Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att syntetisera bioinspired kiseldioxid material och immobilisera enzymer däri. Kiseldioxid syntetiseras genom att kombinera natriumsilikat och en Amin 'tillsatser', som neutraliserar i en kontrollerad takt. Materialets egenskaper och funktion kan ändras antingen i situ enzym immobilisering eller efter syntetisk syra eluering av inkapslade tillsatser.
Abstract
Målet med de protokoll som beskrivs häri är att syntetisera bioinspired kiseldioxid material, utföra enzym inkapsling däri och helt eller delvis rena samma genom syra eluering. Genom att kombinera natriumsilikat med en Polyfunktionella bioinspired additiv, bildas kiselsyra snabbt på omgivningsförhållanden vid neutralisering.
Effekten av neutralisering ränta och biomolecule tillägg punkt på silica avkastning undersöks och biomolecule immobilisering effektivitet redovisas för olika tillägg punkt. Till skillnad från andra porös kiseldioxid syntesmetoder visas det att de milda förhållanden som krävs för bioinspired kiseldioxid syntes är fullt kompatibla med inkapsling av känslig biomolekyler. Dessutom används milda förhållanden över alla syntes och modifiering steg, att göra bioinspired kiseldioxid en lovande måltavla för uppskalning och kommersialisering som både en bare material och aktivt stöd medium.
Syntesen är visat sig vara mycket känsliga för villkor, dvs andelen neutralisering och slutliga syntes pH, men tight kontroll över dessa parametrar kan påvisas med hjälp av automatisk titrering metoder, vilket leder till hög reproducerbarhet i reaktion progression väg och avkastning.
Bioinspired kiseldioxid är därför ett utmärkt aktiva materiellt stöd val, visar mångsidighet mot många aktuella program, inte begränsat till de visat här, och styrkan i framtida tillämpningar.
Introduction
Användning av kiseldioxid som ett strukturellt stöd för industriella katalysatorer är väl etablerad, vilket möjliggör förbättrad katalysator aktivitet, stabilitet och processbarhet,1 därmed potentiellt minska driftskostnaden. Dessa fördelar förvärras när det gäller enzym immobilisering, som lagring inom kiseldioxid pore system kan ge betydande fördelar enzym livstid över dess gratis motsvarighet. Följaktligen har lagts ner mycket möda i att hitta den bästa metoden att fästa enzymer kiseldioxid arter, med flera recensioner jämföra utredningar med olika metoder av immobilisering på kiseldioxidhaltiga solid stöder. 2 , 3 , 4
Enzymer är vanligtvis kopplade via physisorption eller kovalent bindning, förutom inkapsling inom ett poröst material. 5 det finns dock betydande nackdelar med varje metod: physisorption bygger på övergående Ytinteraktioner mellan kiseldioxid och biomolecule, som mycket enkelt kan försvagas av de reaktionsbetingelser som leder till det oacceptabla enzymet urlakning. Mycket starkare kovalenta kvarstad resulterar vanligen i lägre aktivitet på grund av de aktiva arterna reducerade konfirmerande frihet. Inkapsling kan resultera i minskad aktivitet av enzymet otillgänglighet eller tröghetsseparation begränsningar. 6
Senaste utvecklingen inom fältet för mildare (ofta dubbat ' bioinspired') kiseldioxid synteser har etablerat i situ inkapsling av biomolekyler och andra aktiva arter under materiella syntesen. 7 , 8 , 9 denna metod förnekar många av nackdelarna med konventionella immobilisering - till skillnad från chemisorption metoder biomolecule konfirmerande frihet upprätthålls av användningen av svagare noncovalent interaktioner men som formulären pore hålrummet runt biomolecule, urlakning fortfarande förhindras. Faktiskt, inkapsling har visat sig fungera för en rad biomolekyler och även hela celler,10 och genom inkapsling i bioinspired kiseldioxid effekter såsom avaktivering på grund av hårda process villkor kan undvikas. 7 , 11
Målet med den metod som beskrivs häri är att förbereda en porös kiseldioxid med kontrollerbara egenskaper, under omgivningsförhållanden, med hjälp av en bioinspired organisk tillsats. Metoden kan enkelt modifieras för att inkludera inkapsling av antingen oorganiska eller bioorganisk molekyler, ett urval som ska visas. Vi visar ytterligare en lättköpt metod för att ändra det som-syntetiskt framställda materialen för att uppnå önskad bulk egenskaper och rening genom att ta bort organiska mallen genom syra eluering.
Jämfört med traditionella syntesen av mallade porös kiseldioxid stöder (t.ex.kvarts material mallade genom supramolekylär tensid församlingar som MCM-41 eller SBA-15)12 metoden är betydligt snabbare och mildare, aktivera «««skräddarsydda, i situ inkapsling utan behov av många immobilisering steg och mödosamma rening. Dessutom, användning av syra eluering i stället för på kalcinering öppnar möjligheten att organiska ytan funktionalisering.
Denna metod är mycket gäller för dem som arbetar i aktiva arter immobilisering som har hittat physisorption eller kovalent immobilisering ineffektiva. Det är också användbart för dem forska processen skala upp som bioinspired syntesen är unikt positionerat för industrialisering jämfört med konventionella mallade kiseldioxid material. 13 , 14 den här metoden inte rekommenderas för program som kräver en ordnad mängd porer inom den materiella t.ex.fotonik, som materialstrukturen är störda trots någon likhet i bulk egenskaper.
Protocol
1. beredning av föregångare lösningar (och valfria Encapsulant lösningar)
- Till 180 mL plastflaska, mäta 1,5 mmol natrium silikat pentahydrat (318.2 mg) och lös i 20 mL avjoniserat vatten.
- Likaså i en ytterbehållare, mäta 0,25 mmol pentaethylene hexamine (PEHA, 58,1 mg) och lös i 20 mL avjoniserat vatten.
- När du använder alternativa amine-innehållande föreningar t.ex.Dietylentriamin (DETA) eller triethylenetetraamine (TETA), se till att det totala Si:N mullvad förhållandet förblir konstant på 1 (dvs. motsvarande 0,5 mmol DETA eller 0,375 mmol TETA i det beskrivna förfarandet)15.
- När du använder polymera amine tillsatser t.ex.poly(ethyleneimine) (PEI) eller poly(allylamine hydrochloride) (PAH), upprätthålla en koncentration av 1 mg/mL (slutliga reaktionsvolym)15.
FÖRSIKTIGHET: Hantera dessa aminer endast inuti dragskåp, som de är frätande eller giftiga i deras rena former (särskilt som ångor).
- För att utföra i situ inkapsling under syntes, upplösa en förutbestämd massa protein (häri 50 mg av bovint serumalbumin, BSA) i 5 mL avjoniserat vatten. Subtrahera denna mängd vatten från volymen avjoniserat vatten användas för upplösning av natriumsilikat pentahydrat.
- För att underlätta protein upplösningen utan att ändra dess struktur, en gång blandas med avjoniserat vatten, förslut behållaren och förvaras vid 4 ° C. Ibland kontrollera om framsteg som upplösning, helst utan omrörning.
2. silica syntes
- Kombinera lösningar av natriumsilikat pentahydrat och PEHA i ett av de 180 mL behållaren och tillsätt tillräckligt avjoniserat vatten för att göra slutliga lösningen volym 41 mL (eller 46 utelämnas i situ inkapsling).
- Placera den nylagade blandningen av natriumsilikat och PEHA lösningar på toppen av en omrörare tallrik, lägga till en omrörare bar för att ge konsekvent mixning.
- I detta fartyg, avbryta en pH-givare och registrera den ursprungliga pH.
- I detta skede, alternativt, ta bort en 750 µL alikvot av börjar blandningen för senare bestämning av den ursprungliga [Si] koncentrationen med molybden blå spektrofotometrisk analys, som beskrivs i steg 8,1.
- Påbörja syntesen genom att lägga till en förutbestämd mängd 1 M HCl, beräknat från figur 1, och iaktta omedelbar utvecklingen av grumlighet (se figur 2)
- Så snart syra tillägg är över, Lägg till den encapsulant lösningen (om någon) så snabbt som möjligt.
Obs: Den slutliga volymen eftersom dessa kvantiteter är 50 mL totalt reaktionsblandningen, leder till Si och N koncentrationer av 30mM. Detta kan skalas efter önskemål genom att multiplicera alla över mängder med ett konstant belopp. - Spela in pH efter 5 min att bestämma reaktion avslutningen; Kontrollera att pH är 7 ± 0,05.
3. syra eluering av material
- Ändra sammansättningen av producerade silica efter reaktionen har nått avslutad (antingen som en som-made koagulatet eller genom omblandning ett tidigare syntetiserade prov av kiseldioxid) genom tillägg av ytterligare syra.
- Om omblandning kiseldioxid, blanda ca 150 mg som förberedda bioinspired kiseldioxid med 100 mL avjoniserat vatten i 180 mL plastflaska och placera på toppen av en omrörare tallrik.
- När suspensionen är väl blandade, avbryta en pH-givare i fartyget.
- Titrera i ytterligare HCl tills önskad pH (mellan 7 och 2) har uppnåtts och tillåta för att stabilisera för ca. 1 min.
- Vänta ytterligare 5 minuter för att säkerställa att systemet har helt utjämnad, och sedan fortsätta att isolera solid kiseldioxid.
4. silica Separation och torkning
- Häll upp den bioinspired kiseldioxid suspensionen i 50 mL centrifugrör.
- Centrifugera suspensionen vid 5 000 g i 15 min.
- Ta bort supernatanten efter centrifugering och store för vidare analys (t.ex. Bradford test, se nedan). Refill Centrifugera rören med avjoniserat vatten och resuspendera kiseldioxid med en vortex mixer.
- Upprepa centrifugering, supernatanten lagring och resuspension två gånger.
- Efter den slutliga centrifugeringen, avlägsna supernatanten och skrapa kiseldioxid i en keramisk degel.
- Torka i ugn över natten vid 85 ° C.
- Om inkapsling har ägt rum, Använd en frystorkning anläggning eller en ugn som verkar under vakuum för att undvika protein denaturering.
5. produktion av molybden blå reagens (MBR) för [Si] bestämning
- Till en plast 1 L mätkolv, tillsätt 8 mmol (10 g) ammonium molybdat tetrahydrat i dragskåp.
- Lös detta i 500 mL avjoniserat vatten under omrörning.
- Syrsätt lösningen genom att försiktigt tillsätta 60 mL 10 M HCl-lösning.
- Anpassa den slutliga volymen till 1 L.
6. produktion av para-aminophenol sulfat reduktionsmedel (RA) för bestämning av [Si]
- Placera en mätkolv på 500 mL glas i ett vattenbad vid omgivningstemperatur på en omrörare tallrik i dragskåp.
- Lägga till 111 mmol (10 g) av vattenfri oxalsyra, 19,5 mmol (3.35 g) av para-aminophenol sulfat och 16 mmol (2 g) av natrium sulfit och lös i 250 mL vatten.
- Försiktigt och långsamt lägga till 92 g (50 mL) av mättade sulfuric syra under omrörning och vänta på lösningen svalna.
- Slutligen, späds till 500 mL med avjoniserat vatten.
7. Silicomolybdic Acid Test på monomer kiseldioxid arter
- I en 5 mL injektionsflaska av plast produceras utspädd 300 µL av MBR i steg 5,4 med 3 mL avjoniserat vatten.
- Tillsätt 10 µL av en kiselsyrasalter eldprov lösning och skaka för att blanda.
Obs: Denna lösning kommer sakta gulnar. - Efter exakt 15 min, tillsätt 1,6 mL den förminskande medel beredd från avsnitt 6 att reducera de gula silicomolybdate komplexa till sin blå isomer.
- Tillåta en blå färg för att utveckla minst 2, men inte mer än 24 h.
- Mäta prov absorbansen vid 810 nm i en UV-vis-spektrofotometer och beräkna [Si] mot en kalibreringskurva.
8. Silico Molybdic Acid Test på polymera kiseldioxid arter
- För att mäta koncentrationen av polysilikat arter med metoden molybden blå i en mikrocentrifug rör, kombinera 750 µL 2 M natriumhydroxidlösning med 750 µL kiseldioxid suspension.
- Tätning och plats i en mikrocentrifug float.
- Säkerställa tillräcklig headspace är kvar i röret att förhindra spricker på grund av trycket bygga upp.
Obs: En headspace på 500 µL är vanligen tillräckligt för att undvika detta. Alternativt, förfarandet kan utföras i öppen injektionsflaskor så länge flytande förluster genom avdunstning redovisas.
- Säkerställa tillräcklig headspace är kvar i röret att förhindra spricker på grund av trycket bygga upp.
- Flyta i mikrocentrifugrör i ett vattenbad som upphettats till 80 ° C och låt den lösas upp för 1 h.
- Efter 1 h förflutit, ta bort mikrocentrifugrör och torka utsidan torr.
- När svalnat, kan [Si] bestämmas enligt ovan enligt beskrivningen i steg 7,2-7,5.
9. Bradford Assay förfarande för bestämning av proteinkoncentration i kiseldioxid
- Infoga en förutbestämd (rumstemperatur) Bradford reagent och prov i varje tilldelad kyvetten (se tabell 1 och tabell 2 för specifika volymer). Använd disponibel pipettspetsar för varje kyvetten att undvika volym förändringar pågrund av reagens och upprepa varje punkt i tre exemplar.
- Blanda varje kyvetten genom att invertera 3 gånger och låt för att utveckla i 10 min.
- Mät absorbansen vid 595 nm med ren supernatanten som tomma.
- Beräkna ursprungliga absorbansen hos varje kyvetten genom att subtrahera från varje mätning absorbansen hittade för referensprovet (kyvetten nr 0 i båda analyser).
- Beräkna protein koncentrationen av okänt prov med hjälp av kalibreringskurvan (figur 3). Vid utspädning av det ursprungliga provet måste utspädningsfaktorn redovisas.
- Skapa en kalibreringskurva för varje uppsättning experiment genom plotting uppmätta absorbansen mot koncentrationen av BSA att undvika slumpmässiga variationer som kan påverka analysens känslighet.
- Även om detta protein-analysen är tänkt att använda BSA som standard för att kvantifiera någon typ av protein, skapa en kalibreringskurva för varje specifikt protein av intresse för förbättrad noggrannhet.
- Om proteinhalten i det okända provet förväntas vara högre än intervallet täckta av kalibreringskurvan, späd det som behövs.
- Bestämma proteinhalt för varje prov under resuspension att övervaka möjliga protein förlust.
Representative Results
De tekniker som beskrivs ovan kan konsekvent och reproducibly fällningen kiseldioxid. Det är lättast att avgöra av den snabbt insättande grumlighet i reaktionskärlet, som efter upphörande av agitation kvittar spontant i en tjock koaglet av utfälld kiseldioxid (figur 2). Omfattningen av reaktionen och därmed avkastningen kan bekräftas genom att mäta massan av denna koagulatet efter separation och är vanligtvis 58 ± 6,5% (figur 4, gul).
Ytterligare insikt i reaktion progression kan genereras genom att anpassa den molybden blå spektroskopisk metoden för att upptäcka mängden oreagerad monomer silikat arter samt de arter som har reagerat på bildar polysilicates eller 'oligomerer', men har inte lyckats nå tillräcklig storlek för att koagulera (figur 4, rött och blått respektive).
Denna specifika kiseldioxid specifikationsdata är av särskilt intresse när man jämför olika titrering effektivitetsvinster för nederbörd reaktionen - dvs hur slutliga reaktion pH-värdet och takt med vilken denna nås påverkar polymerisation av monomer kiseldioxid till en 'oligomer' och dess efterföljande koagulation till solid kiseldioxid. Genom att ändra mängden syra tillkom scenen 2.4 något, under - eller över - titration av reaktionsblandningen kan vara utfört (figur 5). Genom att mäta den kiseldioxid artbildning igen för dessa två fall, kan en tydlig skillnad ses i reaktion avslutningen (figur 4) trots endast mindre ändringar att titrering profilen reaktion (figur 5).
Även om ingen skillnad finns mellan konsumtion av monomer arter för de tre reaktion fall (återstående mellan 29-33%), finns det en tydlig skillnad på mängden Oligomera kiseldioxid arter som fällning i varje fall. Detta är i samförstånd med traditionell teori på sol-gel silicas - i 'hamna långt under' fall pH hålls högre för längre, gör det möjligt för enskilda partiklar att växa och därmed medhjälp effektiv koagulering; i 'överskridande' fall koaguleringen framkallas mycket snabbare på grund av den snabba titreringen, har därmed färre av arterna som kiseldioxid vuxit till en tillräcklig storlek för att koagulera och förblir instängda i kolloidkemi fas. 16
Med tanke på vikten av titrering när kiselsyra bildas, är en priori kunskap om lämpliga titrering volymen nödvändig. Även om inte extraherbara från den reaktion stökiometri på grund av den komplexa protonation beteenden av amine tillsatser och förändring i kisel ytan surhetsgrad på koagulering, mycket tillförlitliga empiriska samband mellan systemet innehållet, koncentrationer och titer volymer är lätt genereras (figur 1).
När koagulation har slutförts, kan materiella ytor lätt ändras med hjälp av syra eluering, som har nyligen rapporterats av författarna någon annanstans. 13 Detta möjliggör finjustering av materialegenskaper som komposition, porositet och kemisk aktivitet av tillsats (figur 6a och b).
I denna studie, BSA användes som ett föredöme encapsulant enzym, dock de metoder som beskrivs här kan användas för flera enzymer17,18. Förfarandet för identifiering av protein är protokollet assay Bradford,19 använda supernatanterna lagras från varje centrifugering cykel. Mängden protein i supernatanten beräknas med en kalibreringskurva som skapats från kända mängder BSA upplöst i supernatanten av ett prov med noll proteinhalt (kontrollprov). Mängden protein inkapslade i silica kommer att beräknas genom subtraktion av upptäckta proteinet i supernatanterna från den ursprungliga mängden protein lagt till. Den enda reagens som behövs för analysen är Bradford reagens (antingen upphandlas eller gjort enligt standardrecept).
Det finns tre typer av test-format, beroende på provvolymen, den beräknade mängden protein ska identifieras och den mätmetod som används. Häri, följt formatet anges för en spektrofotometer, kräver disponibla kyvetter av makro och mikro storlek och kan upptäcka från 10 µg/mL till 1,4 mg/mL av protein.
I figur 7 visas mängden protein som upptäckts efter varje tvätt (steg 4,3) i % av det belopp som inledande protein (som var 50 mg). Runt upptäcktes ~ 50% av BSA i supernatanten efter den första centrifugering, som avser ~ 50% immobilisering effektivitet. Som fanns det ingen BSA upptäcks i de följande tvättarna, BSA (eller några andra enzym) kunde vara säkert inkapslade under kiseldioxid syntes med ingen urlakning - är detta en betydande fördel med denna metod. För att bekräfta förekomsten av BSA i kiseldioxid produceras, utfördes Fourier Transform infraröd spektroskopi (FTIR) analysen. Närvaron av de karakteristiska band av Amid I och II i området 1500 cm och 1650/cm (figur 8) i proverna som förberett i närvaro av BSA, men i kontrollen prover (ingen BSA) bekräftat inte förekomsten av BSA i fasta ämnen.
Utöver metoden av enzymet tillägg beskrivs ovan (BSA lagts under neutralisering av reaktionsblandningen), finns det andra möjliga variationer t.ex.BSA tillägg under omblandning av silikat och additiv lösningarna, före neutralisering eller enzym läggas till silikat eller tillsats lösningen före sin blandning och neutralisering. Några av dessa möjligheter undersöktes ytterligare och immobilisering effektivitetsvinsterna (massa BSA orörlig som en procentandel av enzymet läggs till reaktion systemet, beräknas baserat på Bradford analysen) och mängden BSA i slutliga kiseldioxid var uppmätta) koncentrationen av BSA i kiseldioxid som en procentandel av sammansatta totalvikten produceras, se figur 9). Det var tydligt att när BSA lades till oreagerad reagensen (fall A-C i figur 9) fanns det inga avsevärda skillnader i immobilisering effektivitet eller mängden BSA i den resulterande sammansatt. Men när BSA läggs under kiseldioxid bildandet (fall D i figur 9), var immobilisering effektivitet och mängden BSA i den slutliga produkten båda betydligt lägre. Trots dessa skillnader var det genomsnittliga beloppet av kiseldioxid produceras oförändrad (mellan 85-90 mg). Dessa observationer kan förklaras på grundval av jonisering (eller isoelektrisk punkt) av BSA, silikat/kvarts och tillsatsen. De olika metoderna för tillägg möjliggör olika interaktioner mellan prekursorer som enzym och kiseldioxid. Som pH-värdet vid tidpunkten för tillägg av enzymet ändringarna avgör joniseringen av varje art intermolekylära växelverkningar, som i sin tur kommer att kontrollera immobilisering effektivitet.
| Kyvetten nr | Koncentrationen av BSA (mg/mL) | Bradford reagens (mL) | Provet (mL) |
| 0 | 0 (kontroll) | 1.5 | 0,05 |
| 1 | 0,1 | 1.5 | 0,05 |
| 2 | 0,25 | 1.5 | 0,05 |
| 3 | 0,5 | 1.5 | 0,05 |
| 4 | 0,75 | 1.5 | 0,05 |
| 5 | 1 | 1.5 | 0,05 |
| 6 | 1,25 | 1.5 | 0,05 |
| 7 | Okänt prov (X) | 1.5 | 0,05 |
Tabell 1: makro Bradford assay set-up och beräknade komponent volymer. Giltig för bestämning utbud 0.1-1.4mg/mL (volymer för 1 replikat)
| Kyvetten nr | Koncentrationen av BSA (ug/mL) | Bradford reagens (mL) | Provet (mL) |
| 0 | 0 (kontroll) | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 2.5 | 1 | 1 |
| 3 | 5 | 1 | 1 |
| 4 | 7.5 | 1 | 1 |
| 5 | 10 | 1 | 1 |
| 6 | Okänt prov (X) | 1 | 1 |
Tabell 2: Micro Bradford assay set-up och beräknade komponent volymer. Gäller för bestämning räckvidd 1-10 µg/mL (volymer för 1 replikat)
Figur 1 : Krävs titer volym mot kiseldioxid koncentration för reaktion system med DETA eller PEHA som tillsats. Kiseldioxid var syntetiseras i varierande koncentrationer bibehållen en [N]: [Si] förhållandet 1, för två olika tillsats kemikalier. Felstaplar är en standardavvikelse kring medelvärdet.
Figur 2 : Fotografier av kiseldioxid koaglet i reaktionskärlet a under och (b) efter omskakning, visar lösning turbiditeten och lösa som är vägledande för en optimal reaktion.
Figur 3 : Föredöme kalibreringskurvan för Bradford makro assay. Supernatanten från bioinspired kiseldioxid syntes i avsaknad av BSA blandas med en känd mängd proteinet, varefter Bradford analysen utförs enligt beskrivningen i steg 9,1.
Figur 4 : Sista polymerisation påstår av kiseldioxid arter för olika reaktionsbetingelser. Kiseldioxid syntetiseras med optimal (baslinje) villkor, såväl som med över- eller under titrering, varefter relativa kiseldioxid koncentration kvantifieras för monomer eller dimeriskt silikater (röd), polysilikat 'oligomerer' (blå) och instabil koagulera kiseldioxid (gul).
Figur 5 : Progression av pH genom reaktion system som en funktion av ursprungliga titern volym. Syra är omedelbart doseras efter ca. 38s blandning, orsakar pH till snabbt sjunka till under 8. Efteråt, ytterligare doseras mängder syra automatiskt så att pH-värdet var 7,0 ± 0,05 300s efter första tillägg. När det gäller alltför titreringen var detta inte möjligt, som den initiala dosen var tillräckligt att släppa pH under 7, når pH 6,65 efter 300s. Ursprungliga HCl volymen till för 'hamna långt under,' 'baslinje,' och 'överskridande' var 6,90, 7,05 och 7,20 mL respektive.
Figur 6 : Representativa egenskapsändringar på försurning av koagulerat kiseldioxid material. (a) ändring av additiv koncentration med avseende på pH, och (b) ändring av kiseldioxid porositet med avseende på pH. Återgivits från Manning et al. 13 under Creative Commons licens.
Figur 7 : BSA koncentration i bioinspired kiseldioxid syntes supernatanterna. Bradford analyser utfördes på reaktion supernatanterna efter centrifugeringen, från vilket de relativa belopp återstående (därför ockluderas från syntetiserade kiseldioxid) bestämdes.
Figur 8 : FTIR analys på bioinspired kiseldioxid med och utan aktiva arter inkapsling. Spectra visade: svart linje: bioinspired kiseldioxid, grå linje: ren BSA, blå linjen: bioinspired kiseldioxid laddad med BSA. Vertikala streckade visar linjer karakteristiska amide band.
Figur 9 : Immobilisering effektivitet och mängden BSA i sammansatt för kiseldioxid produceras med PEHA. BSA har lagts till (A) i PEHA lösningen före blandning med silikat, (B) i silikat lösningen före blandning med PEHA, (C) efter första blandning av PEHA och silikat lösningar och (D) efter blandning PEHA och silikat lösningar och neutralisera. Effektivitet mäts som % BSA inkapslade från reaktionsblandningen som andel av totala BSA La, medan BSA i silica betyder % koncentration av BSA i slutliga kiseldioxid komposit av massan. Felstaplar är en standardavvikelse kring medelvärdet.
Discussion
I det nuvarande arbetet presenterar vi en metod för snabbt utfällning bioinspired kiseldioxid material och inkapsling av biomolekyler däri. Vi visar kritiska steg i förfarandet, nämligen mängden reaktion-inleda syra tillsättas, och tidpunkten för tillägg av den biomolecule encapsulant. Vi visar effekten av syra utöver beloppet på både reaktion progression och avkastning (figur 4 och figur 5, respektive), och visat en metod för tight kontroll över syntes förhållanden, vilket möjliggör konsistens trots denna känslighet. Angående aktiva arter inkapsling, även om okomplicerad när det gäller förfarandet, inkapsling är visat sig vara känsliga för villkoren för experimentet (ordning dessutom pH-värdet i tillägg, miljöförhållanden), dock konsekvens i material egenskaper uppnås igen.
Syntes villkor kan ändras med hjälp av olika tillsatser, varav många har publicerats på annat håll,15 som tillhandahåller en rad morfologier och porositeter. Ytterligare, efter syntetiska tekniker för att ändra och kemiskt skräddarsy bioinspired kiseldioxid material har rapporterats såsom mild rening13 och ytan amine dekoration. 20 slutligen pågrund mild, vattenlösning av syntesen, i situ inkapsling är möjligt för ett bredare utbud av substrat än de visat här, alltifrån enzymer17,18 hela celler,21 metall salter,22 aktiva farmaceutiska substanser,23 och quantum dots. 24
Till skillnad från andra organiska-medierad kiseldioxid synteser (såsom MCM-41 eller SBA-15 familjen av material) beställde Polyfunktionella beskaffenhet bioinspired tillsatser inte kan producera pore strukturer, inte heller mycket monodisperse partikelstorlek distributioner kännetecken av Stöber-typ kisel. 25 detta är på grund av bristen på väl definierade micellization beteende av bioinspired tillsatser (utanför specialfall)26 tillsammans med deras ökade katalytisk aktivitet över monofunktionella amine-innehållande tillsatser. 26
Å andra sidan, möjliggör denna Polyfunktionella tillsatsen natur användning av kortare reaktionstider och mildare temperatur & Tryck jämfört med andra organiska-medierad kiseldioxid synteser. Detta leder också till möjligheten att rumstemperatur additiv eluering som beskrivits ovan, som ännu inte uppnått för dessa andra kiseldioxid familjer på grund av detaljerna av deras ytkemi. 27 , 28 , 29 följaktligen bioinspired kiseldioxid material har visat sig vara både mer ekonomiskt och praktiskt att producera i större skala, vilket leder till enklare kommersialisering och utveckling. 14
Sammanfattningsvis representerar bioinspired kiseldioxid syntes en snabb, facile metod för att producera aktiva arter stöder eller gas sorbent media. Genom sträng kontroll av pH under och efter reaktionen, kan ett brett utbud av kiseldioxid-Amin kompositer syntetiseras med varierande egenskaper, som kompletteras ytterligare av möjligheten att i situ inkapsling av en rad olika ekologiska, oorganiska eller bio-organiska material. Även om oberoende efter syntetiska ändring av bioinspired additiv och encapsulant koncentration har ännu inte uppnås, representerar dessa metoder ett lovande steg mot miljövänlig kemiska processer.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de ekonomiskt stödet från den avdelning av kemiska och biologiska Engineering (University of Sheffield) och EPSRC (EP/L017059/1 och EP/P006892/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica synthesis | |||
| Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
| Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
| Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
| Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
| Silicomolybdic acid assay | |||
| Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
| Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
| Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford assay | |||
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Equipment | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
| Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
| UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
