Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتوليف مواد السيليكا بيوينسبيريد وشل الإنزيمات فيه. يتم تصنيعه السليكا بالجمع بين سيليكات الصوديوم، وأمين 'مضافة'، تحييد بمعدل الخاضعة للرقابة. ويمكن تغيير خصائص المواد ودالة في الموقع تجميد إنزيم أو الاصطناعية بعد شطف حمض المضافات الغذائية المغلفة.
Abstract
وهدف البروتوكولات المبينة في هذا التقرير هو توليف مواد السيليكا بيوينسبيريد وأداء التغليف إنزيم فيه جزئيا أو كلياً تنقية نفسه من شطف حمض. عن طريق الجمع بين سيليكات الصوديوم مع بيوينسبيريد بوليفونكشونال مضافة، والسليكا تتشكل سريعاً في الظروف المحيطة على تحييد.
يجري التحقيق في تأثير تحييد معدل وبيوموليكولي إضافة نقطة على السليكا الغلة، وذكر كفاءة التثبيت بيوموليكولي لاختلاف إضافة نقطة. على النقيض من أساليب أخرى في توليف والسليكا المسامية، يرد أن معتدل الشروط المطلوبة لتوليف السليكا بيوينسبيريد متوافقة تماما مع تغليف الجزيئات الحيوية الحساسة. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام شروط معتدلة عبر كافة الخطوات التوليف والتعديل، مما يجعل السليكا بيوينسبيريد هدفا واعدة للارتقاء وتسويق المواد العارية والمتوسطة الدعم النشط.
ويرد التقرير التوليفي لتكون حساسة للغاية للظروف، أي معدل الأبطال والحموضة التجميع النهائي، ولكن ضيق والسيطرة على هذه المعلمات يتجلى من خلال استخدام أساليب المعايرة التلقائية، مما يؤدي إلى إمكانية تكرار نتائج عالية في مسار تطور رد الفعل والغلة.
ولذلك، السليكا بيوينسبيريد خيار دعم مادي نشط ممتازة، إظهار مرونة تجاه العديد من التطبيقات الحالية، لا تقتصر على تلك التي أثبت هنا، والفاعلية في التطبيقات المستقبلية.
Introduction
استخدام السليكا كدعم هيكلية للمحفزات الصناعية راسخة، مما يسمح لنشاط محفز محسنة والاستقرار والتجهيز،1 ومن ثم يحتمل أن تخفيض تكاليف التشغيل. وتتفاقم هذه الفوائد في حالة تجميد إنزيم، كالتخزين داخل نظام مسام والسليكا يمكن أن تمنح فوائد كبيرة على عمر الإنزيم على نظيرتها الحرة. وبناء على ذلك، أنفق الكثير من الجهد في العثور على أفضل طريقة لإرفاق الإنزيمات للأنواع والسليكا، مع ملاحظات متعددة مقارنة التحقيقات باستخدام أساليب مختلفة للتثبيت على وملاط يدعم الصلبة. 2 , 3 , 4
عادة ما يتم إرفاق الإنزيمات عبر فيسيسوربشن أو الترابط التساهمي، بالإضافة إلى تغليف داخل مادة مسامية. 5 ومع ذلك، هناك عيوب كبيرة تتصل بكل أسلوب: فيسيسوربشن يعتمد على التفاعلات السطحية العابرة بين والسليكا وبيوموليكولي، التي يمكن أن تضعف بسهولة جداً برد فعل الظروف المؤدية إلى ما لا يمكن قبوله إنزيم النض. عادة ما ينتج كثير المرفق التساهمية أقوى نشاط أقل بسبب حرية conformational انخفاض الأنواع النشطة. يمكن أن يؤدي انخفاض النشاط بسبب صعوبة الوصول إلى إنزيم أو قيود ديفوسيونال التغليف. 6
التطورات الأخيرة في المجال أكثر اعتدالا من التوليفات السليكا (غالباً ما يطلق عليها اسم 'بيوينسبيريد') أقامت التغليف في الموقع من الجزيئات الحيوية وغيرها من الأنواع النشطة خلال التوليف المادية. 7 , 8 , 9 يبطل هذا الأسلوب العديد من المآخذ على التثبيت التقليدية--خلافا للنهج chemisorption هو الإبقاء على حرية كونفورماشونال بيوموليكولي باستخدام التفاعلات نونكوفالينت الأضعف ولكن كأشكال تجويف المسام حولها بيوموليكولي، ما زالت تمنع النض. وفي الواقع، التغليف وقد ثبت للعمل لمجموعة من الجزيئات الحيوية وحتى كل الخلايا،10 ويمكن تجنبها عن طريق التغليف في بيوينسبيريد والسليكا تأثيرات مثل التعطيل بسبب عملية قاسية الظروف. 7 , 11
هدف الطريقة الموصوفة هنا إعداد السليكا المليئة بالثغرات مع خصائص يمكن السيطرة عليها، في ظل الظروف المحيطة، باستخدام المواد عضوية مضافة على بيوينسبيريد. يمكن بسهولة تعديل الأسلوب لتشمل تغليف الجزيئات غير العضوية أو بيورجانيك، مجموعة مختارة من الذي يوضع. ونحن كذلك إظهار طريقة سهلة لتعديل المواد التي جمعت كتحقيق خصائص السائبة المرجوة وتنقية بإزالة القالب العضوية عن طريق شطف حمض.
مقارنة بتوليف التقليدية ليدعم templated والسليكا المسامية (مثلاً،والسليكا مواد موجودة في قالب من خلال الجمعيات الفاعل supramolecular مثل 41 مليون متر مكعب أو سباعي-15)12 هذا الأسلوب إلى حد كبير أسرع وأكثر اعتدالا، تمكين مصممة، التغليف في الموقع دون الحاجة للعديد من خطوات التثبيت وتنقية شاقة. وعلاوة على ذلك، استخدام شطف حمض بدلاً من تكليس يفتح إمكانية العضوية الروغان السطحية.
هذا الأسلوب الغاية تنطبق على أولئك الذين يعملون في تجميد الأنواع النشطة الذين وجدوا فيسيسوربشن أو تجميد التساهمية غير فعالة. كما أنها مفيدة للبحث في عملية الارتقاء بحسب التوليف بيوينسبيريد في موقف فريد للتصنيع بالمقارنة مع المواد التقليدية والسليكا templated. 13 , 14 لا ينصح بهذا الأسلوب للتطبيقات التي تتطلب مجموعة مرتبة من مسام داخل المواد مثلاً،والضوئيات، كبنية مادية هو اضطرابه رغم أي تشابه في خصائص السائبة.
Protocol
1-إعداد الحلول السلائف (والحلول انكابسولانت اختياري)
- في وعاء من بلاستيك 180 مل، قياس 1.5 ملمول من سيليكات الصوديوم بينتاهيدراتي (318.2 mg)، وتذوب في 20 مل مياه.
- وبالمثل، في حاوية ثانية، قياس ملمول 0.25 من الهيكسامين بينتايثيليني (بيها، مغ 58.1) وتذوب في 20 مل مياه.
- عند استخدام البديلة أمين المحتوية على مركبات مثلديثيلينيترياميني (ديتا) أو تريثيلينيتيتراعميني (تيتا)، ضمان أن نسبة إجمالي Si:N الخلد يبقى ثابتاً في 1 (أي، تناظر 0.5 مليمول من ديتا أو 0.375 mmol من تيتا في وصف الإجراء)15.
- عند استخدام أمين البوليمرية المضافة مثلpoly(ethyleneimine) (جزيرة الأمير إدوارد) أو poly(allylamine hydrochloride) (PAH)، الاحتفاظ بتركيز 1 ملغ/مل (حجم الرد النهائي)15.
تنبيه: تعامل مع هذه الأمينات فقط داخل غطاء دخان، كما المسببة للتآكل أو سامة في أشكالها النقي (لا سيما الأبخرة).
- أداء التغليف في الموقع خلال التوليف، حل كتلة محددة سلفا من البروتين (هنا 50 مغ من "ألبومين المصل البقري"، جيش صرب البوسنة) في 5 مل مياه. طرح هذه الكمية من المياه من حجم المياه التي ستستخدم لحل بينتاهيدراتي سيليكات الصوديوم.
- لتسهيل حل البروتين دون تغيير هيكلها، مرة واحدة مختلطة مع المياه، كاب الحاوية وتخزينها في 4 درجات مئوية. تحقق أحياناً عن التقدم انحلال ويفضل أن يتم ذلك دون إثارة.
2-السليكا التوليف
- الجمع بين الحلول pentahydrate سيليكات الصوديوم وبيها في واحدة من الحاوية 180 مل وإضافة المياه كافية لجعل النهائي حل حجم مل 41 (أو 46 في حالة حذف التغليف في الموقع ).
- ضع المخلوط طازج سيليكات الصوديوم والحلول بها أعلى لوحة محرض، إضافة شريط محرض لتقديم خلط متسقة.
- في هذه السفينة، تعليق تحقيق الأس الهيدروجيني وسجل الرقم الهيدروجيني الأولية.
- بشكل اختياري، في هذه المرحلة، إزالة قاسمة ميليلتر 750 من خليط الانطلاق لتحديد لاحقة من التركيز [Si] الأولية باستخدام مقايسة spectrophotometric الموليبدينوم الأزرق، كما هو موضح في الخطوة 8، 1.
- يبدأ التجميع عن طريق إضافة كمية محددة سلفا من 1 M HCl، محسوبة من الرقم 1، ومراقبة تطور التعكر فورا (انظر الشكل 2)
- حالما يتم إضافة حمض أكثر، إضافة الحل انكابسولانت (أن وجدت)، في أسرع وقت ممكن.
ملاحظة: وحدة التخزين النهائي نظراً لهذه الكميات 50 مل خليط رد الفعل الكلي، مما يؤدي إلى تركيزات Si و N من عيار 30 ملم. وهذا يمكن قياسه المطلوب بضرب جميع أعلاه كميات كمية ثابتة. - تسجيل درجة الحموضة بعد 5 دقائق لتحديد اكتمال رد فعل؛ تأكد من أن درجة الحموضة 7 ± 0.05.
3-حمض شطف المواد
- تعديل تكوين والسليكا المنتجة بعد رد فعل قد توصلت إلى إنجاز (أما كواجولوم الصنع أو بواسطة ريسوسبيندينج عينة مركبة سابقة من السليكا) بإضافة مزيد من حمض.
- إذا ريسوسبيندينج والسليكا، مزيج حوالي 150 ملغ بيوينسبيريد أعد السليكا مع 100 مل مياه في وعاء من بلاستيك 180 مل، ووضع على رأس لوحة محرض.
- وبمجرد التعليق مختلطة، وهو أيضا تعليق تحقيق الأس الهيدروجيني في السفينة.
- تيتراتي في المزيد من HCl حتى تم التوصل إلى درجة الحموضة المطلوبة (بين 7 و 2) والسماح لتحقيق الاستقرار لكاليفورنيا. 1 دقيقة.
- انتظر دقيقة 5 مزيد لضمان النظام وقد اكويليبراتيد تماما، وثم انتقل إلى عزل والسليكا الصلبة.
4-الفصل السليكا وتجفيف
- صب تعليق السليكا بيوينسبيريد في أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
- الطرد المركزي بتعليق في ز 5,000 لمدة 15 دقيقة.
- إزالة المادة طافية بعد الطرد المركزي ومخزن لمزيد من التحليل (مثلاً، برادفورد المقايسة، انظر أدناه). إعادة ملء أنابيب الطرد المركزي مع المياه.، وإعادة تعليق السليكا استخدام خلاط دوامة.
- تكرار استخدام الطرد المركزي، وتخزين طافية، وإعادة تعليق مرتين.
- بعد الطرد المركزي النهائية، إزالة المادة طافية وكشط السيليكا في بوتقة خزفية.
- الجافة في فرن بين عشية وضحاها في 85 درجة مئوية.
- إذا كان قد حدث التغليف، استخدام منشأة للتجفيف أو فرن يعمل بموجب فراغ لتجنب تمسخ البروتين.
5-إنتاج الموليبدينوم الأزرق كاشف (MBR) لتحديد [Si]
- إلى دورق حجمي 1 لتر بلاستيك، إضافة 8 ملمول (10 جرام) موليبدات أمونيوم رباعي، هيدرات في خزانة الأبخرة.
- يحل هذا في ماء منزوع 500 مل تحت التحريك.
- أسيديفي الحل بإضافة 60 مل من محلول HCl 10 م بعناية.
- ضبط وحدة التخزين النهائي للأم 1
6-إنتاج أمينوفينول الفقرة كبريتات الفلزي (RA) لتحديد [Si]
- ضع 500 مل زجاج دورق حجمي في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة على لوحة محرض في خزانة الأبخرة.
- إضافة ملمول 111 (10 جرام) من حمض الأكساليك اللامائى، 19.5 ملمول (3.35 g) من كبريتات أمينوفينول الفقرة، و 16 ملمول (2g) من كبريتيت الصوديوم، وتذوب في الماء 250 مل.
- بعناية وبطء إضافة 92 غ (50 مل) من حمض الكبريتيك المشبعة أثناء التحريك وتنتظر الحل لتبرد.
- وأخيراً، تضعف إلى 500 مل مع المياه.
7-مقايسة حمض سيليكوموليبديك على أنواع السليكا أحادي
- في قنينة بلاستيك 5 مل، أنتجت ميليلتر 300 مخفف من حصر في الخطوة 5، 4 مع 3 مل مياه.
- إضافة 10 ميليلتر اختبار حامض silicic الحل ويهز لمزيج.
ملاحظة: هذا الحل سوف ببطء بدوره الصفراء. - وبعد 15 دقيقة بالضبط، إضافة 1.6 مل عامل تخفيض إعداد من القسم 6 للحد من سيليكوموليبداتي الصفراء المعقدة، ايزومير الأزرق.
- السماح بلون أزرق لتطوير 2 على الأقل، ولكن ليس أكثر من 24 ساعة.
- قياس امتصاص العينة في 810 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي تجاه الأشعة فوق البنفسجية وحساب [Si] ضد منحنى معايرة.
8-السيليكون مقايسة حمض موليبديك على أنواع السليكا البوليمرية
- لقياس تركيز الأنواع بوليسيليكاتي استخدام الأسلوب الموليبدينوم الأزرق، في أنبوب ميكروسينتريفوجي، تجمع بين 750 ميليلتر من حل هيدروكسيد الصوديوم 2 متر 750 تعليق والسليكا ميليلتر.
- وختم والمكان في عدد عشري ميكروسينتريفوجي.
- التأكد من ترك headspace كافية في أنبوب لمنع انفجار بسبب تراكم الضغط.
ملاحظة: headspace من 500 ميليلتر عادة ما تكون كافية لتجنب هذا الأمر. بدلاً من ذلك، هذا الإجراء يمكن القيام في قارورة مفتوحة طالما استأثرت هو فقدان السوائل بسبب التبخر.
- التأكد من ترك headspace كافية في أنبوب لمنع انفجار بسبب تراكم الضغط.
- تعويم أنابيب ميكروسينتريفوجي في حمام مياه ساخنة إلى 80 درجة مئوية، وترك الأمر إلى أن يحل أجل ح 1.
- بعد انقضاء ح 1، إزالة أنابيب ميكروسينتريفوجي والجاف خارج القضاء.
- بعد تبريده، يمكن تحديد [Si] كما هو موضح أعلاه كما هو موضح في الخطوات 7.2 إلى 7.5.
9-برادفورد التحليل الداخلي لتحديد تركيز البروتين في السليكا
- إدراج كمية محددة سلفا من كاشف (درجة حرارة الغرفة) برادفورد وعينه في كل ومبومو المعينة (انظر الجدول 1 و الجدول 2 لكميات محددة). استخدام تلميحات ماصة المتاح لكل ومبومو لتجنب تغيرات الحجم نظراً للطبيعة الكاشف وكرر كل نقطة في ثلاث نسخ.
- مزج كل ومبومو بعكس 3 مرات وإجازة وضع لمدة 10 دقائق.
- قياس امتصاص في 595 نانومتر باستخدام المادة طافية نقية فارغة.
- حساب امتصاص الأصلي لكل ومبومو بطرح من كل قياس امتصاص تبين للعينة التحكم (ومبومو رقم 0 في كلا فحوصات).
- حساب تركيز البروتين عينة غير معروف باستخدام منحنى معايرة (الشكل 3). في حالة تخفيف العينة الأصلية، يحتاج عامل تخفيف تحسب.
- إنشاء منحنى معايرة لكل مجموعة من التجارب بامتصاص المقاسة التآمر ضد تمركز جيش صرب البوسنة لتجنب التقلبات العشوائية التي قد تؤثر على حساسية للمقايسة.
- على الرغم من أن هذا التحليل البروتين يهدف إلى استخدام جيش صرب البوسنة كمعيار لتحديد أي نوع من البروتين، إنشاء منحنى معايرة لكل البروتين محددة ذات أهمية لتحسين دقة.
- إذا كان من المتوقع أن تكون أعلى من نطاق تغطية منحنى المعايرة محتوى البروتين من العينة غير معروف، تمييع حسب الحاجة.
- تحديد المحتوى البروتيني لكل عينة أثناء إعادة تعليق لرصد فقدان البروتين ممكن.
Representative Results
التقنيات الموضحة أعلاه قادرة على الدوام وتكاثر يعجل والسليكا. هذا أسهل لتحديد ببداية سريعة التعكر داخل السفينة ردود الفعل التي سوف تستقر تلقائياً إلى كواجولوم سميكة من سرع السليكا (الشكل 2) عند وقف التحريض. مدى رد الفعل ومن ثم يمكن تأكيدها عن طريق قياس كتلة هذه coagulum بعد الانفصال الغلة وهو عادة 58 ± 6.5% (الشكل 4، الأصفر).
يمكن إنشاء مزيد من التبصر في تطور رد الفعل بتكييف أسلوب الموليبدينوم الأزرق الطيفية للكشف عن مقدار الممتص أحادي سيليكات الأنواع، فضلا عن تلك الأنواع التي استجابت لتشكيل بوليسيليكاتيس أو 'ليغومرات'، ولكن لم تتمكن من التوصل إلى حجم كاف يتجمد (الشكل 4والأحمر والأزرق على التوالي).
هذه البيانات انتواع والسليكا محددة باهتمام خاص عند مقارنة الكفاءة معايرة مختلفة لرد الفعل هطول الأمطار-أي كيف يتم التوصل إلى الرقم الهيدروجيني الرد النهائي ومعدل هذا يؤثر على بلمرة السليكا أحادي 'أوليجومير' وعن التخثر اللاحقة على السليكا الصلبة. عن طريق تعديل مقدار حامض قليلاً وأضاف في المرحلة 2، 4، تحت-أو أكثر-تيتريشن المخلوط رد فعل يمكن أن يؤديها (الشكل 5). عن طريق قياس انتواع والسليكا مرة أخرى لهاتين القضيتين، يتبين فرقا واضحا في استكمال الرد (الشكل 4) على الرغم من إدخال تغييرات طفيفة على الشخصية المعايرة لرد فعل (الشكل 5).
على الرغم من أن لا يوجد فرق غير موجود بين استهلاك الأنواع أحادي لرد فعل ثلاث الحالات (المتبقية بين 29-33%)، هناك فرق واضح مبلغ السليكا أوليجوميريك الأنواع التي تتسبب في كل حالة على حدة. وهذا ما يتفق مع النظرية التقليدية في سيليكاس سول-جيل-في قضية 'إلا' الرقم الهيدروجيني عقد أعلى بالنسبة لفترة أطول، مما يسمح للجزيئات الفردية لتنمو ومن ثم مساعدة تخثر تتسم بالكفاءة؛ في قضية 'الانحسار' تخثر الدم هو فعل أسرع بكثير بسبب المعايرة السريعة، وبالتالي أقل من الأنواع والسليكا نمت إلى حجم كاف يتجمد وتظل حبيسة في مرحلة غروانيه. 16
نظراً لأهمية المعايرة عند تشكيل والسليكا، المعرفة مسبقاً حجم المعايرة المناسبة أمر ضروري. على الرغم من أن لا يمكن استخراجها من ستويتشيوميتري رد فعل بسبب سلوك بروتونيشن معقدة المضافات أمين والتغير في حموضة سطح السليكا في تخثر الدم، وموثوق بها للغاية العلاقات التجريبية بين محتويات النظام، تركيزات و عيار وحدات التخزين بسهولة إنشاء (الشكل 1).
بعد الانتهاء من تخثر الدم، السطوح المادية يمكن سهولة تعديل عن طريق استخدام حمض شطف، كما أفيد مؤخرا بالمؤلفين في أماكن أخرى. 13 وهذا يسمح للضبط الدقيق لخصائص المواد مثل التشكيل، المسامية، والنشاط الكيميائي للمادة المضافة (الشكل 6 أ و ب).
في هذه الدراسة، تم استخدام جيش صرب البوسنة إنزيم انكابسولانت أنموذج، ومع ذلك، يمكن استخدامها الأساليب الموصوفة هنا لعدة إنزيمات17،18. الإجراءات المتبعة للكشف عن البروتين هو بروتوكول فحص برادفورد،19 supernatants المخزنة من كل دورة الطرد المركزي باستخدام. يتم حساب كمية البروتين في المادة طافية باستخدام منحنى معايرة التي تم إنشاؤها من كميات معروفة من جيش صرب البوسنة المذابة في المادة طافية من عينة مع صفر من البروتين (عنصر تحكم نموذج). سيتم حساب كمية البروتين مغلفة في السليكا بطرح البروتين المكتشف في supernatants من البروتين أضيف مبلغ أولى. الكاشف فقط بحاجة للفحص هو "الكاشف برادفورد" (المشتراة أو طبقاً لوصفات القياسية).
وهناك ثلاثة أنواع من تنسيق المقايسة، تبعاً لحجم العينة، والمبلغ المتوقع للبروتين الكشف عنها وطريقة القياس المستخدمة. هنا، بالشكل المتبع هو المحدد لجهاز المطياف الضوئي، يتطلب الترعة المتاح من الماكرو ومن الحجم الصغير ويمكن الكشف عن من 10 ميكروغرام/مل إلى 1.4 ملغ/مل بروتين.
في الشكل 7 يظهر مقدار البروتين اكتشفت بعد كل غسل (الخطوة 4، 3) كنسبة مئوية من كمية البروتين الأولى (الذي كان 50 ملغ). واكتشفت حوالي ~ 50% من جيش صرب البوسنة في المادة طافية بعد الطرد المركزي الأول، الذي يتعلق بكفاءة التثبيت ~ 50%. كما كان هناك جيش صرب البوسنة لم تكتشف في يغسل التالية، جيش صرب البوسنة (أو أي إنزيم أخرى) يمكن أن يتم تغليف بشكل أمن خلال التوليف السليكا مع لا نض-هذا ميزة كبيرة لهذا الأسلوب. من أجل تأكيد وجود جيش صرب البوسنة في السليكا تنتج، أجرى تحليل فورييه تحويل الأشعة تحت الحمراء الطيفي (FTIR). وجود عصابات مميزة أميد الأول والثاني في منطقة 1,500/سم و 1650/سم (الشكل 8) في العينات إعداد حضور جيش صرب البوسنة، ولكن ليس في السيطرة عينات (جيش صرب البوسنة) أكدت وجود جيش صرب البوسنة في المواد الصلبة.
بالإضافة إلى طريقة إضافة إنزيم الموصوفة أعلاه (أضيف خلال تحييد خليط رد فعل جيش صرب البوسنة)، هناك أخرى الاختلافات المحتملة مثلجيش صرب البوسنة إضافة خلال خلط السيليكات والحلول المضافة، قبل تحييد أو إضافة الإنزيم للحل سيليكات أو كمادة مضافة قبل الاختلاط وإبطال مفعولها. بعض من هذه الإمكانيات وبحثت كذلك والكفاءة التثبيت (كتلة من جيش صرب البوسنة المعطل تداولها كنسبة مئوية من الإنزيمات إضافة إلى نظام رد الفعل، حسبت استناداً إلى المقايسة برادفورد) وكمية جيش صرب البوسنة في السليكا النهائي (قياس تركيز لجيش صرب البوسنة في السليكا كنسبة مئوية من إجمالي وزن المركبة المنتجة، انظر الشكل 9). كان من الواضح أنه عندما تمت إضافة جيش صرب البوسنة إلى الكواشف الممتص (حالات A-C في الشكل 9) كانت هناك لا اختلافات كبيرة في كفاءة التثبيت أو المبلغ لجيش صرب البوسنة في المركب الناتج. ومع ذلك، عندما تتم إضافة جيش صرب البوسنة أثناء تشكيل السليكا (قضية د في الشكل 9)، كفاءة التثبيت ومقدار جيش صرب البوسنة في المنتج النهائي كلاهما أقل بكثير. وعلى الرغم من هذه الاختلافات، يتغير مقدار متوسط من السليكا تنتج (بين 85-90 ملغ). ويمكن تفسير هذه الملاحظات على أساس التأين (أو نقطة isoelectric) لجيش صرب البوسنة، سيليكات/والسليكا والمواد المضافة إلى الأغذية. الأساليب المختلفة لإضافة تسمح للتفاعلات المختلفة بين الإنزيم ووالسليكا والسلائف. كدرجة الحموضة في وقت إضافة التغييرات الإنزيم، ستحدد التأين من كل الأنواع جزيئية، التي بدورها سوف تتحكم بكفاءة التثبيت.
| لا ومبومو | تركيز لجيش صرب البوسنة (mg/mL) | برادفورد كاشف (mL) | عينة (mL) |
| 0 | 0 (التحكم) | 1.5 | 0.05 |
| 1 | 0.1 | 1.5 | 0.05 |
| 2 | 0.25 | 1.5 | 0.05 |
| 3 | 0.5 | 1.5 | 0.05 |
| 4 | 0.75 | 1.5 | 0.05 |
| 5 | 1 | 1.5 | 0.05 |
| 6 | 1.25 | 1.5 | 0.05 |
| 7 | نموذج غير معروف (X) | 1.5 | 0.05 |
الجدول 1: ماكرو برادفورد مقايسة إنشاء وحدات تخزين عنصر محتسب. صالحة لتحديد نطاق 0.1-1.4mg/mL (وحدات التخزين لتكرار 1)
| لا ومبومو | تركيز لجيش صرب البوسنة (ميكروغرام/مل) | برادفورد كاشف (mL) | عينة (mL) |
| 0 | 0 (التحكم) | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 2.5 | 1 | 1 |
| 3 | 5 | 1 | 1 |
| 4 | 7.5 | 1 | 1 |
| 5 | 10 | 1 | 1 |
| 6 | نموذج غير معروف (X) | 1 | 1 |
الجدول 2: "برادفورد الصغرى" مقايسة إنشاء وحدات تخزين عنصر محتسب. صالحة لتحديد نطاق 1-10 ميكروغرام/مل (وحدات التخزين لتكرار 1)
الشكل 1 : تتطلب وحدة التخزين عيار ضد تركز السليكا لرد فعل نظم استخدام ديتا أو بها كالمواد المضافة إلى الأغذية. السليكا تم تصنيعه بتركيزات متفاوتة مع الحفاظ على [N]: [Si] نسبة 1، لاثنين من المواد الكيميائية المضافة المختلفة. أشرطة الخطأ هي واحدة من الانحراف المعياري حول الوسط.
الشكل 2 : صور فوتوغرافية ل coagulum السليكا في وعاء التفاعل (أ) خلال و (ب) بعد الانفعالات، مما يدل على تعكر حل وتسوية إرشادية لفعل الأمثل.
الشكل 3 : منحنى المعايرة أنموذج للمقايسة الماكرو برادفورد. يتم خلط المادة طافية من بيوينسبيريد والسليكا التوليف في غياب جيش صرب البوسنة مع كمية معروفة من البروتين، بعد ذلك يتم إجراء تحليل برادفورد كما هو موضح في الخطوة 9، 1.
الشكل 4 : الدول البلمرة النهائية من الأنواع السليكا لظروف ردود فعل مختلفة- والسليكا يتم تصنيعه في الأحوال المثلى (الأساس)، وكذلك باستخدام كما هو الحال مع أكثر-أو المعايرة الناقص، بعدها يتم كمياً تركز السليكا النسبي سيليكات أحادي أو ديميريك (أحمر)، بوليسيليكاتي 'ليغومرات' (أزرق) والتخثر غير مستقرة السيليكا (أصفر).
الشكل 5 : التقدم لدرجة الحموضة من خلال نظام رد الفعل كدالة لحجم عيار الأولية. هو مداوي حمض فورا بعد ca. 38s الاختلاط، مما تسبب في درجة الحموضة تنخفض بسرعة 8. بعد ذلك، كذلك كميات من حمض يتم تلقائياً مداوي أن كانت درجة الحموضة 7.0 ± 0.05 300s بعد الإضافة الأولى. في حالة الإفراط المعايرة، ليست قابلة للتحقيق، كما أن الجرعة الأولى كان كافياً لإسقاط الرقم الهيدروجيني أدناه 7، وصلت إلى درجة الحموضة 6.65 بعد 300s. التخزين HCl الأولية إضافة ل 'إلا'، 'خط الأساس،' وكان 'الانحسار' 6.90 و 7.05 7.20 مل على التوالي.
الرقم 6 : تغييرات الخاصية الممثل عند تحميض مادة السليكا متخثر. (أ) تغيير تركيز المواد المضافة فيما يتعلق بدرجة الحموضة، و (ب) التغيير مسامية والسليكا فيما يتعلق بالاس الهيدروجيني. مستنسخة من مانينغ et al. 13 تحت ترخيص Creative Commons.
الشكل 7 : تركيز جيش صرب البوسنة في supernatants التوليف السليكا بيوينسبيريد. وأجريت فحوصات برادفورد في supernatants رد فعل بعد الطرد المركزي، منها مبلغ نسبي المتبقية (وبالتالي تغطي من السليكا تجميعي) مصممة.
الشكل 8 : تحليل فتير في السيليكا بيوينسبيريد مع أو بدون تغليف الأنواع النشطة. الأطياف وأظهرت: الأسود الخط: خط بيوينسبيريد والسليكا، رمادي: نقية جيش صرب البوسنة، الخط الأزرق: السليكا بيوينسبيريد محملة بجيش صرب البوسنة. تشير الخطوط المتقطعة العمودي إلى نطاقات أميد المميزة.
الرقم 9 : كفاءة التثبيت ومقدار جيش صرب البوسنة في المركب السليكا تنتج باستخدام بها. جيش صرب البوسنة تمت إضافة (A) في حل بها قبل الاختلاط مع سيليكات، (ب) في الحل سيليكات قبل الاختلاط مع بها، (ج) بعد خلط الأولية للحلول بها والسليكات، و (د) بعد خلط بها وسيليكات الحلول وتحييدها. وتقاس كفاءة كجيش صرب البوسنة % مغلفة من خليط رد فعل كنسبة من مجموع جيش صرب البوسنة المضافة، بينما جيش صرب البوسنة في السليكا يدل تركيز % من جيش صرب البوسنة في مركب والسليكا النهائي حسب الكتلة. أشرطة الخطأ هي واحدة من الانحراف المعياري حول الوسط.
Discussion
في العمل الحالي، نقدم طريقة لسرعة عجل بيوينسبيريد والسليكا المواد وتغليف الجزيئات الحيوية فيه. علينا أن نظهر الخطوات الحاسمة ضمن الإجراء، إلا وهي كمية حمض الشروع في رد فعل لإضافتها، وتوقيت إضافة انكابسولانت بيوموليكولي. نظهر أثر إضافة حمض المبلغ على تطور رد الفعل والعائد (الشكل 4 و الشكل 5، على التوالي)، وأظهر أسلوب لرقابة مشددة على شروط التوليف، مما يسمح للاتساق وعلى الرغم من هذه الحساسية. فيما يتعلق بتغليف الأنواع النشطة، رغم مباشرة من حيث الإجراء، تغليف يرد ينبغي أن تراعي ظروف التجربة (ترتيب الإضافة، درجة حموضة إضافة، الظروف البيئية)، ومع ذلك، الاتساق في المواد مرة أخرى من خصائص قابلة للتحقيق.
يمكن تعديل شروط التوليف من خلال استخدام المضافات المختلفة، قد نشرت العديد منها في أماكن أخرى،15 تقديم مجموعة من مورفولوجيس ومساميه. وأبلغ تقنيات أخرى، بعد انتهاء الاصطناعية تعديل وتكييف مواد السيليكا بيوينسبيريد كيميائيا مثل تنقية خفيفة13 وسطح الديكور أمين. 20 أخيرا، نظراً لطبيعة تركيب خفيفة، مائي، التغليف في الموقع من الممكن لنطاق أوسع من ركائز من تلك أثبت هنا، بدءاً من الإنزيمات17،18 لكل الخلايا،21 المعادن الأملاح،22 المكونات الصيدلانية الفعالة، النقاط23 والكم. 24
خلافا لغيرها التوليفات العضوية بوساطة السليكا (مثل عائلة المواد 41 مليون متر مكعب أو سباعي-15)، طبيعة بوليفونكشونال بيوينسبيريد لا يمكن أن تنتج المواد المضافة أمرت هياكل المسامية، ولا شدة مونوديسبيرسي توزيع حجم الجسيمات خاصية من نوع Stöber والسليكا. 25 نظراً لعدم وجود سلوك ميسيليزيشن واضحة المعالم من المضافات (خارج الحالات الخاصة) بيوينسبيريد26 يقترن ذلك بنشاطها التحفيزي زيادة على الإضافات المحتوية على أمين مونوفونكشونال. 26
من ناحية أخرى، تمكن هذه الطبيعة المضافة بوليفونكشونال استخدام أقصر رد فعل مرات وأكثر اعتدالا درجة الحرارة والضغط مقارنة بغيرها التوليفات والسليكا العضوية بوساطة. يؤدي هذا أيضا إلى إمكانية شطف المضافة درجة حرارة الغرفة كما هو موضح أعلاه، الذي لم يتحقق لهذه والسليكا الأسر الأخرى نظراً لخصوصيات هذه الكيمياء السطحية. 27 , 28 , 29 وبالتالي مواد السيليكا بيوينسبيريد أظهرت أن تكون أكثر اقتصادا والعملية لإنتاج على نطاق أوسع، مما يؤدي إلى تسويق أسهل والتنمية. 14
وباختصار، يمثل بيوينسبيريد والسليكا توليف طريقة سريعة وسهلة لإنتاج يدعم الأنواع النشطة أو غاز مسيل وسائط الإعلام. من خلال رقابة صارمة من درجة الحموضة أثناء وبعد التفاعل، مجموعة واسعة من مركبات السليكا-أمين يمكن توليفها مع خصائص مختلفة، التي تكملها كذلك إمكانية في الموقع تغليف طائفة واسعة من مختلف العضوية، المواد غير العضوية أو البيولوجية العضوية. على الرغم من أن التعديل بعد الاصطناعية المستقلة بيوينسبيريد المضافة وتركيز انكابسولانت لم يتحقق، وهذه الأساليب تمثل خطوة واعدة نحو العمليات الكيميائية غير ضارة بيئياً.
Disclosures
الكتاب يعلن أي مصلحة مالية المتنافسة.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون دعم مالي من إدارة الكيماويات والهندسة البيولوجية (جامعة شيفيلد) و EPSRC (الجيش الشعبي/L017059/1 والجيش الشعبي/P006892/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica synthesis | |||
| Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
| Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
| Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
| Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
| Silicomolybdic acid assay | |||
| Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
| Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
| Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford assay | |||
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Equipment | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
| Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
| UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
