Summary
ويصف هذا البروتوكول تسجيل الإمكانات الميدانية المحلية مع متعدد عرقوب يسبر السليكون الخطي. يسمح تحويل الإشارات باستخدام تحليل كثافة المصدر الحالي إعادة بناء نشاط الكهربائية المحلية في قرن آمون الماوس. مع هذه التقنية، يمكن دراسة ذبذبات الدماغ مكانياً المقيدة في الانتقال بحرية الفئران.
Abstract
الإمكانات الميدانية المحلية (طابعات الحجم الكبير) ينبثق من حركات أيون عبر الأغشية العصبية. نظراً للجهد سجلتها أقطاب طابعات الحجم الكبير يعكس الحقل الكهربائي summed كمية كبيرة من أنسجة المخ، استخراج معلومات حول النشاط المحلي يشكل تحديا. دراسة رقائق الخلايا العصبية، ومع ذلك، يتطلب موثوق بها تمييز بين الأحداث المحلية حقاً وإشارات أجرت وحدة التخزين التي تنشأ في المناطق البعيدة من الدماغ. تحليل كثافة (CSD) المصدر الحالي يوفر حلاً لهذه المشكلة بتوفير معلومات حول المصارف الحالية ومصادر مقربة من أقطاب كهربائية. في مناطق الدماغ مع الصفحي سيتوارتشيتيكتوري مثل قرن آمون، يمكن الحصول على أحادي البعد لجنة التنمية المستدامة بتقدير مشتقة الثانية المكانية طابعات الحجم الكبير. هنا، يمكننا وصف أسلوب لفبس مولتيلامينار سجل استخدام المسابير السليكون الخطي مزروع في الحصين الظهرية. وتحسب آثار لجنة التنمية المستدامة على طول السيقان الفردية للتحقيق. وهكذا يصف هذا البروتوكول إجراء لحل ذبذبات مكانياً مقيد شبكة الخلايا العصبية في قرن آمون التحرك بحرية الفئران.
Introduction
التذبذبات في طابعات الحجم الكبير خطيرة تشترك في معلومات معالجة بواسطة الدوائر العصبية. وهي تغطي طائفة واسعة من الترددات، تتراوح بين موجات بطيئة (~ 1 هرتز) تموج بسرعة ذبذبات (~ 200 هرتز)1. نطاقات التردد متميزة ترتبط بالوظائف المعرفية بما في ذلك الذاكرة والمعالجة العاطفية، والملاحة2،3،،من45،،من67. تدفق التيار عبر أغشية الخلايا العصبية تشكل الجزء الأكبر من إشارة طابعات الحجم الكبير8. الكاتيونات دخول الخلية (مثلاً عن طريق تنشيط نهايات ضادات جلوتاماتيرجيك) تمثل المصارف الحالية نشطة (كما يترك تهمة المتوسطة خارج الخلية). وفي المقابل، يصور التدفق الصافي مقابل إيجابية إلى الوسط خارج الخلية، على سبيل المثال بالتنشيط من الاشتباكات العصبية المثبطة جابايرجيك، مصدر الحالية نشطة في هذا الموقع. في قطبانيه العصبية، المقترنة المصارف الحالية مع مصادر سلبية، والعكس بالعكس بسبب تعويض التيارات التي تؤثر على الغشاء المسؤول في مواقع بعيدة.
يمكن أن يؤدي أيضا إلى الجهد الكبير أو في قطب تسجيل مجال الكهربائية التي تنتجها العمليات العصبية البعيدة وقد وبالتالي يعتبر كذبا كحدث محلي. هذا التوصيل الحجم يشكل تحديا خطيرا لتفسير الإشارات طابعات الحجم الكبير. تحليل لجنة التنمية المستدامة يوفر معلومات حول المصارف الحالية المحلية والمصادر الأساسية لطابعات الحجم الكبير إشارات، ويشمل ذلك وسيلة الحد من تأثير حجم التوصيل8. في هياكل مغلفة مثل قرن آمون، ويمكن الحصول أحادي البعد لجنة التنمية المستدامة إشارات المشتقة المكانية الثانية من طابعات الحجم الكبير سجل من مسافة واحدة أقطاب ترتيب عمودي إلى طائرات الصفحي9. أتاح ظهور المسابير السليكون الخطية المتاحة تجارياً الباحثين استخدام أسلوب لجنة التنمية المستدامة لدراسة النشاط المحلي التذبذب في قرن آمون. على سبيل المثال، وقد ثبت أن ذبذبات غاما متميزة تبرز بصورة خاصة بطبقة في المنطقة CA110. علاوة على ذلك، حددت لجنة التنمية المستدامة تحليل المستقلة بؤر النشاط غاما في الطبقة الرئيسية الخلية المغزلي المسنن11. الأهم من ذلك، كانت هذه النتائج الظاهر في لجنة التنمية المستدامة المحلية ولكن ليس في طابعات الحجم الكبير إشارات فقط. وهكذا يوفر تحليل لجنة التنمية المستدامة أداة قوية لاكتساب المعرفة في عمليات سليكون الحصين.
في هذا البروتوكول، ونحن توفير دليل شامل للحصول على إشارات لجنة التنمية المستدامة أحادي الأبعاد مع تحقيقات السليكون. هذه الأساليب سوف تمكن المستخدمين من التحقيق في أحداث التذبذب المترجمة في قرن آمون الفئران يتصرف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت كافة الأساليب التي تنطوي على الحيوانات التي تعيش فرايبورغ Regierungspräsidium وفقا "القانون الألماني لرعاية الحيوان".
1-الأعمال التحضيرية
- تصميم وبناء أداة مناسبة إدراج عابر يحمل المسبار السليكون والموصل الكهربائي أثناء عملية زرع. انظر الشكل 1 لأداة إدراج مبنية مخصصة مثال.
- عناية تحرير الموصل المسبار والقطب السليكون من التعبئة والتغليف باستخدام الملقط مقلوب السيراميك.
- رفع المجلس موصل وإصلاحه بشكل أمن مع المشبك تمساح يعلق على موقف.
- استخدام ستيريوسكوبي، محاذاة التحقيق مع أداة الإدراج مع الملقط مقلوب السيراميك. تطبيق طبقة ~ 2 مم من شمع البارافين ذاب مع كوتيريزير الغراء المسبار إلى أداة الإدراج. الحرص على عدم لمس شانكس التحقيق أثناء هذا الإجراء.
- إصلاح للموصل الكهربائي برمح الأداة الإدراج باستخدام شريط لاصق القياسية. علما أنه حسب الشركة المصنعة، قد يلزم الأسلاك الأرضية يكون ملحوم إلى مجلس الموصل الكهربائي قبل غرس. إزالة العزل من قطعتين قصيرة من الأسلاك النحاسية المعزولة الورنيش باستخدام القصدير اللحام تطبيقها لحام حديد (400 درجة مئوية). لحام الأسلاك الأرضية بفتحات المناسبة في مجلس الموصل الكهربائي.
- إزالة عزل قطعتين إضافية من الأسلاك النحاسية. التفاف كل الأسلاك النحاسية العارية ثلاث مرات حول المسمار فولاذ المقاوم للصدأ (قطرها 1 مم، وطول 2 ملم). تطبيق التمويه مناسبة للحام الصلب ولحام الأسلاك النحاسية إلى الجزء السفلي من غطاء المسمار. تأكد من أن الجزء السفلي نصف رفات المسمار الخيط مجاناً للحام القصدير.
- استخدام متعدد قياسية للتحقق من وجود تماس كهربائي بين السلك والمسمار.
- تطهير شانكس المسبار السليكون ومسامير الأرض بالانغماس في الإيثانول 70% (10 ق).
- إعداد غطاء حماية لزرع المسبار بقطع رأس البلاستيك ماصة باستور في نصف.
2. جراحة زرع
- تعقيم الأدوات الجراحية (مقص، ملقط الجميلة ذات الرؤوس، والمشابك الجراحية) مع معقم حبة ساخنة. مسح جميع الأسطح مع الإيثانول 70%.
- حمل التخدير مع إيسوفلوراني 3% في الأوكسجين وألقى في ~ 1 لتر في الدقيقة.
- للصيانة، واستخدام إيسوفلوراني 1-1، 5%. علما بأن تركيز isoflurane المطلوبة لتحقيق التسامح الجراحية يمكن أن تختلف من الحيوان للحيوان.
- ويتحقق التسامح الجراحية مستقرة عند الحيوان لا تستجيب معسر أخمص القدمين. رصد معدل التنفس للماوس وضبط تركيز isoflurane إذا لزم الأمر.
- تطبيق مرهم عيون الحيوان لمنع الجفاف.
- جبل الماوس في إطار ستيريوتاكسيك بإدراج أشرطة الإذن بلطف في قناة الإذن. مرة واحدة واستقرت رأس الماوس بأشرطة الإذن، ضع قطعة فم على الآنف لتسليم isoflurane المستمر. ضع الماوس على وسادة أو منشفة على وسادة تدفئة وحقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.05-0.1 مغ/كغ وزن الجسم) لضمان التسكين بعد العملية الجراحية.
- حلق الرأس مع آلة حلاقة قياسية وتطهير الجلد مع الإيثانول 70%. باستخدام مقص جراحي، جعل شق في الجلد على طول خط الوسط من الجمجمة وفتح الجلد باستخدام المشابك الجراحية.
- قم بمحاذاة رأس الحيوان مع المعونة من أداة المحاذاة ستيريوتاكسيك بريجما المستوى وامدا. وينبغي أن يكون هناك أقل من 50 ميكرون من إزاحة الارتفاع بين بريجما وامدا. وعلاوة على ذلك، تحديد مستوى سطح الرأس على طول المحور ميديولاتيرال بقياس العمق من بريجما في الجمجمة في المسافات والأيسر (مثلاً، 1 مم غادر وحق بريجما). ضبط إمالة الرأس إذا لزم الأمر.
- تنظيف الرأس مع بيروكسيد الهيدروجين 3% والقضاء على الجفاف مع مناديل معقمة القطن.
- تحديد موقع اوديما بالنسبة إلى بريجما باستخدام طائرة مناسبة أطلس ستيريوتاكسيك12.
- استخدام رأس حفر 0.9 ملم، حفر ثقوب المسمار اثنين في العظام خلال المخيخ مكان مسامير الأرض ومرجع. بالإضافة إلى ذلك، 1-3 ثقوب للمسامير ترسيخ مرغوب فيه لتحقيق الاستقرار في عملية الزرع. موقع مسامير الربط سيعتمد على موقع اوديما. لغرس في الحصين، مكان مسامير ربط أكثر contralateral الجدارية وعن القشرة الأمامية. إدخال المسامير في العظام باستخدام مفك براغي مناسبة. الحرص على عدم اختراق الدماغ.
- أداء اوديما ببطء رقيق الجمجمة بالحفر في منطقة مستطيلة حول الجانب غرس. وكثيراً ما ترطيب العظام مع الفوسفات تعقيم المخزن المؤقت (الجريدة الرسمية). يمكن اخترقت الجمجمة ضعفت المتبقية بلطف وإزالتها مع المعونة من إبرة حقن (27 ز) غرامة وزوج من ملاقط.
- بيرس بعناية الأم الجافية بإبرة حقن (27 ز) رقيقة. شكل هوك صغيرة عن طريق ثني طرف الإبرة مع زوج من ملاقط وسحب دوراً للإزالة. تطبيق الجريدة الرسمية لمنع جفاف سطح الدماغ.
- تحميل الأداة الإدراج القطب على حامل ستيريوتاكسيك وصفر التحقيق في بريجما وحرك اوديما التحقيق إلى إحداثيات ستيريوتاكسيك. اختراق سطح الدماغ ببطء. تأكد من عدم ثني مهاوي التحقيق. تجنب زرع عن طريق الأوعية الدموية.
- انخفاض ببطء التحقيق حتى ~ 200 ميكرومتر أعلاه العمق المطلوب. تغطية اوديما والسيقان المسبار السيليكون مع فازلين معقم للحماية. تطبيق الأسمنت الأسنان لإصلاح القاعدة للتحقيق معه لترسيخ المسمار في الجمجمة.
- الحق بعد تطبيق الأسمنت، تتحرك ببطء التحقيق بعمق الهدف. تتقدم ميكرومتر آخر 200 ~ بعد تطبيق الأسمنت يقلل من الحركة الجانبية للتحقيق ويضمن تلف الأنسجة الحد الأدنى في المنطقة المستهدفة. علما بأن فترة علاج من الأسمنت المستخدمة يمكن أن تؤثر على هذه الخطوة من البروتوكول. بسرعة علاج الأسمنت، تجاهل هذه الخطوة وزرع مباشرة التحقيق بعمق الهدف تجنبا للأضرار بالتحقيق السليكون.
- بعد وقد شُفي الأسمنت، الإفراج عن التحقيق من أداة الإدراج قبل ذوبان الشمع مع كوتيريزير.
- إطلاق المجلس موصل من الجهاز الإدراج ووضعه في مكان مناسب في الجمجمة باستخدام المشبك التماسيح إرفاق إلى مؤشر الإدراج. في حالة زرع التحقيق إلى الحصين، وضع المجلس موصل على العظم الجداري كونترالاتيرال. إصلاح المجلس موصل الجمجمة باستخدام الأسمنت الأسنان.
- لحام أسلاك أرضية ومرجعية المجلس موصل بأسلاك تعلق على مسامير اثنين على المخيخ.
- تقليم الغطاء الواقي للطول الصحيح ووضعه على التحقيق السليكون. إصلاح الغطاء إلى المجلس موصل والجمجمة باستخدام أسمنت الأسنان، تجنب الجلد حول الجمجمة المكشوفة. خياطة الجلد حول الموقع غرس عادة غير مطلوب.
3-الإنعاش بعد الجراحة
- تطبيق العلاج مسكن مناسب لمدة يومين على الأقل (مثلاً تحت الجلد حقن البوبرينورفين كل ح 6 خلال النهار وفي مياه الشرب بين عشية وضحاها جنبا إلى جنب مع والايبوبروفين (4-5 ملغ/كغ من وزن الجسم) تحت الجلد كل 24 ساعة). واحد-الإسكان يوصي بمنع الأضرار بعملية الزرع.
- السماح بأسبوع واحد على الأقل للتعافي. التشاور مع المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات المحلية.
4. الحصول على البيانات
- سجل لفبس من الانتقال بحرية الفئران باستخدام نظام حيازة بيانات مناسبة متصلة عن طريق مبدلة. للحصول على لفبس، استخدام تردد أخذ عينات من 1-5 كيلو هرتز. معدلات أخذ العينات (20-30 كيلو هرتز) مطلوبة إذا التصريفات وحدة واحدة أن يسجل جنبا إلى جنب مع طابعات الحجم الكبير.
- تخزين الملفات الخام تسجيل القنوات الفردية للتحليل دون اتصال.
5-علم الأنسجة
- بعد انتهاء التسجيل، عميق تخدير الحيوان (مثل 2 غ/كغ الجسم الوزن يوريتان حقن إينترابيريتونيلي). وتؤكد الدولة مخدر بعدم الرد على أخمص القدمين معسر.
- نتخلل ترانسكارديالي الماوس مع المثلج مخزنة الفوسفات المالحة (~ 1 دقيقة) تليها بارافورمالدهيد 4% (~ 10 دقيقة) باستخدام أساليب نضح إينتراكارديال القياسية13. قبل التروية، ليسيونينج كهربائياً من مواقع التسجيل قد التي يؤديها (مثلاً عن طريق تطبيق الخامس 10-20 من الجهد المستمر ليصل إلى 1 s). بدلاً من ذلك، تطبيق الأصباغ الفلورية نصائح عرقوب قبل غرس يمكن استخدامها لتحديد المسار. ويوصي باختبار الأساليب المختلفة للتعرف على مواقف قطب كهربائي للحصول على أفضل النتائج مع أنواع مختلفة من المجسات السليكون.
- قص أجزاء الدماغ (~ 100 ميكرومتر) ووصمة عار الشرائح مع 4-6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1 ميكروغرام/مل) تليها ثلاث خطوات الغسيل في الجريدة الرسمية (كل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة).
- وضع المقاطع على شريحة مجهر وتطبيق قطره من تضمين المتوسطة ويشمل القسم كشف الغطاء. واسمحوا التضمين متوسطة الجافة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- استخدام ابيفلوريسسينسي أو [كنفوكل] مجهر مسح ليزر، تحديد مواقع التسجيل.
- لمحاولة استرداد المسبار السيليكون لاستخدامها مرة أخرى، إجراء التحقيق مع المشبك التماسيح والإفراج عن التحقيق من سكل بعناية ذوبان الأسمنت الأسنان لحام حديد (400 درجة مئوية). الحرص على عدم لمس شانكس التحقيق أثناء هذا الإجراء!
- أغسل المسبار في الماء المقطر الساخن (~ 80 درجة مئوية، 15 دقيقة) تليها حل الانزيمية (1% تيرجازيمي في الماء المقطر، 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) والغسيل آخر خطوة في الماء المقطر (15 دقيقة). علما أن معدل نجاح الانتعاش مسبار منخفضة.
6-لجنة التنمية المستدامة التحليل
- استخدام بيئة تحليل مناسبة (مثل بيثون)، تحويل بيانات طابعات الحجم الكبير شأنك الفردية إلى لجنة التنمية المستدامة التي تقارب المشتقة الثانية المكانية على طول الساق
حيث طابعات الحجم الكبيرn, t هو إشارة طابعات الحجم الكبير على مسرىth nعند الزمن t و Δz هو التباعد بين القطب. لاحظ أن سبب n-1 وعمليات n+ 1، يتعذر تقدير لجنة التنمية المستدامة أقطاب الأول والأخير عرقوب، التي يجب أن تؤخذ قيد النظر أثناء موضع التحقيق. تنفيذ الصيغة تقريب استخدام قطعة قصيرة من التعليمات البرمجية التي يحسب إشارة لجنة التنمية المستدامة لكل قطب كهربائي أثناء التكرار مع مرور الزمن (انظر ملف التعليمات البرمجية الإضافية). - استخدام إشارة لجنة التنمية المستدامة التي تم الحصول عليها لمزيد من التحليل (مثلاً، دراسة نطاقات الترددات المحددة من ذبذبات الدماغ عن طريق تطبيق عوامل تصفية تمرير النطاق).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الإدراج الأداة المستخدمة لغرس المسابير السليكون. تسجيلات من السليكون مزمن مزروع يسبر استهداف منطقة CA1 وطبقة الخلايا الحبيبية المغزلي المسنن مبينة في الشكل 2. سجلنا لفبس من شانكس المسبار خلال حرية الحركة في هوميكاجي. لتقليل تأثير حجم التوصيل، تم تحويل الإشارات التي تم الحصول عليها إلى لجنة التنمية المستدامة على طول كل ساق من التحقيق (الشكل 2، د). في المثال الأول هو مبين في الشكل 2، تموج موجه حادة واحد يؤدي الحدث إلى بالوعة الحالية بارزة في طبقة رادياتوم من CA1. في المثال الثاني المعروض في الشكل 2-E، سجلنا من اثنين من مواقع متميزة في طبقة الخلايا الحبيبية من المغزلي المسنن (المسافة الجانبية 400 ميكرون). تم عزل الفرقة عالية-غاما بتطبيق عامل تصفية ممر الموجه هرتز 60-80 إلى إشارة لجنة التنمية المستدامة، يكشف عن رشقات نارية غاما المحلي على واحد من اثنين من المواقع التسجيل الموجود في طبقة الخلايا الحبيبية (الشكل 2D؛ موقع تسجيل أحمر). ملاحظة أن النشاط التذبذب غاما المحلي يمكن الكشف عنها إلا بعد تحويل الإشارات المسجلة إلى لجنة التنمية المستدامة (الشكل 2D، حق). ويبين الشكل 2E فترات زمنية منفصلة لتسجيل نفسه، خلالها تختلف ذبذبات غاما في كلا مواقع التسجيل في هذه المرحلة (الشكل 2E، اليسار) أو السعة (الشكل 2E، الأوسط). المثال الموجود في أقصى اليمين يعرض حقبة نشاط غاما متزامنة في كلا الموقعين تسجيل. وتوضح هذه الأمثلة أن تحليل لجنة التنمية المستدامة قادر على عزل النشاط المحلي ليس فقط في البعد للتحليل ولكن أيضا في اتجاه عمودي. لزيادة توضيح هذا المفهوم المركزي، ونحن على غرار تجربة مع تحقيق سيليكون تتألف من اثنين من شانكس (الأول والثاني) مع خمسة مواقع التسجيل، كل في القياس على النتائج هو مبين في الشكل 2. في نموذجنا، التحقيق هو مزروع في المغزلي المسنن مع التذبذب جاما محلية الظهور في طبقة الخلايا الحبيبية بجوار موقع تسجيل 4 من شأنك الأول (الشكل 3). افتراض التوصيل حجم متجانس في جميع أنحاء الأنسجة، سيتم تسجيلها بالتذبذب المحلية في طابعات الحجم الكبير في جميع مواقع التسجيل الأخرى في إصدار تصفية السعة (الشكل 3). أداء تحليل لجنة التنمية المستدامة على طول كلا شانكس يعزل بيد وضوح موضع جيل غاما (3D الشكل). علاوة على ذلك، المسافة بين مواقع التسجيل في عرقوب نفسه، أصغر من الحديث المتبادل بين لجنة التنمية المستدامة أصغر الإشارات على المجاورة شانكس (3E الشكل، و).
رقم 1: صورة للأداة الإدراج. المسبار السليكون مرفق دبوس الحشرات لصقها على قاعدة المشبك التماسيح. يمكن إدراج رمح حامل في ستيريوتاكسيك مناور الجزئي لغرس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل نتائج تحليل لجنة التنمية المستدامة في الحصين. A: صفيف قطب يتألف من التحقيق السليكون أربعة-عرقوب (عرقوب تباعد 400 ميكرون، والقطب تباعد 100 ميكرومتر، أقطاب 8/عرقوب) كان مزروع في أمونيس قرن منطقة 1 (CA1). اجتياز شانكس أ-ج oriens الطبقة (س)، والطبقة بيراميدالي (ع)، والطبقة رادياتوم (r). التردد: شرخ هيبوكامبال. المديرية العامة: المغزلي المسنن. ب: طابعات الحجم الكبير (آثار سوداء)، ولجنة التنمية المستدامة (مرمزة) من السيقان الثلاثة في CA1 خلال حقبة 200 ms تحتوي على موجه حادة عفوية تموج الحدث. ملاحظة الحوض الحالي بارزة في الطبقة رادياتوم. طابعات الحجم الكبير الحجم بار: 2 أم. ج: مثال للتحقيق السليكون تسجيل من المدير العام. السيقان باختراق المدير العام. CA3: قرن منطقة أمونيس 3. وأجريت آفات الالكتروليتى بعد التسجيل لتسمية المسارات قطب كهربائي. د: الرسم من شانكس القطب فيما يتعلق بتشريح هيبوكامبال. طابعات الحجم الكبير تسجيل من اثنين مكانياً المواقع المنفصلة في طبقة الخلايا الحبيبية (الأحمر والأزرق تسجيل الموقع) تقترح أن ذبذبات غاما (60-80 هرتز) يتم مزامنتها بين كلا الموقعين (إلى اليسار). ومع ذلك، تكشف إشارات لجنة التنمية المستدامة للفترة الزمنية نفسها غاما تنسيق 'ساخنة' مقيدة إلى موقع التسجيل الحمراء (على اليمين). يتم رسم إشارات لجنة التنمية المستدامة من كل مواقع التسجيل على نفس النطاق. ﻫ: إشارات لجنة التنمية المستدامة ولكن لا طابعات الحجم الكبير تحديد فترات المرحلة (يسار) والسعة أسينتشروني (وسط) بين كل مواقع التسجيل. ويبين العصر على الحق في حقبة قصيرة من النشاط غاما متزامنة. آثار في الأسفل توضيح الفرق المرحلة (المرحلة Δ بالتقدير الدائري) والسعة الفرق مؤشر (Ampl.، ويعرف الفرق السعة بين كلا الموقعين تسجيل مقسوماً على إجمالي الاتساع عند كل نقطة مرة مع مجموعة من-1 إلى 1) طابعات الحجم الكبير (الرمادي)، ولجنة التنمية المستدامة (أسود) آثار. الأمثلة الثلاثة 30 مللي ثانية طويلة ووقعت داخل 400 السيدة "لوحات ج" ود مقتبسة من Strüber et al. عام 201711 تحت الإبداعي (https://creativecommons.org/Licenses/by/4.0/). يتم رسم إشارات لجنة التنمية المستدامة من كل مواقع التسجيل على نفس النطاق في كل لوحة فردية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نموذج التجربة مع محاكاة ذبذبة 40 هرتز المحورية في طبقة الخلايا الحبيبية المغزلي المسنن. أ: تحقيق سيليكون نموذجي مع شانكس اثنين على مسافة دعرقوب = 400 ميكرومتر وخمسة مواقع التسجيل يقع على مسافات دالقطب = 100 ميكرومتر يوضع في المغزلي المسنن. ب: إلى جانب موقع تسجيل 4 من شأنك الأول، التذبذب 40 هرتز تنسيق محاكاة الموجي جيبية بالإضافة إلى الضبابي الضوضاء البيضاء. في جميع المواقع الأخرى، التي يتسبب فيها الضجيج فقط. المعلمات: غاما السعة: 1 أم؛ الانحراف المعياري للضوضاء: 0.05 mV؛ الأزمنة: 10 كيلوهرتز. ج: نحن على غرار أثر تصفية السعة حجم التوصيل عبر الفضاء خارج الخلية بطريقة مبسطة تحلل أسي سلبية من الاتساع غاما مع ثابت مساحة أنسجة من 500 ميكرومتر. المعلمات الدقيقة بشكل صحيح يصف انتشار الإشارات طابعات الحجم الكبير الأفقي هي مثيرة للجدل14. ومع ذلك، يناسب تقديراتنا جيدا للبيانات من نيوكورتيكال جاما التذبذب تماسك دراسة15. في طابعات الحجم الكبير الناتج، يشمل بالتذبذب التنسيق أصلاً عدة مواقع التسجيل. د: بعد إجراء تحليل لجنة التنمية المستدامة على طول مهاوي الفردية باستخدام المعادلة لجنة التنمية المستدامة معين، بالتذبذب مرئياً فقط في الموقع الأصلي. هاء: تحليل الكثافة الطيفية طاقة طابعات الحجم الكبير (يسار، أحمر) وآثار لجنة التنمية المستدامة (حق، أزرق) لتسجيل مواقع 4 على شأنك الأول (الخط المنقط) والثاني (خط مستمر). ملاحظة أن تحليل لجنة التنمية المستدامة بشكل صحيح عزل بالتذبذب 40 هرتز المحلية على شأنك أنا مع طابعات الحجم الكبير إشارة يحتوي على نشاط التذبذب الكبير أجرت وحدة التخزين على شأنك ثانيا. تم إجراء تحليل مديرية الأمن العام باستخدام الدالة بولك في MATLAB. واو: زيادة المسافة بين مواقع التسجيلات على شانكس الفردية إلى 400 ميكرون نتائج في انخفاض قدرة تحليل لجنة التنمية المستدامة عزل نشاط التنسيق. تم إجراء التحليل والمحاكاة باستخدام MATLAB 7.10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أدلة متزايدة تشير إلى أن ذبذبات الدماغ في الدوائر العصبية هيبوكامبال تحدث في النطاقات المكانية المنفصلة10،،من1116. تحليل لجنة التنمية المستدامة يخفض بشكل كبير تأثير حجم التوصيل، شرطا حاسما لدراسة الأحداث المحلية التذبذب. مع هذا الفيديو، ونحن توفير دليل لغرس المسابير السليكون في الحصين الماوس لتحليل بيانات لجنة التنمية المستدامة. نعرض أمثلة من إشارات لجنة التنمية المستدامة من تموجات موجه حادة في CA1 وذبذبات غاما المترجمة في المغزلي المسنن. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة أنماط النشاط متذبذبة هيبوكامبال الأخرى، مثل ثيتا أو الشبكة المتصلة بالتنفس ذبذبات17.
يعتمد نجاح غرس حاسمة على التوافق السليم لرأس الحيوان في إطار ستيريوتاكسيك. نحن نستخدم إبرة حقن فرضت في حامل ستيريوتاكسيك لقياس انحراف الرأس في الاتجاهات التي أنتيريوبوستيريور وميديولاتيرال. نحن نتحرك تسلسلياً الإبرة للمس بريجما وامدا وتعويض أي الإزاحة بين مرتفعات نقطتا عن إمالة الإطار ستيريوتاكسيك. وبالمثل، سوف يبين قياس الارتفاع في 1 مم من اليسار واليمين من بريجما أي إزاحة ميديولاتيرال، التي يمكن أن تعدل عن إمالة في الإطار الأيسر أو الأيمن. يزيح < 50 ميكرومتر يوصي بغرس أفضل النتائج.
اختيار تصميم المسبار جانب حاسم آخر. لدينا المحاكاة تشير إلى أن القدرة على عزل الأحداث المحلية ينخفض مع زيادة تباعد قطب كهربائي. أننا قد عزلت بنجاح أحداث التذبذب غاما المترجمة باستخدام المسابر السيليكون مع 25 و 100 ميكرومتر القطب تباعد و 250 و 400 ميكرون عرقوب تباعد11. هذه المقاييس وهكذا توفر نقطة انطلاق جيدة لتصميم التحقيق.
ونظرا للتكاليف العالية لتحقيقات السيليكون، إعادة الاستخدام المسابر تسجيل حاليا عاملاً مقيداً. تسمح الأساليب الموصوفة هنا في الرئيسية لتحقيق الانتعاش. بيد أننا فقط استرداد بنجاح المسبار بعد التسجيل في حالة واحدة، تشير إلى أن معدل نجاح هذا الإجراء منخفض جداً. وقد تشمل تحسين البروتوكول في المستقبل استخدام محركات الأقراص الصغيرة مصممة لتسهيل تحقيق الانتعاش18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن ممتنون كارين وينتيرهالتير و Semmler كرستين للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل مجموعة التميز برينلينكس-برينتولس (EXC 1086) مؤسسة البحوث الألمانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crocodile clamp with stand | Reichelt Elektronik | HALTER ZD-10D | |
| Silicon probe | Cambridge Neurotech | P-series 32 | |
| Stereoscope | Olympus | SZ51 | |
| Varnish-insulated copper wire | Bürklin Elektronik | 89 F 232 | |
| Ground screws | Screws & More GmbH (screwsandmore.de) | DIN 84 A2 M1x2 | |
| Flux | Stannol | 114018 | |
| Ceramic-tipped forceps | Fine Science Tools | 11210-60 | |
| Paraffine Wax | Sigma-Aldrich | 327204 | |
| Cauterizer | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Soldering iron | Kurtz Ersa | OIC1300 | |
| Multimeter | Uni-T | UT61C | |
| Ethanol | Carl Roth | 9065.1 | |
| Pasteur pipettes | Carl Roth | EA65.1 | |
| Heat sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 1900 | |
| Stereotaxic electrode holder | David Kopf | Model 1900 | |
| Isoflurane | Abbvie | B506 | |
| Oxygen concentrator | Respironix | 1020007 | |
| Buprenorphine | Indivior UK Limited | ||
| Electrical shaver | Tondeo | Eco-XS | |
| Heating pad | Thermolux | 463265/-67 | |
| Surgical clamps | Fine Science Tools | 18050-28 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Sterile cotton wipes | Carl Roth | EH12.1 | |
| Drill | Proxxon | Micromot 230/E | |
| 21G injection needle | B. Braun | 4657527 | |
| Phosphate buffer/phosphate buffered saline | |||
| Stereotaxic atlas | Elsevier | 9.78012E+12 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Surgical forceps | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| 27G injection needles | B. Braun | 4657705 | |
| Vaseline | |||
| Dental cement | Sun Medical | SuperBond T&M | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50mg/ml | |
| Recording amplifier | Intan Technologies | C3323 | |
| USB acquisition board | Intan Technologies | C3004 | |
| Recording cables | Intan Technologies | C3216 | |
| Electrical commutator | Doric lenses | HRJ-OE_FC_12_HARW | |
| Acquisition software | OpenEphys (www.open-ephys.org) | GUI | allows platform-independent data acquisition |
| Computer for data acquisition | |||
| Analysis environment | Python (www.python.org) | allows platform-independent data analysis | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | ||
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Microscope slides | Carl Roth | H868.1 | |
| Cover slips | Carl Roth | H878.2 | |
| Embedding medium | Sigma-Aldrich | 81381-50G | |
| Distilled water | Millipore | Milli Q | Table-top machine for the production of distilled water |
| Tergazyme | Alconox | Tergazyme |
References
- Buzsáki, G., Draguhn, A. Neuronal oscillations in cortical networks. Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).
- Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Benchenane, K., et al. Coherent theta oscillations and reorganization of spike timing in the hippocampal-prefrontal network upon learning. Neuron. 66 (6), 921-936 (2010).
- Jadhav, S. P., Kemere, C., German, P. W., Frank, L. M. Awake hippocampal sharp-wave ripples support spatial memory. Science. 336 (6087), 1454-1458 (2012).
- Yamamoto, J., Suh, J., Takeuchi, D., Tonegawa, S. Successful execution of working memory linked to synchronized high-frequency gamma oscillations. Cell. 157 (4), 845-857 (2014).
- Karalis, N., et al. 4-Hz oscillations synchronize prefrontal-amygdala circuits during fear behavior. Nature Neuroscience. 19 (4), 605-612 (2016).
- Khodagholy, D., Gelinas, J. N., Buzsáki, G. Learning-enhanced coupling between ripple oscillations in association cortices and hippocampus. Science. 358 (6361), 369-372 (2017).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Mitzdorf, U. Current source-density method and application in cat cerebral cortex: investigation of evoked potentials and EEG phenomena. Physiological Reviews. 65 (1), 37-100 (1985).
- Lasztóczi, B., Klausberger, T. Layer-specific GABAergic control of distinct gamma oscillations in the CA1 hippocampus. Neuron. 81 (5), 1126-1139 (2014).
- Strüber, M., Sauer, J. -F., Jonas, P., Bartos, M. Distance-dependent inhibition facilitates focality of gamma oscillations in the dentate gyrus. Nature Communications. 8 (1), 758 (2017).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press, Elsevier. (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Kajikawa, Y., Schroeder, C. E. How local is the local field potential? Neuron. 72 (5), 847-858 (2011).
- Berens, P., Keliris, G. A., Ecker, A. S., Logothetis, N. K., Tolias, A. S. Feature selectivity of the gamma-band of the local field potential in primate primary visual cortex. Frontiers in Neuroscience. 2 (2), 199-207 (2008).
- Lastóczi, B., Klausberger, T. Distinct gamma oscillations in the distal dendritic field of the dentate gyrus and the CA1 area of mouse hippocampus. Brain Structure and Function. 222 (7), 3355-3365 (2017).
- Nguyen Chi, V., Müller, C., Wolfenstetter, T., Yanovsky, Y., Draguhn, A., Tort, A. B. L., Brankačk, J. Hippocampal respiration-driven rhythm distinct from theta oscillations in awake mice. Journal of Neuroscience. 36 (1), 162-177 (2016).
- Chung, J., Sharif, F., Jung, D., Kim, S., Royer, S. Micro-drive and headgear for chronic implant and recovery of optoelectronic probes. Scientific Reports. 7 (1), 2773 (2017).
