Summary
Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.
Abstract
Bakteri, çeşitli bitki hastalıklarının en önemli etken ajanlarından biri efektör proteinler birtakım bitki bağışıklık sistemi yıkmak için ana bitki hücre salgılar. Enfeksiyon sırasında sitoplazmik effectors ana bilgisayar sitozol bir tip III salgı sistemi (T3SS) ile teslim edilir. Bitki hücre içine doğumdan sonra effector(s) ana hücre işlemleri için hayatta kalma ve çoğaltma patojenin modüle için belirli compartment(s) hedefler. Ortada olmasına rağmen biraz araştırma hücre altı yerelleştirme doğrudan enjekte bakterilerden effectors dinamikleri incelenmesi floresan proteinler, kullanarak patojenitesi içinde onların işlevini anlamak için ana bilgisayar hücrelerdeki efektör proteinlerin üzerinde T3SS ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk nedeniyle zor oldu.
Burada, konak hücre içinde bakteriyel T3SS üzerinden teslim effectors lokalizasyonu görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bölünmüş superfolder yeşil flüoresan protein sistemin (sfGFPOPT) bizim son yöntem açıklanmaktadır. SfGFP11 (11inci β-strand sfGFP)-tagged efektör T3SS salgılanan monte belirli organel hedef sfGFP1-10OPT (1-10th β-strand sfGFP) lideri ile floresan emisyon sitesinde için. Bu iletişim kuralı Sulandırılan sfGFP floresan sinyal Pseudomonas syringae Arabidopsis ve Nicotiana benthamiana tesislerinde belirli bir organel içinde bir efektör protein ile görselleştirmek için bir yordam sağlar.
Introduction
Bitkilerin bakteri, mantar, virüs, böcekler ve onların yaşam döngüsü boyunca nematodlar dahil olmak üzere çok sayıda işgal patojenler karşılaşma sesil organizmalardır. Phytopathogens arasında Pseudomonas spp. ve Ralstonia spp., gibi gram-negatif bakteriyel patojenlere bulaştırmak onların ana bitkiler yaralar veya stoma bantlı ve hydathode gibi doğal açıklıklar üzerinden girerek1. Başarılı bir şekilde ev sahibi bitkiler kolonize etmek bakteriyel patojenler virülans faktörleri2çeşitli geliştirmek için evrim geçirmiş. Ana bitki bakteri istila zaman onlar bir dizi virülans protein enjekte — effectors bilinen — onların patojenitesi tanıtmak için doğrudan bitki hücreleri içine. Bu effectors bastırmak veya bitki doğuştan gelen bağışıklık modüle ve bakteriyel hayatta kalma3' neden için ana hücresel işlemleri işlemek.
Patojen bakteriler bir T3SS efektör proteinler doğrudan ana hücreleri4sunmak için esas olarak kullanın. T3SS moleküler bir şırınga bir iskele protein yapısından iç ve dış bakteriyel membranlar arasında konak hücre5enjeksiyon sitesine bağlanma bir iğne gibi kanal ile benzer. Bu T3SS-aracılı efektör (T3E) salgılanması çeşitli Ayagin Gram-negatif bakteri patojenlerin bitki iyi korunmuş gibi insan mekanizmasıdır. Bir temsilci bitki patojenleri, P. syringae pv. Domates Genellikle hatalı bir T3SS vardır DC3000 hrcC mutant tamamen bitki bağışıklık (tarafından efektör protein enjekte)6bastırmak için bu mutant yetersizlik nedeniyle büyük olasılıkla bitkilerde büyüme sınırlı. Konak hücre içine translocation effectors bitki savunma yanıt, Gen transkripsiyonu, hücre ölümü, proteasome, vezikül kaçakçılığı ve hormon yolları7 de dahil olmak üzere ana hücre sistemi için önemlidir çeşitli ana bilgisayar proteinlerin hedef. , 8 , 9 , 10. bu nedenle, ana bilgisayar hücrelerdeki efektör proteinlerin hücresel yerelleştirme izleme işlevlerini bitki bağışıklık modülasyonu ile ilgili anlamak için çekici bir hedeftir.
T3Es yerelleştirme çalışmaların en aracılı Agrobacterium -overexpression ana bitki9büyük floresans protein ile istihdam. Ancak, diğer türler tanıttı genler için kapaklı ifade yöntemi yanlış lokalize ya da zaman zaman işlevsel11,12,13olmak gösterilmiştir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda bakteriyel effectors uygun ana hücreleri14' te,15,16,17hedefleme için değişiklik tabi ortaya koydu. Bu nedenle, geçici effectors hücreleri üzerine patojen bulaşma18T3SS tarafından teslim effectors için işlevsel olarak veya kantitatif aynı olmayabilir bitki sitozol içinde dile getirdi. Ayrıca, efektör proteinler için büyük floresan Etiketler füzyon uygun efektör teslim ve görselleştirme18,19bozabilir. Bu nedenle, bu yaklaşımlardan T3E işlevi tahlil T3SS salgılanan effectors yerli lokalizasyonu tam olarak yansıtmıyor olabilir.
Yeşil flüoresan protein (GFP) bir 11 iplikli β-chromophore20içerir bir merkez strand kapsayan varil oluşur. Waldo vd. küçük bir parçası oluşan bir roman split-GFP sistem bildirdi (GFP β strand 11; GFP11) ve büyük bir tamamlayıcı parçası (GFP β strand 1-10; GFP1-10)21. Parçaları kendileri tarafından belli değil ama her iki parçaları birbirleri ile yakın olduğunda kendini onların dernek bulabilsem. Protein katlama verimliliği optimizasyonu için sağlam katlama türevleri GFP, yani, sfGFP ve sfGFPOPT, daha sonra için split GFP sistem20,21,22geliştirilmiştir. Son zamanlarda, değişik-bir sfGFP11 parçası ve gösteri sarı ve mavi floresan ile sırasıyla yeniden oluşturmak, oluşturulan23 olduğunu sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT ve sfCFP1-10OPT- in tek amino asit mutasyona uğramış . Ayrıca, sfCherry, mCherry, bir türevi bölebilirsiniz aynı şekilde sfGFP23olarak sfCherry1-10 ve sfCherry11 parçalara.
Bu sistem etiket ve Salmonella24. effectors kullanarak enfeksiyon sırasında T3SS effectors HeLa hücreleri içinde izlemek için adapte edilmiş Ancak, bu daha önce ana bitki-bakteriyel pathogen sistemi için optimize edildi değil. Son zamanlarda, bitki hücreleri25 P. syringae teslim T3Es hücre altı lokalizasyonu izlemek için geliştirilmiş sfGFP1-10OPT dayalı split GFP sistemi optimize. T3Es bitki hücrelerinde, transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi farklı hücre altı bölmeleri için yerelleştirme çalışmaları kolaylaştırmak için bitkiler sfGFP1-10OPT çeşitli hücre altı bölmeleri ifade etmek için oluşturulan 25. Ayrıca, çeşitli taşıyan plazmidlerin organel sfGFP1-10OPT için Agrobacteriumhedefli-aracılı geçici overexpression ve T3SS tabanlı efektör teslimat için sfGFP11 öğesini vektörler da oluşturmak. Çeşitli transgenik Arabidopsis satırları ve T3Es ilgi ifade etmek için plazmid tohumları Malzemeler tablo26,27' belirtilen kaynaklardan elde edilebilir.
Aşağıdaki iletişim kuralında, split sfGFP sistemi kullanarak konak hücreleri bakteri tarafından teslim effectors dinamikleri izlemek için en iyi duruma getirilmiş bir sistemi açıklanmaktadır. Enfeksiyon sfGFP1-10OPT transgenik Pseudomonas rekombinant sfGFP11 plazmid taşıyan ile ifade bitkilerin sfGFP11 öğesini efektör teslimini Pseudomonas üzerinden ana hücre içine sonuçlanır. Sonuç olarak, bu proteinler yeniden ve belirli efektör hedef compartment(s) için translocate. Pseudomonas syringae pv. domates CUCPB5500 gerilim içinde 18 effectors silinir, bu zorlanma A. thaliana ve i. benthamianas28yılında düşük veya hiç hücre ölümü öğrettin kullanıldı. Ancak, tüm malzemeler ve burada açıklanan adımları değiştirilmesi veya diğer biyolojik sorular veya optimizasyonu belirli laboratuvar koşullarında soruşturma için split sfGFP sistemi adapte değiştirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aksi belirtilmedikçe oda sıcaklığında tüm adımlar gerçekleştirilir.
1. bitki malzemeleri (4 hafta) hazırlanması
- İ. benthamiana bitkiler için hazırlık
- İ. benthamiana 2 tohumları üzerinde her pot toprak yüzeyine ekmek, plastik bir kubbe ile tepsi kapsar ve tohumları bir 25 ° C'de % 60 nem oranı büyüme odası 16/8-h açık/koyu photoperiod döngüsü ile çimlenme için olanak sağlar.
- İki hafta sonra dışarı almak ve her pot küçük fide atın ve çimlenme adım 1.1.1 için uygulanan bitkiler aynı büyüme koşullar altında büyümeye devam. İki günde 1 litre su tepsisi başına ekleyin.
Not: Bitkiler büyüme koşullarını labs arasında değişebilir. Bu nedenle, bitki sağlıklı koşuldaki büyümek için düzenli sulama iletişim kurallarını izleyin. - Bir hafta içinde bitkiler yeni bir tepsiye aktarın ve onlara daha fazla büyüme için yeterli alan ile düzenlemek. 4 haftalık sızmış hazır olana 1.1.1. adımda açıklanan koşullar altında bitkiler büyüyor.
Not: Bitki büyüme labs arasında büyüme durumuna bağlı olarak farklı olabilir. Genellikle, bu 4-hafta-yaşlı bulmak i. benthamiana bitkiler ayı yaklaşık altı yaprakları.
- A. thaliana transgenik bitkiler için hazırlık
- Tablo malzemeler için başvurmak ve transgenik Arabidopsis tohum sipariş.
- ~ 50-100 transgenik Arabidopsis tohumlar 1 mL distile su emmek ve çimlenme başlangıcı eşitlemek için karanlıkta 3 gündür 4 ° C'de depolayabilirsiniz.
- Bir fiş bitki tepsi toprak yüzeyinde ~ 2-3 tohumları ekmek ve tepsiyi plastik bir kubbe ile kaplayın. Tohumları 23 ° c, % 60 nem 10/14-h açık/koyu photoperiod döngüsü ile çimlenme için izin.
Not: Tohumlar homozygotes olmalıdır. Ancak, toplu iş transgene varlığı reconfirming öneririz. Bu durumda, tohum % 70 etanol için 2 dk, % 50 çamaşır suyu ile yıkayarak sterilize (yaklaşık % 2 hipoklorit) % 0.05 içeren triton X-100 5 dakika süreyle takip steril Çift Kişilik distile su ile (GKD2O) 5 - 6 kez yıkayarak. Sterilizasyon sonra 4 ° C'de 3 gün boyunca tabakalaşmak ve onları transgenik bitkiler seçmek için hygromycin B 25 µg/L içeren bitki çimlenmesi medyada plakası. - Bir hafta sonra Tak başına yalnızca bir bitki bırak ve büyüyen bitkiler için adım 1.2.3 kullanılan aynı büyüme koşullar altında devam.
Not: 4-hafta-yaşlı bitkilerin P. syringae enfeksiyonu için kullanılmıştır. Bitki bitkiler sağlıklı tutmak için her geçen gün su.
2. Pseudomonas Kültür (~ 1 hafta) hazırlanması
- Plazmid Pseudomonas dönüşüm inşaatı
- Tablo malzemeler için başvurmak ve istenen vector(s) T3SS tabanlı efektör iletim sistemi vektör25sipariş.
- İlgi efektör gen25klonlama siteye özgü rekombinasyon kullanarak efektör teslimat vektör yerleştirin.
Not: tam uzunlukta efektör proteinin hücre altı yerelleştirme izlerken, pBK-GW-1-2 veya pBG-GW-1-2 tam uzunlukta gen içine koymak. PBK-GW-1-4 seçmek mümkündür veya pBG-GW-1-4 içeren 2 floresan sinyal x sfGFP11 için arttı. Kısmi bir efektör sinyal peptid eksik olması durumunda, pBK-GW-2-2 veya pBK-GW-2-4 kullanın. Park et al. efektör teslim vektörel çizimler25hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız.
- SfGFP11 etiketi P. syringae pv için erimiş bir efektör taşıyan plazmid dönüşümü. Domates (Pst) CUCPB5500 standart Elektroporasyon29kullanarak.
Not: Diğer Pseudomonas suşlarının gerekirse kullanılabilir. SfGFP11 etiket sistemi vektörel çizimler30 geniş bir yelpazesi için inşa edilmiştir ve efektör gen ekspresyonu ile Örneğin, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31karşılaştırılabilir AvrRpm1 düzenleyici tarafından düzenlenmiştir. - Dönüştürülmüş bakteri hücreleri Kral'ın B ağar kaplamalar 100 µg/mL rifampisin ve 25 µg/mL sefaloridin veya 25 µg/mL viomisin içeren yüzey üzerinde yavaşça yayıldı. 28 ° C de 2 gün kuluçkaya.
- Kral'ın B sıvı medya kullanılan vektör için uygun antibiyotiklerle içine bir koloni aşılamak ve 200 devir / dakikada sallayarak ile gecede 28 ° C'de hücrelerin büyümesine.
- Gliserol hazır olun. Autoclaved gliserol % 50 ve mağaza-80 ° C'de son bir konsantrasyon ekleyin
3. geçici ifade organel hedefli sfGFP1-10OPT i. benthamiana (4 gün) içinde
- Agrobacterium kültür hazırlanması
- Sipariş ( Tablo malzemeleriçin başvurmak) sfGFP1-10OPT plasmid(s) organel hedefli istenen vector(s).
- Plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens zorlanma GV3101 hücreleri32dönüşümü. Luria-Bertani (LB) agar orta 50 µg/mL sefaloridin ve 28 ° c 50 µg/mL rifampisin ile 2 gün boyunca takıma sayfasındaki hücreleri büyümek.
- LB agar ortamdaki bir tek koloni, 5 mL sıvı LB medya 50 µg/mL sefaloridin ve 50 µg/mL rifampisin ile de içine hücreleri aşılamak. 200 devir / dakikada sallayarak ile gecede 28 ° C'de hücrelerin büyümesine.
- Hücreler tarafından Santrifüjü 3000 x g 10 dakika süreyle de süpernatant basına dökün ve pelet 1 mL taze resuspend hasat sızma arabellek yaptı.
- Bir absorbans 600 optik yoğunluk (OD) değerinde elde ederek Agrobacterium miktarını ölçmek nm (Abs 600 nm). 0,5 ile infiltrasyon arabellek için bakterilerin aşırı doz600 ayarlayın.
Not: 1 mL süspansiyon konusunda iki noktalar sızmak için yeterlidir. - Kültür oda sıcaklığında 1-5 h önce infiltrasyon için nazik bir rocker açık bırak.
- 10 µL bahşiş sızmış yaprakları ortasına içine bir delik poke. 1 mL needleless şırınga Agrobacterium süspansiyonlar sızmak için kullanın. Dikkatli ve yavaş adım 3.1.5 yaprak adaxial yan içine şırınga ile hazırlanan süspansiyonlar yaklaşık 500 µL enjekte et. İnfiltrasyon en az üç farklı bitkiler üzerinde deneysel çoğaltır için yineleyin.
Not: sağlık ve güvenlik nedeniyle, infiltrasyon sırasında göz koruma giyilmelidir. - Yaprakların üzerine kalan bakteri süspansiyon yok etmek ve infiltre bölge kenarlığını işaretleyin.
- 2 gün boyunca adım 1.1.1 için kullanılan aynı büyüme koşullar altında infiltre bitkiler tutun.
4. aşı Pseudomonas (4 gün)
- Çizgi dönüştürülmüş Pseudomonas soy adım 2.5 Kral'ın B agar medya 2 gün 28 ° C'de uygun antibiyotiklerle gliserol stoktan.
Not: Pseudomonas sağlık çok önemlidir. Kolonilere de oluşturmuyorsa, hücreleri tekrar çizgi veya devam etmeden önce Kral'ın sıvı medya hücrelerde yaymak. - Bir loopful için bir gecede 200 devir / dakikada sallayarak ile Mannitol-glutamat (MG) sıvı ortamları 28 ° C'de Pseudomonas hücrelerinin aşılamak.
- Hücreler tarafından Santrifüjü 3000 x g 10 dakika süreyle de süpernatant basına dökün hasat Pelet 10 mM MgCl2resuspend ve i. benthamiana yaprakları için ve 0,002 (1 x 106 için 0,02 (1 x 107 cfu/mL) OD600 uyum CFU/mL) Arabidopsis yaprakları için.
- İ. benthamianaiçin Pseudomonas süspansiyon yaprak alanına nerede sfGFP1-10OPT yapı taşıyan Agrobacterium 2 gün önceden (olduğu gibi adım 3.1.7) sızmış sızmak. SfGFP1-10OPT transgenik Arabidopsisiçin Pseudomonas süspansiyon iki 4-hafta-yaşlı kısa gün yetiştirilen yaprakları sızmak.
Not: en az üç bitki için deneysel çoğaltır ihtiyaç vardır.
5. sfGFP Confocal mikroskobu (1 gün) üzerinden sinyal gözlenmesi
- Yaprak disk Pseudomonaskesmek-aşılamaya yaprakları. Pseudomonasinfiltrasyonu sonra zaman belirli noktalarda, 40 X ile confocal sistem tarama bir lazer kullanarak tek bitki iki 2-cm2 yaprak diskleri görüntü / 1.2 NA C-Apochromat su daldırma amaç veya 63 X / 0.8 NA C-Apochromat petrol daldırma amaç. Ölü hücreleri tarafından yaralama öldürdü önlemek için hücre infiltrasyonu delik uzak gözlemlemek.
- 488-nm argon lazer bir düşük güç ayarı, gözlem başlatın. SfGFP tespit etmek için lazer gücünü arttırın.
Not: Biz genellikle lazer yoğunluğunun % 2-15 floresans sinyali algılamak için kullanır. Ancak, lazer güç ve algılama ayarı kullanıcının mikroskobu sistemine bağlı ayarlanmalıdır. Burada, emisyon filtreleri 520-550 nm için ayarlanmış. Ölü hücreleri kez auto-floresan 488-nm lazer uyarma altında yayarlar. Bu nedenle, bir negatif kontrol sfGFP11 etiketi olmadan aynı efektör sızmış olmalı ve aynı gözlem şartlar altında görülmektedir. Buna ek olarak, yüksek lazer uyarma klorofil autofluorescence tetikleyebilir. Bu nedenle, olarak değil klorofil autofluorescence ikna etmek için kontrol bitki hücreleri kullanarak lazer yoğunluğunu ayarlayın.- Bir hücre duvarına counterstaining için 20 mM propidium iyodür (PI) 5-10 dk önce gözlem yaprak disk içine sızmak.
- Boyama çekirdeği için yaprak diskler % 0,1 paraformaldehyde 5 dk su ile yıkayarak takip için içine daldırın. O zaman, 10 mM PI 5-10 dk önce mikroskobik gözlem yaprak disk içine sızmak. Deneyler en az üç kez tekrarlayın.
Not: Bu adım kritik olmakla effektör yerelleştirme plazma zarı veya çekirdek tanımlamak yararlı değildir. Effectors ilgi belirli bir organel içinde onların yerelleştirme ise, verilen organel avans efektör lokalizasyonu onaylamak için kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP β-varil yapısını ve onbir β iplikçikleri oluşur iki parçaları, 1-10th iplikçik (GFP1-10OPT) ve 11inci (GFP11) strand ayrılır. İki parçaları yakın (Şekil 1A) bulunduğunda iki parçaları kendileri tarafından floresan hiçbiri rağmen kendi kendine monte sfGFP floresan yayarlar olabilir. Bu sistemde, sfGFP1-10OPT- Arabidopsis veya i. benthamiana ifade bitkiler öğesini sfGFP11 efektör taşıyan Pseudomonas ile aşılanmış. Konak hücre sitozol Pseudomonas tarafından teslim öğesini sfGFP11 efektör sitozol içinde ifade sfGFP1-10OPT için yeniden düzenlendi ve sonra birlikte hedef yuvası (Şekil 1B) içine translocate. Şekil 2 bitki malzeme ve Pst hazırlanması algılama bitki hücresinde floresans sinyalinin üzerinden genel yordamı temsil eder.
Bizim Yöntem örneği, P. syringae efektör protein, AvrB, ana bitki hücreleri ayrıntılı T3SS enfeksiyon sırasında teslim edilen kullandık. Arabidopsisiçinde AvrB ilgili bir direnç protein, RPM1 ve Tetikleyiciler bağışıklık yanıtı aşırı duyarlı hücre ölüm33dahil olmak üzere tarafından kabul edilmektedir. Önceki çalışmada, AvrB ve RPM1 bitki hücre33,34,35plazma zarı içinde lokalize GFP muhabir tahlil ve biyokimyasal tahlil ortaya koydu. Bizim yöntemini kullanarak AvrB lokalizasyonu incelemek için CYTO sfGFP1-10OPT gen yataklık Agrobacterium i. benthamianaiçinde sızmış. İki gün içinde Pseudomonas AvrB sfGFP11 dönüştürülmüş hücrelerin Agrobacteriumaşılanmış-bölge sızmış. Çıkarılan sfGFP floresan sinyallerini gözlendi Pst CUCPB5500 AvrB-sfGFP11 plazma zarı (Şekil 3B) içeren. Buna ek olarak, hiçbir sinyalleri yerli AvrB (Şekil 3A) taşıyan virüslü hücreye Pst tarafından bulundu.
Şekil 1. En iyi duruma getirilmiş split GFP sistemi. (A)GFP β-varil yapısını onbir β-tellerinin yapılır ve 1-10th β-strand (GFP1-10) ve 11inci β-strand (GFP11) bölebilirsiniz. (B) sfGFP11 strand AvrB için erimiş ve Pseudomonasdönüştürülmüş bu yöntemde, sfGFP1-10OPT parçaları bitki hücrelerinde ifade edildi. Yalnızca sfGFP11 içeren Pseudomonas tarafından enfekte bitkiler hücre sfGFP Floresan (nerede efektör yerelleştirir) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Yordamı bakış. Transgenik Arabidopsis veya sfGFP1-10OPT- i. benthamiana sızmış bitki Pst CUCPB5500 ile enfekte sfGFP11 öğesini efektör şırınga infiltrasyon yoluyla taşıma. Monte sfGFP floresan confocal mikroskobu sistemi efektör yerelleştirme yerinde tespit edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. İ. benthamiana AvrB-sfGFP algılama bırakır 3 h enfeksiyon sonra. Pst CUCPB5500 sfGFP11 öğesini AvrB gene 5inci veya hangi sfGFP1-10OPT 2 gün önceden taşıyan Agrobacterium tarafından infiltre i. benthamiana, 6inci yaprak infiltre yataklık. Hücre duvarı propidium iyodür tarafından lekeli. SfGFP1-10 OPT salt AvrB ile ifade hücreleri ise herhangi bir floresan sinyal(a)gösterme. GFP sinyalleri (sarı ok) enfekte hücreleri 3 h sonrası infiltrasyon (B), AvrB-sfGFP11 gen içeren Pst tarafından tespit edildi. Bu sonuç tek AvrB-sfGFP11, yok AvrB, sfGFP1-10OPT sitozol, ile yeniden düzenlendi ve sonra birleştirilmiş sfGFP plazma zarı translocated temsil eder. Pembe sözde renk hücre duvarı ve klorofil autofluorescence temsil eder. Yeşil monte sfGFP floresan temsil eder. Ölçek çubukları 40 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol ana bilgisayar bitki hücre üzerine enfeksiyon Bakteriyel T3SS tarafından enjekte efektör proteinlerin doğru yerelleştirme izlenmesi için kullanılır. Daha önce split GFP sistemi bir araç olarak hücre altı yerelleştirme memeli proteinler23,36, Salmonella T3E yerelleştirme ve Agrobacterium VirE2 teslim T4SS ile çalışmak için kullanılan bitki hücreleri37. Bitki hücreleri bu sistemi uygulamak için yapısal sitoplazmik GFP1-10 ve transgenik mantarlar, ifade bir transgenik Mısır tesisi GFP11 öğesini efektör protein ifade eden Ustilago maydis, önceki çalışmalarda kullanılan. Ancak, Mısır -U. maydis sistem translocated efektör proteinlerin ifade düzeyleri zayıf olduğunu ve arka plan autofluorescence yüksek düzeyde Sulandırılan GFP sinyal38tespiti engelledi çünkü başarılı olmamıştır. Bu sorunu çözmek için biz bir sfGFP1-10 kullanılan çözünürlük ve floresan yoğunluğu21,22önemli ölçüde artıran değişken, sfGFP1-10OPT,.
Bölünmüş sfGFP sisteminin avantajları rağmen efektör yerelleştirme ve dinamikleri çalışma için bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, gözlenen Sulandırılan sfGFP floresan sinyal nispeten zayıftır. Bu küçük bir miktar doğrudan P. syringaeteslim efektör moleküllerin nedeniyle olabilir. Bu zayıf sinyal multimerizing sfGFP11 etiketi kullanarak gelişmiş olabilir. 2 x sfGFP11 etiketi taşıyan vektörel çizimler de Malzemeleri tablodalistelenen kaynaklardan mevcuttur. İkinci olarak, sitozolik sfGFP1-10 OPT Golgi, ER ve Plastit25yönelik sfGFP11 ile yeniden başarısız oldu. SfGFP11 mitokondri hedefli ve sitozolik sfGFP1-10OPT Co ifadesi sitozol ve çekirdek25için yeniden oluşturulmuş sfGFP mislocalization içinde sonuçlandı. Bu nedenle, faiz efektör lokalizasyonu uygun organel hedefli sfGFP1-10OPTuygulayarak yeniden doğrulanması. Herhangi bir GFP sinyal enfekte hücrelerde sitozolik sfGFP1-10OPTifade değil algıladığında, Golgi, ER, ifade i. benth kullanmanızı öneririz ve sfGFP1-10OPT veya hedef karşılık gelen organel kullanarak Plastit hedef sfGFP1-10OPT transgenik Arabidopsis25.
Bu yöntem effectors ana bitkiler25zamansal ve mekansal dinamiklerini incelemek için yararlı bir araç olarak split floresan protein sistemi kullanımı gösterilmiştir. Gelecekteki araştırma plazma zarı lokalize effectors dinamiklerinin ayrıntılı çalışmalar sağlayabilir tek molekül görüntüleme gelişmeler ele alınacak. Ayrıca, bakteriyel bir sistem kullanarak bir salgı tahlil mantar effectors lokalizasyonu eğitim için yararlı alternatif olabilir; effectors ve yüksek autofluorescence mantar penetrasyon sitesinde toplama engeller.
Bu unutulmamalıdır ki bu yöntemde bazı önemli noktalar vardır. İlk olarak, bitki malzeme ve bakteri sağlıklı ve taze olması gerekir. Görselleştirme efektör sinyal sağlamak için bitkilerden sfGFP1-10OPT ve Pseudomonas üzerinden sfGFP11 kuvvetle ifade edilmelidir. Bu nedenle, en uygun büyüme koşullar altında bitkiler büyümek ve çevresel stres gibi zararlıları onları korumak önemlidir. Ayrıca tüm bakteriler için infiltrasyon kullanılan 2 gün yetiştirilen hücreleri üzerine ağar kaplamalar ve gliserol hisse senedi alınması önerilmektedir. İkinci olarak, N. benthamiana, geçici ifade söz konusu olduğunda, organel hedefli sfGFP1-10OPT olgunlaşma için gereken sürenin uzunluğu her organel marker protein için farklı olabilir. Örneğin, PM-sfGFP1-10OPT olgunlaşma daha 48 h infiltrasyon sonra gerektirir. Son olarak, zaman nokta ve Sulandırılan sfGFP sinyalleri ifade düzeyde bazı deneysel koşullar en iyi duruma getirmek için gerekli efektör proteinler türüne bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu araştırma temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı, ICT ve etki alanı denetleyicisinin gelecekteki planlama (NMK-2018R1A2A1A05019892) ve () bitki moleküler ıslah merkezi bir hibe tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir PMBC) EP için Kırsal Kalkınma İdaresi (PJ013201) sonraki nesil Biogreen 21 programı Görüntüleme Merkezi Ulusal araçları merkezi filme confocal mikroskop sağlamak çevre yönetim için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidopsis transgenic lines | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfCherry1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml) |
| Bacterial strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml) | ||
| Media components | |||
| Plant germination media | Add 2.165g/L Murashige & Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve. | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | Store at 4 °C. |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| LB media | Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave. Allow solution to cool to 55 °C, and add antibiotic if needed. | ||
| Tryptone | BD Bioscience | 211705 | |
| Yeast extract | BD Bioscience | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | S0520 | |
| Micro agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B media | 10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K2HPO4, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 °C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO4 to the medium. Add antibiotics if needed. | ||
| Proteose peptone | BD Bioscience | 212120 | |
| Anhydrous K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 USP | |
| Glycerol | Duchefa Biochemie | G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Bioscience | 214010 | |
| Mannitol-Glutamate (MG) liquid media | Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH2PO4, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO4 to water. Adjust to pH 7 | ||
| Mannitol | Duchefa Biochemie | M0803 | |
| L-glutamic acid | Duchefa Biochemie | G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltration buffer | 10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 µM acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Prepare 100 mM stock in water. Autoclave. |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | Prepare 150 mM stock in DMSO. |
| Confocal microscope equipments/materials | |||
| 710 laser scanning confocal system | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss | ||
| Propidium iodide | ThermoFisher | P1304MP |
References
- Melotto, M., Underwood, W., He, S. Y. Role of stomata in plant innate immunity and foliar bacterial diseases. Annu Rev Phytopathol. 46, 101-122 (2008).
- Melotto, M., Underwood, W., Koczan, J., Nomura, K., He, S. Y. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell. 126 (5), 969-980 (2006).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annu Rev Phytopathol. 54, 419-441 (2016).
- Buttner, D. Behind the lines-actions of bacterial type III effector proteins in plant cells. FEMS Microbiol Rev. 40 (6), 894-937 (2016).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 4 (2013).
- Deng, W. L., Preston, G., Collmer, A., Chang, C. J., Huang, H. C. Characterization of the hrpC and hrpRS operons of Pseudomonas syringae pathovars syringae, tomato, and glycinea and analysis of the ability of hrpF, hrpG, hrcC, hrpT, and hrpV mutants to elicit the hypersensitive response and disease in plants. J Bacteriol. 180 (17), 4523-4531 (1998).
- Lewis, J. D., Guttman, D. S., Desveaux, D. The targeting of plant cellular systems by injected type III effector proteins. Semin Cell Dev Biol. 20 (9), 1055-1063 (2009).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopathol. 42, 385-414 (2004).
- Aung, K., Xin, X., Mecey, C., He, S. Y. Subcellular Localization of Pseudomonas syringae pv. tomato Effector Proteins in Plants. Methods Mol Biol. 1531, 141-153 (2017).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Bassham, D. C., Raikhel, N. V. Plant cells are not just green yeast. Plant Physiol. 122 (4), 999-1001 (2000).
- Courbot, M., et al. A major quantitative trait locus for cadmium tolerance in Arabidopsis halleri colocalizes with HMA4, a gene encoding a heavy metal ATPase. Plant Physiol. 144 (2), 1052-1065 (2007).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Boucrot, E., Beuzon, C. R., Holden, D. W., Gorvel, J. P., Meresse, S. Salmonella typhimurium SifA effector protein requires its membrane-anchoring C-terminal hexapeptide for its biological function. J Biol Chem. 278 (16), 14196-14202 (2003).
- Reinicke, A. T., et al. A Salmonella typhimurium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery. J Biol Chem. 280 (15), 14620-14627 (2005).
- Patel, J. C., Hueffer, K., Lam, T. T., Galan, J. E. Diversification of a Salmonella virulence protein function by ubiquitin-dependent differential localization. Cell. 137 (2), 283-294 (2009).
- Fernandez-Alvarez, A., et al. Identification of O-mannosylated virulence factors in Ustilago maydis. PLoS Pathog. 8 (3), e1002563 (2012).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Rigó, G., Ayaydin, F., Szabados, L., Koncz, C., Cséplô, Á Suspension protoplasts as useful experimental tool to study localization of GFP-tagged proteins in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the 9th Hungarian Congress on Plant Biology. 52 (1), 59 (2008).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Cabantous, S., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 23 (1), 102-107 (2005).
- Cabantous, S., et al. A new protein-protein interaction sensor based on tripartite split-GFP association. Sci Rep. 3, 2854 (2013).
- Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nat Commun. 7, 11046 (2016).
- Van Engelenburg, S. B., Palmer, A. E. Imaging type-III secretion reveals dynamics and spatial segregation of Salmonella effectors. Nat Methods. 7 (4), 325-330 (2010).
- Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D., Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017).
- Addgene. , Available from: https://www.addgene.org (2018).
- Arabidopsis Biological Resource Center. , Available from: https://abrc.osu.edu (2018).
- Kvitko, B. H., et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4), e1000388 (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
- Kovach, M. E., et al. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 166 (1), 175-176 (1995).
- Upadhyaya, N. M., et al. A bacterial type III secretion assay for delivery of fungal effector proteins into wheat. Mol Plant Microbe Interact. 27 (3), 255-264 (2014).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH Protoc. 2006 (7), (2006).
- Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).
- Nimchuk, Z., et al. Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae. Cell. 101 (4), 353-363 (2000).
- Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).
- Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).
- Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells. Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).
- Tanaka, S., et al. Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem. Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).
