Summary
यहां, हम एक को प्रेरित सिलिका सामग्री और उसमें एंजाइमों को संश्लेषित करने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । सिलिका सोडियम सिलिकेट और एक अमीन ' additive ' है, जो एक नियंत्रित दर पर बेअसर संयोजन द्वारा संश्लेषित है । सामग्री गुण और समारोह में सीटू एंजाइम स्थिरीकरण या के बाद-encapsulated additives के सिंथेटिक एसिड रेफरेंस द्वारा या तो बदला जा सकता है ।
Abstract
यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लक्ष्य को प्रेरित सिलिका सामग्री संश्लेषित करने के लिए है, उसमें एंजाइम encapsulation प्रदर्शन, और आंशिक रूप से या पूरी तरह से एसिड रेफरेंस द्वारा ही शुद्ध । एक polyfunctional के साथ सोडियम सिलिकेट के संयोजन से प्रेरित additive, सिलिका तेजी से बेअसर पर परिवेश की स्थिति पर गठन किया है ।
बेअसर दर और सिलिका उपज पर और अधिक अणु इसके अलावा बिंदु के प्रभाव की जांच कर रहे हैं, और एक अतिरिक्त अणु स्थिरीकरण क्षमता बदलती के अलावा बिंदु के लिए सूचित किया है । अन्य छिद्रित सिलिका संश्लेषण विधियों के विपरीत, यह दिखाया गया है कि हल्के से प्रेरित सिलिका संश्लेषण के लिए आवश्यक शर्तों नाजुक के encapsulation के साथ पूरी तरह से संगत कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, हल्के शर्तों सभी संश्लेषण और संशोधन चरणों में उपयोग किया जाता है, एक नंगे सामग्री और सक्रिय समर्थन माध्यम के रूप में स्केल-अप और व्यावसायीकरण के लिए प्रेरित सिलिका एक होनहार लक्ष्य बना रही है ।
संश्लेषण की स्थिति के लिए अत्यधिक संवेदनशील होने के लिए दिखाया गया है, यानी, बेअसर दर और अंतिम संश्लेषण पीएच, लेकिन इन मापदंडों पर तंग नियंत्रण ऑटो अनुमापन तरीकों के उपयोग के माध्यम से प्रदर्शन किया है, उच्च reproducibility में अग्रणी प्रतिक्रिया प्रगति मार्ग और उपज ।
इसलिए, प्रेरित सिलिका एक उत्कृष्ट सक्रिय सामग्री समर्थन पसंद है, कई वर्तमान अनुप्रयोगों के प्रति बहुमुखी प्रतिभा दिखा, उन तक सीमित नहीं यहां का प्रदर्शन किया, और भविष्य अनुप्रयोगों में शक्ति ।
Introduction
औद्योगिक उत्प्रेरक के लिए एक संरचनात्मक समर्थन के रूप में सिलिका का उपयोग अच्छी तरह से स्थापित है, बेहतर उत्प्रेरक गतिविधि, स्थिरता और प्रक्रिया,1 इसलिए संभावित परिचालन लागत को कम करने के लिए अनुमति देता है । ये लाभ एंजाइम स्थिरीकरण के मामले में जटिल हैं, एक सिलिका ताकना प्रणाली के भीतर भंडारण के रूप में अपने मुक्त समकक्ष पर एंजाइम जीवनकाल पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकते हैं । तदनुसार, बहुत प्रयास सबसे अच्छा तरीका है सिलिका प्रजातियों के लिए एंजाइमों संलग्न खोजने में व्यय किया गया है, कई siliceous ठोस समर्थन करता है पर स्थिरीकरण के विभिंन तरीकों का उपयोग कर जांच की तुलना समीक्षाएं के साथ । 2 , 3 , 4
एंजाइमों आम तौर पर physisorption या आबंध संबंध के माध्यम से संलग्न कर रहे हैं, एक छिद्रित सामग्री के भीतर encapsulation के अलावा । 5 हालांकि, वहां महत्वपूर्ण कमियां है प्रत्येक विधि से संबंधित: physisorption सिलिका और परमाणु, जो बहुत आसानी से अस्वीकार्य करने के लिए अग्रणी प्रतिक्रिया की स्थिति से कमजोर हो सकता है के बीच क्षणिक सतह बातचीत पर निर्भर करता है एंजाइम नमकीन पानी । बहुत मजबूत आबंध लगाव आमतौर पर सक्रिय प्रजातियों के कम संरचना स्वतंत्रता के कारण कम गतिविधि में परिणाम है । encapsulation एंजाइम अप्राप्यता या diffusional सीमाओं के कारण कम गतिविधि में परिणाम कर सकते हैं । 6
मामूली के क्षेत्र में हाल ही में घटनाक्रम (अक्सर ' प्रेरित ' डब) सिलिका syntheses सामग्री संश्लेषण के दौरान और अन्य सक्रिय प्रजातियों के बीच में सीटू encapsulation की स्थापना की है । 7 , 8 , 9 यह विधि पारंपरिक स्थिरीकरण की खामियों के कई नकारती है-chemisorption दृष्टिकोण के विपरीत-विरोधी अणु के गठन की स्वतंत्रता कमजोर noncovalent बातचीत के उपयोग के द्वारा बनाए रखा है, लेकिन के रूप में ताकना गुहा रूपों के आसपास अब भी इस पर रोक लगाई गई है । दरअसल, encapsulation के लिए एक सीमा के लिए काम करने के लिए प्रदर्शन किया गया है और यहां तक कि पूरे कोशिकाओं,10 और इस तरह की कठोर प्रक्रिया शर्तों के कारण निष्क्रियण के रूप में प्रेरित सिलिका प्रभाव में encapsulation के माध्यम से बचा जा सकता है । 7 , 11
यहां वर्णित विधि का लक्ष्य नियंत्रणीय गुणों के साथ एक छिद्रपूर्ण सिलिका तैयार करना है, परिवेशी स्थितियों के तहत, एक जैव प्रेरित कार्बनिक additive का उपयोग करके । विधि आसानी से या तो अकार्बनिक या जैविक अणुओं, जिनमें से एक चयन दिखाया जाएगा के encapsulation शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । हम आगे एसिड रेफरेंस के माध्यम से कार्बनिक टेम्पलेट को हटाकर वांछित थोक संपत्तियों और शुद्धिकरण को प्राप्त करने के लिए यथा-संश्लेषण सामग्री को संशोधित करने के लिए एक सतही विधि दिखाते हैं.
टेंपलेट छिद्रित सिलिका के पारंपरिक संश्लेषण की तुलना में समर्थन करता है (जैसे,सिलिका सामग्री एमसीएम-४१ या SBA-15 की तरह supramolecular surfactant सभाओं के माध्यम से खाके)12 इस विधि काफी तेजी से और मामूली है, सक्षम करने सिलवाया, कई स्थिरीकरण कदम और श्रमसाध्य शुद्धिकरण के लिए की आवश्यकता के बिना सीटू encapsulation में . इसके अलावा, एसिड रेफरेंस के इस्तेमाल के बजाय calcination से जैविक सतह functionalization की संभावना खुलती है.
यह विधि अत्यधिक सक्रिय प्रजातियों में काम करने वालों के लिए लागू है जो physisorption या आबंध स्थिरीकरण के लिए अप्रभावी पाया है । यह भी प्रक्रिया पैमाने पर शोध उन के लिए उपयोगी है के रूप में-प्रेरित संश्लेषण पारंपरिक औद्योगिकीकरण सिलिका सामग्री की तुलना में विशिष्ट रूप से तैनात है । 13 , 14 इस विधि के अनुप्रयोगों के लिए अनुशंसित नहीं है जो एक आदेश दिया सरणी सामग्री के भीतर pores जैसे,फोटॉनिक्स के लिए, सामग्री संरचना के रूप में थोक संपत्तियों में किसी भी समानता के बावजूद परिक्रमा की है ।
Protocol
1. प्रणेता समाधानों की तैयारी (और वैकल्पिक Encapsulant समाधान)
- एक १८० मिलीलीटर प्लास्टिक कंटेनर में, सोडियम सिलिकेट pentahydrate के उपाय १.५ mmol (३१८.२ मिलीग्राम), और जल के 20 मिलीलीटर में भंग ।
- इसी प्रकार, एक दूसरे कंटेनर में, pentaethylene hexamine (PEHA, ५८.१ मिलीग्राम) के ०.२५ mmol को मापने और पानी के 20 मिलीलीटर में भंग ।
- वैकल्पिक अमीन युक्त यौगिकों जैसे,diethylenetriamine (DETA) या triethylenetetraamine (तेत) का उपयोग करते हैं, यह सुनिश्चित करें कि कुल Si: N तिल अनुपात 1 पर स्थिर रहता है (यानी, ०.५ mmol के DETA या ०.३७५ mmol में तेत के संगत वर्णित कार्यविधि)15.
- जैसे बहुलक अमीन additives का उपयोग करते हुए,पाली (ethyleneimine) (पी) या पाली (allylamine हाइडरोक्लॉराइड) (पः), 1 मिलीग्राम/एमएल (अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा)15की एकाग्रता बनाए रखें ।
सावधानी: एक धुएं डाकू के अंदर ही इन अमीनों को संभाल, के रूप में वे संक्षारक या उनके शुद्ध रूपों में विषाक्त कर रहे है (विशेष रूप से वाष्पों के रूप में) ।
- संश्लेषण के दौरान सीटू encapsulation में प्रदर्शन करने के लिए, प्रोटीन के एक पूर्व निर्धारित द्रव्यमान को भंग (स्पेसिफिकेशंस ५० मिलीग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, BSA) के 5 मिलीलीटर पानी में । पानी की इस मात्रा में पानी की मात्रा से घटाना सोडियम सिलिकेट pentahydrate के विघटन के लिए इस्तेमाल किया जाना है ।
- अपनी संरचना में फेरबदल के बिना प्रोटीन विघटन को कम करने के लिए, एक बार पानी के साथ मिश्रित, कंटेनर कैप और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान । विघटन की प्रगति पर कभी-कभार जांच करें, अधिमानतः चमचे के बिना ।
2. सिलिका संश्लेषण
- १८० मिलीलीटर कंटेनर में से एक में सोडियम सिलिकेट pentahydrate और PEHA के समाधानों को संयोजित करें और अंतिम समाधान वॉल्यूम ४१ mL (या ४६ यदि सीटू encapsulation में छोड़ा जाता है) बनाने के लिए पर्याप्त जल जोड़ें ।
- एक चमचे की थाली के शीर्ष पर सोडियम सिलिकेट और PEHA समाधान के हौसले से तैयार मिश्रण प्लेस, एक सरगर्मी बार जोड़ने के अनुरूप मिश्रण प्रदान करने के लिए ।
- इस पोत में, एक पीएच जांच निलंबित और प्रारंभिक पीएच रिकॉर्ड ।
- इस स्तर पर, वैकल्पिक रूप से, प्रारंभिक मिश्रण के एक ७५० µ l aliquot के बाद निर्धारण के लिए निकाल [Si] एकाग्रता का उपयोग कर मोलिब्डेनम ब्लू स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक परख, के रूप में चरण ८.१ में वर्णित.
- 1 एम एचसीएल के एक पूर्व निर्धारित मात्रा जोड़कर संश्लेषण शुरू, चित्रा 1से गणना के रूप में, और turbidity के तत्काल विकास का पालन ( चित्रा 2देखें)
- जैसे ही एसिड के अलावा खत्म हो गया है, encapsulant समाधान जोड़ें (यदि कोई हो) के रूप में जल्दी के रूप में संभव है ।
नोट: अंतिम मात्रा दी इन मात्रा में कुल प्रतिक्रिया मिश्रण की ५० मिलीलीटर है, एसआई और 30mM के एन सांद्रता के लिए अग्रणी । यह एक निरंतर राशि से ऊपर सभी मात्रा गुणा द्वारा वांछित के रूप में बढ़ाया जा सकता है । - प्रतिक्रिया पूरा निर्धारित करने के लिए 5 मिनट के बाद पीएच रिकॉर्ड; सुनिश्चित करें कि पीएच 7 ± ०.०५ है ।
3. एसिड की सामग्री का रेफरेंस
- (या तो एक के रूप में बनाया रक्तकण के रूप में या सिलिका का एक पूर्व संश्लेषित नमूना resuspend द्वारा) की प्रतिक्रिया पूर्ण पहुंच गया है के बाद उत्पादित सिलिका की संरचना को संशोधित करें आगे अम्ल के अतिरिक्त द्वारा.
- यदि सिलिका resuspend, मिश्रण लगभग १५० मिलीग्राम के रूप में तैयार एक १८० मिलीलीटर प्लास्टिक कंटेनर में पानी की १०० मिलीलीटर के साथ प्रेरित सिलिका, और एक सरगर्मी थाली के शीर्ष पर जगह है ।
- एक बार निलंबन अच्छी तरह से मिश्रित है, पोत में एक पीएच जांच निलंबित ।
- आगे एचसीएल में अनुमापन जब तक वांछित पीएच (7 और 2 के बीच) तक पहुंच गया है और ca .1 मिनट के लिए स्थिर करने की अनुमति ।
- सिस्टम पूरी तरह से equilibrated है सुनिश्चित करने के लिए एक आगे 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और उसके बाद ठोस सिलिका को अलग करने के लिए आगे बढ़ें ।
4. सिलिका जुदाई और सुखाने
- ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों में प्रेरित सिलिका निलंबन नहीं कर सकते ।
- 15 मिनट के लिए ५,००० g पर निलंबन केंद्रापसारक ।
- और अधिक विश्लेषण के लिए (जैसे, ब्रैडफोर्ड परख, नीचे देखें) के लिए केंद्रापसारक और स्टोर के बाद supernatant निकालें । पानी के साथ केंद्रापसारक ट्यूबों फिर से भरना, और एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर सिलिका पुनः निलंबित ।
- इस केंद्रापसारक, supernatant भंडारण, और फिर से दो बार निलंबन दोहराएं ।
- अंतिम केंद्रापसारक के बाद, supernatant को हटाने और एक सिरेमिक क्रूसिबल में सिलिका परिमार्जन ।
- ८५ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एक ओवन में सूखी ।
- यदि encapsulation जगह ले ली है, एक फ्रीज-सुखाने की सुविधा या वैक्यूम के तहत ऑपरेटिंग प्रोटीन विकार से बचने के लिए एक ओवन का उपयोग करें ।
5. [Si] निर्धारण के लिए मोलिब्डेनम ब्लू रिएजेंट (MBR) का उत्पादन
- एक प्लास्टिक 1 एल volumetric कुप्पी, एक धुएं अलमारी में 8 mmol (10 ग्राम) अमोनियम molybdate टेट्राहाइड्रेट जोड़ें ।
- ५०० मिलीलीटर में इस भंग पानी सरगर्मी के तहत ।
- Acidify 10 एम एचसीएल सॉल्यूशन के ६० एमएल को ध्यानपूर्वक जोड़कर समाधान को ध्यान में रखकर ।
- अंतिम वॉल्यूम को 1 L पर समायोजित करें ।
6. [Si] निर्धारण के लिए पैरा-aminophenol सल्फेट को कम करने वाले एजेंट (आरए) का उत्पादन
- एक धुएं अलमारी में एक चमचे की थाली पर परिवेश के तापमान पर एक पानी के स्नान में एक ५०० मिलीलीटर गिलास volumetric कुप्पी रखें ।
- पैरा-aminophenol सल्फेट के निर्जल oxalic एसिड, १९.५ mmol (३.३५ ग्राम) के १११ mmol (10 ग्राम) और सोडियम mmol के 16 sulfite (2 ग्राम) जोड़ें, और २५० मिलीलीटर पानी में भंग ।
- सरगर्मी से और समाधान के लिए ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करते समय ध्यान से और धीरे से संतृप्त सल्फर एसिड की ९२ जी (५० एमएल) जोड़ें ।
- अंत में, पानी के साथ ५०० मिलीलीटर को पतला ।
7. Monomeric सिलिका प्रजातियों पर Silicomolybdic अम्ल परख
- एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक की शीशी में, पतला ३०० µ l के साथ चरण ५.४ में उत्पादित MBR के 3 मिलीलीटर पानी की.
- एक silicic एसिड परीक्षण समाधान के 10 µ एल जोड़ें और मिश्रण करने के लिए हिला ।
ध्यान दें: यह समाधान धीरे पीले रंग बदल जाएगा । - ठीक 15 मिनट के बाद, अपने नीले isomer के लिए पीले silicomolybdate परिसर को कम करने के लिए धारा 6 से तैयार कम एजेंट के १.६ मिलीलीटर जोड़ें ।
- की अनुमति दें एक नीले रंग के लिए विकसित करने के लिए कम से 2, लेकिन अधिक नहीं 24 एच ।
- एक यूवी विज़ spectrophotometer में ८१० एनएम पर नमूना अवशोषक उपाय और एक अंशांकन वक्र के खिलाफ [Si] की गणना ।
8. Silico Molybdic अम्ल परख पॉलिमर सिलिका प्रजातियों पर
- मोलिब्डेनम ब्लू विधि का उपयोग कर polysilicate प्रजातियों की एकाग्रता को मापने के लिए, एक microcentrifuge ट्यूब में, ७५० हीड्राकसीड एल सिलिका निलंबन के साथ 2 एम सोडियम µ समाधान के ७५० µ एल गठबंधन ।
- सील और एक microcentrifuge नाव में जगह है ।
- सुनिश्चित करें कि पर्याप्त headspace ट्यूब में छोड़ दिया दबाव का निर्माण करने के कारण फट को रोकने के लिए है ।
नोट: ५०० µ एल के एक headspace आम तौर पर इस से बचने के लिए पर्याप्त है । वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया को खुले शीशियों में किया जा सकता है ताकि वाष्पीकरण के कारण तरल नुकसान के लिए जवाबदेह है ।
- सुनिश्चित करें कि पर्याप्त headspace ट्यूब में छोड़ दिया दबाव का निर्माण करने के कारण फट को रोकने के लिए है ।
- एक पानी ८० डिग्री सेल्सियस के लिए गरम स्नान में microcentrifuge ट्यूबों फ्लोट और यह 1 एच के लिए भंग करने के लिए छोड़ दें ।
- 1 घंटे के बाद समाप्त हो गया है, microcentrifuge ट्यूबों को हटा दें और बाहर सूखी पोंछ ।
- एक बार ठंडा, [Si] निर्धारित किया जा सकता है के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में ७.२ चरणों में वर्णित के रूप में ७.५ ।
9. सिलिका में प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए ब्रैडफोर्ड परख प्रक्रिया
- (कक्ष तापमान) ब्रैडफोर्ड रिएजेंट और प्रत्येक असाइन किए गए cuvette में नमूना ( तालिका 1 और तालिका 2 विशिष्ट वॉल्यूंस के लिए देखें) की एक पूर्व निर्धारित मात्रा सम्मिलित करें । हर cuvette के लिए डिस्पोजेबल पिपेट सुझावों का प्रयोग करें एजेंट की प्रकृति के कारण मात्रा परिवर्तन से बचने के लिए और तपसिल में प्रत्येक बिंदु को दोहराने ।
- 3 बार पलटने से प्रत्येक cuvette मिश्रण और 10 मिनट के लिए विकसित करने के लिए छोड़ दें ।
- ५९५ एनएम पर उपाय अवशोषक रिक्त के रूप में शुद्ध supernatant का उपयोग कर ।
- प्रत्येक माप से घटाकर प्रत्येक cuvette के मूल अवशोषण की गणना नियंत्रण नमूने के लिए पाया अवशोषक (दोनों परख में cuvette No. 0) ।
- एक अंशांकन वक्र (चित्रा 3) का उपयोग कर अज्ञात नमूना के प्रोटीन एकाग्रता की गणना । मूल नमूने के कमजोर पड़ने के मामले में, कमजोर पड़ने के कारक के लिए जवाबदेह होने की जरूरत है ।
- यादृच्छिक उतार चढ़ाव है कि परख संवेदनशीलता को प्रभावित हो सकता है से बचने के लिए BSA की एकाग्रता के खिलाफ मापा अवशोषण की साजिश रचने से प्रयोगों के प्रत्येक सेट के लिए एक अंशांकन वक्र बनाएं ।
- हालांकि इस प्रोटीन परख के लिए एक मानक के रूप में BSA का उपयोग करने के लिए प्रोटीन के किसी भी प्रकार मात्रा का होता है, बेहतर सटीकता के लिए ब्याज की प्रत्येक विशिष्ट प्रोटीन के लिए एक अंशांकन वक्र बनाएं ।
- यदि अज्ञात नमूने के प्रोटीन सामग्री अंशांकन वक्र की कवर सीमा से अधिक होने की उंमीद है, यह जरूरत के रूप में पतला ।
- प्रत्येक नमूने के लिए पुनः के दौरान प्रोटीन सामग्री का निर्धारण-निलंबन संभव प्रोटीन हानि की निगरानी के लिए ।
Representative Results
ऊपर वर्णित तकनीक लगातार और reproducibly हाला सिलिका करने में सक्षम हैं । यह प्रतिक्रिया पोत है, जो आंदोलन की समाप्ति पर सहज रूप से उपजी सिलिका की एक मोटी रक्तकण में बसा होगा (चित्रा 2) के भीतर turbidity की तेजी से शुरुआत के द्वारा निर्धारित करने के लिए सबसे आसान है । प्रतिक्रिया की हद और इसलिए उपज जुदाई के बाद इस रक्तकण के द्रव्यमान को मापने के द्वारा पुष्टि की जा सकती है और आम तौर पर ५८ ± ६.५% (चित्रा 4, पीला) है ।
इसके अलावा प्रतिक्रिया प्रगति में अंतर्दृष्टि मोलिब्डेनम नीले स्पेक्ट्रोस्कोपी विधि के लिए अनुकूल monomeric सिलिकेट प्रजातियों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन प्रजातियों जो polysilicates या ' oligomers ' फार्म के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की है की राशि का पता लगाने के द्वारा उत्पंन किया जा सकता है, लेकिन coagulate (चित्रा 4, लाल और नीले क्रमशः) के लिए पर्याप्त आकार तक पहुंचने में कामयाब नहीं है ।
इस विशिष्ट सिलिका speciation डेटा विशेष ब्याज की है जब वर्षा प्रतिक्रिया के लिए विभिंन अनुमापन क्षमता की तुलना-I.E. कैसे अंतिम प्रतिक्रिया पीएच और दर जिस पर यह पहुंच गया है monomeric सिलिका के बहुलकीकरण को प्रभावित करता है एक ' oligomer ' और उसके बाद के लिए ठोस सिलिका के जमावट । एसिड की मात्रा को संशोधित करके चरण २.४ में जोड़ा थोड़ा, के तहत या अधिक-प्रतिक्रिया मिश्रण के अनुमापन (चित्रा 5) किया जा सकता है । सिलिका speciation को मापने के द्वारा फिर से इन दोनों मामलों के लिए, एक स्पष्ट अंतर प्रतिक्रिया पूर्णता में देखा जा सकता है (चित्रा 4) प्रतिक्रिया के अनुमापन प्रोफ़ाइल में केवल मामूली परिवर्तन के बावजूद (चित्रा 5).
हालांकि कोई अंतर तीन प्रतिक्रिया मामलों के लिए monomeric प्रजातियों की खपत के बीच मौजूद है (29-33%) के बीच शेष है, वहां oligomeric सिलिका प्रजातियों जो प्रत्येक मामले में वेग की मात्रा में एक स्पष्ट अंतर है । यह सोल-जेल सिलिका पर पारंपरिक सिद्धांत के साथ समझौते में है-' ' शूट के मामले में पीएच अधिक समय के लिए आयोजित किया जाता है, व्यक्तिगत कणों को विकसित करने के लिए अनुमति देता है और इसलिए कुशल जमावट सहायता; ' overshoot ' मामले में जमावट तेजी से अनुमापन के कारण बहुत तेजी से प्रेरित है, इसलिए सिलिका प्रजातियों में से कम coagulate करने के लिए एक पर्याप्त आकार के लिए हो गया है और colloid चरण में फंसे रहते हैं । 16
सिलिका गठन पर अनुमापन के महत्व को देखते हुए, उचित अनुमापन मात्रा का एक प्राथमिकताओं ज्ञान आवश्यक है । हालांकि प्रतिक्रिया stoichiometry से नहीं निकाले जाने के कारण अमीन additives के जटिल प्रोटॉन व्यवहार और जमावट पर सिलिका सतह अंलता में परिवर्तन, सिस्टम सामग्री, सांद्रता और के बीच अत्यधिक विश्वसनीय अनुभवजंय संबंधों के लिए titer वॉल्यूम आसानी से उत्पन्न कर रहे हैं (चित्रा 1).
एक बार जमावट पूरी कर ली गई है, सामग्री सतहों आसानी से एसिड रेफरेंस के उपयोग के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है, के रूप में हाल ही में कहीं लेखकों द्वारा सूचित किया गया है । 13 इस तरह की संरचना, porosity, और additive के रासायनिक गतिविधि के रूप में सामग्री संपत्तियों की ठीक ट्यूनिंग के लिए अनुमति देता है (चित्रा 6a और बी) ।
इस अध्ययन में, BSA एक अनुकरणीय encapsulant एंजाइम के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तथापि, तकनीक यहां वर्णित कई एंजाइमों17,18के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटीन का पता लगाने के लिए पीछा प्रक्रिया ब्रैडफोर्ड परख प्रोटोकॉल,19 supernatants प्रत्येक केंद्रापसारक चक्र से संग्रहीत का उपयोग कर रहा है । supernatant में प्रोटीन की मात्रा शूंय प्रोटीन सामग्री (नियंत्रण नमूना) के साथ एक नमूना के supernatant में भंग BSA की ज्ञात मात्रा से बनाया गया एक अंशांकन वक्र का उपयोग कर की गणना की है । सिलिका में समझाया प्रोटीन की मात्रा प्रोटीन की प्रारंभिक मात्रा से जोड़ा supernatants में पता लगाया प्रोटीन के घटाव द्वारा गणना की जाएगी । केवल परख के लिए आवश्यक एजेंट ब्रैडफोर्ड एजेंट है (या तो खरीद या मानक व्यंजनों के अनुसार बनाया) ।
वहां परख प्रारूप के तीन प्रकार, नमूना मात्रा पर निर्भर करता है, प्रोटीन की उंमीद की मात्रा का पता लगाया जा सकता है और माप विधि का इस्तेमाल किया । इस के साथ साथ, एक spectrophotometer के लिए निर्दिष्ट किया गया है, इसके बाद स्वरूप, स्थूल और सूक्ष्म आकार के डिस्पोजेबल cuvettes की आवश्यकता है और 10 µ g/ml से १.४ मिलीग्राम/
चित्रा 7 में प्रत्येक धोने के बाद पता चला प्रोटीन की मात्रा (चरण ४.३) प्रारंभिक प्रोटीन राशि का एक% के रूप में दिखाया गया है (जो ५० मिलीग्राम था). लगभग ~ BSA के ५०% पहले केंद्रापसारक, जो ~ ५०% स्थिरीकरण दक्षता से संबंधित है के बाद supernatant में पाया गया । के रूप में कोई BSA निंनलिखित बहाकर में पाया गया था, BSA (या किसी भी अंय एंजाइम) सुरक्षित रूप से कोई नमकीन पानी के साथ सिलिका संश्लेषण के दौरान समझाया जा सकता है-यह इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ है । आदेश में सिलिका उत्पादित में BSA की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, रूपान्तर बदल अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (स्विचेज) विश्लेषण किया गया था । BSA की उपस्थिति में तैयार नमूनों में 1500/cm और 1650/cm (चित्रा 8) के क्षेत्र में मैं और द्वितीय के बीच की विशेषता बैंड की उपस्थिति, लेकिन नियंत्रण के नमूनों में नहीं (कोई BSA) ठोस में BSA की उपस्थिति की पुष्टि की ।
एंजाइम इसके अलावा ऊपर वर्णित की विधि के अलावा (BSA प्रतिक्रिया मिश्रण के बेअसर के दौरान जोड़ा), वहां रहे है अंय संभावित रूपों जैसे,सिलिकेट और additive समाधान के मिश्रण के दौरान BSA इसके अलावा, बेअसर करने से पहले या एंजाइम उनके मिश्रण और बेअसर करने से पहले सिलिकेट या additive समाधान करने के लिए जोड़ा । इन संभावनाओं के कुछ और आगे का पता लगाया और स्थिरीकरण क्षमता (BSA के द्रव्यमान एंजाइम का एक प्रतिशत प्रतिक्रिया प्रणाली में जोड़ा के रूप में मैटीरियल, ब्रैडफोर्ड परख के आधार पर गणना) और अंतिम सिलिका में BSA की मात्रा मापा गया ( BSA की एकाग्रता कुल समग्र वजन का एक प्रतिशत के रूप में सिलिका में उत्पादित, चित्र 9देखें). यह स्पष्ट है कि जब BSA प्रतिक्रिया में जोड़ा गया था (मामले A-C चित्र 9में) स्थिरीकरण दक्षता में कोई काफी अंतर या परिणामी कंपोजिट में BSA की मात्रा में थे । हालांकि, जब BSA सिलिका गठन ( चित्रा 9में केस डी) के दौरान जोड़ा जाता है, स्थिरीकरण दक्षता और अंतिम उत्पाद में BSA की मात्रा दोनों काफी कम थे. इन मतभेदों के बावजूद, सिलिका का उत्पादन औसत राशि अपरिवर्तित बनी रही (85-90 मिलीग्राम के बीच). इन टिप्पणियों को BSA, सिलिकेट/सिलिका और additive के ionization (या isoelectric पॉइंट) के आधार पर समझाया जा सकता है । इसके अलावा के विभिंन तरीकों एंजाइम और सिलिका पुरोगामी के बीच अलग बातचीत के लिए अनुमति देते हैं । एंजाइम परिवर्तन के अलावा के समय में पीएच के रूप में, प्रत्येक प्रजाति के ionization आणविक बातचीत, जो बारी में स्थिरीकरण दक्षता को नियंत्रित करेगा निर्धारित करेगा ।
Cuvette कोई | BSA की एकाग्रता (mg/ | ब्रैडफोर्ड रिएजेंट (एमएल) | नमूना (एमएल) |
0 | 0 (नियंत्रण) | १.५ | ०.०५ |
1 | ०.१ | १.५ | ०.०५ |
2 | ०.२५ | १.५ | ०.०५ |
3 | ०.५ | १.५ | ०.०५ |
4 | ०.७५ | १.५ | ०.०५ |
5 | 1 | १.५ | ०.०५ |
6 | १.२५ | १.५ | ०.०५ |
7 | अज्ञात नमूना (X) | १.५ | ०.०५ |
तालिका 1: मैक्रो ब्रैडफोर्ड परख सेट-अप और परिकलित घटक वॉल्यूम । निर्धारण सीमा के लिए मांय 0.1-1.4 मिलीग्राम/एमएल (1 के लिए खंड दोहराने)
Cuvette कोई | BSA की एकाग्रता (यूजी/ | ब्रैडफोर्ड रिएजेंट (एमएल) | नमूना (एमएल) |
0 | 0 (नियंत्रण) | 1 | 1 |
1 | 1 | 1 | 1 |
2 | २.५ | 1 | 1 |
3 | 5 | 1 | 1 |
4 | ७.५ | 1 | 1 |
5 | 10 | 1 | 1 |
6 | अज्ञात नमूना (X) | 1 | 1 |
तालिका 2: माइक्रो ब्रैडफोर्ड परख सेट-अप और परिकलित घटक वॉल्यूम । निर्धारण सीमा 1-10 µ g/mL के लिए मांय (1 के लिए खंड दोहराने)
चित्रा 1 : प्रतिक्रिया प्रणाली के लिए सिलिका एकाग्रता के खिलाफ आवश्यक titer मात्रा या तो DETA या additive के रूप में PEHA का उपयोग कर। सिलिका अलग सांद्रता पर संश्लेषित किया गया था, जबकि एक को बनाए रखने [N]: [Si] 1 के अनुपात, दो अलग additive रसायनों के लिए. त्रुटि पट्टियां माध्य के चारों ओर एक मानक विचलन हैं ।
चित्रा 2 : प्रतिक्रिया पोत में सिलिका रक्तकण की तस्वीरें (क) के दौरान और (ख) आंदोलन के बाद, समाधान turbidity का प्रदर्शन और बसने कि एक इष्टतम प्रतिक्रिया का संकेत कर रहे हैं.
चित्रा 3 : ब्रैडफोर्ड स्थूल परख के लिए अनुकरणीय अंशांकन वक्र । BSA के अभाव में प्रेरित सिलिका संश्लेषण से Supernatant प्रोटीन की एक ज्ञात मात्रा के साथ मिलाया जाता है, जिसके बाद ब्रैडफोर्ड विश्लेषण के रूप में कदम ९.१ में वर्णित किया जाता है.
चित्र 4 : विभिंन प्रतिक्रिया शर्तों के लिए सिलिका प्रजातियों के अंतिम बहुलकीकरण राज्यों । सिलिका इष्टतम (आधारभूत) शर्तों का उपयोग कर संश्लेषित है, साथ ही साथ ओवर-या के अंतर्गत-अनुमापन, जिसके बाद सापेक्ष सिलिका एकाग्रता monomeric या dimeric सिलीकेट (लाल), polysilicate ' oligomers ' (नीला) और अस्थिर coagulating के लिए quantified है सिलिका (पीला) ।
चित्रा 5 : प्रारंभिक titer मात्रा के एक समारोह के रूप में प्रतिक्रिया प्रणाली के माध्यम से पीएच की प्रगति । एसिड तुरंत 38s के बाद खुराक है मिश्रण का, पीएच के कारण तेजी से नीचे करने के लिए ड्रॉप करने के लिए 8. इसके बाद, एसिड की अधिक मात्रा में स्वचालित रूप से ऐसी है कि पीएच ७.० ± ०.०५ 300s था प्रारंभिक अतिरिक्त के बाद की खुराक । अधिक titrating के मामले में, यह प्राप्त नहीं था, प्रारंभिक खुराक के रूप में 7 से नीचे पीएच ड्रॉप करने के लिए पर्याप्त था, 300s के बाद पीएच ६.६५ तक पहुँचने. आरंभिक HCl वॉल्यूम को ' शूट, ' ' बेसलाइन, ' और ' overshoot ' के लिए जोड़ा गया ६.९०, ७.०५, और क्रमशः 7.20 एमएल था ।
चित्रा 6 : प्रतिनिधि संपत्ति coagulated सिलिका सामग्री के अंलीकरण पर परिवर्तन. (एक) पीएच के संबंध में additive एकाग्रता के परिवर्तन, और (बी) के लिए पीएच के संबंध में सिलिका porosity के परिवर्तन । मान एट अल से reproduced । 13 क्रिएटिव कॉमंस लाइसेंस के अंतर्गत ।
चित्र 7 : BSA एकाग्रता में प्रेरित सिलिका संश्लेषण supernatants. ब्रैडफोर्ड परख पर बाहर किया गया था प्रतिक्रिया supernatants के बाद, जिसमें से संबंधित राशि शेष (इसलिए संश्लेषित सिलिका से occluded) निर्धारित किया गया था ।
चित्र 8 : स्विचेज के साथ और सक्रिय प्रजातियों encapsulation के बिना प्रेरित सिलिका पर विश्लेषण। स्पेक्ट्रा दिखाया: ब्लैक लाइन: प्रेरित सिलिका, ग्रे लाइन: शुद्ध BSA, ब्लू लाइन: BSA के साथ भरी हुई प्रेरित सिलिका. अनुलंब डैश्ड रेखाएं बैंड के बीच विशेषता इंगित करती हैं ।
चित्र 9 : स्थिरीकरण दक्षता और PEHA का उपयोग कर उत्पादित सिलिका के लिए समग्र में BSA की मात्रा । BSA को सिलिकेट के साथ मिलाने से पहले PEHA समाधान में ( क) जोड़ा गया था, (ख) PEHA के साथ मिलाने से पहले सिलिकेट समाधान में, (ग) PEHA और सिलिकेट समाधानों के प्रारंभिक मिश्रण के बाद, और (घ) PEHA और सिलिकेट मिश्रण के बाद समाधान और बेअसर । दक्षता% BSA कुल BSA के अनुपात के रूप में प्रतिक्रिया मिश्रण से समझाया के रूप में मापा जाता है, जबकि सिलिका में BSA मास द्वारा अंतिम सिलिका समग्र में BSA के% एकाग्रता का प्रतीक है. त्रुटि पट्टियां माध्य के चारों ओर एक मानक विचलन हैं ।
Discussion
वर्तमान कार्य में, हम तेजी से प्रेरित सिलिका सामग्री और उसमें मौजूद अणुओं के encapsulation के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । हम प्रक्रिया के भीतर महत्वपूर्ण कदम का प्रदर्शन, अर्थात् प्रतिक्रिया की शुरुआत करने के लिए एसिड जोड़ा जा करने के लिए, और encapsulant के अलावा के समय । हम दोनों की प्रतिक्रिया प्रगति और उपज (चित्रा 4 और चित्रा 5, क्रमशः) पर एसिड इसके अलावा राशि के प्रभाव दिखाने के लिए, और संश्लेषण की स्थिति पर तंग नियंत्रण के लिए एक विधि का प्रदर्शन किया, इस संवेदनशीलता के बावजूद निरंतरता के लिए अनुमति देता है । के बारे में सक्रिय प्रजातियों encapsulation, हालांकि प्रक्रिया के संदर्भ में सीधा, encapsulation के प्रयोग की शर्तों के प्रति संवेदनशील होना दिखाया गया है (के अलावा के आदेश, इसके अलावा के पीएच, पर्यावरण की स्थिति), तथापि, सामग्री में निरंतरता गुण फिर से प्राप्त है ।
संश्लेषण की स्थिति अलग additives के उपयोग के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है, जिनमें से कई कहीं प्रकाशित किया गया है,15 morphologies और porosities की एक सीमा प्रदान. इसके अलावा, बाद सिंथेटिक तकनीक को संशोधित करने और रासायनिक दर्जी प्रेरित सिलिका सामग्री हल्के शुद्धि13 और सतह अमीन सजावट के रूप में इस तरह की सूचना दी गई है । 20 अंत में, संश्लेषण की हल्के, जलीय प्रकृति के कारण, सीटू encapsulation में उन का प्रदर्शन किया से सब्सट्रेट्स की एक व्यापक रेंज के लिए संभव है, एंजाइमों से लेकर17,18 पूरे कोशिकाओं के लिए,21 धातु लवण,22 सक्रिय दवा सामग्री,23 और क्वांटम डॉट्स । 24
अंय कार्बनिक-मध्यस्थता सिलिका syntheses के विपरीत (जैसे एमसीएम-४१ या SBA-15 सामग्री के परिवार के रूप में), जैव प्रेरित additives के polyfunctional प्रकृति आदेश ताकना संरचनाओं का उत्पादन नहीं कर सकते, न ही अत्यधिक monodisperse कण आकार वितरण Stöber-प्रकार सिलिका की विशेषता । 25 यह अच्छी तरह से प्रेरित additives के micellization व्यवहार की कमी के कारण है (विशेष मामलों के बाहर) monofunctional अमीन-additives से अधिक उनके बढ़ उत्प्रेरक गतिविधि के साथ मिलकर26 । 26
दूसरी ओर, इस polyfunctional additive प्रकृति के अंय कार्बनिक मध्यस्थता सिलिका syntheses की तुलना में कम प्रतिक्रिया समय और हल्के तापमान और दबाव के उपयोग में सक्षम बनाता है । यह भी कमरे के रूप में ऊपर वर्णित है, जो अभी तक इन अंय सिलिका उनकी सतह रसायन विज्ञान के विशेष के कारण परिवारों के लिए प्राप्त किया जाना है के रूप में कमरा तापमान additive रेफरेंस की संभावना की ओर जाता है । 27 , 28 , 29 नतीजतन, प्रेरित सिलिका सामग्री दोनों और अधिक किफायती और एक बड़े पैमाने पर उत्पादन करने के लिए व्यावहारिक होना दिखाया गया है, आसान व्यावसायीकरण और विकास के लिए अग्रणी. 14
सारांश में, प्रेरित सिलिका संश्लेषण सक्रिय प्रजातियों का समर्थन करता है या गैस sorbent मीडिया के उत्पादन के लिए एक तेजी से, सतही विधि का प्रतिनिधित्व करता है । के दौरान पीएच के तंग नियंत्रण के माध्यम से और प्रतिक्रिया के बाद, सिलिका-अमीन कंपोजिट की एक विस्तृत सरणी अलग गुण है, जो आगे विभिंन कार्बनिक की एक सरणी के सीटू encapsulation में की संभावना से पूरित है के साथ संश्लेषित किया जा सकता, अकार्बनिक, या जैव जैविक सामग्री । हालांकि स्वतंत्र पोस्ट-प्रेरित additive और encapsulant एकाग्रता के सिंथेटिक संशोधन अभी तक प्राप्त किया जाना है, इन तरीकों पर्यावरण की दृष्टि से सौम्य रासायनिक प्रक्रियाओं की दिशा में एक आशाजनक कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा नहीं वित्तीय हित की घोषणा ।
Acknowledgments
लेखक रासायनिक और जैविक अभियांत्रिकी विभाग (शेफील्ड विश्वविद्यालय) और EPSRC (ep/L017059/1 और ep/P006892/1) से वित्तीय सहायता का धंयवाद ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Silica synthesis | |||
Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
Silicomolybdic acid assay | |||
Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
Bradford assay | |||
Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
Equipment | |||
Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
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