Summary
En este protocolo, describimos cómo hacer Loewe medidas de interacción de drogas basada en la aditividad pares y combinaciones de tres medicamentos.
Abstract
Una combinación de fármacos sinérgicos tiene una eficacia superior en comparación con los efectos de los fármacos individuales. Análisis del tablero de ajedrez, donde las drogas se combinan en muchas dosis, permiten medir sensible de interacción con otros medicamentos. Sin embargo, estos ensayos son costosos y no escala bien para medir la interacción entre muchas drogas. Varios estudios recientes han reportado medidas de interacción de drogas utilizando un muestreo diagonal del ensayo tradicional damero. Esta metodología alternativa en gran medida disminuye el costo de los experimentos de interacción de drogas y permite la medición de la interacción para combinaciones con muchos fármacos. Aquí, describimos un protocolo para medir las interacciones pares tres y una interacción de tres vías entre tres antibióticos por duplicado, en cinco días, con sólo tres microplacas de 96 pozos y equipo normal de laboratorio. Presentamos resultados representativos mostrando que la combinación de tres antibióticos de levofloxacina + ácido nalidíxico penicilina G es sinérgica. Nuestro protocolo de escala para medir las interacciones entre muchos fármacos y en otros contextos biológicos, permitiendo eficientes pantallas de sinergias múltiples fármacos contra patógenos y tumores.
Introduction
Combinaciones de drogas pueden presentar efecto sorprendentemente alta o baja en un fenotipo dado los efectos de fármacos constituyentes, corresponden a interacciones sinérgicas o antagónicas, respectivamente1,2,3. Puede permitir el uso de combinaciones sinérgicas de escalada de dosis para el aumento de la eficacia y reducción de la dosis para el alivio del efecto secundario. Tratamientos de combinación también pueden aplicar múltiples reveses a la maquinaria celular, bloqueando así posibles mecanismos evolutivos escape a resistencia4. Por lo tanto, combinaciones de tres o más fármacos se utilizan habitualmente en el tratamiento de patógenos o cáncer5.
Sinergia y antagonismo son definidos por una comparación entre el efecto observado de una combinación versus un efecto esperado dado los efectos de drogas individuales. Entre los modelos de las interacciones entre medicamentos, aditividad de Loewe es el más estricto y tiene un bien definido modelo nulo ()figura 1)6, y la interacción de sinergia/antagonismo inferido es independiente de la concentración de la droga utilizada 6 , 7. sin embargo, el modelo de Loewe es experimental costoso incluso para una prueba de interacción pares. Ensayos de interacción de drogas que tradicionalmente forman parte de una matriz 2D de combinación de fármacos concentración (ensayo de un tablero de ajedrez) ()figura 2). Si se utilizan 5 dosis para cada fármaco, entonces 25 combinaciones son necesarios, correspondientes a una mitad de una microplaca si los experimentos se llevan a cabo en repetición. El costo de este enfoque, medición de sinergia prohíba el modelo de aditividad de Loewe para combinaciones de múltiples medicamentos ()figura 3). Por ejemplo, para probar una interacción de 10 vías, métodos tradicionales requeriría más de 100 mil placas, medición experimental de las sinergias de alto orden de restricción por el modelo de aditividad de Loewe estricto y bien teoría independiente de la concentración 8.
Los tratamientos clínicos actuales utilizan sólo una fracción de combinaciones de fármacos posible. Por ejemplo, el tratamiento estándar de la tuberculosis activa es una combinación de tres antibióticos. Hay aproximadamente 20 antibióticos utilizados en el tratamiento de la Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Hay 1140 posibles combinaciones de 3 vías entre 20 medicamentos, cada uno con el potencial para tener una sinergia fuerte contra Mtb. No ha habido ningún método rentable para medir interacciones entre muchos fármacos, combinaciones sinérgicas potencialmente salvar la vida siendo no probados.
Aquí, describimos un protocolo simple para medir interacciones pares y tres vías mediante el muestreo sólo la diagonal de un ensayo de tablero de ajedrez ()figura 4 y figura 5). El concepto subyacente de la diagonal de un experimento tablero de muestreo fue teorizado por Berenbaum en su trabajo seminal en 19789. Sin embargo, este enfoque se ha aplicado recientemente a droga sinergia pantallas10,11,12. Presentamos nuestro protocolo con Escherichia coli (e. coli) y el fenotipo de crecimiento. Sin embargo, observamos que el protocolo es independiente de las especies biológicas y el fenotipo de interés y por lo tanto puede aplicarse a la medición de la sinergia de drogas de alto orden en otros contextos biológicos.
Protocol
Nota: Puede utilizarse cualquier pequeña molécula que inhibe el crecimiento de bacterias e. coli por el método diagonal. En este protocolo, levofloxacina (LEV), ácido nalidíxico (NAL) y penicilina G (PNG) se utilizará como ejemplo, ya que estos fármacos muestran una sinergia de tres camino saliente. Figura 6se muestra el flujo de trabajo de este protocolo. Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente. Usar alícuotas frescas de bacterias y medicamentos cada día. Realizar el experimento bajo niveles de seguridad de la biotecnología apropiados para e. coli.
1. los pasos de preparación
- Preparar medios de Luria-Bertani (LB) añadiendo 25 g de caldo LB a 1 L de agua destilada y mezclar. Autoclave a 121 ° C durante 15 minutos y almacenar los medios de comunicación en autoclave a temperatura ambiente.
- Preparar acciones de glicerol de e. coli mediante la mezcla de volúmenes iguales de glicerol 50% estéril y las células bacterianas al OD600 = 1 en caldo LB y la congelación de 150 alícuotas μL en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL a-80 ° C.
- Disolver 20 mg de antibióticos, LEV, NAL y PNG en 1 mL de dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir LEV solución 100 x a 0.2 μg/mL mediante la mezcla de 10 μl de solución LEV con 990 μl de DMSO. Uso de LEV de 0,2 mg/mL y 20 mg/mL NAL y PNG en los pasos del procedimiento.
- Alícuota de 50 μl de cada antibiótico a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y congelar a-20 ° C.
- Tome un 150 μL alícuota de e. coli de-80 ° C. Deshielo.
- Añada 100 μl del stock de glicerol de e. coli en 5 mL de medio LB en un tubo de cultivo de 14 mL.
- Agitar los tubos de una incubadora de 37 ° C durante la noche a 200 rpm.
2. experimento de respuesta a la dosis de dilución serial
- Tomar una alícuota de drogas LEV, NAL y PNG desde-20 ° C, dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos descongelar y preparar diluciones seriadas de estos fármacos.
- Preparar 1100 μl de LB - 10% sol mezclando 990 μl de medio LB y 110 μl del solvente (DMSO).
- Preparar 500 μl de LB - 10% LEV mezclando 450 μl de medio LB y 50 μl de LEV.
- Sol de vórtice LB - 10% para 5 s en la posición más alta. Añadir 20 μl de LB - 10% sol a las filas de cuatro de los pocillos de una microplaca de 96 pozos.
- Vórtice LEV LB - 10% para 5 s en la posición más alta. Añadir 20 μl de LEV LB - 10% para el primer pozo en fila A.
- Preparan doble dilución serial para LB - 10% LEV tomando 20 μl del primer pozo, añadiendo al segundo pozo, pipeteo arriba y abajo de cinco veces. Repita esto para todos los pozos secuencialmente hasta el 11 bien, que termina con 40 μl (Figura 7A).
- Retire y deseche 20 μl del contenido del 11, utilizando una micropipeta.
- Repita los pasos 2.3-2.7 para las drogas NAL y PNG con la segunda y tercera filas de la microplaca, respectivamente.
- Repita los pasos 2.3-2.7 para la droga LEV otra vez en cuarta fila como control positivo interno.
- Mediante un espectrofotómetro, medir OD600 de un 1:10 dilución de la cultura (pasos 1.5-1.7).
- Diluir las células en 5 mL de medio LB a un OD600 de 0.01. Vierta en un recipiente.
- Usando una micropipeta multicanal, añadir 80 μl de células diluidas a las diluciones seriadas de droga preparadas en el paso 2.4-2.9. Las concentraciones de droga final en cada pozo se muestra en la Figura 7A. Sello de la placa para evitar la evaporación.
- Incubar la placa de 16 h a 37 ° C.
- Iniciar un nuevo cultivo bacteriano para utilizar en el paso 3 (repetir pasos 1.5-1.7).
3. experimento de respuesta a la dosis de dilución lineal
- Medir la absorbancia de600 OD para placa de respuesta a la dosis de dilución seriada del paso 2 utilizando un lector de placas (Figura 7A a la derecha) e interpretar los resultados basados en los siguientes pasos.
- Normalizar el crecimiento al dividir el crecimiento en cada pozo con el crecimiento del no control de drogas para cada fila y calcular crecimiento porcentual por normalización OD600a ninguna condición de droga.
- Para cada medicamento, ubicar los pozos que tienen inhibición del crecimiento de ~ 50% (IC50), que se muestra en color naranja en la Figura 7A derecha. Asignar la concentración en estos pozos como "IC50 serial" por cada medicamento.
- Descongelar las alícuotas de droga fresca, 1 mL de sol LB - 10% se prepara mezclando media libra y solvente (DMSO) en una proporción 9:1 y LB - 10% mediante la mezcla de media libra y la droga en una proporción 9:1, donde la concentración de la droga es 100 x de IC50 serial de cada medicamento antes de agregar la media libra , seleccionado en el paso 3.3.
- Preparar dosis linealmente crecientes de LEV, NAL y PNG en 11 concentraciones, mezclando la droga LB - 10% y sol LB - 10% en volúmenes que se muestra en la figura 7B.
- Preparar dosis linealmente crecientes de LEV en cuarta fila como control positivo interno.
- Medir OD600 de las 1:10 dilución de la cultura iniciado en paso 2.14.
- Diluir las células en 5 mL de medio LB a un OD600 de 0.01. Vierta en un recipiente.
- Añadir 80 μl de las células diluidas en las diluciones de drogas lineal preparadas en el paso 3.6 utilizando una micropipeta multicanal. Las concentraciones de droga final en cada pozo se muestra en la figura 7B.
Nota: El centro bien en la respuesta a la dosis recibirán la IC50 serial para esta droga. La placa para evitar la evaporación del sello. - Incubar la placa de 16 h a 37 ° C.
- Iniciar dos cultivos bacterianos frescas para usar en el paso 4 (repetir pasos 1.5-1.7).
4. diagonal droga interacción experimento
- Medir la absorbancia de600 OD de dilución lineal dosis-respuesta del paso 3 (figura 7B).
- Para cada medicamento, elegir la concentración que dio lugar a la IC50 y prepara droga LEV, NAL y PNG en concentraciones x IC50 100.
- Descongele la droga fresca, prepare 100 x IC50 para cada droga y preparar mezclas de drogas de 1:1 por volumen de LEV + NAL, LEV + PNG y NAL + PNG y 1: mezcla 1:1 drogas por volumen de NAL + LEV + PNG.
- Preparar dos placas para los experimentos de interacción de drogas como se muestra en la figura 8.
- Medir OD600 de las 1:10 dilución de las culturas comenzó en paso 3.11.
- Preparar OD600 = 0,01 diluciones de dos culturas en dos 10 mL de medio LB.
- Agregar 80 μl de las células de cultura 1 y 2 en las placas 1 y 2, respectivamente. Sellar las placas para evitar la evaporación. Incubar las placas durante 16 horas a 37 ° C.
5. partituras de interacción de drogas diagonal
- Medir la absorbancia de600 OD de diagonal interacción experimento placas del paso 4.
- Normalizar el crecimiento al dividir el crecimiento en cada pozo con el crecimiento del no control de drogas para cada fila.
- Para cada fila, ubique la columna que tiene la inhibición del crecimiento más cercana al IC50, se muestra en color naranja en la figura 8 derecha. Asignar el IC50 basado en la concentración relativa de fármaco en este pozo.
- Para LEV + NAL, LEV + PNG y PNG + NAL y NAL + LEV + PNG dosis-respuestas, calcular IC50 esperado promediando la IC50 de los fármacos individuales en cada combinación. Tenga en cuenta que un promedio es una aproximación simple para el cálculo exacto de IC50 esperado como se describe antes de las12.
- Calcular resultados de concentración inhibitoria fraccionada (FIC) dividiendo la CI50 observado por la IC50 esperado en cada combinación.
Representative Results
Hemos divulgado previamente, las interacciones pares entre los tres medicamentos: LEV, NAL y PNG basan en las pruebas en los ensayos miniatura tablero de ajedrez, donde dos drogas se combinan en una matriz de 4 x 413,14. Mientras que NAL y LEV fueron sinérgicos, PNG informó que fue antagónica con LEV y NAL13,14. Aquí verificamos estas interacciones pares y la interacción de tres vías entre estos tres medicamentos usando un análisis diagonal. Nuestros resultados demuestran que NAL + LEV + PNG es una combinación sinérgica de antibióticos de 3 vías. Representaciones esquemáticas de los resultados de las secciones de cada procedimiento experimental se dieron en el lado derecho de la figura 7 y figura 8. Aquí, presentamos e interpretar resultados crudos representativos de tres lecturas de la placa, que se dan en la figura 9. La lectura de la placa superior corresponde a experimentos dilución serial y lineal en los pasos 2 y 3. Las parte inferior dos placa lecturas son placas duplicadas interacción llevado a cabo en el paso 4.
Los datos en bruto en la figura 9 muestran que crecimiento superior es alrededor de 0,55, pero hay una densidad óptica de 0,05 de los medios de comunicación, como se observa en el OD600 de las concentraciones de droga alta donde no hay crecimiento. Por lo tanto, definimos el IC50 como (0.55-0.05)/2 = 0.25. Para cada respuesta a la dosis, los pozos que se encuentra más cercano a este valor se muestran con naranja.
La mitad superior de la Figura 9A muestra el resultado del paso 2, experimento de serie dosis-respuesta. Los pozos de la IC50 para LEV es en repeticiones de 10 en dos columnas, que corresponden a 4 ng/mL. La IC50 para el NAL y PNG son de 3 μg/mL y 25 μg/mL, respectivamente. Estas concentraciones corresponden a la concentración de 1 x que se muestra en la figura 7B. La mitad inferior de la figura 9B muestra los resultados del paso 3, experimentos de dosis respuesta lineal. LEV, NAL y IC50 de Papua Nueva Guinea se encuentran en 0.4 x, 0.8 y 1.2 x, respectivamente. Estas concentraciones son asignadas como 1 X IC50 para el paso 4.
Se muestran dos placas correspondientes a replicar dos experimentos se muestran en la figura 9B, donde la IC50 pozos con naranja. En placa de 1, todos los medicamentos solo tienen su IC50 en concentración de 1 x. La IC50 esperados para la combinación pares o de tres vías se calcula la media aritmética de fármacos constituyentes, haciendo IC50 prevista para la concentración de x también 1 combinaciones todas. En la placa 2, LEV y PNG tienen su IC50 en la concentración de 1 x, pero NAL IC50 es 1.2 x. El IC50 esperados para cada combinación se define mediante los medios aritméticos de los valores de IC50. Por ejemplo, la IC50 esperado para LEV + NAL y NAL + PNG es 1.1 x. La interacción de droga puntuación (FIC) para cada combinación se calcula dividiendo observado IC50 con la IC50 esperada, como se muestra a la derecha de las placas. Inspección de las puntuaciones de la FIC de las dos placas demuestra que LEV + NAL y NAL + LEV + PNG sinérgica, mientras que LEV + PNG y NAL + PNG son antagónicos. Puntuaciones FIC obtenidas en las dos placas están de acuerdo, apoyo a la fiabilidad del protocolo.
Figura 1: nulo determinación del modelo de modelo de interacción de drogas de aditividad de Loewe. 5 x dos 5 matrices en una microplaca, donde drogas A se incrementa linealmente en un eje como se muestra a la izquierda, y una alta concentración de fármaco inhibe un fenotipo cuantificable (arriba a la derecha). La adición de estas matrices se muestra en el medio, donde las líneas de conexión equipotente droga concentraciones de cada fármaco individual tienen la misma concentración como droga A. Cuando las células se agregan en este "tablero" de combinaciones de concentración del fármaco, se espera que el fenotipo grabado en esta línea será equivalente para los pozos que se conecta. En este experimento de interacción de drogas de uno mismo, la isobole con un fenotipo (se muestra con una línea verde discontinua) se espera que lineal, definiendo el modelo nulo de aditividad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: interacciones pares según el modelo de interacción de drogas de aditividad de Loewe. Cuando dos drogas se combinan en un ensayo de tablero de ajedrez como en la figura 1, el contorno de isophenotypic observado puede ser recto, convexo o cóncavo. A la derecha, posible isophenotypic contornos (líneas verdes discontinuas) se superponen en ensayos de tablero de ajedrez. Combinaciones de drogas con contornos rectos isophenotypic son Loewe-aditivo, como los contornos no son diferentes de una interacción de drogas de uno mismo-self, que es Loewe añadido por definición. Cuando el contorno de isophenotypic significativamente es cóncavo o convexo, la combinación es sinérgica o antagónica, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: interacciones de la droga de tres vías según el modelo de interacción de drogas de aditividad de Loewe. Similar para el análisis del tablero de ajedrez para las interacciones de pares, tres drogas se combinan en una cuadrícula 3D (un "checkercube"), donde cada fármaco se incrementa linealmente en un eje. Si las tres drogas eran idénticas, la superficie isophenotypic se espera que sea plano, definir la aditividad para tres combinaciones de fármacos. Si la superficie es más cóncavo o convexo que este modelo de Loewe-aditivo null, combinaciones de medicamentos son sinérgicos o antagonistas, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: método Diagonal para medir interacciones pares. Para cada ensayo de tablero de ajedrez, se miden sólo las regiones que se muestran en rectángulos magentas. i y ii linealmente estamos aumentando las concentraciones de fármaco único. III se evalúa haciendo una mezcla 1:1 de dos fármacos y valorar linealmente esta mezcla como si fuese un solo medicamento. El FIC es igual a la IC50 observada en la combinación dividida por la IC50 esperada de dos fármacos solo. Para el modelo de aditividad de Loewe, la IC50 prevista se aproxima por la IC50 media de los dos fármacos solos. Un valor FIC 1 pares de Loewe-aditivo y es inferior o superior a 1 para los pares sinérgicos o antagonistas, respectivamente2,12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: método Diagonal para medir las interacciones de droga de tres vías. Para cada ensayo de checkercube, se miden sólo las regiones que se muestra. i, ii y iii estamos aumentando linealmente concentraciones de la droga sola. IV se mide haciendo un 1:1:1 mezcla de tres medicamentos y valorar linealmente esta mezcla como si fuera un solo medicamento. La concentración inhibitoria fraccional es igual a la observada IC50 en la combinación dividida por la IC50 esperado dado drogas solo tres. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: flujo de trabajo para el protocolo del método diagonal descritos y los detalles de configuración para cada microplaca. La placa que se muestra en el día 4 se realiza por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: experimentos de dilución Serial y lineal dosis-respuesta. (A) preparación de la dilución serial dosis-respuesta para un fármaco y las concentraciones de droga final correspondiente. Las células de e. coli se agregan a la placa; crecimiento se registra después de 16 h. IC50 de serie, se muestra en naranja, es seleccionado para cada fármaco para uso en el día siguiente de lineal experimentos de dosis respuesta de dilución. (B) preparación de la dilución lineal dosis-respuesta para un fármaco y las concentraciones de droga final correspondiente. Las células de e. coli se agregan a la placa; crecimiento se registra después de 16 h. Para cada medicamento, el IC50s seleccionado que se utilizará en el día siguiente la droga interacción experimentos se muestran en naranja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: experimentos de interacción de la droga. Preparación de experimentos de interacción es similar a una droga dosis-respuestas lineales, salvo que 1:1 o 1:1:1 mezcla de fármacos se utiliza para dos o tres dosis-de la respuesta farmacológica, respectivamente. Observado IC50s para cada dosis-respuesta, representada en color naranja, se utilizan para calcular puntuaciones FIC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Representante experimentar resultados. Se muestran resultados representativos obtenidos mediante el protocolo descrito, con datos proporcionados en el texto principal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El uso de combinaciones de fármacos contra patógenos o tumores es una atractiva, especialmente en las circunstancias de la tubería antibiótica de secado. Sin embargo, este potencial se ve obstaculizado por al menos dos dificultades. La primera dificultad es el número astronómico de combinaciones posibles. Hay, por ejemplo, 4950 combinaciones pares posibles entre 100 antibióticos. Todas las combinaciones posibles entre 100 antibióticos (2100) es en el mismo orden de magnitud con el número de bacterias en la tierra (~ 1030). Cómo predecir fuertemente sinérgicas combinaciones entre estas posibilidades ha sido objeto de numerosos estudios computacionales. La segunda dificultad es la medida de las interacciones de orden superior. Considerar que una plataforma computacional puede sugerir que una cierta combinación de drogas 10 es fuertemente sinérgica contra un determinado patógeno. Los métodos tradicionales para probar la interacción con otros medicamentos es demasiado costoso verificar o refutar esta hipótesis, por lo tanto ha sido el estudio de la sinergia entre muchas drogas fuera de los límites de la investigación científica. El método diagonal, que primero fue propuesto hace casi 30 años y fue utilizado en algunas pantallas de sinergia recientes proporcionan una base sólida para el primer problema, permitiendo que la prueba de la interacción entre muchos pares. Resuelve el segundo problema por una muestra informativa de los ensayos tradicionales y permite el estudio de interacciones de orden superior.
Lo importante es que notamos que nuestro protocolo utiliza un dosificador lineal para medidas de interacción de drogas, para ofrecer la sensibilidad para detectar incluso las interacciones débiles. Establecer el rango de concentración adecuada dosificación lineal es una tarea difícil. Realizando primero una dilución seriada, tomamos una decisión informada sobre el espacio de búsqueda de dosis lineal. Sin embargo, el protocolo puede ser modificado para usar 2 o más diluciones seriadas de drogas pruebas de interacción. Tal modificación sería acortar el tiempo de experimento y el realizar las pruebas de las interacciones más; sin embargo, tendría la sensibilidad para detectar las interacciones sólo fuertemente sinérgicas o antagónicas.
El protocolo que se describe muestra la medición de las interacciones de parejas o de tres vías. Un aspecto fundamental del protocolo es que los agentes solo son en el mismo plato como la combinación, para minimizar el sesgo debido a las variaciones de la placa. Por lo tanto, el protocolo puede ajustarse para medir interacciones hasta 7 vías combinaciones modificaciones triviales. Combinaciones de más de 7 medicamentos requerirá más de una microplaca de 96 pocillos y consideraciones adicionales deben tomarse para asegurar la integración de datos correctos, como repeticiones entre placas.
Una notable limitación del método diagonal es la restricción que cada medicamento en el ensayo debe inhibir el fenotipo de interés. Por lo tanto, el método diagonal no es útil para la comprensión de las interacciones entre los agentes activos y coadyuvantes inertes. Tales interacciones 'refuerzo' pueden ser estudiados bajo modelos alternativos como los modelos de felicidad o agente único más alto.
Una consideración importante para el análisis de interacciones de orden superior es la opción del modelo nulo para los "IC50 esperados". Cuando se combinan dos fármacos, efecto de la combinación puede sólo ser comparado con los efectos de la droga sola. Cuando se combinan tres drogas, efecto de la combinación puede compararse a los solos efectos o efectos pares. Por ejemplo, si todas las combinaciones de pares de tres medicamentos son sinérgicas, entonces se puede esperar que estas drogas mostrará una sinergia de tres vías. Desviación de la interacción de tres vías de lo que se espera de interacciones entre pares ha sido recientemente denominado "interacción emergente"16,17. Para simplificar, nuestro protocolo describe la medición de la de la combinación de tres vías "neta interacción," que el modelo nulo se define como efectos de la droga sola. Sin embargo, los datos que se obtuvieron a partir del protocolo también pueden utilizarse para calcular la interacción emergente de la combinación de tres vías. En nuestro análisis, definimos la IC50 esperada de la combinación de tres vías como la media de la droga solo IC50s. Alternativamente, la IC50 esperado se puede definir como el promedio de la IC50s de combinaciones de pares (~1.1-1.2). Cuando la CI50 observado se divide por esta alternativa esperada IC50, el FIC obtenido proporciona el FIC emergente para la combinación de tres vías, como se describió anteriormente12. Este examen revela que NAL + LEV + PNG es más sinérgica que lo que se esperaría de las interacciones pares entre los tres medicamentos, demostrando que NAL + LEV + PNG tiene sinergia emergente.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por NIGMS Grant P50GM107618. Los autores agradecen a Zohar B. Weinstein para los perspicaces comentarios y sugerencias sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Semi Micro Cuvette | VWR | 97000-586 | |
| 1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 1000 µL Tips | Geneseesci | 24830 | |
| 14 mL Breathable Cell Culture Tube | VWR | 60819-761 | |
| 20 µL Tips | Geneseesci | 24804 | |
| 200 µL Tips | Geneseesci | 24815 | |
| 37 °C Incubator | Panasonic | MIR-262-PA | |
| 37 °C Shaker Incubator | Thermo Scientific | SHKE8000 | |
| 5 mL Cell Culture Serological Pipette | VWR | 53300-421 | |
| 96-well Microplates | VWR | 15705-066 | |
| Breathable Sealing Film | USA Scientific | 2920-0010 | |
| DMSO | Sigma | 41647 | |
| Escherichia coli | ATCC | 700926 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| LB Broth Powder | RPI | L24065 | |
| Levofloxacin | Sigma | 28266 | |
| Micropipette | GILSON | PIPETMAN Classic | |
| Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | |
| Multichannel micropipette | VistaLab | 1060 | |
| Nalidixic acid | Sigma | N8878 | |
| Penicillin G | Sigma | P3032 | |
| Pipette Pump | Drummond | 4-000-501 | |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-658 | |
| Spectrophotometer | BIO-RAD | 1702525 | |
| Vortex Mixer | Fisher Scientific | 10-320-807 |
References
- Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).
- Berenbaum, M. C. What is synergy? Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).
- Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).
- Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).
- Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).
- Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).
- Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).
- Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).
- Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).
- Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
- Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Cancer Research. 76 (23), 6950-6963 (2016).
- Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).
- Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).
- Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).
- Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).
- Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).
- Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).
