiques (en vert) liés à la décidualisation in vitro , où le bleu représente le noyau (DAPI). La flèche rouge représente les cellules decidualized. La flèche noire montre des cellules fibroblastiques. Echelle : 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Des changements moléculaires dans les cellules stromales endométriales humaines pendant à la vitro décidualisation. A) l’ARN total a été isolé de HSECs cultivés pendant six jours dans des milieux contenant soit véhicule ou E2, MPA et cAMP (CBE) et soumises à une analyse pour détecter des PRL et des niveaux de transcription IGFBP1 qRT-PCR. B) niveaux de PRL sécrété dans les milieux de culture ont été mesurés à l’aide d’une analyse selon ELISA de CSEh cultivé pendant six jours dans un véhicule à CBE. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Knockdown de SRC-2 dans les cellules du stroma endométriales humains affecte à la vitro décidualisation. A) changements morphologiques en siARN transfectés CSEh après 6 jours de culture et médias de la CBE (albums de panneaux : siARN contrôle au moment des points jour 0 et 6 jours, panneaux inférieurs : siARN SRC-2 en temps points jour 0 et 6 jours). B) niveaux transcription de SRC-2, PRLet IGFBP1 le jour 0 et 6 jours de CBE traitement CSEh transfecté avec les siARN SRC-2 ou de contrôle. La flèche noire représente les cellules decidualized. La flèche blanche montre des cellules fibroblastiques. Echelle : 200 µm. *** p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le cycle menstruel reproducteur féminin se caractérise par une augmentation de la concentration de progestérone pendant la phase lutéale, induisant ainsi la décidualisation de ESC en rond, épithéliales-comme des cellules sécrétrices3,8. L’initiation de décidualisation est espèces dépendantes. Chez l’homme, décidualisation se fait spontanément sur la hausse de la concentration de progestérone, tandis que les souris exigent blastocyste présence10,11. Cette incohérence dans la décidualisation illustre bien les avantages translationnelles d’étudier la différenciation cellulaire dans des lignées cellulaires humaines. Des essais in vitro par culture de cellules primaires sont souvent utilisées pour explorer la modulation de décidualisation via hormones4,6,10. Toutefois, les limitations de cette méthode peuvent survenir sur l’obtainability d’un grand échantillon de tissus humains sans variations significatives dans l’histoire de phase et grossesse cycle. Néanmoins, peuvent prendre des mesures pour s’assurer que les limites sont réduits au minimum en planifiant l’étude assez longtemps à l’avance afin de garantir un grand échantillons et ordonnancement des biopsies dans la phase proliférative (jour 9 - 12 jours) du cycle menstruel.
Dans cette étude, les CSEh sont cultivées et decidualized artificiellement grâce à une nouvelle méthode d’abord été décrit en Brosens et al. 16 quelles hormones E2, P4 et cAMP sont complétées dans le milieu de culture tout au long d’une période d’incubation de 6 jours. En règle générale, méthodes alternatives12,14 amorcée cell cultures pour décidualisation artificielle grâce à l’ajout de E2 et MPA sur une période d’incubation prolongée de 14 jours. Lorsqu’il s’agit du cAMP aux médias culture synergie amplifie la décidualisation de ESC dans un laps de temps réduite tout en simultanément cytoprotectrices l’expression des gènes contenant des régions promotrices de cAMP élément sensible (c'est-à-dire, PRL et IGFBP1)12,13. Cette méthode, basée sur le protocole décrit dans Kommagani et al. 10, permet l’optimisation de l’isolement et la culture des CSEh. Pureté de la culture de cellules a été optimisée en utilisant une passoire de cellule 40 µm pour séparer des lignées de cellules stromales et épithéliales. En outre, gradient de Ficoll-Paque PLUS réactif a été appliquée pour assurer une isolation de viable, haut rendement des cellules stromales pures sur le prélèvement de cellules de sang de l’échantillon. Ajout de Ficoll suivant inclus afin d’assurer l’élimination complète des globules de la population cellulaire a été une étape de centrifugation supplémentaires (400 g pendant 30 min). Enfin, rendement et la viabilité de CSEh ont été optimisées sur culture de cellules embryonnaires jusqu'à 95 % confluence de décidualisation. Au total, ces étapes supplémentaires assurée la culture pure de viable, haut rendement CSEh.
Le degré de décidualisation a été évalué en utilisant qRT-PCR ELISA et phalloïdine souillure pour observer le réarrangement du cytosquelette et la stimulation de l’expression des gènes de la marque de fabrique. Par qRT-PCR, les niveaux de transcription des marqueurs de décidualisation PRL et IGFBP1 ont été évalués. À la décidualisation de CSEh, PRL et IGFBP1 augmentent de façon dépendante du temps, tel qu’établi de précédentes recherches6. L’augmentation dépendant du temps des concentrations de PRL sécrètent a également été confirmée en examinant les milieux de culture de tissu de CSEh par ELISA. En outre, des altérations morphologiques des cellules stromales en cellules déciduale peuvent être visualisées par le biais de la costaining des filaments d’actine via la phalloïdine et marqueur nucléaire 4', 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)17. Ensemble, ces résultats expérimentaux ont confirmé l’efficacité des CSEh de culture par le biais de la supplémentation de E2, MPA et cAMP.
La capacité du présent protocole pour étudier le knockdown spécifique de gène a également été évaluée utilisant des siARN contre SRC-2. Morphologiquement, SRC-2 transfectées CSEh sont demeurée fibroblastique, tandis que les CSEh traitées avec des siARN contrôle decidualized en cellules épithélioïdes. SRC-2 knockdown efficacité a été évaluée par le niveau de transcription et diminue significativement, ce qui indique un succès silencing du gène spécifique avec notre protocole. Ainsi, notre protocole peut être une ressource utile pour les chercheurs qui s’intéressent à délimiter le rôle des gènes spécifiques dans l’endomètre décidualisation.
Progrès dans la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de décidualisation ont été faits, une lacune importante existe toujours sur les détails. Décidualisation incorrecte a été établie comme une cause de racine d’échec d’implantation et ultérieures début embryon fausse couche4,6,7,10. Une étude plus poussée concernant les facteurs épigénétiques et la caractérisation des voies moléculaires est donc nécessaire pour le diagnostic et le traitement de l’insuffisance de la grossesse.
En conclusion, le protocole présenté tout au long de cette étude établit une méthode efficace pour isoler et une ligne pure et viable de cellules du stroma endométriales humains de la culture. En complétant les hormones E2, MPA et cAMP aux médias culture, décidualisation artificielle peut être induite, tel que confirmé par qRT-PCR, ELISA et la coloration de la phalloïdine. En outre, notre protocole décrit les étapes détaillées requises pour la précipitation efficace d’un gène spécifique d’intérêt à l’aide de siARN et axée sur les lipides transfections. Au total, cette méthode présente la possibilité d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent, associés de décidualisation CSEh.
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Disclosures
Ce travail est soutenu par un financement du National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) subvention (R00 HD080742) et démarrage de la Washington University School of Medicine fonds de R.K. Nous tenons à remercier la clinique de fertilité de l’Université de Washington pour fournir des échantillons de biopsie de l’endomètre.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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