Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur muskelmodelle Kieselsäure Materialien zu synthetisieren und Enzyme darin zu immobilisieren. Kieselsäure wird synthetisiert durch die Kombination von Natrium-Silikat und einem Amin "Additiv", die mit einer kontrollierten Rate zu neutralisieren. Materialeigenschaften und Funktion können entweder durch in Situ Enzym Immobilisierung oder Post-synthetische Säure Elution von gekapselten Zusatzstoffe verändert werden.
Abstract
Das Ziel der hier beschriebenen Protokolle ist muskelmodelle Kieselsäure Materialien zu synthetisieren, Enzym Kapselung darin, und teilweise oder vollständig reinigen das gleiche durch Säure Elution. Durch die Kombination von Natrium-Silikat mit einem polyfunktionalen muskelmodelle Additiv, ist Kieselsäure schnell bei Umgebungsbedingungen nach Neutralisation gebildet.
Die Wirkung der Neutralisation Rate und Biomolekül Zusatz Punkt auf Kieselsäure Ertrag werden untersucht, und Biomolekül Immobilisierung Effizienz wird für unterschiedliche Zusatz-Punkt berichtet. Im Gegensatz zu anderen porösen Silica Syntheseverfahren wird gezeigt, dass die milden Bedingungen für muskelmodelle Kieselsäure Synthese mit der Kapselung von empfindlichen Biomoleküle vollständig kompatibel sind. Darüber hinaus werden alle Synthese und Modifizierung Schritte machen muskelmodelle Kieselsäure ein viel versprechendes Ziel für das Scale-Up und Vermarktung als bloßen Material und aktive Unterstützung Medium milde Bedingungen eingesetzt.
Die Synthese zeigt sich sehr empfindlich auf Bedingungen, d. h. die Neutralisation Rate und abschließende Synthese pH, aber enge Kontrolle über diese Parameter durch den Einsatz von automatischen Titration Methoden, führt zu hoher Reproduzierbarkeit in nachgewiesen wird Reaktion Fortschreiten Weg und Ertrag.
Daher eignet sich muskelmodelle Kieselsäure ausgezeichnete aktive materielle Unterstützung, Vielseitigkeit in Richtung viele aktuelle Anwendungen, nicht beschränkt auf diejenigen hier gezeigt und Potenz in zukünftigen Anwendungen zeigt.
Introduction
Die Verwendung von Silica als strukturelle Unterstützung für Industriekatalysatoren ist gut etabliert, zulassend verbesserten Katalysatoraktivität, Stabilität und Verarbeitbarkeit,1 daher potenziell reduzieren die Betriebskosten. Diese Vorteile werden im Falle von Enzym-Immobilisierung, verstärkt, wie Lagerung innerhalb einer Kieselsäure Porensystem erhebliche Vorteile für die Enzym-Lebensdauer über ihr kostenloses Pendant verleihen kann. Dementsprechend hat ein großer Aufwand betrieben worden in die Suche nach der besten Methode Enzyme an Kieselsäure Arten, mit mehreren Bewertungen vergleichen Untersuchungen mit verschiedenen Methoden der Immobilisierung auf siliziumhaltigen solide stützen befestigen. 2 , 3 , 4
Enzyme sind in der Regel über Physisorption oder kovalente Bindungen, neben Kapselung in ein poröses Material angebracht. 5 es gibt jedoch erhebliche Nachteile im Zusammenhang mit jeder Methode: Physisorption stützt sich auf Transienten Oberfläche Wechselwirkungen zwischen der Kieselsäure und Biomolekül, die sehr leicht durch die Reaktionsbedingungen führt zu das inakzeptable geschwächt werden kann Enzym auslaugen. Die viel stärker kovalenten Bindung führt in der Regel geringere Aktivität aufgrund der reduzierten Konformationsänderungen Freiheit der aktiven Spezies. Kapselung führt zu reduzierter Aktivität aufgrund der Unzugänglichkeit des Enzyms oder Diffusionsprozess Einschränkungen. 6
Jüngste Entwicklungen im Bereich der milderen (häufig genannt "gliedmaßenkonstruktionen") Kieselsäure Synthesen haben die in Situ -Verkapselung von Biomolekülen und anderen aktiven Spezies während der materiellen Synthese etabliert. 7 , 8 , 9 negiert diese Methode viele der Nachteile der konventionellen Ruhigstellung - im Gegensatz zu Chemisorption Konformationsänderungen Meinungsfreiheit das Biomolekül bleibt durch die Verwendung von schwächeren nichtkovalente Wechselwirkungen, sondern als die Pore Hohlraum bildet rund um das Biomolekül Auswaschung ist noch verhindert. In der Tat Kapselung hat nachgewiesen, dass für eine Reihe von Biomolekülen und sogar ganze Zellen,10 arbeiten und durch Verkapselung in muskelmodelle Kieselsäure Effekte wie Deaktivierung aufgrund rauer Prozess Bedingungen vermieden werden. 7 , 11
Das Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist es, eine poröse Kieselsäure mit kontrollierbaren Eigenschaften unter Umgebungsbedingungen, vorbereiten, indem ein muskelmodelle organischer Zusatzstoff. Die Methode kann leicht geändert werden, um die Verkapselung von anorganischen oder Bioorganische Moleküle enthalten, von denen eine Auswahl angezeigt werden sollen. Weiter zeigen wir eine einfache Methode zur Modifizierung der als synthetisierte Materialien zur Erreichung der gewünschten Volumeneigenschaften und Reinigung durch die Beseitigung der organischen Vorlage durch Säure Elution.
Im Vergleich zu den traditionellen Synthese von vorgefertigten porösen Silica unterstützt (z. B.Kieselsäure Materialien durch supramolekularen Tensid Baugruppen wie MCM-41 oder SBA-15 Vorlagen)12 ist diese Methode deutlich schneller und milder, so dass zugeschnitten, in Situ Kapselung ohne die Notwendigkeit für zahlreiche Immobilisierung Schritte und mühsame Reinigung. Darüber hinaus eröffnet die Verwendung von saurem Elution statt Kalzinierung die Möglichkeit organische Oberfläche Funktionalisierung.
Diese Methode ist sehr zutreffend für die Beschäftigten im aktiven Spezies Immobilisierung, die Physisorption gefunden haben oder kovalente Immobilisierung, erfolglos zu sein. Es ist auch nützlich für diejenigen Prozess Scale-up erforscht, wie die muskelmodelle Synthese für die Industrialisierung im Vergleich zu herkömmlichen vorgefertigten Kieselsäure Materialien einzigartig positioniert ist. 13 , 14 ist diese Methode nicht empfehlenswert für Anwendungen erfordern ein geordnetes Array der Poren innerhalb der Material z. B.für Photonik, als die Materialstruktur ist trotz Ähnlichkeiten in Volumeneigenschaften ungeordnet.
Protocol
1. Vorbereitung des Vorläufer-Lösungen (und Optional Verkapselungen)
- In einem 180 mL-Kunststoff-Behälter 1,5 Mmol Natrium-Silikat-Pentahydrat (318,2 mg) zu messen, und in 20 mL entionisiertem Wasser auflösen.
- In ähnlicher Weise in ein zweites Gefäß 0,25 Mmol Pentaethylene Urotropin (PEHA, 58,1 mg) zu messen und in 20 mL entionisiertem Wasser auflösen.
- Bei Verwendung von alternativen Amin-haltigen Verbindungen z. B.Diethylenetriamine (DETA) oder Triethylenetetraamine (TETA) sicherzustellen Sie, dass das gesamte Si:N Maulwurf Verhältnis bei 1 (d. h. entspricht 0,5 Mmol DETA oder 0,375 Mmol TETA in konstant bleibt Das beschriebene Verfahren)15.
- Bei Verwendung von Polymeren Amin Zusatzstoffe z. B.poly(ethyleneimine) (PEI) oder Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) pflegen Sie eine Konzentration von 1 mg/mL (endgültige Reaktionsvolumen)15.
Achtung: Behandeln Sie diese Amine nur innerhalb einer Abzugshaube, korrosiven oder in ihrer reinen Form (vor allem als Dämpfe) giftig sind.
- Zum Ausführen von in Situ Kapselung während der Synthese auflösen eine vorgegebene Masse des Proteins (hierin 50 mg von Rinderserumalbumin, BSA) in 5 mL entionisiertem Wasser. Subtrahieren Sie diese Menge an Wasser aus der Menge der deionisiertes Wasser für die Auflösung von Natrium-Silikat Pentahydrat verwendet werden.
- Um die Protein-Auflösung zu erleichtern, ohne Veränderung seiner Struktur nach dem Mischen mit entionisiertem Wasser, verschließen Sie den Behälter und Lagerung bei 4 ° C. Prüfen Sie gelegentlich über den Auflösung stand, vorzugsweise ohne sich zu rühren.
(2) Kieselsäure-Synthese
- Kombinieren Sie die Lösungen der Natrium-Silikat-Pentahydrat und PEHA in eines der 180 mL Behälter und fügen Sie ausreichendes deionisiertes Wasser um das Finale zu Lösung Volume 41 mL (oder 46 wird in Situ Kapselung weggelassen).
- Legen Sie die frisch zubereiteten Mischung von Natriumsilikat und PEHA-Lösungen auf der Oberseite einen Rührer Teller, hinzufügen ein Rührer-Leiste, um konsistente Mischung bieten.
- Aussetzen Sie in diesem Gefäß einer pH-Elektrode und notieren Sie die anfänglichen pH.
- Entfernen Sie zu diesem Zeitpunkt optional eine 750 µL Aliquot der Ausgangspunkt Mischung für späteren Bestimmung der Ausgangskonzentration [Si] mit Molybdän blaue spektralphotometrische Assays, wie beschrieben im Schritt 8.1.
- Zunächst die Synthese einer vorgegebenen Menge von 1 M HCl, wie aus Abbildung 1berechnet und die sofortige Entwicklung der Trübung beobachten (siehe Abbildung 2)
- Sobald die saure Ergänzung vorbei ist, die Verkapselungen Lösung hinzufügen (falls vorhanden) so schnell wie möglich.
Hinweis: Das Endvolumen angesichts dieser Mengen ist 50 mL insgesamt Reaktionsgemisch zu Si und N-Konzentrationen von 30mM. Dies kann skaliert werden wie gewünscht durch Multiplikation alle obigen Mengen um einen konstanten Betrag. - Notieren Sie den pH-Wert nach 5 min die Reaktion Vollendung zu bestimmen; sicherstellen Sie, dass der pH-Wert 7 ± 0,05.
(3) saure Elution der Materialien
- Die Zusammensetzung des produzierten Kieselsäure zu ändern, nachdem die Reaktion (entweder als ein Koagulum als gemacht oder durch resuspending einer früheren synthetisierten Probe von Kieselsäure) durch die Zugabe von weiteren Säure erreicht hat.
- Wenn Kieselsäure resuspending, mischen Sie ca. 150 mg als vorbereitet muskelmodelle Kieselsäure mit 100 mL entionisiertem Wasser in einem Plastikbehälter 180 mL und auf der Oberseite einen Rührer Teller legen.
- Sobald die Suspension gut vermischt ist, aussetzen einer pH-Elektrode in das Schiff.
- In weiteren HCl titrieren, bis der gewünschte pH-Wert (zwischen 7 und 2) erreicht ist und lassen Sie Sie stabilisieren für ca. 1 min.
- Warten Sie weitere 5 min um sicherzustellen das System hat voll equilibriert, und fahren Sie anschließend mit die solidere Kieselsäure zu isolieren.
(4) Kieselsäure Trennung und Trocknung
- Dekantieren Sie die muskelmodelle Kieselsäure Aussetzung in 50 mL Zentrifuge Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die Federung bei 5.000 g für 15 min.
- Den überstand nach Zentrifugation und Store für weitere Analysen (z. B. Bradford-Test, siehe unten) entfernen. Die Zentrifuge Rohre mit entionisiertem Wasser nachfüllen, und erneut aussetzen der Kieselsäure mit einem Vortex-Mixer.
- Wiederholen Sie das Zentrifugieren, überstand Speicher- und Resuspension zweimal.
- Entfernen Sie nach der endgültigen Zentrifugation den überstand zu und kratzen Sie die Kieselsäure in einem Keramiktiegel.
- Trocknen im Ofen über Nacht bei 85 ° C.
- Verwenden Sie Kapselung stattgefunden hat, eine Gefriertrocknung Anlage oder einem Ofen unter Vakuum, um Protein-Denaturierung zu vermeiden.
5. Herstellung von Molybdän blau Reagenz (MBR) [Si] Bestimmung
- Ein Kunststoff 1 L volumetrischen Kolben fügen Sie 8 Mmol (10 g) Ammonium Molybdat Tetrahydrat in einem Laborabzug hinzu.
- Dies in 500 mL entionisiertem Wasser unter Rühren auflösen.
- Ansäuern der Lösung durch Zugabe von sorgfältig 60 mL 10 M HCl-Lösung.
- Die letzte Lautstärke 1 l.
6. Herstellung von Para-Aminophenol Sulfat Reduktionsmittel (RA) [Si] Bestimmung
- Legen Sie eine Volumetrische Glaskolben 500 mL in einem Wasserbad bei Raumtemperatur auf einem Rührer Teller in einem Laborabzug.
- 111 Mmol (10 g) wasserfreier Oxalsäure, 19.5 Mmol (3,35 g) Para-Aminophenol Sulfat und 16 Mmol (2 g) Natrium-Sulfit und hinzufügen in 250 mL Wasser auflösen.
- Vorsichtig und langsam 92 g (50 mL) von gesättigten Schwefelsäure unter Rühren und warten Sie, bis die Lösung abkühlen lassen.
- Zu guter Letzt bis 500 mL mit entionisiertem Wasser verdünnen.
7. Silicomolybdic Säure-Assay auf monomerer Kieselsäure-Arten
- In einer 5 mL-Kunststoff-Phiole verdünnte 300 µL des MBR in Schritt 5.4 mit 3 mL entionisiertem Wasser hergestellt.
- Fügen Sie 10 µL einer Apotheke Nagelprobe Lösung und schütteln zu mischen.
Hinweis: Diese Lösung wird langsam Vergilben. - Fügen Sie nach genau 15 min 1,6 mL des Reduktionsmittels bereit aus Abschnitt 6, der gelbe Silicomolybdate Komplex zu seiner blauen Isomer zu reduzieren.
- Lassen Sie eine blaue Farbe, mindestens 2, aber nicht mehr als 24 h zu entwickeln.
- Messen der Probe Extinktion bei 810 nm in einem UV-Vis Spektralphotometer und [Si] gegen eine Kalibrierungskurve zu berechnen.
8. Silico Molybdic Acid Assays auf Polymeren Silica-Arten
- Zur Messung der Konzentration von Polysilicate Spezies Methode Molybdän blau in einem Microcentrifuge Schlauch kombinieren Sie 750 µL 2 M Natronlauge mit 750 µL Kieselsäure Aussetzung.
- Dichtung und Ort in einem Microcentrifuge Schwimmer.
- Stellen Sie sicher, dass genügend Freiraum in der Röhre zu verhindern durch Druckaufbau Platzen übrig bleibt.
Hinweis: Ein Headspace von 500 µL ist in der Regel ausreichend, um dies zu vermeiden. Alternativ kann das Verfahren in geöffnete Fläschchen erfolgen, solange Flüssigkeitsverlust durch Verdunstung berücksichtigt wird.
- Stellen Sie sicher, dass genügend Freiraum in der Röhre zu verhindern durch Druckaufbau Platzen übrig bleibt.
- Schweben Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in einem Wasserbad auf 80 ° C erhitzt und für 1 h auflösen lassen.
- Nach 1 h vergangen ist, entfernen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen und wischen Sie die außen trocken.
- Sobald Sie abgekühlt, kann [Si] bestimmt werden, wie oben beschrieben, wie in 7.2 bis 7.5 beschrieben.
9. Bradford Testverfahren zur Bestimmung der Proteinkonzentration an Kieselsäure
- Legen Sie eine vorgegebene Menge an (Raumtemperatur) Bradford-Reagenz und Probe in jedem zugeordneten Küvette (siehe Tabelle 1 und Tabelle 2 für bestimmte Volumes). Verwenden Sie Einweg-Pipettenspitzen für jede Küvette zu vermeiden Volumen Veränderungen aufgrund der Beschaffenheit des Reagens und wiederholen jeden Punkt in dreifacher Ausfertigung.
- Jede Küvette durch 3 mal umdrehen und lassen für 10 min. zu entwickeln.
- Messung der Extinktion bei 595 nm mit reinen überstand als leer.
- Berechnen der ursprünglichen Extinktion von jedem Küvette durch Subtraktion aus jeder Messung der Extinktion für die Kontrollprobe (Küvette Nr. 0 in beiden Tests) gefunden.
- Berechnen Sie die Konzentration des Proteins der unbekannten Probe mit einer Kalibrierkurve (Abbildung 3). Im Falle einer Verwässerung der ursprünglichen Probe muss der Verdünnungsfaktor berücksichtigt werden.
- Erstellen Sie eine Eichkurve für jeden Satz von Experimenten durch Plotten gemessene Extinktion gegen Konzentration der BSA, zufällige Schwankungen zu vermeiden, die Empfindlichkeit des Tests beeinflussen könnten.
- Obwohl dieses Protein Assay gemeint, BSA als Standard zu verwenden, um jede Art von Protein zu quantifizieren, Erstellen einer Kalibrierkurve für jede spezifische Protein des Interesses für verbesserte Genauigkeit.
- Wenn der Proteingehalt der unbekannten Probe höher sein als der überdachten Bereich für die Eichkurve voraussichtlich wird, verdünnen Sie es nach Bedarf.
- Ermitteln Sie Protein-Inhalt für jede Probe während Resuspension möglich Proteinverlust zu überwachen.
Representative Results
Die oben beschriebenen Techniken sind in der Lage, konsequent und reproduzierbar Kieselerde auszufällen. Dies ist am einfachsten durch die schnell einsetzende Trübung in das Reaktionsgefäß zu bestimmen, welche nach Beendigung der Erregung spontan in ein dickes Koagulum gefällte Kieselsäure (Abbildung 2) begleichen. Das Ausmaß der Reaktion und damit Ertrag kann durch die Messung der Mass dieser Koagulum nach Trennung bestätigt werden und ist in der Regel 58 ± 6,5 % (Abbildung 4, gelb).
Weitere Einblicke in den Verlauf der Reaktion erzeugt werden kann, durch eine Anpassung der Molybdän blau spektroskopische Methode zur Erkennung des Betrags der nicht umgesetzten Monomeren Silikat-Arten sowie den Arten, die auf reagiert haben bilden Polysilicates oder "Oligomere", aber nicht gelungen, ausreichenden Größe, um gerinnen zu erreichen (Abbildung 4, rot und blau jeweils).
Diese spezifischen Kieselsäure speziationsdaten ist von besonderem Interesse beim Vergleich von verschiedenen Titration Wirkungsgrade für die Fällung Reaktion - D.H. wie der letzte Reaktion pH-Wert und die Rate, mit der diese erreicht die Polymerisation von Monomeren Kieselsäure, betrifft eine "Oligomer" und seine anschließende Gerinnung solide Siliziumdioxid. Ändern die Menge der Säure im Stadium 2.4 etwas hinzugefügt, unter - oder over - titration des Reaktionsgemisches kann sein (Abbildung 5) durchgeführt. Durch die Messung der Kieselsäure Speziation wieder für diese beiden Fälle, ist ein deutlicher Unterschied in der Reaktion Fertigstellung (Abbildung 4) trotz nur geringfügige Änderungen an dem Profil der Titration der Reaktion (Abbildung 5) ersichtlich.
Obwohl kein Unterschied zwischen dem Konsum von Monomeren Arten für die drei Reaktion Fälle (verbleibende zwischen 29-33 %) vorhanden ist, gibt es ein deutlichen Unterschied in der Höhe von Oligomere Kieselsäure-Arten, die in jedem Fall auszufällen. Dies ist im Einvernehmen mit der traditionellen Theorie auf Sol-Gel Kieselsäuren - im Fall "aneinander", dass der pH-Wert mehr, höher gehalten wird, zulassend einzelne Partikel zu wachsen und damit effiziente Koagulation Beihilfe; im Fall "Überschwingen", die, den die Gerinnung viel schneller durch die schnelle Titration induziert wird, daher weniger der Gattung Kieselsäure gewachsen eine ausreichende Größe zu gerinnen und gefangen in der Kolloid-Phase bleiben. 16
Angesichts der Bedeutung der Titration auf Kieselsäure Bildung, ist a priori Kenntnis der entsprechenden Titration Volumen unerlässlich. Obwohl nicht extrahierbaren aus der Stöchiometrie der Reaktion aufgrund der komplexen Protonierung Verhalten von Amin Zusätze und Änderung in Silica Oberfläche Säure auf Koagulation, höchst zuverlässige empirischen Beziehungen zwischen Inhalt, Konzentrationen und Titer Bände sind leicht erzeugt (Abb. 1).
Nach erfolgter Koagulation können Materialoberflächen leicht durch den Einsatz von sauren Elution geändert werden, wie vor kurzem von den Autoren an anderer Stelle berichtet wurde. 13 Dies ermöglicht eine Feineinstellung der Materialeigenschaften wie Komposition, Porosität und chemische Aktivität des Additivs (Abb. 6a und b).
In dieser Studie BSA diente als Vorbild Verkapselungen Enzym, jedoch können die hier beschriebenen Techniken für mehrere Enzyme17,18verwendet werden. Das Verfahren zur Proteindetektion ist das Bradford Assay Protokoll,19 mit der Überstände aus jedem Zyklus Zentrifugation gespeichert. Die Menge des Proteins im Überstand wird anhand einer Kalibrationskurve erstellt von bekannten Mengen an BSA im überstand einer Probe mit NULL Proteingehalt (Kontrollprobe) aufgelöst. Die Menge an Protein in Kieselsäure gekapselt wird durch Subtraktion des gefundenen Proteins in Überstände aus der ursprünglichen Menge des Proteins hinzugefügt berechnet. Das einzige Reagenz benötigt für den Assay ist das Bradford-Reagenz (beschafft oder nach standard Rezepten hergestellt).
Es gibt drei Arten von Test-Format, je nach dem Probenvolumen, die erwartete Menge des Proteins erkannt werden und die Messmethode verwendet. Hierin, gefolgte Format für ein Spektralphotometer angegeben ist, erfordert Einweg-Küvetten von Makro und Mikro Größe und kann von 10 µg/mL bis 1,4 mg/mL Protein erkennen.
Abbildung 7 zeigt die Menge des Proteins nach jedem Waschen (Schritt 4.3) erkannt als % des ursprünglichen Proteins (war 50 mg). Rund um ~ 50 % der BSA im überstand nach der ersten Zentrifugation festgestellt die Immobilisierung von ~ 50 % Effizienz betrifft. Da gab es in den folgenden Waschungen erkannten keinen BSA BSA (oder anderen Enzym) sicher während der Kieselsäure Synthese mit keine Auslaugung - gekapselt werden konnte ist dies ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Um das Vorhandensein von BSA in der Kieselsäure produziert zu bestätigen, wurde Fourier transformieren Infrarot-Spektroskopie (FTIR) Analyse durchgeführt. Das Vorhandensein von den charakteristischen Banden des Amid I und II im Bereich von 1.500/cm und 1650/cm (Abbildung 8) in den Proben vorbereitet, im Beisein von BSA, aber nicht im Steuerelement Proben (keine BSA) bestätigte das Vorhandensein von BSA im Feststoff.
Neben der Methode der zurückgekühlt beschriebenen (BSA während der Neutralisation des Reaktionsgemisches hinzugefügt) gibt es andere mögliche Variationen z. B.BSA Zusatz während des Mischens der Silikat und die additive Lösungen vor Neutralisation oder Enzym vor ihrem mischen und Neutralisierung der Silikat oder Additiv Projektmappe hinzugefügt. Einige dieser Möglichkeiten wurden weiter erforscht und die Immobilisierung Wirkungsgrade (Masse des BSA unbeweglich wie ein Prozentsatz des Enzyms hinzugefügt, um das Reaktionssystem, berechnet der Bradford-Test anhand) und die Höhe der BSA in der endgültigen Kieselsäure waren gemessen) Konzentration der BSA an Kieselsäure als prozentualer Anteil der zusammengesetzten Gesamtgewicht produziert, siehe Abbildung 9). Es war klar, dass wenn BSA nicht umgesetzten Reagenzien (Fälle A-C in Abbildung 9) hinzugefügt wurde, gab es keine erhebliche Unterschiede in der Immobilisierung Effizienz oder die Höhe der BSA in der entstehende Verbund. Wenn BSA während Kieselsäure Bildung (Fall D in Abbildung 9) hinzugefügt wird, waren beide aber Immobilisierung Effizienz und die Höhe der BSA im Endprodukt deutlich geringer. Trotz dieser Unterschiede blieb die durchschnittliche Menge an Kieselsäure produziert (zwischen 85-90 mg). Diese Beobachtungen können auf der Grundlage der Ionisation (oder isoelektrischen Punkt) des BSA, Silikat/Kieselerde und das Additiv erklärt werden. Die verschiedenen Methoden der Zusatz ermöglichen verschiedene Interaktionen zwischen Enzym und Kieselsäure Vorläufer. Als der pH-Wert zum Zeitpunkt der Zugabe des Enzyms ändert wird die Ionisation der einzelnen Arten Intermolekulare Wechselwirkungen bestimmen, die welche wiederum die Immobilisierung Effizienz steuern wird.
| Küvette Nein | Konzentration der BSA (mg/mL) | Bradford-Reagenz (mL) | Probe (mL) |
| 0 | 0 (Kontrolle) | 1.5 | 0.05 |
| 1 | 0.1 | 1.5 | 0.05 |
| 2 | 0,25 | 1.5 | 0.05 |
| 3 | 0,5 | 1.5 | 0.05 |
| 4 | 0,75 | 1.5 | 0.05 |
| 5 | 1 | 1.5 | 0.05 |
| 6 | 1.25 | 1.5 | 0.05 |
| 7 | Unbekannten Probe (X) | 1.5 | 0.05 |
Tabelle 1: Makro Bradford-Test-Set-up und berechnete Komponente Bände. Gültig für Entschlossenheit Palette 0.1-1.4mg/mL (Bände für 1 replizieren)
| Küvette Nein | Konzentration der BSA (Ug/mL) | Bradford-Reagenz (mL) | Probe (mL) |
| 0 | 0 (Kontrolle) | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 2.5 | 1 | 1 |
| 3 | 5 | 1 | 1 |
| 4 | 7.5 | 1 | 1 |
| 5 | 10 | 1 | 1 |
| 6 | Unbekannten Probe (X) | 1 | 1 |
Tabelle 2: Micro Bradford-Test-Set-up und berechnete Komponente Bände. Gültig für Entschlossenheit range 1-10 µg/mL (Volumen für 1 replizieren)
Abbildung 1 : Titer Volumen gegen Kieselsäure Konzentration für Reaktionssysteme mit DETA oder PEHA als Zusatz erforderlich. Kieselsäure wurde in unterschiedlichen Konzentrationen synthetisiert, unter Beibehaltung einer [N]: [Si] Verhältnis 1 für zwei verschiedene Hilfschemikalien. Fehlerbalken sind eine Standardabweichung um den Mittelwert.
Abbildung 2 : Fotografien von Kieselsäure Koagulum in das Reaktionsgefäß (a) während und (b) nach Erregung, demonstrieren die Trübung der Lösung und die Abrechnung, die sind ein Indikator für eine optimale Reaktion.
Abbildung 3 : Exemplar Eichkurve für Bradford Makro Assay. Überstand von muskelmodelle Kieselsäure Synthese in Abwesenheit von BSA wird mit einer bekannten Menge des Proteins, gemischt nach dem Bradford Analyse durchgeführt wird, wie unter Punkt 9.1 beschrieben.
Abbildung 4 : Endgültige Polymerisation Staaten Kieselsäure Arten für unterschiedliche Reaktionsbedingungen. Kieselsäure wird synthetisiert mit optimalen (Baseline) Bedingungen, sowie wie bei über- oder unter Titration, nach denen relative Kieselsäure Konzentration wird für Monomere oder dimeres Silikate (rot), Polysilicate "Oligomere" (blau) quantifiziert und instabilen gerinnen zu lassen Kieselsäure (gelb).
Abbildung 5 : Progression des pH-Wertes durch Reaktions-System als eine Funktion des ursprünglichen Titer Volumens. Säure wird sofort nach ca. 38 s mischen, dosiert den pH-Wert schnell auf unter 8 Drop verursacht. Danach werden weitere Mengen an Säure automatisch dosiert so dass der pH-Wert 7,0 ± 0,05 300 s nach der ersten Zugabe war. Im Falle zu titrieren war dies nicht erreichbar, wie die Initiale Dosis ausreicht, um den pH-Wert unter 7, erreichte pH-Wert 6,65 nach 300 s fallen. HCl-Anfangsvolumen hinzugefügt für ","Grundlinie"aneinander" und "Überschwingen" 6.90, 7,05 und 7,20 mL bzw..
Abbildung 6 : Repräsentative Eigenschaftsänderungen bei Übersäuerung des koagulierten Kieselsäure Material. (a) Änderung des Additiven Konzentration in Bezug auf die pH, und (b) Änderung der Kieselsäure Porosität in Bezug auf die pH. Übernommen aus: Manning Et al. 13 unter Creative Commons Lizenz.
Abbildung 7 : BSA-Konzentration im muskelmodelle Kieselsäure Synthese Überstände. Bradford-Assays wurden auf Reaktion Überstände nach Zentrifugation, durchgeführt von denen der relative Restbetrag (daher verdeckt von der synthetisierten Kieselsäure) ermittelt wurde.
Abbildung 8 : FTIR Analyse auf muskelmodelle Kieselsäure mit und ohne aktiven Spezies Kapselung. Spektren zeigte: schwarze Linie: muskelmodelle Kieselsäure, graue Linie: reine BSA, blaue Linie: muskelmodelle Kieselsäure mit BSA geladen. Vertikale gestrichelte Linien zeigen charakteristische Amid Bands.
Abbildung 9 : Mit PEHA Immobilisierung Effizienz und die Höhe der BSA im Verbund für Kieselsäure produziert. BSA (A) in die PEHA Lösung vor dem Mischen mit Silikat, hinzugefügt wurde (B) in der Silikat-Lösung vor dem Mischen mit PEHA, (C) nach dem ersten Mischen von PEHA und Silikat-Lösungen, und (D) nach dem Mischen PEHA und Silikat Lösungen und neutralisieren. Effizienz wird gemessen als % BSA als ein Teil der gesamten BSA hinzugefügt, während BSA an Kieselsäure Masse-% Konzentration der BSA im endgültigen Kieselsäure Composite bedeutet aus dem Reaktionsgemisch gekapselt. Fehlerbalken sind eine Standardabweichung um den Mittelwert.
Discussion
Bei den laufenden Arbeiten präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Fällung schnell muskelmodelle Kieselsäure Materialien und Kapselung von Biomolekülen darin. Wir zeigen wichtige Schritte im Rahmen des Verfahrens, nämlich die Höhe der Reaktion initiiert Säure hinzugefügt werden, und den Zeitpunkt der Zugabe von Biomolekül Verkapselungen. Zeigen wir die Wirkung der Säure Zugabemenge auf Reaktion Progression und Ertrag (Abbildung 4 und Abbildung 5, beziehungsweise), und eine Methode zur Kontrolle synthesebedingungen, zulassend Konsistenz trotz dieser Sensibilität gezeigt. Zur aktiven Spezies Kapselung, obwohl einfach in Bezug auf die Verfahren, Kapselung zeigt sich empfindlich auf die Bedingungen des Experiments (Reihenfolge der Zugabe, pH-Wert des Zusatzes, Umweltbedingungen), jedoch Konsistenz in Material Eigenschaften ist wieder erreichbar.
Die synthesebedingungen können geändert werden durch den Einsatz von verschiedenen Zusatzstoffe, von die viele an anderer Stelle veröffentlicht wurden,15 bietet eine Reihe von Morphologien und Porositäten. Weitere, Post-synthetische Techniken zu modifizieren und chemisch Schneider muskelmodelle Kieselsäure Materialien sind z. B. milde Reinigung13 und Oberfläche Amin Dekoration berichtet worden. 20 schließlich ist aufgrund der milden, wässrige Art der Synthese, in Situ Kapselung möglich für ein breiteres Spektrum von Substraten als hier gezeigt von Enzymen17,18 bis hin zu ganzen Zellen,21 Metall Salze, pharmazeutische Wirkstoffe22 ,23 und Quantum Dots. 24
Im Gegensatz zu anderen Bio-vermittelten Kieselsäure Synthesen (z. B. die MCM-41 oder SBA-15 Familie von Materialien) bestellte polyfunktionalen Artder muskelmodelle Zusatzstoffe produzieren können nicht porenstrukturen, noch höchst Monodisperse Partikelgröße Distributionen Charakteristisch für Stöber-Typ Kieselsäure. 25 Dies ist aufgrund der fehlenden wohldefinierte micellenbildung Verhalten der muskelmodelle Zusatzstoffe (außerhalb von Sonderfällen)26 mit ihrer erhöhten katalytische Aktivität über monofunktionalen Amin-haltige Zusätze gekoppelt. 26
Auf der anderen Seite ermöglicht dieses polyfunktionalen additiver Natur den Einsatz kürzere Reaktionszeiten und milder Temperatur & Druck im Vergleich zu anderen Bio-vermittelten Kieselsäure-Synthesen. Dies führt auch auf die Möglichkeit der Raumtemperatur Additiv Elution wie oben beschrieben, die noch nicht für diese anderen Kieselsäure Familien wegen der Besonderheiten ihrer Oberflächenchemie erreicht werden. 27 , 28 , 29 folglich muskelmodelle Kieselsäure Materialien nachweislich sowohl wirtschaftlich als auch praktisch, in einem größeren Maßstab, was zu einfacher Vermarktung und Entwicklung produzieren werden. 14
Zusammenfassend stellt muskelmodelle Kieselsäure Synthese eine schnelle, einfache Methode zur Herstellung von aktiven Spezies unterstützt oder Gas sorbent Media. Durch strenge Kontrolle des pH-Wertes während und nach der Reaktion kann eine breite Palette von Kieselsäure-Amin Composites mit unterschiedlichen Eigenschaften synthetisiert werden weiter durch die Möglichkeit der in Situ Kapselung aus einem Array von verschiedenen organischen ergänzt, anorganischen oder Bio-organische Materialien. Obwohl unabhängige Post-synthetische Modifikation muskelmodelle additive und Verkapselungen Konzentration noch nicht erreicht werden, sind diese Methoden einen vielversprechenden Schritt in Richtung umweltverträgliche chemische Prozesse.
Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Die Autoren danken den finanziellen Unterstützung aus dem Department Chemie- und Bioingenieurwesen (Universität von Sheffield) und EPSRC (EP/L017059/1 und EP/P006892/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica synthesis | |||
| Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
| Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
| Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
| Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
| Silicomolybdic acid assay | |||
| Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
| Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
| Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford assay | |||
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Equipment | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
| Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
| UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
