Summary
Это исследование представляет проверяемое и оптимизированы процедуры для изоляции и культуры стромальных клеток человека эндометрия проводить в пробирке decidualization assay. Кроме того это исследование предоставляет подробный метод эффективно нокдаун конкретных генов, используя малые интерферирующие РНК в клетках стромы человека эндометрия.
Abstract
Дифференциация эндометрия стромальных клеток человека (Госкомсанэпиднадзором) от фибробластоподобных появление в секреторную decidua является преобразования, необходимые для имплантации эмбриона в слизистую оболочку матки в материнской утробе. Неправильное decidualization был создан как причины для имплантации неудачи и последующих раннего эмбриона выкидыша. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно повышение показателя успешных родов. В естественных условиях на основе исследования искусственных decidualization часто ограничения вследствие этических дилемм, связанных с исследований человеческого, а также поступательное осложнения в течение животных моделей. В результате в пробирке анализов через культуры главной ячейки часто используются для изучения модуляции decidualization через гормоны. Это исследование содержит подробный протокол для изоляции Госкомсанэпиднадзором и последующие искусственные decidualization через добавок гормонов в среде культивирования. Кроме того это исследование предоставляет хорошо продуманных метод нокдаун любой ген интереса, используя transfections на основе липидов siRNA. Этот протокол позволяет оптимизацию культуры чистоты, а также выход продукта, тем самым максимального способность использовать эту модель как надежный способ понять молекулярные механизмы, лежащих в основе decidualization и последующее количественная оценка выделяется агенты decidualized стромальные клетки эндометрия.
Introduction
На этапах менструации и менопаузы женщин репродуктивного возраста проходят месячные циклы гормона регулируется эндометрия распространения, дифференциация и последующих пролить в рамках подготовки к беременности в процессе, известном как менструация1 ,2. Такие физические изменения человеческого эндометрия являются необходимыми для надлежащего эмбриона имплантации в матки стены1. Изменения эндометрия, включая биохимические и морфологические адаптации, опосредованного на протяжении менструального цикла через яичников стероидных гормонов эстрогена и прогестерона (P4)3,4,5. В течение этапа пролиферативной (или фолликулярной) preovulatory эстроген уровнях увеличения, инициирование утолщение эндометрия. После овуляции фазы секреторной (или лютеиновой) способствует значительное увеличение концентрации P4, вызывая морфологических трансформации эндометрия стромальных клеток (ESC) от фибробластоподобных внешний вид к округлые, децидуальной клетки эпителия как в процессе, известном как decidualization4,6. Неправильное decidualization был создан как причины для отказа имплантации и последующих раннего эмбриона выкидыш4,7,8. Таким образом понимание молекулярных механизмов лежащих в основе decidualization выгодно для диагностики и лечения ранних потери беременности.
В настоящее время несколько методов используются для изучения базовых эффектов decidualization на стромальные клетки эндометрия. В естественных условиях, мыши матки может быть искусственно вызываемые для decidualization через механической стимуляции (т.е., царапин) или масло инъекций в гормонально загрунтовать матки9. Отличаются от людей, это синтетический стимуляции способствует дифференциация матки люмен, обеспечивая появление бластоциста присутствия, шаг, который требуется для инициирования decidualization грызунов10,11. Соответственно, поступательные осложнения, связанные с Животные модели и этические дилеммы, окружающих в естественных условиях на основе исследования на людях, decidualization на основе модели наиболее успешно изучал в пробирке.
В этом исследовании предметы набираются через размещение рекламы в обоих местных газетах английский и испанский. Предметы, которые определены в качестве подходящих кандидатов для этого исследования привлекаются встретиться с координатором исследований, в котором обсуждаются полное раскрытие потенциальных рисков. После подтверждения полного понимания потенциальных рисков достигается согласие испытуемых в письменной и устной формах. Предметом согласия включает разрешение (1) проходят кровопускания (2) длительного хранения их тканей для будущих исследований и (3) согласиться на создание первичных культур от ткани собранных образцов. После согласия темы даны формы для завершения в которых разрешается самоидентификации расы/этнической принадлежности и/или право неразглашения. Последующий визит планируется достичь биопсию эндометрия, основанный на субъекта менструального цикла. Добровольцев, набираемых для этого исследования отражают этнические и расовые демография в Сент-Луисе митрополит регионе как документально подтверждено 2012 переписи и не с участием любых уязвимых групп населения, в том числе беременные женщины, плод, эмбрионы, Дети до 18 лет возраста, или других уязвимых групп. Требования для участия в коллекции биопсии образца включают (1) людей в возрасте от 18-45 лет (2), имеющих регулярный менструальный цикл (25-32 дней), (3) не имея текущий беременности или использование гормональных/внутриматочные контрацептивы за 30 дней до подачи заявок (4) без текущего вагинальной инфекции и венерических заболеваний (5) не текущего лечения антибиотиками, и (6) имея не текущей пап.
В рамках этого исследования культурный и искусственно вызванного пройти в пробирке decidualization через добавок гормонов (эстрадиола (Е2), медроксипрогестерона ацетат (МПа) и циклической аденозин стромальные клетки человека эндометрия (Госкомсанэпиднадзором) монофосфат (лагерь)) в среде. В этом методе степень decidualization изменяется основанный на общее количество дней гормонального лечения. В сочетании с цитоскелета перегруппировки гормональных добавок индуцирует биохимической адаптации, в которых децидуальной клетки опыт секреторной подобных качеств2,4. Экспрессии генов, отличительной чертой, как Пролактин (ПРЛ) и белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 1 (IGFBP1), могут быть использованы для подтверждения и количественно оценить степень Госкомсанэпиднадзором decidualization5,12, 13 , 14. Важно отметить, что также продемонстрировал жизнеспособность этого протокола для проведения конкретных нокдаун гена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все биопсии человеческой эндометрия, собранные для этого исследования были достигнуты от Университет Вашингтона в Сент-Луисе, Кафедра акушерства и гинекологии с помощью институционального обзора Совет (IRB) утвердил форму письменного согласия.
1. Подготовка
- Подготовка 500 мл 1 x Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS) путем добавления СМИ содержащие бутылки (далее упоминается как HBSS + средний) 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
- Подготовка 500 мл Дульбекко изменения среды орла: питательной смеси F-12 (DMEM/F12) с 15 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), добавляя 1% раствор антибиотика противогрибковое (конечная концентрация фенола красного и L-глютамина Это 100 ед/мл пенициллин, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл Fungizone) к средствам массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ).
- Подготовка 500 мл DMEM/F12 с фенола красного, L-глютамин и 15 мм HEPES, добавляя 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), 1 x Na2HCO3и 1% пенициллин (10000 ед/мл) и стрептомицин (10 000 мкг/мл) (стрептококк перо) СМИ содержащие бутылки (далее Ссылка на как Госкомсанэпиднадзором СМИ).
- Подготовка 500 мл с 2% снижение средних сыворотки с L-глютамином, бикарбонат натрия 2,4 г/Л и HEPES уголь раздели плода Bovine сыворотки (csFBS) и 1% перо стрептококк в средствах массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как Decidualization СМИ).
- Подготовка 500 мл фенола Красного свободной среде DMEM/F12, добавив 2% угля раздели плода бычьим сывороточным (csFBS) в средствах массовой информации, содержащие бутылка (далее упоминается как изменения СМИ).
- Подготовка 10 Нм эстрадиола (Е2), медроксипрогестерона ацетат 1 мкм (МПа) и 50 мкм циклический аденозинмонофосфат (лагерь) в 15 мл полипропиленовые Конические трубки и добавить по 2 мл в хорошо Алиготе ранее подготовленные decidualization СМИ в пробирке decidualization проба (далее упоминается как EPC СМИ).
- Подготовка 50 мл замораживания средств массовой информации с 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) в 50 мл полипропиленовые Конические трубки (далее упоминается как замораживание средств массовой информации).
- Предварительно весят 25 мг коллагеназы и 5 мг DNase I в 50 мл конические полипропиленовые трубы и хранить при температуре от-20 ° C.
2. человека эндометрия биопсии приобретение
- Получение человека эндометрия биопсии образцов, собранных в пролиферативной стадии (день 9 - 12 день) менструального цикла из клиники IRB утвержденных в HBSS.
- Вымойте биопсии образцы с 1 мл раствора подогретую 37 ° C HBSS + среднего и осторожно встряхнуть, чтобы удалить избыток крови и слизи.
3. изоляция клетки стромы эндометрия человека (Госкомсанэпиднадзором)
Примечание: Эта процедура изоляции производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.
- Перевести биопсии стерилизовать пинцетом в 50 мл конические полипропиленовые пластиковых пробирок, содержащие 10 мл свежего HBSS.
- Центрифуга для биопсии при комнатной температуре на 500 g x 90 s.
- Если ячейка Пелле разрывов, повторно спина биопсию в 2000 g x 90 s.
- Удалите носитель с помощью пипетки 1 мл и мыть с 10 мл 37 ° C подогретую Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ после центрифугирования в g 500 x 90 s.
- Удалите носитель с помощью пипетки 1 мл и энергично добавить 3 мл свежего Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ выбить биопсии.
- Декант биопсии в чашку Петри, содержащие 5 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации.
- Фарш биопсии в как маленькие кусочки, как можно с помощью тонкой прямой стежок ножницы и #5 щипцы для около 20 минут.
- Подготовить DNase I и коллагеназы ферментов, добавив 10 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции СМИ предварительно взвешенный DNase I (0.5 мг/мл) и коллагеназы (2,5 мг/мл). Смешать с пипетки.
- Пипетка вырезать образцы тканей с помощью пипетки 1 мл в новой 50 мл конические полипропиленовой трубки. Вымойте с 7 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации и добавить в полипропиленовые трубы приобрести полный пример.
- Центрифуга образца при комнатной температуре на 800 x g на 2 мин осторожно удалить супернатант, пипетки.
- Фильтр DNase I и коллагеназы решения через 0,2 мкм фильтром придает шприц 10 мл непосредственно на пеллетах.
- Вортекс для 10 s Ресуспензируйте Пелле.
- Дайджест в водяной бане 37 ° C для 1,5 ч, vortexing для 10 s тщательно каждые 10 мин, пока ткань переваривается.
- Образец фильтра через стрейнер клеток 40 мкм, укладываются над 50 мл конические полипропиленовой трубки удалить эпителиальных клеток и тканей мусора.
Примечание: Стромальные клетки находятся в 50 мл конические полипропиленовые трубы. - Центрифуга конические полипропиленовые Тюбик 50 мл на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант с Пипетка 1 мл.
- Ресуспензируйте гранулы в 10 мл Госкомсанэпиднадзором изоляции средств массовой информации.
- Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатанта и затем Ресуспензируйте клетки в 6 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и пипетки прямого и обратного смешивать.
- Медленно слой на 3 мл градиента плотности СМИ ресуспензированы клеток, чтобы отделить остальные клетки крови от стромальных клеток, соблюдая осторожность, чтобы не смешивать слои.
- Центрифуга 15 мл полипропиленовые трубы на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре.
- Собирать 5 мл супернатант в новой 50 мл трубки из полипропилена и добавить дополнительные 5 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ Ресуспензируйте клетки.
- Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре, затем удаления супернатанта и дополнение 6 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации. Вихревой образца для 10 s и микс от закупорить прямого и обратного 5 раз.
- Аликвота 10 мкл вновь приостановлено клеток в 1,5 мл microcentrifuge трубку для клеток.
- 10 мкл 0,4% Трипановый синий краситель ячейки Алиготе и смешать с пипетки. Загрузить 10 мкл Алиготе и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева.
- Пластина клетки в соответствующие колбу зависит количество ячейке в 15 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ.
- Если общее количество клеток менее 1 миллиона человек, плиты все ячейки в колбу 25-см с 6 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации. Если общее количество клеток более чем 1 миллион, плиты все клетки в колбе 75 см с 15 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации.
- Культура клетки в инкубаторе2 CO 5% при 37 ° C не менее 6 ч для обеспечения надлежащего клеточной адгезии и изменить СМИ Госкомсанэпиднадзором СМИ.
- Культуры изолированных Госкомсанэпиднадзором в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 3-5 дней до тех пор, пока клетки формируют монослоя, достижение 80-90% confluency в покрытием колбы.
- Изменить Госкомсанэпиднадзором СМИ каждые два дня.
- Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
- Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
- Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.
- После того как Госкомсанэпиднадзором стали 80-90% притока, передавать клетки от 25-см до 75 см колбу или один флакон 75 см три колбы 75см.
Примечание: Госкомсанэпиднадзором можно замороженные и сохранены для последующего использования в настоящее время для будущих экспериментов.
4. Замораживание и размораживание ЭСК
- Аспирационная СМИ от 75-cm колбу и добавить 2 мл трипсина-ЭДТА.
- Инкубируйте в 5% CO2 инкубатора для 2-3 мин при 37 ° C, до тех пор, пока клетки выбить из колбы.
- Добавление 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и перемешать хорошо, закупорить вперед и назад.
- Центрифуга на 800 x g за 2,5 мин и удалить супернатант.
- Метка, замораживания труб с клеточной линии, Дата и номер прохода.
- Вновь приостановите Пелле клеток в 5 мл замораживания средств массовой информации.
- Аликвота 1 мл вновь приостановлено Госкомсанэпиднадзором для каждой трубки и передачи трубы до-80 ° C морозильник.
- Передавать трубки жидкий азот в течение 24 часов.
Примечание: Если вы планируете оттепель клетки в ближайшем будущем, храните замороженные клетки в-80 ° C на один месяц. - Для размораживания ЭСК Разогрейте Госкомсанэпиднадзором СМИ за 20 мин.
- Добавьте 8 мл разогретой Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу 25-см.
- Получение замораживания труб из бака жидким азотом или -80 ° C и Погрузите трубку в водяной бане 37 ° C для 1-2 мин разморозить клетки.
- Передача талой Госкомсанэпиднадзором колбу 25-см с Госкомсанэпиднадзором СМИ и инкубировать в 5% CO2 инкубатора на ночь при 37 ° C.
- Следующий день, измените Госкомсанэпиднадзором СМИ и ждать 2-3 дня до тех пор, пока Госкомсанэпиднадзором стать вырожденная и передать 75см колба как описано ниже в протокол 5 клеток.
- Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
- Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
- Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.
5. Культивирование клеток стромы эндометрия человека (Госкомсанэпиднадзором)
Примечание: Эта процедура Culturing производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.
- Подогрейте Госкомсанэпиднадзором СМИ при 37 ° C на водяной бане 20-30 мин.
- Аспирационная СМИ от колбу и добавить 0,25% трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (1 мл флакон 25-см или 2 мл флакон 75 см).
- Инкубируйте в инкубаторе2 CO 5% при 37 ° C на 2-3 мин до тех пор, пока клетки выбить.
- Аккуратно нажмите колбу стены, чтобы выбить оставшиеся ячейки. Добавление 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и перемешать хорошо, закупорить вперед и назад.
- Накапайте в ячейку смесь в 50 мл конические полипропиленовые трубы и центрифуги на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре.
- Аспирационная супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в Госкомсанэпиднадзором СМИ.
- Добавьте 15 мл флакон 25-см или 45 мл флакон 75 см (15 мл).
- Добавьте 5 мл или 15 мл суспензии клеток в каждой колбу 25-см или 75-см соответственно.
- Культуры изолированных Госкомсанэпиднадзором в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 3-5 дней до тех пор, пока клетки формируют монослоя, достижение 80-90% confluency в покрытием колбы.
- Изменить Госкомсанэпиднадзором СМИ каждые два дня.
- Теплый Госкомсанэпиднадзором СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
- Аспирационная СМИ от колбу и добавить свежие Госкомсанэпиднадзором СМИ в колбу (Рабочий объём: 8 мл или 16 мл флакон 25-см или 75-см соответственно).
- Колба место обратно в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C, пока не будет достигнуто confluency 80-90%.
6. человека эндометрия стромальные клетки (Госкомсанэпиднадзором) покрытия и siRNA Transfection
Примечание: Эта процедура трансфекции производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.
- Аспирационная Госкомсанэпиднадзором СМИ от 75-cm колбу и добавить 2 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА.
- Инкубируйте в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C на 2-3 мин до тех пор, пока клетки выбить.
- После того, как клетки выбили из колбы, добавить 7 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ и смешайте нежно закупорить вперед и обратного 5 раз.
- Накапайте в ячейку смесь в 50 мл конические полипропиленовые трубы и центрифуги на 800 x g за 2,5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 10 мл Госкомсанэпиднадзором средств массовой информации.
Примечание: Если покрытие клетки от более чем одной колбе, просто увеличьте объем Госкомсанэпиднадзором СМИ. - Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
- Аликвота 10 мкл вновь приостановлено клеток в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- 10 мкл 0,4% Трипановый синий краситель ячейку аликвота и mix закупорить вперед и обратного.
- Плиты 0,8 x 105 клеток на скважину в 6-ну пластины. После двух дней клетки должны быть 60-70% притока для оптимального transfection.
- Для каждого образца трансфекции siRNA Подготовьте комплексы, с помощью малых интерферирующих РНК (60 наномоль) к трансфекции реагента.
- Разбавить 5 мкл Реагента трансфекции в 150 мкл сокращение сыворотке свободных средств массовой информации и инкубировать в течение 5 мин.
- Разбавляют 60 наномоль интерферирующей РНК в 100 мкл сокращение сыворотке свободных средств массовой информации и инкубировать в течение 5 мин.
- После 5 минут объединить разреженных siRNA с разбавленным трансфекции реагент решения и смешайте нежно закупорить вперед и обратного 5 раз.
Примечание: Если transfecting одного или более малых интерферирующих РНК в нескольких скважин, подготовьте мастер смесь в 10 мл полистирола трубы. - Инкубируйте малых интерферирующих РНК трансфекции реагент комплексы для 5 мин при комнатной температуре.
- Во время этой инкубации добавьте 1 mL изменения средств массовой информации в каждой скважине.
- После 5 минут инкубации центрифуга трубы на 500 x g для 2 минут для сбора раствора и 250 мкл малых интерферирующих РНК трансфекции реагент комплексов каждому хорошо содержащие клетки и СМИ.
- Смешайте нежно покачиваясь и инкубации клеток при 37° C в 5% CO2 инкубатора для 5 h.
- После 5 h измените СМИ Госкомсанэпиднадзором СМИ.
- Проинкубируйте 2 дней в рамках подготовки в пробирке decidualization assay клетки при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора.
7. в пробирке Decidualization Assay
Примечание: Этот assay производится в стерильных условиях под биологической безопасности кабинета.
- Подготовка EPC СМИ до начала лечения decidualization в пробирке , как описано в Камден et al. 3 (см. 1.6).
- Аспирационная СМИ от пост-48 часа, что transfected линии Госкомсанэпиднадзором инкубировали с шагом 6.16.
- Добавьте 2 мл в каждую лунку EPC СМИ.
Примечание: как элемент управления, отпуск, один набор клеток лечить с EPC СМИ. Вместо этого добавьте 2 мл Госкомсанэпиднадзором СМИ управления скважин. - Инкубируйте клетки в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 6 дней.
- Измените EPC СМИ каждые 48 часов.
- Теплый и подготовить EPC СМИ в ванну воды 37 ° C 15-20 мин.
- Аспирационная СМИ из колодца и добавить свежие EPC СМИ.
- Поместите пластины обратно в 5% CO2 инкубатора 37 ° c.
- Измените EPC СМИ каждые 48 часов.
- После шестой день Проанализируйте степень decidualization стромальные клетки через ИФА и ПЦР qRT (как описано ниже).
8. Проверка In Vitro Decidualization использованием количественного PCR реального времени (qRT-PCR)
Примечание: qRT-PCR будет завершена, как описано в Kommagani et al10.
- Изолируйте всего РНК с Госкомсанэпиднадзором, используя протокол от коммерчески доступных комплект изоляции РНК.
- Анализ количества РНК и чистоты (260/a280) с помощью NanoDrop или аналогичной методологии как описано в Гарсия-Элиас et al15.
- Синтез cDNA от 1 мкг всего РНК через протокол комплект коммерчески доступных обратной транскрипции.
- Запустите qRT ПЦР-реакции, как описано в протоколе комплект коммерчески доступных qRT-PCR.
- Выполните использование коммерчески доступных Mix PCR Master реального времени реакции и гена конкретных зонды наряду с внутренней системы контроля (18s, ПРЛи IGFBP1).
9. Проверка Decidualization In Vitro , используя ELISA
- Количественно секретируемые уровни пролактина носителя культуры ткани, использование коммерчески доступных комплект пролактина ELISA.
10. Проверка Decidualization In Vitro , используя Фаллоидин пятнать.
- Вставьте стерильную coverslips в каждой скважине 12 хорошо плиты.
- Повторите шаги 6.1-6.5.
- Плиты 0,8 x 105 клеток на колодец 12 хорошо плиты.
- Инкубируйте клетки в 5% CO2 инкубатора при 37 ° C в течение 2 дней.
- Аспирационная средств массовой информации.
- Повторите шаги 7.3-7.4.
- Исправьте ячейки в параформальдегида 4% (PFA) в фосфатный буфер (PBS) при комнатной температуре за 30 мин.
- Аспирационная решение фиксации и мыть 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
- Добавьте 0,1% неионные ПАВ полиэтиленгликоль трет октиловый фенил эфира в PBS для 5 мин на фиксированные ячейки для увеличения проницаемости.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
- 100 мкл раствора Фаллоидин на coverslip и инкубации при комнатной температуре 90 мин.
- Подготовьте разбавления 1: 100 в PBS с помощью Фаллоидин Стоковый раствор в 1 единицу в 5 мкл.
- Вымойте 3 раза с 1 мл PBS на 5 мин.
- Смонтируйте слайды с монтажа носитель, содержащий 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Наблюдать за использованием конфокального микроскопа клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decidualization в культуре Госкомсанэпиднадзором
После изоляции, эндометрия стромальные клетки человека были культивировали формирование монослоя с confluency 80-90% и индуцированных лечения с 10 Нм E2, 1 мкм МПа и 50 мкм лагерь в пробирке decidualization (EPC). Морфологических сдвигов, связанных с decidualization в vitro были визуализирована на рисунке 1A. После decidualization ЭСК проходят цитоскелета перестановка от удлиненные, фибробластический клеток к округлые Эпителиоидная клеток. Таким образом окрашивание Фаллоидин была выполнена для подтверждения цитоскелета реорганизации во время Госкомсанэпиднадзором decidualization. Фаллоидин является весьма избирательно бициклических пептид, который используется, чтобы пятно для нитей актина, тем самым визуализации перепланированием цитоскелета соответствует в пробирке decidualization (Рисунок 1B).
На шесть дней поста EPC лечения ПРЛ и уровни mRNA IGFBP1 были оценены через qRT ПЦР для подтверждения степени decidualization (рис. 2A). PRL и IGFBP1 уровни были значительно увеличилась по сравнению с Госкомсанэпиднадзором, относились с контроля автотранспортных средств (p < 0,001). Биохимические изменения, связанные с decidualization были также оценены путем количественной оценки секретируемые ПРЛ уровнях от культивирования среднего (рис. 2B). В соответствии с уровнями стенограмма, ПРЛ уровнях были высоко поднятый в EPC культивированный Госкомсанэпиднадзором, по сравнению с контролем (p < 0,001).
Эффект отмены конкретных генов на клеточном и молекулярном изменения ЭСК decidualization были оценены с использованием SRC-2 как кандидат гена (рис. 3). После 48 часов трансфекции с элементом управления или SRC-2 малых интерферирующих РНК Госкомсанэпиднадзором были культивировали в на 6 дней в средствах массовой информации EPC. Transfected управления siRNA Госкомсанэпиднадзором продемонстрировал клеточном и молекулярном изменения в соответствии с надлежащей decidualization, включая булыжником морфологические изменения и увеличение Стенограмма уровни маркеров decidualization ПРЛ и IGFBP1. Как и ожидалось, с SRC-2 малых интерферирующих РНК нокдаун, Госкомсанэпиднадзором оставался фибробластический по внешнему виду по сравнению с контролем siRNA transfected Госкомсанэпиднадзором (рис. 3A). В соответствии с этой сотовой изменения, ПРЛ и IGFBP1 Стенограмма уровни были значительно снижены в SRC-2 малых интерферирующих РНК transfected Госкомсанэпиднадзором, указанием крушения в decidualization программирование с SRC-2 нокдаун (* **p < 0,001). SRC-2 Стенограмма уровни были значительно снижены в SRC-2 transfected siRNA Госкомсанэпиднадзором при сравнении контролировать siRNA, указывающее заставлять замолчать гена эффективным с нашим методом (***p < 0,001) (рис. 3B).
Рисунок 1 : Клеточные изменения эндометрия стромальных клеток человека во время в пробирке decidualization. ЭСК были изолированы и культивировали в течение шести дней в средствах массовой информации, содержащие транспортного средства или E2, МПа и лагерь (EPC). A) клеток изображения, иллюстрируя изменения в клеточной морфологии от фибробластический Эпителиоидная клеток. B) Фаллоидин окрашенные образы Госкомсанэпиднадзором, иллюстрируя изменения цитоскелета (в зеленом), связанные с decidualization в пробирке , где синий цвет представляет ядро (DAPI). Красная стрелка представляет decidualized клетки. Черная стрелка показывает фибробластический клетки. Линейки: 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Молекулярные изменения в стромальные клетки человека эндометрия во время в пробирке decidualization. A) Общая РНК была изолирована от HSECs культивировали в течение шести дней в средствах массовой информации, содержащие транспортного средства или E2, МПа и лагерь (EPC) и подвергается qRT ПЦР-анализа для обнаружения ПРЛ и IGFBP1 Стенограмма уровнях. B) уровни ПРЛ, секретируемых в культуре средств массовой информации были измерены с помощью ИФА на основе assay с Госкомсанэпиднадзором, культивируемых на шесть дней в любом средстве EPC. p < 0,05, ** p < 0.01, *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Нокдаун SRC-2 эндометрия стромальных клеток человека влияет на в пробирке decidualization. A) морфологические изменения в siRNA transfected Госкомсанэпиднадзором после 6 дней культуры с EPC СМИ (Топ панелей: управления малых интерферирующих РНК в время указывает день 0 и 6 день, нижней панели: SRC-2 малых интерферирующих РНК в время указывает день 0 и 6 день). B) уровень Стенограмма SRC-2, ПРЛи IGFBP1 на день 0 и 6 день EPC лечение Госкомсанэпиднадзором transfected с элементом управления или SRC-2 siRNA. Черная стрелка представляет decidualized клетки. Белая стрелка показывает фибробластический клетки. Линейки: 200 µm. *** p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Женского репродуктивного менструального цикла характеризуется ростом уровня прогестерона течение лютеиновой фазы, тем самым вызывая decidualization ESC в круглых, эпителиальные как секреторные клетки3,8. Начало decidualization является зависимых видов. В организме человека decidualization происходит спонтанно на рост концентрации прогестерона, тогда как мышей требуют бластоциста присутствие10,11. Это несоответствие в decidualization является примером поступательного преимущества изучения клеточной дифференциации в линий клеток человека. В пробирке анализов через культуры главной ячейки часто используются для изучения модуляции decidualization через гормоны4,6,10. Однако ограничения данного метода может произойти после obtainability большой выборки тканей человека без значительные вариации в истории цикла фаза и беременности. Тем не менее можно принять меры, чтобы убедиться, что ограничения были сведены к минимуму путем планирования исследования достаточно заблаговременно, чтобы гарантировать достаточное образцов и планирования биопсий в пролиферативной фазе менструального цикла (день 9 - 12 дней).
В этом исследовании Госкомсанэпиднадзором культивировали и искусственно decidualized через новый метод впервые описана в Бросенс и др. 16 в котором гормоны E2, P4 и лагерь дополняются в среде культивирования на протяжении 6 дней инкубационного периода. Как правило, альтернативные методы12,14 загрунтовать клеток культур для искусственного decidualization путем добавления E2 и МПа над расширенной 14 дней инкубационного периода. Добавок лагеря для культивирования СМИ синергетически усиливает decidualization ESC в сокращенные сроки при одновременно upregulating экспрессии генов, содержащих лагеря реагировать элемент промоутер регионов (т.е. PRL и IGFBP1)12,13. Этот метод, основанный на протоколе, описанных в Kommagani et al. 10, позволяет оптимизации изоляции и культуры Госкомсанэпиднадзором. Чистоту культуры клеток был оптимизирован, используя стрейнер клеток 40 мкм для разделения стромы и эпителиальных клеточных линий. Кроме того Ficoll-Paque плюс реагент был применен для обеспечения жизнеспособного, высокая урожайность изоляции чистого стромальных клеток после удаления кровяных клеток из образца. Дополнительные центрифугирования шаг (400 x г за 30 мин) был включены следующие Ficoll дополнение к обеспечить полную ликвидацию кровяных клеток из популяции клеток. Наконец были оптимизированы Госкомсанэпиднадзором жизнеспособность и урожайность при культивировании клеток до 95% confluency для decidualization. Вообще эти дополнительные шаги обеспечили чистой культуры жизнеспособных, высокая урожайность Госкомсанэпиднадзором.
Степень decidualization оценивали, используя qRT ПЦР, ИФА и Фаллоидин пятнать соблюдать цитоскелета перегруппировки и upregulation отличительной генов. В qRT-PCR были оценены Стенограмма уровни маркеров decidualization ПРЛ и IGFBP1 . После decidualization Госкомсанэпиднадзором ПРЛ и IGFBP1 уровни увеличились в зависимости от времени моды, как установлено от предыдущих исследований6. Время зависимых увеличение секретируемые ПРЛ уровнях было также подтверждено путем изучения культуры ткани СМИ Госкомсанэпиднадзором через ELISA. Кроме того морфологические изменения стромальных клеток в децидуальной клетки могут быть визуализированы путем costaining нитей актина через Фаллоидин и ядерных маркеров 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Вместе эти экспериментальные результаты подтвердили эффективность культивирования Госкомсанэпиднадзором через добавок E2, МПа, и лагерь.
Этот протокол возможность изучить конкретные нокдаун гена также оценивали, используя siRNA против SRC-2. Морфологически SRC-2 transfected Госкомсанэпиднадзором оставался фибробластический, тогда как Госкомсанэпиднадзором относились с управления siRNA, decidualized в Эпителиоидная клетки. SRC-2 нокдаун эффективность оценивали через уровень транскрипта и значительно уменьшилась, указывающее успешно глушителей конкретных генов с нашей протокола. Таким образом наш протокол может быть полезным ресурсом для следователей с интересом в определении роли конкретных gene(s) в decidualization эндометрия.
Хотя достигнут прогресс в понимании основных молекулярных механизмов decidualization, на специфике по-прежнему существует значительный объем знаний разрыв. Неправильное decidualization был создан как причины для отказа имплантации и последующих раннего эмбриона выкидыш4,6,7,10. Таким образом дальнейшее изучение относительно эпигенетических факторов и характеристик молекулярные пути необходим для диагностики и лечения недостаточности беременность.
В заключение представленные в настоящем исследовании Протокол устанавливает эффективный метод для изоляции и культуры чистой и жизнеспособной линии эндометрия стромальных клеток человека. Дополняя гормоны E2, МПа и лагерь для культивирования СМИ, искусственные decidualization может быть вызван как подтверждено qRT ПЦР, ИФА и Фаллоидин окрашивания. Кроме того наш протокол излагаются подробные шаги, необходимые для эффективного нокдаун определенного гена интереса, с помощью малых интерферирующих РНК и липидные transfections. Вообще этот метод представляет возможность изучить основные клеточном и молекулярном механизма(ов), связанные с Госкомсанэпиднадзором decidualization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Эта работа поддерживается финансирование от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) / Национальный институт здоровья детей и развития человека (NICHD) Грант (R00 HD080742) и ввод в эксплуатацию Вашингтона школы медицины университета средств на р.к. Мы хотели бы поблагодарить клинике рождаемости университета Вашингтона для предоставления образцы биопсии эндометрия.
Acknowledgments
Авторы не имеют ничего сообщать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
