Summary
Questo studio presenta una procedura convalidata e ottimizzata per l'isolamento e la coltura delle cellule stromali dell'endometrio umane per condurre l'analisi in vitro decidualizzazione. Inoltre, questo studio fornisce un metodo dettagliato per atterramento in modo efficiente un gene specifico utilizzando siRNA in cellule stromal dell'endometrio umane.
Abstract
La differenziazione delle cellule stromale dell'endometrio umane (HESC) da fibroblasto-come l'apparenza nella decidua secretiva è una trasformazione necessaria per l'impianto dell'embrione nella mucosa uterina del grembo materno. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e conseguente aborto spontaneo precoce l'embrione. Pertanto, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per migliorare il tasso di nascite di successo. In vivo basato su studi di decidualizzazione artificiali sono spesso limitanti a causa di dilemmi etici connessi con la ricerca umana, come pure traslazionale complicazioni all'interno di modelli animali. Di conseguenza, saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'isolamento di HESC e successive decidualizzazione artificiale tramite il completamento di ormoni al mezzo di coltura. Inoltre, questo studio fornisce un metodo ben progettato per atterramento qualsiasi gene di interesse utilizzando siRNA basata sui lipidi transfezioni. Questo protocollo consente l'ottimizzazione della purezza di cultura così come la resa del prodotto, in modo da massimizzare la capacità di utilizzare questo modello come un metodo affidabile per capire i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione e la successiva quantificazione del agenti secreti dalle cellule stromali dell'endometrio proteina.
Introduction
Tra le tappe del menarca e la menopausa, le donne dell'età riproduttiva subiscono cicli mensili di ormone-regolata proliferazione dell'endometrio, la differenziazione e il successivo spargimento in preparazione per la gravidanza in un processo noto come mestruazioni1 ,2. Tali modifiche fisiche dell'endometrio umano sono necessari per l'impianto di embrione corretta nel parete uterina1. Alterazioni dell'endometrio, compresi gli adattamenti sia morfologici e biochimici, sono mediate durante il ciclo mestruale tramite ormoni steroidi ovarici estrogeni e progesterone (P4)3,4,5. Entro la fase proliferativa (o follicolare), estrogeno preovulatorio i livelli aumentano, avviando l'ispessimento dell'endometrio. Dopo l'ovulazione, la fase secretiva (o luteinica) promuove un aumento significativo delle concentrazioni di P4, che induce la trasformazione morfologica delle cellule stromali dell'endometrio (ESC) da fibroblasto-come l'apparenza arrotondati, epiteliale-come le cellule deciduali in un processo noto come decidualizzazione4,6. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e successivi primi embrione aborto spontaneo4,7,8. Di conseguenza, comprendere i meccanismi molecolari sottostanti decidualizzazione è vantaggioso per la diagnosi ed il trattamento di perdita iniziale di gravidanza.
Attualmente, diverse metodologie sono utilizzati per esplorare gli effetti sottostanti di decidualizzazione su cellule stromal dell'endometrio. In vivo, l'utero del mouse può essere indotta artificialmente per decidualizzazione tramite stimolazione meccanica (cioè, graffiare) o iniezione in un utero ormonalmente innescato9di olio. Distinti dagli esseri umani, questa stimolazione sintetica promuove la differenziazione del lume uterino fornendo l'aspetto della presenza di blastocisti, un passo necessario per l'avvio di decidualizzazione in roditori10,11. Di conseguenza, a causa delle complicazioni traslazionale associate modelli animali e i dilemmi etici che circondano in vivo basato su studi in esseri umani, sono più correttamente studiati modelli decidualizzazione basato in vitro.
In questo studio, gli oggetti vengono reclutati attraverso il collocamento di pubblicità in entrambi i giornali locali inglese e spagnolo. Soggetti identificati come idonei per questo studio sono portati dentro per soddisfare con il coordinatore della ricerca, in cui una rilevazione completa dei rischi potenziali sono discussi. Al momento della conferma di una completa comprensione dei potenziali rischi, consenso degli oggetti è raggiunto in forme sia scritte che verbali. Consenso della persona interessata include autorizzazione di (1) subiscono il deposito (2) a lungo termine flebotomia dei loro tessuti per scopi di ricerca futura e (3) d'accordo per la creazione di colture primarie da esemplari raccolti del tessuto. A seguito di consenso, gli oggetti sono dati un modulo da compilare in cui consentito autoidentificazione di razza/etnia e/o il diritto di non divulgazione. Una successiva visita è prevista per raggiungere la biopsia dell'endometrio basata sul ciclo mestruale del soggetto. Volontari reclutati per questo studio riflettono entrambi la demografia etnica e razza della regione metropolitana di St. Louis, come documentato dal censimento del 2012 e non hanno coinvolto la partecipazione di qualsiasi popolazione vulnerabili, tra cui donne incinte, feti, embrioni, bambini sotto i 18 anni di età, o di altri gruppi vulnerabili. Requisiti di ammissibilità per la partecipazione alla raccolta del campione di biopsia includono (1) essere tra i 18-45 anni (2) avere cicli mestruali regolari (25-32 giorni) (3) non avendo attuale gravidanza o uso di contraccettivi ormonali/intrauterina dispositivo per 30 giorni prima dell'arruolamento (4) non avendo attuale infezione vaginale o malattie sessualmente trasmissibili (5) avendo nessuna correnti trattamenti antibiotici e (6) non avendo nessuna corrente Pap test anormale.
All'interno di questo studio, le cellule stromale dell'endometrio umane (HESC) sono coltivate e artificialmente indotte per subire in vitro decidualizzazione attraverso il completamento di ormoni (estradiolo (E2), medrossiprogesterone acetato (MPA) e adenosina ciclica monofosfato ciclico (cAMP)) al mezzo. In questo metodo, il grado di decidualizzazione è alterato basata sul numero totale di giorni di trattamento ormonale. In concomitanza con la riorganizzazione del citoscheletro, completamento ormonale induce adattamenti biochimici in cui le cellule deciduali esperienza qualità secretiva-come2,4. L'espressione dei geni di segno distintivo, come la prolattina (PRL) e proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (IGFBP1), possa essere utilizzata per confermare e quantificare il grado di HESC decidualizzazione5,12, 13 , 14. d'importanza, è dimostrata anche la vitalità di questo protocollo per condurre atterramento specifico gene.
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Protocol
Tutte le biopsie dell'endometrio umano raccolte per questo studio sono state conseguite presso l'Università di Washington a St. Louis, dipartimento di ostetricia e ginecologia utilizzando un Institutional Review Board (IRB) ha approvato il modulo di consenso scritto.
1. preparazione
- Preparare 500 mL di 1 x di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) aggiungendo 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina nel flacone contenente media (ulteriore riferito come HBSS + medio).
- Preparare 500 mL di Medium di Eagle per volta di Dulbecco: miscela nutriente F-12 (DMEM/F12) con rosso fenolo, L-Glutammina e 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) aggiungendo soluzione antibiotico antimicotico (la concentrazione finale di 1% è 0,25 µ g/mL 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomicina Fungizone) ai media contenente flacone (ulteriore riferito come HESC isolamento Media).
- Preparare 500 mL di DMEM/F12 con rosso fenolo, L-Glutammina e 15 mM HEPES aggiungendo 10% siero bovino fetale (FBS), 1 x Na2HCO3e 1% penicillina (10.000 U/mL) e streptomicina (10.000 µ g/mL) (penna Strep) ai media contenente bombola (ulteriormente riferimento come HESC Media).
- Preparare 500 mL di mezzo di siero ridotto con L-Glutammina, 2,4 g/L sodio bicarbonato e HEPES con 2% carbone spogliato siero bovino fetale (csFBS) e 1% Strep penna ai media contenente flacone (ulteriore riferito come decidualizzazione Media).
- Preparare 500 mL di fenolo rosso gratis DMEM/F12 aggiungendo 2% carbone spogliato di siero bovino fetale (csFBS) nei mezzi di comunicazione contenente flacone (ulteriore riferito come Media di cambiamento).
- Preparare 10 nM estradiolo (E2), 1 µM medrossiprogesterone acetato (MPA) e 50 µM dell'amp ciclico (cAMP) in un tubo conico in polipropilene da 15 mL e aggiungere un 2 mL / ben aliquota media decidualizzazione precedentemente preparato per in vitro dosaggio di decidualizzazione (ulteriore riferito come EPC Media).
- Preparare 50 mL di congelamento media con 90% di FBS e 10% di dimetilsolfossido (DMSO) in tubo conico in polipropilene da 50 mL (ulteriore riferito come Media di congelamento).
- Pre-pesare 25 mg di collagenasi e 5 mg di dnasi I in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e conservare a-20 ° C.
2. endometrio biopsia acquisizione
- Ottenere campioni di biopsia endometrio umano raccolti nella fase proliferativa (giorno 9 - giorno 12) del ciclo mestruale dalla clinica IRB approvato in HBSS.
- Lavare i campioni di biopsia con 1 mL di preriscaldati 37 ° C HBSS + medio e agitare delicatamente per rimuovere il sangue in eccesso e delle mucose.
3. isolamento di cellule stromali dell'endometrio umane (HESC)
Nota: Questa procedura di isolamento viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.
- Trasferire la biopsia con la pinzetta sterilizzati in una provetta conica per centrifuga in polipropilene 50 mL contenente 10 mL HBSS fresco.
- Centrifugare la biopsia a temperatura ambiente a 500 x g per 90 s.
- Se le rotture di pellet cellulare, re-spin la biopsia a 2.000 x g per 90 s.
- Rimuovere il supporto utilizzando una pipetta da 1 mL e lavare con 10 mL di 37 ° C preriscaldato HESC isolamento Media seguita da centrifugazione a 500 x g per 90 s.
- Rimuovere il supporto utilizzando una pipetta da 1 mL e vigorosamente aggiungere 3 mL di fresco HESC isolamento Media per sloggiare la biopsia.
- Decantare la biopsia in una piastra Petri contenente 5 mL di HESC isolamento Media.
- Tritare la biopsia in come piccoli pezzi possibili utilizzando #5 pinze e le forbici bene punto dritto per circa 20 minuti.
- Preparare dnasi I e gli enzimi collagenasi aggiungendo 10 mL di HESC isolamento Media pre-pesata dnasi I (0,5 mg/mL) e la collagenosi (2,5 mg/mL). Mescolare con pipetta.
- Pipetta taglia campioni di tessuto utilizzando una pipetta da 1 mL in una provetta di polipropilene conica 50 mL nuovo. Lavare con 7 mL di HESC isolamento Media e aggiungere al tubo in polipropilene ad acquisire l'esempio completo.
- Centrifugare il campione a temperatura ambiente a 800 x g per 2 minuti, delicatamente, eliminare il surnatante mediante pipetta.
- Filtrare la dnasi I e soluzione della collagenosi attraverso 0,2 µm filtro collegati a siringa da 10 mL direttamente sul pellet.
- Vortexare per 10 s per risospendere il pellet.
- Digest in bagnomaria a 37 ° C per 1,5 h, su vortex per 10 s accuratamente ogni 10 min, fino a quando il tessuto viene digerito.
- Filtrare il campione attraverso un colino di cella µm 40 impilati uno sopra un tubo in polipropilene conico da 50 mL per rimuovere le cellule epiteliali e detriti del tessuto.
Nota: Le cellule Stromal sono nel tubo in polipropilene conica 50 mL. - Centrifugare la provetta di polipropilene 50 mL conica a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il surnatante con una pipetta da 1 mL.
- Risospendere il pellet in 10 mL di HESC isolamento Media.
- Centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e quindi risospendere le cellule in 6 di Media HESC e pipetta avanti e indietro per mescolare.
- Lentamente strato su 3 mL di media gradienti di densità per le cellule sedimento di separare i restanti cellule del sangue dalle cellule stromali, facendo attenzione a non mescolare gli strati.
- Centrifugare la provetta da 15 mL in polipropilene a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente.
- Raccogliere 5 mL del surnatante in un nuovo tubo in polipropilene da 50 mL e aggiungere un ulteriore 5 mL HESC supporti per risospendere le cellule.
- Centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente, seguita dalla rimozione del surnatante e aggiunta di 6 mL HESC Media. Vortice il campione per 10 s e mescolare pipettando avanti e indietro 5 volte.
- Aliquotare e 10 µ l di cellule risospese in una microcentrifuga da 1,5 mL per il conteggio delle cellule.
- Aggiungere 10 µ l di 0,4% Trypan blu macchia per cella aliquota e mescolare con pipetta. Caricare 10 µ l di aliquota e contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Le cellule in una boccetta appropriata dipenda dal conteggio totale delle cellule in 15ml HESC Media del piatto.
- Se il numero totale delle cellule è meno di 1 milione, piastra di tutte le celle nella beuta 25 cm con 6 mL di Media HESC. Se il numero totale delle cellule è più di 1 milione, piastra di tutte le celle in pallone da 75 cm con 15 mL di Media HESC.
- Coltura le cellule in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un minimo di 6 h per garantire adeguata delle cellule adesione e cambiare il supporto ai Media HESC.
- Coltura del HESC isolato in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un periodo di 3-5 giorni fino a quando le cellule formano un monostrato raggiungimento confluency di 80-90% in un pallone di placcato.
- Cambiare HESC Media ogni due giorni.
- Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
- Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
- Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.
- Una volta HESC diventano 80-90% confluenti, cellule di trasferimento da 25 cm a 75 cm boccetta o da una boccetta di 75 cm a tre boccette di 75 cm.
Nota: HESC possono essere congelati e conservati per un successivo utilizzo in questo momento per future sperimentazioni.
4. il congelamento e lo scongelamento HESCs
- Aspirare la media dal pallone di 75 cm e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA.
- Incubare in un incubatore di 5% CO2 per 2-3 min a 37 ° C fino a quando le cellule sloggiare dal pallone.
- Aggiungere 7 mL di HESC Media e mescolare bene di pipettaggio forward e reverse.
- Centrifugare a 800 x g per 2,5 min e aspirare il supernatante.
- Etichetta congelamento tubi con linea cellulare, data e numero di passaggio.
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di media di congelamento.
- Aliquotare 1 mL di ri-sospensione dalle CSE umane ad ogni provetta e trasferire tubi per congelatore a-80 ° C.
- Trasferimento tubi in azoto liquido entro 24 ore.
Nota: Se progettando di scongelare le cellule nel futuro immediato, conservare cellule congelate a-80 ° C per un mese. - Per lo scongelamento il HESCs preriscaldare HESC Media per 20 min.
- Aggiungere 8 mL di preriscaldato HESC Media in bottiglia da 25 cm.
- Il tubo di congelamento di recuperare da-80 ° C o serbatoio di azoto liquido e immergere la provetta in bagnomaria a 37 ° C per 1-2 min a scongelare le cellule.
- Trasferire HESC scongelati in un pallone di 25 cm con Media HESC e incubare in un incubatore di 5% CO2 durante la notte a 37 ° C.
- Giorno successivo, cambiare il supporto HESC e attendere 2-3 giorni fino a quando HESC diventare confluenti e trasferire le cellule in 75 cm pallone come dettagliato di seguito nel protocollo n. 5.
- Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
- Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
- Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.
5. coltura di cellule stromali dell'endometrio umane (HESC)
Nota: Questa procedura Culturing viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.
- Pre-riscaldare HESC Media a 37 ° C in un bagno d'acqua per 20-30 min.
- Aspirare la media dalla beuta e aggiungere acido di 0,25% tripsina etilendiamminotetraacetico (EDTA) (1 mL per beuta 25 cm o 2 mL per beuta di 75 cm).
- Incubare in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sloggiare.
- Picchiettare delicatamente le pareti muffola per sloggiare le celle rimanenti. Aggiungere 7 mL di HESC Media e mescolare bene di pipettaggio forward e reverse.
- Dispensare la miscela delle cellule in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in Media HESC.
- Aggiungere 15 mL per beuta 25 cm o 45mL per beuta 75 cm (15 mL ciascuno).
- Aggiungere 5 mL o 15 mL di sospensione cellulare a ciascuna beuta 25 cm o 75 cm, rispettivamente.
- Coltura del HESC isolato in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C per un periodo di 3-5 giorni fino a quando le cellule formano un monostrato raggiungimento confluency di 80-90% in un pallone di placcato.
- Cambiare HESC Media ogni due giorni.
- Media di HESC caldo a bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
- Aspirare la media dalla beuta e aggiungere fresco HESC Media al pallone (volume di lavoro: mL 8 o 16 mL per fiaschetta di 25 cm o 75 cm rispettivamente).
- Immergere la muffola in 5% CO2 incubatore a 37 ° C fino a raggiungere confluency di 80-90%.
6. umana dell'endometrio Stromal Cell (HESC) placcatura e transfezione di siRNA
Nota: Questa procedura di trasfezione viene eseguita in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.
- Aspirare HESC Media dal pallone di 75 cm e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25%.
- Incubare in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2-3 minuti fino a quando le cellule sloggiare.
- Una volta che le cellule sono sloggiate dalla beuta, aggiungere 7 mL di Media HESC e mescolare delicatamente pipettando forward e reverse 5 volte.
- Dispensare la miscela delle cellule in un tubo conico in polipropilene da 50 mL e centrifugare a 800 x g per 2,5 min a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di Media HESC.
Nota: Se le cellule da più di una boccetta di placcatura, semplicemente aumentare il volume di Media HESC. - Contare le celle utilizzando un emocitometro.
- Aliquotare e 10 µ l di cellule ri-sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 10 µ l di 0,4% Trypan blu macchia al cellulare aliquotare e Miscelare pipettando in avanti e inversa.
- Cellule di5 piastra 0,8 x 10 per pozzetto in piastre da 6 pozzetti. Dopo due giorni, cellule dovrebbero essere confluenti di 60-70% per la transfezione ottima.
- Per ogni campione di transfezione di siRNA, preparare complessi utilizzando siRNA (60 nanomoles) di reagente di transfezione.
- Diluire 5 µ l di reagente di transfezione in 150 µ l di media liberi riduttori del siero e incubare per 5 min.
- Diluire 60 nanomoles di siRNA in 100 µ l di media liberi riduttori del siero e incubare per 5 min.
- Dopo 5 minuti, combinare siRNA diluito con soluzione di reagente di transfezione diluito e mescolare delicatamente pipettando in avanti e retromarcia 5 volte.
Nota: Se uno o più siRNA in pozzi multipli di trasfezione, preparare mix master in 10 mL provette di polistirene. - Incubare complessi di reagente di transfezione di siRNA per 5 min a temperatura ambiente.
- Durante questa incubazione, aggiungere 1 mL di cambiamento Media ad ogni pozzetto.
- Dopo 5 min di incubazione, centrifugare le provette a 500 x g per 2 minuti raccogliere la soluzione e aggiungere il 250 µ l di complessi di reagente di transfezione di siRNA a ciascuno contenente ben celle e media.
- Mescolare delicatamente a dondolo e incubare le cellule a 37° C in un incubatore di 5% CO2 per 5 h.
- Dopo 5 h, è necessario cambiare il supporto ai Media HESC.
- Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 2 giorni in preparazione per un test di decidualizzazione in vitro .
7. in Vitro decidualizzazione Assay
Nota: Questo test viene eseguito in un ambiente sterile sotto una cappa di sicurezza biologica.
- Preparare il supporto EPC prima di iniziare il trattamento in vitro decidualizzazione come descritto in Camden et al. 3 (Vedi 1.6).
- Aspirare i media dalla post-48 ora trasfettata linea di HESC incubata dal passaggio 6.16.
- Aggiungere 2 mL di EPC Media in ciascun pozzetto.
Nota: come un controllo, lascia una serie di celle non trattata con EPC Media. Invece, aggiungere 2 mL di HESC Media dei pozzetti di controllo. - Incubare le cellule in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 6 giorni.
- Modificare il supporto di EPC ogni 48 ore.
- Caldo e preparare supporti EPC in bagnomaria a 37 ° C per 15-20 min.
- Aspirare la media dal pozzo e aggiungere fresco EPC Media.
- Inserire nuovamente la piastra 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
- Modificare il supporto di EPC ogni 48 ore.
- Dopo il sesto giorno, analizzare l'entità della decidualizzazione cellule stromali via ELISA e qRT-PCR (come descritto di seguito).
8. validazione di decidualizzazione In Vitro utilizzando la PCR Real Time quantitativa (qRT-PCR)
Nota: qRT-PCR è completata come precedentemente descritto nella Kommagani et al.10.
- Isolare il RNA totale da HESC che utilizzano il protocollo da un kit di isolamento del RNA disponibile in commercio.
- Analizzare la quantità di RNA e la purezza (un /A260280) utilizzando un NanoDrop o metodologia simile come descritto in Garcia-Elias et al15.
- Sintesi di cDNA da 1 µ g di RNA totale attraverso un protocollo di kit di trascrizione inversa commercialmente disponibili.
- Eseguire una reazione di qRT-PCR come descritto in un protocollo di kit disponibili in commercio qRT-PCR.
- Eseguire la reazione utilizzando un commercialmente disponibile Real-Time PCR Master Mix e gene specifiche sonde insieme ai controlli di sistema interno (18s, PRLe IGFBP1).
9. convalida di decidualizzazione In Vitro utilizzando ELISA
- Quantificare i livelli di prolattina secreti dal supporto di coltura del tessuto utilizzando un kit di prolattina ELISA disponibile in commercio.
10. convalida di decidualizzazione In Vitro utilizzando falloidina macchiatura.
- Inserire vetrini coprioggetto sterili in ciascun pozzetto di una piastra ben 12.
- Ripetere i passaggi da 6.1-6.5.
- Cellule di5 piastra 0,8 x 10 per pozzetto di una piastra ben 12.
- Incubare le cellule in 5% CO2 incubatore a 37 ° C per 2 giorni.
- Aspirare i media.
- Ripetere i passaggi da 7.3-7.4.
- Fissare le cellule in paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente per 30 min.
- Aspirare la soluzione di fissazione e lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere 0,1% tensioattivi non ionici polietilenglicole tert-octyl fenil etere in PBS per 5 min per le celle fisse per aumentare la permeabilità.
- Lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
- Aggiungere 100 µ l di soluzione di falloidina per vetrino coprioggetto e incubare a temperatura ambiente per 90 min.
- Preparazione della diluizione 1: 100 in PBS utilizzando una soluzione di riserva falloidina in 1 unità per 5 µ l.
- Lavare 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti ciascuno.
- Montare i vetrini con mezzo di montaggio contenente 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Osservare le cellule utilizzando un microscopio confocale.
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Representative Results
Decidualizzazione HESC cultura
A seguito di isolamento, cellule stromali dell'endometrio umane sono state coltivate ad una formazione di monostrato con confluency di 80-90% e indotta per in vitro decidualizzazione trattando con 10 nM E2, 1 µM MPA e 50 µM cAMP (EPC). Cambiamenti morfologici associati in vitro decidualizzazione sono stati visualizzati in Figura 1A. Al momento decidualizzazione, HESCs sono sottoposti a riarrangiamento del citoscheletro dalle cellule fibroblastiche di forma allungate, a cellule epitelioidi arrotondate. Così, falloidina macchiatura è stata effettuata per confermare la riorganizzazione del citoscheletro durante decidualizzazione HESC. Falloidina è un peptide biciclico altamente selettivo che viene utilizzato a macchiare per filamenti dell'actina, quindi visualizzare il riarrangiamento del citoscheletro coerenza con in vitro decidualizzazione (Figura 1B).
Alla sei giorni di trattamenti post EPC, PRL e livelli di mRNA di IGFBP1 sono stati valutati tramite qRT-PCR per confermare il grado di decidualizzazione (Figura 2A). I livelli PRL e IGFBP1 erano significativamente aumentati rispetto a HESC trattati con il veicolo di controllo (p < 0,001). I cambiamenti biochimici associati decidualizzazione inoltre sono stati valutati attraverso la quantificazione dei livelli di PRL secreti dal mezzo di coltura (Figura 2B). Coerente con i livelli della trascrizione, i livelli di PRL altamente sono stati elevati in EPC coltivate HESC rispetto al controllo (p < 0,001).
L'effetto dell'abrogazione di gene specifico sui cambiamenti cellulari e molecolari delle HESCs decidualizzazione sono stati valutati usando SRC-2 come gene candidato (Figura 3). Dopo 48 ore dalla transfezione con controllo o siRNA SRC-2 , HESC sono state coltivate in per 6 giorni in media EPC. Controllo siRNA trasfettate HESC hanno dimostrato cellulari e molecolari cambiamenti costanti con decidualizzazione corretto, tra cui un cambiamento morfologico di ciottoli e i livelli di trascrizione aumentata di indicatori decidualizzazione PRL e IGFBP1. Come previsto, con SRC-2 siRNA atterramento, HESC rimase fibroblastico in apparenza rispetto gli siRNA di controllo transfected HESC (Figura 3A). Coerentemente con questo cambiamento cellulare, PRL e trascrizione di IGFBP1 livelli sono stati diminuiti significativamente all'interno di siRNA SRC-2 trasfettate HESC, che indica un deragliamento in programmazione decidualizzazione con atterramento SRC-2 (* * *p < 0,001). SRC-2 livelli di trascrizione sono stati diminuiti significativamente in SRC-2 siRNA trasfettate HESC rispetto per controllare siRNA, che indica un silenziamento genico efficiente con il nostro metodo (* * *p < 0,001) (Figura 3B).
Figura 1 : Cambiamenti cellulari delle cellule stromali dell'endometrio umane durante in vitro decidualizzazione. HESC erano isolate e coltivate per sei giorni in media che contengono veicolo o E2, MPA e cAMP (EPC). A) cella immagini che illustrano i cambiamenti nella morfologia cellulare da fibroblastiche a cellule epitelioidi. B) falloidina macchiato immagini di HESC che illustrano le modifiche del citoscheletro (in verde) associate in vitro decidualizzazione, dove il blu rappresenta il nucleo (DAPI). La freccia rossa rappresenta le cellule proteina. La freccia nera indica cellule fibroblastiche. Barra della scala: 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Cambiamenti molecolari in cellule stromal dell'endometrio umane durante in vitro decidualizzazione. A) totale RNA è stato isolato da HSECs coltivate per sei giorni in media che contengono veicolo o E2, MPA e cAMP (EPC) e sottoposti ad analisi qRT-PCR per rilevare livelli di trascrizione di IGFBP1 e PRL . B) livelli di PRL secernuta nel mezzo di coltura sono stati misurati usando un'analisi di base di ELISA da HESC coltivate per sei giorni in entrambi veicolo di EPC. p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Atterramento di SRC-2 in cellule stromal dell'endometrio umane colpisce in vitro decidualizzazione. A) cambiamenti morfologici in siRNA trasfettate HESC dopo 6 giorni di cultura con i media EPC (pannello superiore: siRNA di controllo a tempo punti giorno 0 e 6 ° giorno, pannelli di fondo: SRC-2 siRNA a tempo punti giorno 0 e 6 ° giorno). B) trascrizione livelli di SRC-2, PRLe IGFBP1 il giorno 0 e 6 giorno di EPC trattati HESC transfettate con controllo o siRNA SRC-2 . La freccia nera rappresenta proteina celle. La freccia bianca indica cellule fibroblastiche. Barra della scala: 200 µm. * * * p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il ciclo mestruale femminile riproduttivo è caratterizzato da un aumento nei livelli di progesterone durante la fase luteale, quindi inducendo la decidualizzazione dell'ESC in tondo, epiteliale-come le cellule secretive3,8. L'iniziazione di decidualizzazione è specie dipendenti. In esseri umani, decidualizzazione si verifica spontaneamente al momento l'aumento della concentrazione del progesterone, mentre topi richiedono blastocisti presenza10,11. Questa incongruenza nella decidualizzazione esemplifica i vantaggi traslazionali di studiare la differenziazione cellulare nelle linee cellulari umane. Saggi in vitro mediante colture cellulari primarie sono spesso utilizzate per esplorare la modulazione della decidualizzazione tramite ormoni4,6,10. Tuttavia, limitazioni di questo metodo possono verificarsi al momento della disponibilità di una dimensione grande campione di tessuto umano senza variazioni di rilievo nella storia di gravidanza e la fase di ciclo. Tuttavia, possono adottare misure affinché le limitazioni sono ridotte al minimo di pianificazione pianificazione biopsie nella fase proliferativa (giorno 9 - giorno 12) del ciclo mestruale e lo studio abbastanza lontano in anticipo per garantire ampi campioni.
In questo studio, HESC sono coltivate e proteina artificialmente attraverso un metodo novello in primo luogo descritto in Brosens et al. 16 in quali ormoni E2, P4 e cAMP sono integrati al mezzo di coltura nel corso di un periodo di incubazione di 6 giorni. In genere, metodi alternativi12,14 innescato cell culture per decidualizzazione artificiale attraverso l'aggiunta di E2 e MPA durante un periodo di incubazione estesa 14 giorni. Il completamento del campo ai media coltura sinergico amplifica la decidualizzazione dell'ESC in un lasso di tempo ridotto, mentre allo stesso tempo aumentare l'espressione dei geni contenenti regioni promotrici accampamento elemento reattivo (cioè, PRL e IGFBP1)12,13. Questo metodo, basato sul protocollo descritto in Kommagani et al. 10, consente l'ottimizzazione dell'isolamento e coltura di HESC. Purezza di coltura delle cellule è stato ottimizzato utilizzando un colino di cella 40 µm per separare le linee di cellule stromali ed epiteliali. Inoltre, reagente di Ficoll-Paque PLUS è stato applicato per garantire un isolamento di vitali, ad alto rendimento delle cellule stromal pure dopo la rimozione di cellule del sangue da campione. Un passo ulteriore centrifugazione (400 x g per 30 min) è stata aggiunta di Ficoll seguente incluso per garantire la completa eliminazione delle cellule del sangue da parte della popolazione delle cellule. Infine, rendimento e redditività HESC sono stati ottimizzati su coltura delle cellule fino al 95% confluency per decidualizzazione. Complessivamente, questi passaggi aggiuntivi assicurata la coltura pura di vitale, ad alto rendimento HESC.
Il grado di decidualizzazione è stato valutato utilizzando qRT-PCR, ELISA e falloidina macchiatura per osservare il riarrangiamento del citoscheletro e il upregulation dei geni di hallmark. In qRT-PCR, sono stati valutati i livelli di trascrizione di indicatori decidualizzazione PRL e IGFBP1 . Al decidualizzazione di HESC, livelli di PRL e IGFBP1 crebbe in un modo dipendente dal tempo, come stabilito dalla precedente ricerca6. L'aumento di tempo-dipendente dei livelli di PRL secreti è stato confermato anche esaminando i media di coltura del tessuto HESC via ELISA. Inoltre, alterazioni morfologiche delle cellule stromali in cellule deciduali possono essere visualizzate attraverso la costaining dei filamenti dell'actina via falloidina e marcatore nucleare 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Insieme, questi risultati sperimentali hanno confermato l'efficacia di coltura HESC attraverso il completamento di E2, MPA e cAMP.
La capacità di questo protocollo di studio atterramento specifico gene inoltre è stata valutata utilizzando siRNA contro SRC-2. Morfologicamente, SRC-2 trasfettate HESC rimase fibroblastiche, considerando che HESC trattate con siRNA di controllo proteina in cellule epitelioidi. SRC-2 knockdown efficienza è stata valutata attraverso il livello di trascrizione ed è stato diminuito significativamente, che indica un successo silenziamento del gene specifico con il nostro protocollo. Così, il nostro protocollo può essere una risorsa utile per i ricercatori con un interesse nel delineare il ruolo di specifici geni in decidualizzazione endometriale.
Sebbene siano stati fatti progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari sottostanti di decidualizzazione, un divario di conoscenza significativa esiste ancora sulle specifiche. Decidualizzazione improprio è stato stabilito come causa radice per mancato impianto e successivi primi embrione aborto spontaneo4,6,7,10. Pertanto, occorre ulteriore esplorazione per quanto riguarda i fattori epigenetici e caratterizzazione dei meccanismi molecolari per la diagnosi e il trattamento dell'insufficienza di gravidanza.
In conclusione, il protocollo presentato in tutto questo studio stabilisce un metodo efficiente per isolare e cultura una linea pura e vitale delle cellule stromali dell'endometrio umane. Completando gli ormoni E2, MPA e campo ai media coltura, decidualizzazione artificiale può essere indotta, come confermato da qRT-PCR, ELISA e colorazione falloidina. Ulteriormente, il nostro protocollo delinea dettagliate passaggi necessari per l'efficiente atterramento di un gene specifico di interesse utilizzando siRNA e transfezioni basata sui lipidi. Complessivamente, questo metodo presenta la possibilità di studiare i meccanismi cellulari e molecolari di fondo associati decidualizzazione HESC.
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Disclosures
Questo lavoro è sostenuto da finanziamenti da National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) grant (R00 HD080742) e Start-up Washington University School of Medicine fondi a R.K. Vorremmo ringraziare la clinica di fertilità Washington University per fornire i campioni di biopsia dell'endometrio.
Acknowledgments
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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