Summary
Anche se molti insetti in sottordine Heteroptera (Insecta: Hemiptera) sono velenoso, loro composizione del veleno e le funzioni delle loro tossine del veleno sono per lo più sconosciute. Questo protocollo descrive i metodi per la raccolta heteropteran veleni per ulteriore caratterizzazione, mediante elettrostimolazione, molestie e dissezione della ghiandola.
Abstract
Heteropteran insetti ad esempio assassin bug (Reduviidae) e insetti giganti di acqua (Belostomatidae) discendono da un antenato comune selvatiche e velenoso, e la maggior parte dei heteropterans esistenti conserva questa strategia trofica. Alcuni heteropterans hanno effettuato la transizione a nutrire il sangue dei vertebrati (ad esempio i bug baciare, eziologico; e cimici, Cimicidae) mentre gli altri sono ritornati all'alimentazione sulle piante (la maggior parte Pentatomomorpha). Tuttavia, con l'eccezione della saliva utilizzata da kissing bugs per facilitare l'alimentazione di sangue, poco è conosciuta circa i veleni di heteropteran rispetto ai veleni di ragni, scorpioni e serpenti.
Un ostacolo alla caratterizzazione delle tossine del veleno di heteropteran è la struttura e la funzione delle ghiandole labiali/veleno, che sono entrambi morfologicamente complessa e svolgere più ruoli biologici (difesa, cattura di prede e digestione extra-orale). In questo articolo, descriviamo tre metodi che abbiamo usato con successo per raccogliere heteropteran veleni. In primo luogo, vi presentiamo l'elettrostimolazione come un modo pratico per raccogliere il veleno che è spesso letale quando iniettato in preda di animali, e che previene la contaminazione di tessuto ghiandolare. In secondo luogo, indichiamo che dolce molestie degli animali sono sufficiente a produrre estrusione di veleno dalla proboscide e/o veleno sputare in alcuni gruppi di heteropterans. In terzo luogo, descriviamo i metodi per raccogliere le tossine veleno tramite la dissezione di animali anestetizzati per ottenere le ghiandole velenifere. Questo metodo è complementare ad altri metodi, come può consentire la raccolta delle tossine da taxa in cui l'elettrostimolazione e molestie sono inefficaci. Questi protocolli permetterà ai ricercatori di raccogliere le tossine da insetti di heteropteran per la caratterizzazione di struttura-funzione e possibili applicazioni in medicina e agricoltura.
Introduction
Heteropteran veleni sono sostanze bioattive potentemente1. Ad esempio, le secrezioni di veleno/saliva di sangue-alimentazione Heteroptera come kissing bugs (eziologico) e cimici (Cimicidae) facilita l'alimentazione interrompendo l'emostasi2. Tossine in questi veleni bersaglio vie multiple compreso coagulazione, aggregazione piastrinica e vasocostrizione, come pure il dolore e prurito vie. Veleni dalla maggior parte delle altre specie di heteropteran sono adattati per facilitare la predazione, piuttosto che sangue-alimentazione. Loro veleni causano paralisi, morte e liquefazione del tessuto quando iniettato in invertebrati3,4. Quando iniettato in vertebrati, il loro veleno può anche avere effetti drastici. Ad esempio, l'iniezione di veleno dal assassin bug Holotrichius interno nei vertebrati provoca dolore, paralisi del muscolo e l'emorragia; topi envenomated da questo bug muoiono rapidamente a causa di paralisi respiratoria5.
Trascrittomica e proteomica hanno rivelato la composizione proteica di alcuni veleni di heteropteran. Veleni di specie selvatiche sono ricchi di proteasi, altri enzimi e peptidi e proteine di struttura sconosciuta e funzione6,7,8. Bug baciare veleno è ricca di famiglia delle proteine triabin, i cui membri influenzano profondamente la coagulazione, l'aggregazione piastrinica e vasocostrizione2,9. Tuttavia, non è noto quali tossine sono alla base della maggior parte bioattività di veleno. Ad esempio, il veleno del bug baciare Triatoma infestans è stata segnalata per essere analgesico ed inibire i canali di sodio10, ma i componenti responsabili restano delucidare. Allo stesso modo, non è noto quali componenti di assassin bug veleno causano paralisi o dolore. Un prerequisito per l'identificazione le tossine responsabili bioattività particolare veleno e per la caratterizzazione di struttura e funzione delle tossine veleno romanzo, è l'ottenimento di veleno.
Veleno è stata ottenuta da heteropterans da elettrostimolazione5,6,7,8,11,12,13, provocazione di difensivo le risposte4,8, meccanicamente comprimendo il torace12,14,15,16, dissezione veleno ghiandole8,17 ,18,19,20,21,22e applicazione di agonisti del recettore muscarinico23. A giudicare i potenziali vantaggi e gli svantaggi di ogni metodo è complicata dalla morfologia delle ghiandole velenifere heteropteran, che consistono di una ghiandola principale con due separati lumen, la ghiandola principale anteriore (AMG) e la ghiandola principale posteriore (PMG), nonché un associato ghiandola accessoria (AG). Questi scomparti di diverse ghiandole producono secrezioni proteiche diverse, che possono essere specializzate per le diverse funzioni biologiche tra cui la cattura di prede, difesa e digestione extra-orale8,17. In peiratine ed ectrichodiine assassin bug, la AMG è stata associata con la cattura di prede e il PMG con digestione extra-orale17. Tuttavia, nel harpactorine bug Pristhesancus plagipennis PMG è specializzata per la cattura di prede e digestione mentre la AMG è supposto a secernere veleno difensivo8. L'AG è stato descritto come avendo poco funzione secretiva in assassin bug8 o come un importante sito di stoccaggio di proteasi in insetti giganti acqua23. Chiaramente, ulteriore lavoro è necessario per chiarire la funzione di ciascun comparto di ghiandola tra vari sottogruppi di heteropteran e per determinare la funzione della maggior parte delle tossine del veleno. In questo rapporto descriviamo i protocolli per la raccolta le tossine veleno da heteropterans verso questo obiettivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questo protocollo conforme alle politiche di The University of Queensland enunciati in Responsible Care e utilizzare degli animali nell'insegnamento e nella ricerca (PPL 4.20.11) così come il National Health e Medical Research Council codice australiano per la cura e uso di animali per fini scientifici (8th edizione 2013).
Attenzione: fare attenzione a non per essere envenomated quando si gestisce assassin bug. Fare attenzione a proteggere gli occhi quando si maneggia la specie che sputare veleno sulla difensiva. Prendersi cura in tutto di non ferire gli animali sperimentali. Questo include il monitoraggio della pressione sulle restrizioni come elastici e garantendo che la proboscide non è rotta.
Nota: Facoltativamente, anestetizzare gli animali tramite l'esposizione al CO2 per 0,5-2 min o raffreddamento a 4-10 ° C prima della raccolta di veleno mira 1-3 per facilitare il trasferimento sicuro e fermo. Anestetizzazione non è strettamente necessaria, ma può facilitare sicuro contenimento degli esemplari agili o forti. Tuttavia, gli animali devono essere svegli per consentire la raccolta di veleno. Mantenere le applicazioni a valle in mente quando si decide o meno di aggiungere gli inibitori della proteasi.
1. tossine veleno da elettrostimolazione di raccolta
- Ottenere esemplari vivi da cui raccogliere le tossine.
- Pinzette di plastica pre-preparate di uso con elettrodi positivi e negativi montato su qualsiasi suggerimento. Connettersi elettrificate pinzette un elettrostimolatore o una fonte di tensione costante che permette la regolazione della tensione.
- Per le piccole (~ 10 mm) e grandi (circa 25 mm) assassin bug, utilizzare tensioni di picco di 15 e 25 V rispettivamente.
- Per heteropterans più grandi come insetti giganti di acqua, utilizzare fino a 40 V.
- Trattenere gli insetti vivi di reggiatura li a una piattaforma, utilizzando un nastro di gomma sopra il torace.
- Posizionare la punta della proboscide in una punta di raccolta adatta. Per assassin bug, usare una punta di pipetta P200. Per insetti giganti di acqua, tagliare l'estremità fuori una punta di P200 per aumentare la dimensione dell'apertura.
- Sollevare la proboscide con un paio di pinzette pulite chiusi delicatamente e spingere il diaframma aperto della collezione punta sopra l'estremità della proboscide.
- Se lo si desidera, prima di mettere la proboscide nella raccolta dell'acqua ultrapura assorbimento ~ 5 µ l suggerimento. Questo riduce le perdite di veleno rimanendo all'interno della punta, anche se il veleno raccolto sarà diluito.
- Applicare l'elettrostimolazione. Immergere gli elettrodi stimolanti in gel conduttivo, come glicerolo NaCl/50% 2,5 M. Applicare gli elettrodi al torace. Per belostomatids, applicare i due elettrodi di superficie dorsale posteriore della testa.
- Memorizzare il veleno per evitare autodegradation. Dopo veleno viene estruso, rapidamente di trasferirla a un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.
- Ripetere i passaggi 1.5 e 1.6 è acquisito sufficiente veleno o nessun ulteriore veleno è imminente.
2. raccolta delle tossine veleno da molestie
- Preparare gli animali per la raccolta del veleno e posizionare la punta della proboscide in un vestibolo di collezione, come descritto nei paragrafi 1.1 e 1.3-1.4.
- Se il veleno viene estruso spontaneamente, passare al punto 2.3. In caso contrario, molestare gli animali toccandola delicatamente sulle gambe, addome e antenne con pinzette fino a quando il veleno è prodotto.
- Trasferire rapidamente il veleno in una provetta a-20 ° C o da-60 ° C o un inibitore della proteasi che contengono tubo cocktail, se lo si desidera.
3. raccolta delle tossine veleno da molestie da Venom "Sputare" specie
- Anestetizzare, o anestetizzare parzialmente, l'insetto prima di rimuoverla dal suo alloggiamento per prevenire qualsiasi prematuro sputare sulla difensiva.
- Provocare il comportamento di sputare veleno. Contenere e riposizionare l'insetto con il coperchio profondo della standard 90 x 16mm di Petri. Tenere il coperchio leggermente posteriore e 1-4 cm sopra l'insetto per impedire il volo. Maggior parte degli insetti sputerà spesso parecchie volte, in rapida successione. Garantire che tutti i venom sono raccolti sul lato inferiore del piatto.
- Raccogliere il veleno sulla parte inferiore del piatto Petri risciacquando con 10 µ l di acqua ultrapura. Rapidamente di trasferirlo in un tubo a-20 ° C o da-60 ° C, o un tubo contenente cocktail inibitore della proteasi.
4. raccolta Venom tossine tramite la dissezione della ghiandola
- Sacrificare gli animali. Pesantemente anestetizzare o uccidere animali utilizzando > 5min esposizione al CO2. Tubo puro CO2 direttamente in aria-fori della recinzione di alloggiamento dell'animale.
- Insetto di pin al vassoio di dissezione. Per assassin bug, dissecare attraverso la superficie ventrale (4.3). Per insetti giganti di acqua, dissecare attraverso la superficie dorsale (4.4).
- Dissezione ventrale
- Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.
- Tagliare un'incisione del midline breve nella superficie ventrale dell'addome usando un bisturi in miniatura. Usare le forbici in miniatura per estendere l'incisione del midline anteriormente alla testa, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.
- Per esporre le strutture interne, rendono più tagli laterali che si estende dall'incisione del midline al lato dell'insetto. Quindi, pin indietro ogni lembo di esoscheletro ventrale per rivelare strutture interne.
- Per grande assassino insetti, fare quattro incisioni laterali, in metà di-addome, anteriore addome, tra le gambe di prime e seconda e di fronte la prima tappa.
- Dissezione dorsale
- Rimuovere le ali vicino alla base. Inserire tre perni nell'addome posteriore per mantenere l'insetto senza perforare le ghiandole velenifere.
- Tagliare un'incisione mediana dalla testa all'addome con delle miniatura forbici, bisturi, avendo cura di tagliare l'esoscheletro solo e non danneggiare strutture interne.
- Forza a parte le due metà dell'insetto. Posto diversi pin lateralmente lungo la lunghezza dell'insetto per lasciare la cavità interna esposta.
- Rimuovere i muscoli di volo con una pinzetta.
- Inondare il vassoio di dissezione. Aggiungere PBS fino a quando il bug è sommerso per consentire strutture interne galleggiano ed essere più facilmente visualizzati.
- Micro-forbici e pinzette, rimuovere delicatamente con connettivo e tessuto nervoso e della trachea. Le ghiandole velenifere appaiono come allungata, costruzioni trasparenti che si estendono lungo ciascun lato del canale alimentare.
- Identificare la ghiandola principale per il suo aspetto caratteristico, con lobi anteriori e posteriori e due condotti incontro al hilus.
- Se lo si desidera, è possibile identificare la ghiandola accessoria tracciando il condotto da hilus. Gratis la ghiandola principale tagliando i due condotti che emana dal hilus.
- Raccogliere i lumen della ghiandola desiderata. Trasferire la ghiandola in una microcentrifuga sul ghiaccio contenente 30 µ l di PBS o PBS più inibitore di proteasi cocktail. Lancia le ghiandole con un pin pulito tagliente.
- Vortexare per 10 s e centrifugare (1 min, 5.000 × g, 4 ° C) per svuotare i lumen della ghiandola. Rimuovere il tessuto ghiandolare con una pinzetta.
- Chiarire l'Estratto di tossina. Centrifugare (5 min, 17.000 × g, 4° C) per rimuovere eventuali particelle solide, conservando il supernatante e scartando il pellet. Conservare a-20 ° C o da-60 ° C per evitare la degradazione di autoproteolytic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alcune specie di heteropteran, come harpactorine p. plagipennis e il reduviine Platymeris rhadamanthus, resa in modo affidabile grandi quantità (5-20 µ l) di veleno in risposta all'elettrostimolazione (tabella 1). In generale, peiratine, reduviine e harpactorine maggior parte dei bug resa veleno in risposta a questo metodo. Tra stenopodaine bug, elettrostimolazione ha suscitato veleno da sp. Oncocephalus ma non Thodelmus sp. I bug di holoptiline ed emesine campionati non hanno reso significativo veleno (ad es. abbastanza per l'analisi mediante spettrometria di massa) in risposta all'elettrostimolazione. L'elettrostimolazione è utilizzabile anche per raccogliere il veleno da belostomatid insetti e predatori stinkbugs. Tuttavia, l'elettrostimolazione di scorpioni d'acqua (Nepidae) induce il rilascio di contenuto delle ghiandole cefaliche solo, piuttosto che di veleno dalla proboscide. Mancato guadagno sulla raccolta veleno da elettrostimolazione in alcune specie è molto probabilmente dovuto la complessità morfologica delle ghiandole velenifere e i meccanismi fisiologici di controllo del rilascio di veleno8.
Oltre a rilasciare veleno a causa di elettrostimolazione, reduviids p. plagipennis, Havinthus rufovarius, p. Radamanto e belostomatid Lethocerus distinctifemur, volontà spontaneamente espellere il veleno da proboscide durante la movimentazione. Tale espulsione di veleno è frequentemente accompagnata da schermi difensivi. P. Radamanto anche sputa veleno sulla difensiva4, un comportamento che si verifica in serpenti ragni e24 25 ma di cui non siamo consapevoli di qualsiasi altra specie di reduviid.
SDS-PAGE e proteomics esperimenti dimostrano che i veleni raccolti di elettrostimolazione e molestie sono ricchi di proteine6,7,8. Proteine responsabili di gran parte del materiale presente, anche se è anche probabile che i veleni contengono ioni inorganici e altre sostanze. Veleno di Assassin bug ottenuta mediante elettrostimolazione e molestie in genere contiene oltre un centinaio di peptidi e proteine (Figura 1, Figura 2). Belostomatid veleno precedentemente è stata segnalata per essere ricco di lysophospholipids13. Gli spettri di assorbanza a infrarossi del veleno dal bug acqua belostomatine Diplonychus eques sono coerenti con un contenuto di proteine e di lysophospholipids. Per la lethocerine L. distinctifemur, la prova è stata trovata solo per proteina e non lysophospholipids6.
Come segnalato per spider veleni26, veleno raccolto dagli insetti heteropteran rischia di variare in concentrazione e composizione, a seconda l'insetto utilizzato e il metodo mediante il quale si raccoglie. Spettroscopia di UV di campioni diluiti veleno suggerisce valori di assorbanza (A280) di 50-250 (10 mm di lunghezza di percorso) per veleno non diluito, coerenza con una concentrazione ad alta percentuale proteica di ~ 50-250 mg/mL7,12,19. Privazione di preda è stata segnalata per causare aumento successivo veleno concentrazione e paralitico potenziale3 come pure diminuzioni successive pH27. Tuttavia, inedia prolungata si tradurrà in perdita di condizione e di morte. Oltre a concentrazione, il metodo con cui veleno è raccolto da heteropterans potrebbe influire sulla sua composizione. La composizione di tossina del veleno dal assassin bug p. plagipennis hanno differito contrassegnato a seconda se era coltivata da elettrostimolazione o molestie8. Nel caso di p. plagipennis, questo è stato indicato per essere dovuto l'elettrostimolazione cedendo il contenuto del PMG, mentre le molestie ha reso il contenuto dell'AMG. Veleno ottenuto da elettrostimolazione, ma non le molestie, potentemente paralizzato preda insetti (Figura 3). Tuttavia, non è chiaro in che misura questo risultato può essere generalizzato ad altri Reduviidae o altri Heteroptera.
Raccolta di veleno direttamente dissecando ghiandole velenifere permette i meccanismi di controllo delle ghiandole veleno per essere eluse, a costo di contaminazione con proteine del tessuto ghiandolare (non-veleno). Indipendentemente da ciò, gli estratti ottenuti da materiale dissecato possono essere utilizzati per i test di tossicità/bioattività. Ad esempio, gli estratti del PMG, AMG e AG di p. plagipennis, preparato utilizzando il protocollo di cui sopra, sono stati analizzati mediante cromatografia liquida/tandem spettrometria totale8. Questo processo identificato un totale di 182, 114 e 71 proteine in totale, di cui 45, 51 e 12 sono stati classificati come proteine del veleno presunto basati sulle caratteristiche di sequenza dell'amminoacido, con le restanti proteine classificate come proteine delle pulizie putativo. Iniezione di estratti del PMG, ma non AMG o AG, in insetti ha provocato la paralisi e morte8.
| Infraordine | Famiglia | Sottofamiglia | Nome binomiale | Nome comune | Elettrostimolazione | Molestie | Dissezione |
| Cimicomorpha | Reduviidae | Harpactorinae | Pristhesancus plagipennis | Comune Brisbane assassin bug | √ | √ | √ |
| Havinthus rufovarius | Tigre rossa assassin bug | √ | √ | √ | |||
| Scipinia arenacea | Rosso spinosi assassin bug | √ | ND | √ | |||
| Gminatus spp. | Grande arancio assassin bug | √ | ND | √ | |||
| Trachylestes aspericollis | Piccolo rosso assassin bug | √ | ND | ND | |||
| Reduviinae | Platymeris spp. | Gigante africano assassin bug | √ | √ | √ | ||
| Psytalla horrida | Spinosi assassin bug | √ | ND | √ | |||
| Peiratinae | Ectomocoris spp. | Terra arancione assassin bug | √ | ND | √ | ||
| Peirates spp. | Nero assassino bug | √ | ND | ND | |||
| Stenopodainae | Oncocephalus spp. | - | √ | ND | √ | ||
| Thodelmus spp. | - | x | ND | √ | |||
| Holoptilinae | Lemure Ptilocnemus | Piuma-legged bug | x | x | ND | ||
| Emesinae | Stenolemus spp. | Filo-legged bug | x | x | x | ||
| Pentatomomorpha | Pentatomidae | Asopinae | Amyotea hamata | Errore di programma giallo predatori puzzo | √ | ND | ND |
| Nepomorpha | Nepidae | Ranatrinae | Ranatra dispar | Scorpione di acqua | x, cg | x | √ |
| Belostomatidae | Belostomatinae | Diplonychus eques | Bug di acqua | √ | ND | ND | |
| Belostomatidae | Semiaquatic | Lethocerus sp. | Insetto gigante di acqua | √ | √ | √ | |
| Tick, esito positivo; Croce, infruttuoso; ND, non determinata; CG, scarico cefalica ghiandola solo | |||||||
Tabella 1: Specificità Taxon dei metodi utilizzati per la raccolta di veleno da heteropterans.
Figura 1 : Proteine individuate dall'analisi LC-MS/MS di 2D macchie di SDS-PAGE e le frazioni HPLC di veleno raccolti da P. plagipennis da elettrostimolazione (protocollo 1), mostrando le proteasi abbondanti, CUB-dominio e proteine heteropteran veleno famiglia 1. (A) 2D gel di SDS-PAGE di greggio veleno di p. plagipennis , mostrando le famiglie di proteine identificate da LC-MS/MS di macchie di gel. (B) HPLC cromatogramma dal frazionamento del veleno di p. plagipennis , mostrando le famiglie di proteine identificate dall'analisi LC-MS/MS di raccolta differenziata. Riprodotto con permesso7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Proporzione di sequenze appartenenti a ciascuna classe di proteina principale nel veleno di P. plagipennis. Riprodotto con permesso7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : P. plagipennis veleno ottenuto mediante elettrostimolazione, ma non le molestie, paralizza insetti. (A) effetto di iniettare veleno ottenuto da elettrostimolazione o molestie o dall'acqua, sulla fuga di cricket. Per ogni condizione di veleno, 0.17 veleno µ l equivalente è stato iniettato nell'addome e il tempo di fuggire un coperchio rovesciato di Petri (in s, fino a 300 s, media ± SD) è stato segnato. Dose-risposta (B) curva per inibizione del successo di fuga dal veleno ottenuto da p. plagipennis da elettrostimolazione. Riprodotto con permesso8. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La fase più critica nella raccolta del veleno assassin bug sta selezionando il metodo appropriato a seconda della finalità dello studio. Ognuno dei tre metodi presentati per la raccolta heteropteran veleni ha vantaggi e svantaggi a seconda delle applicazioni a valle.
Inducendo il bug di espellere il veleno da proboscide (protocolli 1-3) evita la contaminazione del veleno dai tessuti ghiandolari. Inoltre, questi metodi sono non-letale e possono essere ripetuti più volte nel corso della vita di un bug. L'elettrostimolazione di solito fornisce la più grande quantità di veleno e produce veleno con tossicità potente preda insetti secondo diversi studi5,8. Provocare una reazione difensiva è un altro modo per suscitare veleno dalla proboscide e uno che può produrre veleno del tenore di proteine differenti a elettrostimolazione8. Tuttavia, l'elettrostimolazione e provocazione non funzionano per molte specie, e senza indagini parallele dell'uscita secretiva delle ghiandole del veleno non è chiaro quale lumen della ghiandola (o quale combinazione di lumen della ghiandola) è essere raccolto.
La raccolta di veleno da dissezione (protocollo n. 4) è in molti modi complementari. Dissezione rappresenta un modo diretto per accedere stored veleno, e ogni vano della ghiandola veleno possa essere raccolte separatamente o in pool (cioè, la possibilità che il veleno 'sbagliato' è stato raccolto è prevenuto). Tuttavia, il metodo è letale e inoltre provoca lieve contaminazione del veleno dai componenti del tessuto. Heteroptera molti sono troppo piccoli (o troppo allungata nel caso di Emesinae, gli insetti a zampe thread) per consentire il veleno raccolta tramite la dissezione. Se la dissezione è utilizzata per estrarre proteine dai comparti singoli ghiandola separatamente, è fondamentale per separare i lobi rapidamente ed estrarre il contenuto separatamente per evitare la contaminazione incrociata.
I metodi presentati qui dovrà essere modificato a seconda della specie particolare studiata. Per la raccolta del veleno da elettrostimolazione, gli aspetti principali di ottimizzare sono come il bug è trattenuto. Ad esempio, la maggior parte delle reduviids sono in grado di estendere la loro proboscide sopra una vasta gamma di movimento. Queste specie possono essere semplicemente trattenuto destra-way-up su una piattaforma che utilizza un nastro di gomma, e la proboscide estroflesso manualmente. Per specie con proboscide meno flessibile, ad esempio belostomatids, è invece necessario trattenere gli insetti in posizione capovolta e abbassare un recipiente di raccolta l'angolo corretto utilizzando una storta o braccio meccanico. La grandezza e il modello dell'elettricità applicata anche devono essere ottimizzati, e in questo caso, è preferibile iniziare bassa e lentamente aumentare la tensione applicata per evitare letalità.
Se l'obiettivo di uno studio è quello di raggiungere una comprensione dettagliata di come una particolare specie produce e utilizza il veleno, un'indagine approfondita che unisce più raccolta metodi, nonché tecnologie di spettrometria di massa ed esperimenti di RNA-Seq, può essere Obbligatorio. Se l'obiettivo è quello di utilizzare heteropteran veleni come librerie di molecole biologiche per essere sottoposti a screening per alcune attività biologica desiderata, quindi un pannello di veleno campioni ottenuti da elettrostimolazione, molestie, e/o dissezione può essere adatta. Tuttavia, notiamo che il normale ruolo biologico del veleno raccolto rischia di determinare quali bioattività sono presenti. Ad esempio, utilizzato per la predazione di veleno è più probabile che contengono composti insetticidi, mentre veleno usato per la difesa è più probabile che contengono agenti algogene (che causano dolore).
Non abbiamo incluso raccolta veleno applicando la pilocarpina di agonista del recettore muscarinico in questo protocollo. Gli esperimenti futuri sono necessari per determinare le caratteristiche di espulsione veleno indotti da pilocarpina rispetto ai metodi di cui sopra.
In questo articolo, abbiamo presentato metodi che permetteranno ai ricercatori di ottenere veleni da insetti heteropteran. Collezione di veleno successo permetterà ulteriori indagini la produzione, la composizione, la funzione e l'evoluzione del veleno in Heteroptera. Inoltre, alcune tossine heteropteran possono trovare utilità come insetticidi ecologici, molecole di piombo per sviluppare terapeutica umana, o come gli strumenti scientifici per studiare i sistemi biologici.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo finanziari di sostegno dall'Australian Research Council (sovvenzioni DP130103813 e LP140100832 a G.F.K., DECRA Fellowship DE160101142 a ELHAJEB), l'Australian National Health & Medical Research Council (Principal Research Fellowship APP1044414 a G.F.K.) e la University of Queensland (Postdoctoral Fellowship a A.A.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
References
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
