Summary
يوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة جديدة لرصد الإخلاص للنسخ في الكائنات نموذج متعددة.
Abstract
دقة النسخ مطلوب للتعبير الصادق عن المعلومات الوراثية. على الرغم من المثير للدهشة، يعرف الكثير عن الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ. لملء هذه الفجوة في المعرفة العلمية، ونحن مؤخرا الأمثل المقايسة تسلسل دائرة للكشف عن أخطاء النسخ في جميع أنحاء الترنسكربيتوم Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية ميلانوجاستير كاينورهابديتيس ايليجانس. وسيوفر هذا البروتوكول الباحثين مع أداة قوية جديدة تعيين المناظر الطبيعية أخطاء النسخ في الخلايا حقيقية النواة بحيث يمكن توضيح الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ بتفصيل لم يسبق له مثيل.
Introduction
الجينوم يوفر مخططا بيولوجية دقيقة للحياة. لتنفيذ هذا المخطط بشكل صحيح، من المهم للجينوم يتم نسخها بدقة كبيرة. ومع ذلك، النسخ من غير المرجح أن تكون خالية من الأخطاء. على سبيل المثال، رنا بولمرس منذ فترة طويلة من المعروف أن يكون عرضه للخطأ في المختبر1،2، ومؤخرا فقد تبين أنهم يرتكبون أخطاء في فيفو فضلا عن3،،من56، لا سيما عندما تواجه مع الحمض النووي الضرر7،،من89،10. وتشير هذه الملاحظات مجتمعة، إلى أن أخطاء النسخ تحدث باستمرار في جميع الخلايا الحية، مما يوحي بأنها يمكن أن تكون مصدرا قويا للبروتينات المتحولة.
هذه العملية، ووصف الطفرات النسخي، يختلف عن الطفرات الكلاسيكية بطريقتين. أولاً، على عكس الطفرات الوراثية، أخطاء النسخ تؤثر على الخلايا الانقسامية والانقسامية اللاحقة على حد سواء، كما أنها لا تعتمد على تكرار الحمض النووي. ولذلك، دراسة الآليات التي تؤثر على الإخلاص للنسخ سيوفر نظرة متعمقة في التحميل تحور الخلايا الانقسامية والانقسامية اللاحقة على حد سواء. من المثير للاهتمام، تورطت مؤخرا في الترويج للبروتين تجميع11،،من1213 أخطاء النسخ وقد تم الافتراض بالإسهام في كلا التسرطن10 تطوير المقاومة للمضادات الحيوية في البكتيريا14.
ثانيا، على النقيض من الطفرات الوراثية، أخطاء النسخ عابرة في الطبيعة. وجودها مؤقت يشكل تحديا كبيرا لأنه يجعل من الصعوبة للكشف عن أخطاء النسخ. على سبيل المثال، في حين وضعت عدة مختبرات فحوصات مراسل قيماً لدراسة الطفرات النسخي، هذه فحوصات فقط قادرة على قياس أخطاء النسخ في عدد محدود من سياقات ونموذج الكائنات الحية4،15. للتغلب على هذه القيود، تحولت العديد من الباحثين لتكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي (الرنا-seq)، الذي يسمح نظرياً أخطاء النسخ التي سيتم تسجيلها في جميع أنحاء الترنسكربيتوم من أي نوع. ومع ذلك، هذه الدراسات بسهولة خلطت بين من التحف بناء مكتبة، مثل أخطاء النسخ العكسي، وبكر تضخيم الأخطاء، وطبيعة التسلسل نفسه عرضه للخطأ. على سبيل المثال، ترانسكريبتاسيس عكس ارتكاب خطأ واحد تقريبا كل القواعد ~ 20,000، بينما يتوقع رنا بولمرس (رنابس) لجعل خطأ واحد فقط كل5،القواعد 300,0006. لأن نسبة الخطأ لوحدها عكس النسخ الأقزام بمعدل خطأ رنا بولمرس داخل الخلايا، يكاد يكون من المستحيل التمييز بين أخطاء النسخ الحقيقية من النتائج الملموسة الناجمة عن إعداد مكتبة في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدية ( الشكل 1a).
لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير نسخة محسنة من الدائرة-التسلسل (سيرسيق، أو ج-seq من الآن فصاعدا) الإنزيم5،16. هذا التحليل يسمح للمستخدم بالكشف عن أخطاء النسخ وغيرها من المتغيرات نادرة في الجيش الملكي النيبالي في جميع أنحاء الترنسكربيتوم5. مقايسة تسلسل التعميم يحمل هذا الاسم لأنه خطوة رئيسية في هذا التحليل تدور حول على الحمض النووي الريبي. حالما يتم سيركولاريزيد أهداف الجيش الملكي النيبالي، وهم عكس نسخها بطريقة دائرة متداول، لإنتاج جزيئات كدنا الخطية التي تحتوي على نسخ عديدة من نفس القالب الجيش الملكي النيبالي. إذا كان خطأ كان حاضرا في أحد هذه القوالب، سيكون أيضا حاضرا في كل تكرار واحد الواردة ضمن الجزيء كدنا هذا الخطأ. على النقيض من ذلك، أخطاء عرض النسخ العكسي، [بكر] تضخيم أو تسلسل تميل إلى أن تنشأ عشوائياً، وهكذا سيكون حاضرا في تكرار واحد أو اثنين فقط. وهكذا، بتوليد تسلسل توافق آراء لكل جزيء كدنا، والتمييز بين أخطاء عشوائية من الأخطاء التي تحدث في كل تكرار، التحف بناء مكتبة يمكن فعلياً فصل من أخطاء النسخ الحقيقية (الشكل 1b).
إذا استخدمت بشكل صحيح، يمكن استخدام مقايسة ج-seq دقة الكشف عن معدل استبدال قاعدة وعمليات الإدراج والحذف في الجيش الملكي النيبالي في جميع أنحاء الترنسكربيتوم من أي نوع (على سبيل المثال، انظر الاعتراضية و Ochman17). على سبيل المثال، أننا استخدمنا التحليل ج-seq توفير قياسات المجين على نطاق المنظومة لمعدل خطأ النسخ في Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية melanogaster ايليجانس كاينورهابديتيس بقرار واحد لقاعدة5 (غير منشورة الملاحظات). المستخدمة في الأصل لدقة تسلسل السكان فيروسات الرنا، تم تبسيط هذا الإصدار الأمثل من التحليل ج-seq للتقليل من الظروف القاسية أثناء إعداد المكتبة التي تسهم في بناء مكتبة التحف. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام عدد من مجموعات المتاحة تجارياً، الإنتاجية من الفحص هو تحسن كبير، كذلك سهولة. هذا التحليل بدقة إذا ما استخدمت بشكل صحيح، يمكن اكتشاف آلاف أخطاء النسخ كل تكرار، وبذلك تحسنت في الدراسات السابقة6. وعموما، هذا الأسلوب يوفر أداة قوية لدراسة الطفرات النسخي وسوف تسمح للمستخدم بالحصول على رؤى جديدة في الآليات التي تتحكم في الإخلاص للنسخ في طائفة واسعة من الكائنات الحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد
- رناسيس منتشرة في كل مكان؛ ولذلك تنظيف مساحة العمل بدقة بالرش من أسفل مع كاشف إزالة تلوث (مثل، رناسي بعيداً) و 70% إيثانول. رذاذ أسفل أي الممصات أو الأقلام أو أنبوب رفوف لإزالة المصادر المحتملة للتلوث رناسي.
- إلى منع رنسيس من تلويث العينات، ارتداء معطف مختبر أو تي شيرت كم طويل أثناء التجربة. تجنب الاتصال بين القفازات وداخل أي الأنابيب التي سيتم استخدامها، لا سيما عند استردادها من مربع أو حقيبة.
- قبل النسخ العكسي، تتغير القفازات بشكل متكرر.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا وقفه التجربة قبل النسخ العكسي.
2- الخلية الحيوانية الثقافة وجمع
-
النمو saccharomyces cerevisiae وجمع
- إذا كان المطلوب هو مكتبة ج-seq من الخميرة، أول تطعيم مستعمرة واحدة من S. cerevisiae في 3 مل من استخراج الخميرة التي تحتوي على المتوسط، الأدنين، ببتون وسكر العنب (YAPD)، واحتضان ذلك بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في البرميل متداول.
- في الصباح، وإعادة تطعيم الثقافة في 50 مل YAPD المتوسطة بكثافة بصرية (OD) 0.1 وتنمو الخلايا حتى بلوغهم التطوير التنظيمي من 0.5 – 0.7 (7 ~ × 106 خلايا/مل).
- جمع ثقافة كاملة 50 مل (حوالي 350 × 106 خلايا) في أنبوب 50 مل مخروطية وتدور الخلايا لأسفل لمدة 3 دقائق في س 2,100 ز. بعناية إزالة المتوسطة YAPD وتغسل بيليه مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- ثم، ريسوسبيند بيليه في 480 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل، 48 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10%، وميليلتر 480 من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1)، الرقم الهيدروجيني 6.8. دوامة العينة بأقصى سرعة 5 s، ونقل لسداده ملولبة 1.5 مل أنبوب مع ميليلتر 750 من حبات الزركونيا المثلج (المتوفرة مع مجموعة أدوات). للانتقال إلى الخطوة 3 من هذا البروتوكول لتحلل الخلية واستخراج الحمض النووي الريبي المجموع.
ملاحظة: كل من الكواشف اللازمة للخطوة 2.1.4 ترد في الخميرة الموصى به أدوات استخراج الحمض النووي الريبي. تعمل هذه الكواشف على قدم المساواة للخميرة، الديدان والذباب حيث أنه بعد جمع الخميرة (الخطوة 2، 1)، والديدان (الخطوة 2، 2) أو الذباب (الخطوة 2، 3)، يمكن استخدام نهج موحد لإنشاء مكتبات ج-seq (الخطوات من 3-10).
-
الثقافة ايليجانس كاينورهابديتيس وجمع
- إذا كان المطلوب هو مكتبة ج-seq من الديدان، إيداع 30 الديدان الكبار على لوحة جديدة من أجار رصدت بالبكتيريا OP50.
ملاحظة: خمس لوحات تكفي لتكرار 1. - الثقافة الديدان لمدة 4 أيام وجمع الديدان قبل الغسيل بلطف اللوحات مع 5 مل من M9 وسائل الإعلام، وتجمع الديدان في أنبوب مخروطي واحدة 50 مل.
- تدور الديدان أسفل في 100 س ز 2 دقيقة لإنشاء بيليه. يتباطأ في أجهزة الطرد المركزي بأقل سرعة ممكنة، حتى لا يتعرض للإزعاج بيليه.
- بلطف نقل الديدان في أنبوب 1.5 مل وغسلها مرتين في 1.5 مل الإعلام M9 والطرد المركزي الأنبوب في 100 x ز لمدة 1 دقيقة إزالة البكتيريا وتولد بيليه نظيفة 100 ميليلتر من الديدان.
- ريسوسبيند الديدان في 480 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل و 48 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% ميليلتر 480 من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل. دوامة العينة بأقصى سرعة 5 s ونقل لسداده ملولبة 1.5 مل الأنبوبة المحتوية على ميليلتر 750 من حبات الزركونيا المثلج. للانتقال إلى الخطوة 3 من هذا البروتوكول لتحلل من الديدان واستخراج الحمض النووي الريبي المجموع.
- إذا كان المطلوب هو مكتبة ج-seq من الديدان، إيداع 30 الديدان الكبار على لوحة جديدة من أجار رصدت بالبكتيريا OP50.
-
الثقافة melanogaster المورفولوجية وجمع
- إذا كان المطلوب هو مكتبة ج-seq من الذباب، ثقافة الذباب 20 – 25 في قارورة تحتوي على سكر العنب أو متوسطة على أساس دبس السكر. الكوة الذباب أكثر من 3 زجاجة، حتى كل قنينة تحتوي على حوالي 8 الذباب.
- لجمع الذباب، ضع القنينة إلى دلو الجليد حتى يتم مخدراً الذباب. ثم جمعها مع فرشاة في أنبوب 1.5 مل. لا تجمع الذباب بمعاملة2 CO.
- اسمحوا الذباب الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (RT)، وسرعة إضافة خليط premade من 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل و 50 ميليلتر من الحزب الديمقراطي الصربي 10% 500 ميليلتر من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل إلى الأنبوب. استخدام ميكروبيستلي تطحن الذباب مع حوالي 15 السكتات الدماغية، مصحوبا بشركة التواء الحركة عندما تصل المدقة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
- صب خليط الذباب وتحلل وسائط الإعلام في سداده ملولبة 1.5 مل الأنبوبة المحتوية على ميليلتر 750 الخرز الزركونيا المثلج، ودوامه عليه بأقصى سرعة ممكنة للمضي قدما س. 5 إلى الخطوة 3 من هذا البروتوكول بالنسبة تحلل من الذباب واستخراج الحمض النووي الريبي المجموع.
3-بلغ مجموع الجيش الملكي النيبالي تنقية
ملاحظة: عند هذه النقطة، تلتقي جميع البروتوكولات الثلاثة، واتباع نهج واحد وموحد يمكن استخدامها لإنشاء مكتبات ج-seq.
- المسمار الغطاء محكم وإرفاقه الأنبوب فورتيكسير مع محول أو الأشرطة اللاصقة. دوامة الأنبوب بأقصى سرعة ممكنة لمدة 10 دقيقة العينات. ثم الطرد المركزي العينة في س 16,100 ز لمدة 5 دقائق لفصل المذيبات العضوية من المرحلة المائية.
- بعناية إزالة 400-500 ميليلتر المرحلة المائية دون الإخلال الطور البيني الأبيض، غائم، وإضافته إلى أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 1.9 مل من المخزن المؤقت ملزم. خلطهما جيدا قبل فورتيكسينج.
- إضافة مل 1.25 من الإيثانول 100% وخلط العينة فورتيكسينج. نقل 700 ميليلتر من العينة لخرطوشة تصفية تجميعها في أنبوب جمع وتدور العينة في س 14,500 ز لتكرار س. 30 حتى كل من العينة التي يتم تمريرها من خلال الخرطوشة.
ملاحظة: عند هذه النقطة، العينة قد تتحول قليلاً مبهمة. إذا تم تفكيك العديد من الخلايا، والديدان، أو الذباب، رواسب يمكن أن تظهر أنه قد تسد عامل التصفية. - يجب غسل الفلتر مرة واحدة مع 700 ميليلتر ليغسل الحل 1، ومرتين مع 500 ميليلتر من الحل أغسل 2 أو 3. الانتهاء يغسل من الغزل العينات في 14,500 س ز 2 دقيقة لإزالة أي فائض من الإيثانول.
- نقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب دولفين 1.5 مل وإضافة ميليلتر 108 من شطف بريوارميد الحل (65 درجة مئوية).
ملاحظة: ابدأ تعريض عينات الحمض النووي الريبي لدرجات حرارة أعلى من 65 درجة مئوية قبل نسخ عكسي، كما تفعل ذلك سيثير السيتوزين اليوراسيل deamination الأحداث التي من المستحيل التمييز بين من أخطاء النسخ. - تخفض التلوث الحمض النووي في الجيش الملكي النيبالي المعزول (راجع الخطوات 3، 2، 1-4) بإضافة 11 ميليلتر من 10 × الدناز أنا المخزن المؤقت و 2 ميليلتر من مثبط رناسي 4 ميليلتر من الدناز أنا (يو 8)، واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وبعد الهضم، إضافة 11 ميليلتر من الدناز المنظمة كاشف. دوامة الخليط والسماح لها بالجلوس على RT لمدة 5 دقائق. ثم الطرد المركزي العينة في س 15,000 ز لمدة 3 دقائق بيليه الكاشف المنظمة وجمع 110 ميليلتر من المادة طافية دون إزعاج بيليه. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: يمكن أن يكون من الصعب جداً أن بيبيت سليم الكاشف المنظمة الدناز، بصريا حتى تفقد نصيحة ماصة بعد كل عمل بيبيتينج. إذا كان الكاشف المنظمة يصبح لزج جداً إلى بيبيت، إضافة 10 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4) يساوي 1/5 حجم المتبقية. - (التحقق من الجودة) قياس تركيز مجموع الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي. ثم جانبا 1 ميليلتر من مجموع الجيش الملكي النيبالي، وتمييع لتركيز 10 نانوغرام/ميليلتر في الماء (NF) نوكلاس خالية. تشغيل الجيش الملكي النيبالي على أداة تحليل النوكليوتيدات مناسبة مع "شريط الحمض النووي الريبي حساسية عالية" لضمان أن الجيش الملكي النيبالي لا تتحلل وله قيمة إيرين على الأقل 8.5 أو أعلى (الشكل 2).
4-مرناً تخصيب
- إجراء تخصيب مرناً مع مينيبريب مرناً كيت (انظر الجدول للمواد). إضافة 140 ميليلتر من الماء NF إلى العينة لإجمالي حجم 250 ميليلتر. ثم قم بإضافة 250 ميليلتر من 2 × المخزن المؤقت ملزم وخلط العينة جيدا قبل فورتيكسينج، وإضافة 15 ميليلتر من حبات اليغو (dT).
- خلط العينة بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان أنه عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. ثم، ضع العينة على RT لمدة 10 دقائق. وأخيراً، الطرد المركزي العينة في 16,100 س ز 2 دقيقة بيليه مجمعات حبة: مرناً.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 500 ميليلتر من الحل أغسل. نقل الحل إلى عمود دوران وتدور لمدة 1 دقيقة في س 15,000 ز. تجاهل-التدفق عبر وتغسل العينة مع ميليلتر 500 إضافية للحل أغسل. وبعد ذلك، تدور العينة لمدة 2 دقيقة في س 15,000 ز لإزالة أي الإيثانول الزائدة من المرشحات تدور.
- نقل عامل التصفية تدور أنبوب دلفين وريسوسبيند بيليه في العمود مع 80 ميليلتر من شطف بريوارميد الحل (65 درجة مئوية). احتضان العينة لمدة 1.5 دقيقة عند 65 درجة مئوية والوتي من الغزل أنه لمدة 1 دقيقة في س 15,000 ز.
- قياس تركيز المنقي الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي أو أداة مماثلة تسمح للتحديد الكمي لتركيز الحمض النووي الريبي والجودة.
5-رناسي الثالث التجزؤ والجيش الملكي النيبالي تنظيف
ملاحظة: (هام) أن تعد جزيئات الحمض النووي الريبي التعميم المناسبة لتوليد ج-seq المكتبات، يجب تجزئة الجيش الملكي النيبالي لحوالي 60 – 80 في القواعد في الطول. بينما استخدمت الأساليب السابقة تجزئة المواد كيميائية إلى جزء من الجيش الملكي النيبالي، يقدم تجزئة المواد الكيميائية مع المعادن الثقيلة الأضرار لعينات الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تفسر خطأ بأنها أخطاء النسخ أثناء التحليل النهائي. للتحايل على هذه المشكلة، تعتمد بدلاً من ذلك على تجزئة استخدام "رناسي الثالث" لتوليد أجزاء صغيرة. ميزة إضافية لهذا النهج الانزيمية أنه يخلق متوافق مع الغايات المطلوبة لربط، تنتفي الحاجة للغاية--إصلاح بعد تجزئة المواد الكيميائية.
- إعداد رد فعل تجزئة الجيش الملكي النيبالي مع 1 ميكروغرام لتنقية الحمض النووي الريبي، 10 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت، 5 ميليلتر رناسي الثالث، ويكفي NF المياه لتحقيق حجم ما يصل إلى 100 ميليلتر (انظر الجدول للمواد). إضافة الإنزيم آخر و "الماصة؛" الخليط صعودا وهبوطاً على الأقل 10 مرات لخلط. احتضان العينة في 37 درجة مئوية ل 25 دقيقة، الذي يميل إلى إنتاج الأجزاء رنا حوالي 60-80 في القواعد في الطول.
- بمجرد اكتمال الحضانة 25 دقيقة، تنظيف رد فعل فورا مع اليغو تنظيف ومركزات كيت (انظر الجدول للمواد) لمنع أي مزيد من الهضم. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت اليغو الملزمة للعينة، أنها مزيج دقيق من فورتيكسينج، وإضافة 800 ميليلتر من الإيثانول 100%. خلط العينة فورتيكسينج وأنه نقل إلى عمود دوران المقدمة في أنبوب جمع.
- الطرد المركزي العينة في 10,000 س ز 30 ثانية والمياه والصرف الصحي مع ميليلتر 750 من المخزن المؤقت للغسيل لإزالة "رناسي الثالث". الطرد المركزي العينة في 10,000 س ز لمدة 30 ثانية، تجاهل في التدفق من خلال، وتغسل العينة مرة أخرى مع ميليلتر 750 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي كما هو موضح أعلاه. بعد الثاني من خلال تدفق تم تجاهل، والطرد المركزي العمود في س 15,000 ز لمدة 2 دقيقة لإزالة أي فائض من الإيثانول.
- نقل العمود إلى أنبوب جديد 1.5 مل والوت العينة في 24 ميليلتر من الماء NF بالغزل في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة.
- فحص الجودة: تأخذ 2 ميليلتر من الأجزاء رنا المنقي وتمييع 2-fold بإضافة 2 ميليلتر من الماء NF. تشغيل تجزئة الجيش الملكي النيبالي على شريط شاشة للتأكد من أن الجيش الملكي النيبالي مجزأة في نطاق قواعد 50 – 100 في الطول (الشكل 2 (ج)).
6-الجيش الملكي النيبالي على ودائرة المتداول عكس النسخ
- فيها الأجزاء رنا، الحرارة تؤذي 20 ميكروليتر من عينة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ووضعه على الجليد فورا لمدة 2 دقيقة. ثم إضافة 4 ميليلتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى المخزن المؤقت، ميليلتر 4 ATP 10 ملم، 1 ميليلتر من مثبط رناسي، 1 ميليلتر من الماء NF، و 8 ميليلتر من 50% البولي إثيلين غليكول (الربط).
- خلط العينة جيدا قبل فورتيكسينج، ثم إضافة 2 ميليلتر من 10 U/ميليلتر T4 رنا ليجاسى أولاً مزيج من العينة مرة أخرى قبل بيبيتينج أنها واحتضان أنه عند 25 درجة مئوية ح 2 في ثيرموسيكلير مع درجة حرارة الغطاء في 30 درجة مئوية.
- بعد ح 2، إضافة 10 ميليلتر من الماء NF إلى العينة وتنظيف العينة مع مجموعة مواد تنظيف وتركيز اليغو وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. الوت العينة في 20 ميليلتر من الماء NF.
- بعكس نسخ جزيئات الحمض النووي الريبي دائرية، إضافة 4 ميليلتر من دنتبس 10 ملم و 4 ميليلتر من 50 نانوغرام/ميليلتر عشوائي hexamers 9 ميليلتر من الماء NF ميليلتر 9 من الجيش الملكي النيبالي. خلط كل شيء تماما من بيبيتينج وتؤذي عينة عند 65 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ووضعه على الجليد للحد الأدنى 2 مخزن الجيش الملكي النيبالي المتبقية كاحتياطي.
- إضافة ميليلتر 8 x 5 توليف حبلا أول المخزن المؤقت و 2 ميليلتر من 0.1 مم DTT 4 ميليلتر من 200 المنتسخة العكسية يو/ميليلتر وخلط كل شيء من بيبيتينج. احتضان العينة عند 25 درجة مئوية لمدة دقيقة 10، متبوعاً حضانة 20 دقيقة في 42 درجة مئوية مع الغطاء في 5 درجة مئوية أعلى من درجة حرارة الحضانة.
ملاحظة: يجب استخدام المنتسخة العكسية مع قدرات التشرد حبلا في هذه الخطوة للسماح لنسخ عكسي متداول دائرة. - إضافة 10 ميليلتر من الماء NF إلى العينة وتنظيفه مع أدوات تنظيف وتركيز اليغو وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. الوت العينة في 42 ميليلتر من شطف الحل.
- فحص الجودة: تمييع 2 ميليلتر من كدنا واحد-الذين تقطعت بهم السبل في 2 ميليلتر من الماء NF وتشغيل هذه العينة على أداة تحليل النوكليوتيدات مع "شريط الحمض النووي الريبي حساسية عالية". إذا كانت النسخ العكسي يعمل بشكل صحيح، مكتبة جزيئات كدنا، تتراوح ما بين حوالي 60 – 1,500 في القواعد في الطول، ويجب أن تكون مرئية. ومن الناحية المثالية، معظم كدنا في مجموعة القواعد 500 – 1,000 (الشكل 2d).
7-الثاني حبلا كدنا توليف و "إصلاح نهاية"
- استخدم مجموعة توليف حبلا ثانية لإنشاء مكتبة كدنا مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. وضع العينات في الثلج وإضافة 30 ميليلتر من الماء NF ميليلتر 38 من النموذج الخاص بك. ثم إضافة ميليلتر 8 من 10 × "الثانية حبلا العازلة" و 4 ميليلتر الثانية حبلا إنزيم، وخلط العينة بلطيف بيبيتينج قبل الحضانة في 16 درجة مئوية ح 2.5.
- تنظيف العينات مع اليغو تنظيف وتركيز كيت وفقا لتوصيات الشركة المصنعة 100 ميليلتر التفاعلات والوتي العينات في 38 ميليلتر من الماء NF.
- قم بإعداد رد فعل الإصلاح نهاية بإضافة 20 ميليلتر من الماء NF إلى 35.5 ميليلتر من كدنا مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل، 6.5 ميليلتر من "نهاية إصلاح رد فعل المخزن المؤقت" و 3 ميليلتر من "نهاية الإعدادية خليط الإنزيم". بعناية تحقق من رد فعل المخزن المؤقت لرواسب بيضاء ويحل لهم عن الاحترار اليد إذا كان حاضرا.
- خلط رد فعل الإصلاح نهاية طريق بيبيتينج واحتضان أنه عند 20 درجة مئوية مدة 30 دقيقة، متبوعاً حضانة ثانية 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية. تعيين درجة حرارة الغطاء ثيرموسيكلير في 5 درجة مئوية أعلى من درجة حرارة الحضانة.
8-محول ربط وتحديد حجم المكتبات المعدة
- استخدام إعداد مكتبة متعددة خطوة وحدة للتحضيرات النهائية مكتبة (انظر الجدول للمواد). أولاً، تضعف محولات للجيل التالي التسلسل 10 إضعاف في 10 ملم تريس-HCl بتركيز نهائي من 1.5 ميكرومتر. ثم إضافة 2.5 ميليلتر من محول المخفف و 1 ميليلتر من ربط محسن لكل عينة ومزجها فورتيكسينج.
- إضافة 15 ميليلتر من مزيج ماجستير ليجاسى بلانت/تا ومزجها بيبيتينج واحتضان أنه في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم إضافة 3 ميليلتر إنزيم كاشف اليوراسيل-الخاصة بختان الإناث واحتضان أنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد اكتمال عملية ربط إضافة 13.5 ميليلتر من الماء NF إلى العينة لإجمالي حجم 100 ميليلتر والشروع في اختيار حجم.
ملاحظة: من الأفضل تحديد حجم لجزيئات كدنا في نطاق القواعد 600 – 800 في الطول. إذا كانت جزيئات الحمض النووي الريبي مجزأة حوالي 60 – 80 في القواعد في الطول، يؤدي تحديد للجزيئات التي قواعد 600 – 800 في الطول إلى ضمان أن معظم الجزيئات المحددة تحتوي على ثلاثة على الأقل من يكرر جنبا إلى جنب، وهو مثالي للتجهيز النهائي و تحليل. - لتحديد الجزيئات التي 600 – 800 شركة بريتيش بتروليوم في الطول، إضافة 30 ميليلتر من حراكه المغناطيسي الخرز (انظر الجدول للمواد)، تأقلم على RT، لكل عينة ومزيج من بيبيتينج. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل واحتضان في RT لمدة 5 دقائق.
- ضع العينة على الوقوف مغناطيسية لمدة 5 دقائق لفصل الخرز من المادة طافية. نقل المادة طافية (الذي يحتوي على جزيئات كدنا المرجوة) أنبوب مل 1.5 جديد والتخلص من الخرز المغناطيسي (الذي بد أن الجزيئات الكبيرة كدنا).
- إضافة من قاسمة طازجة من 15 ميليلتر من حبات مغناطيسية لكل العينات ومزيج دقيق من بيبيتينج، واحتضان لمدة 5 دقائق في مكان الرايت العينات على رف مغناطيسية واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق في الرايت ثم، بعناية إزالة والتخلص من سوبيرناتانتس، مع التأكد من عدم الإخلال بالخرز.
ملاحظة: لا تتخلص من الخرز المغناطيسية، التي تحتوي الآن على كدنا الهدف المنشود. - إضافة الإيثانول إلى كل من العينات 200 ميليلتر من 80% طازج دون إزعاج الخرز المغناطيسي الأعلاف واحتضانها لتجاهل س. 30 الإيثانول وغسل العينات مرة أخرى مع الإيثانول 80%. ثم، تماما إزالة أي أثر من الإيثانول من العينات وأيردري الخرز لمدة 5 دقائق لكن يجب الحرص على عدم الإفراط الجاف الخرز. إذا كان يتم أوفيردريد الخرز، سوف تظهر الشقوق في الكريات.
- إلى الوت العينات المأخوذة من الخرز، إزالة الأنابيب من موقف المغناطيسية وإضافة ميليلتر 19 10 مم تريس-HCl. بيبيت أنه ونزولاً عدة مرات لحراكه الخرز واحتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق في الرايت إذا كانت أوفيردريد الخرز، احتضان لهم > 10 دقيقة.
- وضع العينات مرة أخرى على موقف المغناطيسية واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق لفصل الخرز من المادة طافية. بعناية إزالة 15 ميليلتر من المادة طافية التي تحتوي على مكتبات كدنا المنقاة، واختيار حجم من الأنابيب وتحويله إلى أنبوب جديد 1.5 مل.
9-[بكر] تضخيم وتنقية حبة النهائي
-
إضافة 5 ميليلتر من التمهيدي العالمي و 5 ميليلتر من التمهيدي فهرس فريد (انظر الجدول للمواد) لكل مكتبة كدنا تنقيته ومزجها جيدا قبل بيبيتينج. بعناية تحقق المزيج بوليميريز الرئيسي لبلورات ورواسب أخرى، والدافئة في مزيج الرئيسي باليد حتى تذوب رواسب.
- إضافة 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي بوليميريز للعينة، مزجها بيبيتينج، واتبع شروط ركوب أدناه [بكر] تضخيم. تشغيل تمسخ الأولية عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم قم بإجراء خطوة مزدوجة [بكر] رد فعل من جانب ديناتوراتينج العينات عند 98 درجة مئوية لمدة 10 s والصلب/امتداداً لمنتجات PCR عند 65 درجة مئوية مقابل 75 s (س 12)، متبوعة بملحق نهائي عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق و الإيقاف إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية.
- تنظيف حتى المكتبات النهائي بإضافة 45 ميليلتر من حراكه الخرز المغناطيسي مباشرة لتفاعل PCR، مزجها بيبيتينج، واحتضان لهم في RT لأدنى 5 نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل ووضعه في موقف مغناطيسية. تبني عليه لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية وغسله مرتين مع الإيثانول 80% طازجة لمدة 30 ثانية.
- بعد الغسيل الثاني، تماما إزالة الإيثانول من العينة، وأيردري بيليه حبة لمدة 5 دقائق والوتي أنه في 35 ميليلتر من 0.1 x TE. ريسوسبيند الخرز التي بيبيتينج لهم واحتضانها لهم في RT لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف المغناطيسية وبعد 5 دقائق، ونقل 30 ميليلتر من المادة طافية على أنبوب جديد 1.5 مل. تخزين المكتبات في-80 درجة مئوية.
- فحص الجودة: تمييع 1 ميليلتر من المكتبة النهائي في 9 ميليلتر من الماء NF وتشغيل العينة على أداة تحليل الحمض النووي مخصص مع شريحة حساسية عالية؛ ينبغي أن تكون غالبية كدنا في المجموعة من 600 – 800 شركة بريتيش بتروليوم في الطول (الشكل 2e).
- بعد شطف، إرسال العينات قبالة لتعاقب على منصة تسلسل موازية على نطاق واسع استخدام يقرأ نهاية الاقتران بي بي 250 أو 300 بي بي واحد في نهاية ما يلي:.
10-بيو المعلوماتي تحليل دائرة تسلسل البيانات
ملاحظة: تحليل وتفسير البيانات الخام من التحليل ج-seq يتطلب خط أنابيب مخصصة للمعلوماتية الحيوية. تخطيطي لخط الأنابيب الذي تم استخدامه لتحليلاتنا هو مبين في الشكل 3. تحميل خط الأنابيب هذا في https://github.com/LynchLab/MAPGD.
- أولاً، قم بقطع على ما يلي لإزالة محول متواليات وتطلب قاعدة منخفضة الجودة مع كوتادابت18، استخدام عتبة 20 درجة جودة.
- تحديد ثم يكرر مشفرة باستخدام خوارزمية مناسبة للكشف عن أي تكرار مع حجم الحد أدنى من النيوكليوتيدات 30 جزيء الحمض النووي الريبي كونكاتيميريزيد ويكرر كحد أقصى 2 عدم التطابق بين18. تستمد هذه يكرر تسلسل توافق آراء وتتبع جميع المكالمات قاعدة ونقاط الجودة المرتبطة بها في كل موقف.
ملاحظة: لأن يمكن بدء النسخ العكسي في أي موضع على جزيء الحمض النووي الريبي سيركولاريزيد، البدء من تكرار لا تتوافق بالضرورة مع 5-نهاية جزيء الحمض النووي الريبي مجزأة (يشار إليه فيما يلي نقطة ربط). تبعاً لذلك، سوف لا خريطة تسلسل إلى توافق في الآراء بشكل مستمر ضد الترنسكربيتوم المقابلة، مما يتطلب تحديد نقطة ربط. -
لتحديد نقطة ربط، خريطة كونكاتيمير تسلسل توافق الآراء ضد الترنسكربيتوم مرجع باستخدام أداة (بلاط) المحاذاة مثل انفجار19.
- سلسلة مثيلين من التسلسل إلى توافق في الآراء لضمان أن تسلسل معين يحتوي على التواجد دون انقطاع كامل واحد على الأقل من تسلسل الحمض النووي الريبي الأولية على جزء. ثم، قم بتدوير تسلسل توافق الآراء أن يبدأ عند موضع نقطة ربط توقع.
- خريطة تسلسل استدارة توافق الآراء ضد الجينوم استخدام تفت20 واستخدام التحالفات للكشف عن أي واحد من النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) التي يمكن أن يكون مخطئا لأخطاء النسخ.
-
استدعاء أخطاء النسخ من تسلسل معين توافق الآراء الذي تمت استدارته، واختبار ما إذا كانت الأخطاء مرشح تمرير أربعة اختبارات إضافية.
- أولاً، ضمان عدم تداخل خطأ في نسخ مع SNP (شرط نموذجي أن يقرأ على الأقل 20 بحاجة إلى تغطية خاصة قاعدة ولا أكثر من 5% يقرأ قد دعم مكالمة قاعدة بديلة).
- ثانيا، تحقق من أن تسلسل توافق مستمد من 3 على الأقل يكرر جنبا إلى جنب، كل منها يتطلب نفس قاعدة الزوج؛ وثالثاً، تأكد من أن مجموع درجات الجودة لهذا الموقف يجب أن يكون أكثر من 100.
- الرابع والأخير التحقق وتدوير التسلسل إلى توافق في الآراء في جميع التوليفات الممكنة (محاكاة جميع المواقف المحتملة لنقطة ربط) وتعيين كل إصدار ضد الجينوم مرجع باستخدام توفات.
ملاحظة: إذا كان أحد التسلسلات استدارة العثور على تطابق مثالي في الجينوم، يعتبر نقطة ربط المقابلة الآن واحدة صحيحة وينبغي رفض المكالمة خطأ في النسخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مثل كل تسلسل موازية على نطاق واسع النهج، تنتج كل تجربة ج-seq dataset كبيرة وغير عملي. لأول مرة للمستخدمين، قد يكون من الصعب التعامل مع هذه البيانات؛ وهكذا، من المستحسن أن كافة المستخدمين بالاتصال ذوي خبرة بيو-إينفورماتيسيان قبل التجربة. وفي المتوسط، يتوقع أن المستخدمين سوف تولد حوالي 55 – 70 جيجا قواعد (جباسيس) لتشغيل على معظم منصات تسلسل موازية على نطاق واسع. لهذا البروتوكول، عادة، 12 – 30 العينات كانت متعدد في تشغيل حيث أن لكل عينة تم الحصول عليها ما يقرب من 2 – 6 جباسيس. بعد التشذيب بتسلسل محول والمكالمات قاعدة منخفضة الجودة (< 20) من dataset هذه، بقيت ~ 70% حجم البيانات الأولية.
ثم يتم تحليل هذه القواعد كذلك للتحقيق في كفاءة تجزئة الجيش الملكي النيبالي، وعلى تحديد حجم يكرر التي تم إنشاؤها. ويكرر معظم تميل إلى أن تكون القواعد 45 – 80 في الطول (الشكل 4A) وحوالي 50% الأسس التي كانت متسلسلة جزء من تكرار هذه (الشكل 4 باء). أن معظم هذه القواعد موجودة في القراءات التي تحتوي على تكرار 3 أو أكثر، عدد القواعد فريدة من نوعها التي يتم تعيين تسلسل حوالي ثلث العدد الإجمالي لقواعد متسلسلة. وفي المتوسط، > 75% من هذه التسلسلات توافق الآراء يمكن تعيينها مرة أخرى إلى أن الجينوم مرجع. أخيرا، يغطي حوالي 25% من هذه القواعد ما يلي 20 أو أكثر، والذي يعني في نهاية المطاف أن حوالي 10% البيانات يمكن أن تستخدم للكشف عن الخطأ. ويرد مثال على هذا التحليل في الشكل 4، الذي يمثل تسلسل المعلومات التي تم الحصول عليها أثناء إعداد هذا البروتوكول لتكرار 1 من مكتبة ج-seq واحدة أن كان التسلسل نسبيا شالوولي ويمثل أقل الحد الأقصى للبيانات التي يمكن أن تتوقعها المستخدمين للحصول على.
حوالي 5,000 – 25,000 أخطاء في تشغيل تميل إلى تحديد، وعلى الرغم من أن هذه الأرقام يمكن أن تتفاوت تفاوتاً كبيرا تبعاً لمعدل الخطأ نفسه (ارتفاع معدل الخطأ، سيتم الكشف عن المزيد من الأخطاء)، حجم الترنسكربيتوم (أكبر الترنسكربيتوم، سيتم تغطية قواعد أقل من 20 ما يلي: الحد من تسلسل البيانات التي يمكن استخدامها للكشف عن الخطأ)، والعمق الذي يتم تعيين تسلسل (تسلسل أعمق سيجعل من المحتمل أكثر أن تتم تغطية قاعدة معينة بما يلي: 20 أو أكثر). هذه الأخطاء تميل إلى أن تكون موزعة على كامل الجينوم، حيث أن متوسط ~ 47% الأخطاء الموجودة في مرناً الجزيئات التي تم إنشاؤها بواسطة رنا بوليميراز الثاني (رناب II)، ~ 49% توجد في جزيئات الرنا الريباسي المتولدة عن رناب أنا و % ~ 3 المتبقية تقع في الكشف إنشاؤها بواسطة رناب الثالث وبوليميريز الحمض النووي الريبي المتقدرية. ومع ذلك، يمكن أن تختلف هذه النسب كثيرا تبعاً لنوع الخلية أو الكائن قيد التحقيق (الشكل 4). على سبيل المثال، أنواع الخلايا التي تعتمد اعتماداً كبيرا على الوظيفة المتقدرية، مثل كارديوميوسيتيس، تحتوي على الحمض النووي الريبي المتقدرية أكثر كثيرا من أنواع الخلايا الأخرى، إلى حد كبير زيادة عدد المتقدرية جزيئات الحمض النووي الريبي التي هي متسلسلة، وبالتالي عدد للكشف عن أخطاء.
مرة واحدة وقد تم تجميع قائمة بالأخطاء، ومواقعها عبر الجينوم معروفة، يمكن استخدام هذه الأخطاء لتحديد المعلمات التي تتحكم في نسبة الخطأ من النسخ في كل كائن حي. على سبيل المثال، يمكن أن يرتبط موقع أخطاء النسخ هذه مع العديد من الميزات للجينوم، مثل تكرار وجود الحمض النووي، سياقات محددة الوراثية، أو معدل التعبير، أن نفهم كيف يغير هذه الميزات الإخلاص 5من النسخ. ومن المتوقع أن في المستقبل، رغم ذلك، سوف يتمكن المستخدمون تحديد ميزات إضافية لا حصر لها كيف تؤثر على الإخلاص النسخي، بما في ذلك علامات جينية، ومنظمة ثلاثية الأبعاد للجينوم، وتوافر المغذيات، والعمر، أو التعرض للسمية المركبات، لإلقاء الضوء على مساهمة العوامل الوراثية والبيئية إلى الإخلاص للنسخ.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتسلسل الحمض النووي الريبي مقابل ما يليها ج (أ) تسلسل الحمض النووي الريبي التقليدية تجارب عزل الحمض النووي الريبي من عينة فائدة، تفتيت الجيش الملكي النيبالي، وعكس نسخ فإنه قبل إعداد مكتبة النهائية وتسلسلها. ومع ذلك، إدخال هذه الإجراءات إعداد العديد من التحف الفنية في المكتبة في شكل أخطاء النسخ العكسي، بكر تضخيم الأخطاء، وأخطاء التسلسل. (ب) ج-seq الأمثل هذا التحليل يسمح لتصحيح هذه التحف الفنية التي سيركولاريزينج جزيئات الحمض النووي الريبي المجزأة قبل النسخ العكسي، مما يسمح لهم لتكون عكس نسخها بطريقة دائرة متداول لإنتاج الخطي كرر كدنا الجزيئات التي تحتوي على عدة نسخ من قالب الحمض النووي الريبي الأصلي بالترادف. ثم يمكن استخدام هذه يكرر جنبا إلى جنب لتمييز أخطاء النسخ الحقيقية من القطع الأثرية، كما أخطاء النسخ الحقيقية (نجمة) سيكون حاضرا في كل تكرار في نفس الموقع، بينما عكس النتائج الملموسة مثل أخطاء النسخ (مربعة) وبكر أخطاء التضخيم (دائرة) موجودة فقط في تكرار واحد أو اثنين لأي جزيء كدنا معين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: النتائج ممثلة لإعداد مكتبة. تظهر هذه اللوحات سلم اليكتروفوريتوجرام لحساسية الحمض النووي الريبي (أ) ارتفاع الشاشة الشريط (انظر الجدول للمواد)، الحمض النووي الريبي (ب) المجموع تنقيته من Saccharomyces cerevisiaeورنا مجزأة "رناسي الثالث" (ج) ( المتداول د) دائرة كدنا نسخها من الاتجاه المعاكس. (ه) مكتبة كدنا تحديد الحجم النهائي يعمل على تحليل الحمض النووي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل حساسية عالية رقاقة (انظر الجدول للمواد). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التخطيطي خط الأنابيب المعلوماتية البيولوجية المستخدمة لتحليل البيانات تسلسل دائرة. بعد التشذيب على ما يلي التسلسل، يتم تحديد تكرار، ويتم إنشاء تسلسل توافق استخدام استدعاء قاعدة الأكثر احتمالاً في أي موقف معين. ثم يتم تحديد نقطة ربط القالب رنا الأولية والتسلسل إلى توافق في الآراء يتم محاذاة للجينوم مرجع حتى أنه يمكن التعرف على أخطاء النسخ المحتملة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مثال لنتائج خط أنابيب Seq ج. (أ) هذا الفريق يظهر توزيع حجم تسلسل توافق الآراء التي تم الحصول عليها من تجربة ج-تسلسل نموذجية. (ب) يظهر هذا الفريق العدد من القواعد، ويقرأ، والنسبة المئوية لما يلي التسلسل في كل خطوة من خط الأنابيب المعلوماتية الحيوية ج-Seq. (ج) يظهر هذا الفريق العدد من الكشف عن أخطاء النسخ والنسبة المئوية لأخطاء تعزى إلى رنا بوليميراز أنا ورنا بوليميراز الثاني ورنا بوليميراز الثالث والميتوكوندريا الحمض النووي الريبي بوليميراز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهنا يصف لنا بروتوكولا أمثل لإعداد مكتبات ج-seq للكشف عن أخطاء النسخ في Saccharomyces cerevisiaeو المورفولوجية melanogaster ايليجانس كاينورهابديتيس. هذا البروتوكول له مزايا عديدة على البروتوكولات القائمة، فضلا عن تقنيات بديلة.
على مدى السنوات ال 15 الماضية، العديد من نظم مراسل وضعت التي تعتمد على لوسيفراس7،8 أو لوكس Cre جزئ3،4،،من1521 للكشف عن النسخ أخطاء. وكانت هذه النظم مراسل لا يقدر بثمن للباحثين فهم الدقة النسخي لأنه يسمح لهم بالجينات، الآليلات، والآليات الجزيئية تحديد التي تنظم بشكل مباشر الإخلاص للنسخ. بيد أنها تقرير فقط عن الأخطاء في قوالب مصطنعة معطوب، أو ضمن سياقات وراثية محددة للغاية، مما يحد من الأسئلة العلمية التي يمكن الإجابة. ميزة هامة من البروتوكول ج-seq هو أنها تراقب إخلاص النسخ في جميع أنحاء الترنسكربيتوم كامل5، إلى حد كبير في توسيع المعرفة العلمية بدقة التي يتم التعبير عن المعلومات الوراثية. ثانيا، لأن التحليل ج-seq يستخدم الجيش الملكي النيبالي كمواد المصدر، فمن المحتمل أن هذا التحليل يمكن تكييفها مع أي كائن حي من اختيارهم، وتنتفي الحاجة إلى إنشاء بنيات معقدة مراسل لكل طراز المحورة وراثيا. هذا البروتوكول أيضا مزايا أكثر النهج تسلسل واسع الموازية القائمة17،22. الجدير بالذكر أن معظم هذه النهج جعل استخدام المعادن الثقيلة إلى المكتبات بلغة الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، إدخال أساليب تجزئة هذه التحف في الجيش الملكي النيبالي التي لا يمكن تمييزها عن أخطاء النسخ صحيح5. لحل هذه المشكلة، هذا البروتوكول الأجزاء رنا انزيماتيكالي مع "رناسي الثالث"، التي لديها ميزة إضافية فإنه يترك نهايات متوافقة لربط الذاتي، إلى حد كبير تبسيط على الجيش الملكي النيبالي، وزيادة حساسية المقايسة ~ الوقت.
في الوقت نفسه، قد المقايسة ج-seq نصيبها القيود. أولاً، على الرغم من أن التدابير الفحص أخطاء النسخ في جميع أنحاء كامل الجينوم، يميل عنصرا كبيرا من البيانات المستمدة من الجينات التي يتم التعبير عنها عاليا، النصوص من هذه الجينات يميلون إلى السيطرة على معظم الجيش الملكي النيبالي المكتبات. عامل آخر يشوه التحليل نحو الجينات الغاية المعلنة هو العتبة في صلب خط الأنابيب المعلوماتية الحيوية التي تمنع الطفرات الوراثية والحمض النووي الريبي تحرير الأحداث من التباس القياسات النهائية. وتملي هذه العتبة أن الأسس فقط التي تم تعيين تسلسل 20 مرة أو أكثر يمكن أن تستخدم للتحليل النهائي. القيد ثاني يتعلق بالمكتبة التنوع. مثل معظم مجموعات تستخدم لاستخراج الحمض النووي الريبي، طقم المستخدمة هنا عدم كفاءة تنقية جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة، مما يحد من عدد القراءات المستمدة من الجزيئات توليفها من قبل رناب الثالث. كذلك يحد من تنوع المكتبة التسلسل النهائي خطوة تنقية مرناً المستخدمة هنا. على الرغم من أن الجزيئات التي تم إنشاؤها بواسطة رناب يمكن كفاءة متسلسلة، معظم الكشف المتقدرية المتبقية، ترنس، والكشف غير الترميز يتم فقدان أثناء هذه الخطوة. لالتقاط هذه الجزيئات أكثر في كثير من الأحيان، ينبغي أن تستخدم مجموعة مختلفة على وجه التحديد ينقي جزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة، أو ينبغي أن تستهدف أنواع الخلايا التي يتم إثراء لهذه الجزيئات. يرجى ملاحظة أنه على الرغم من أن معظم هذه المشاكل يمكن حلها بواسطة تسلسل أعمق من المعتاد، أو في نفس الوقت تسلسل الحمض النووي من الخلايا نفسها، على الرغم من أن كلا من هذه الحلول سوف تتطلب استثمارات مالية أكبر المحققون.
وبالإضافة إلى ذلك، تستعد التطورات التكنولوجية في المستقبل لتحسين التحليل ج-seq على مستوى أساسي. على سبيل المثال، من خلال توسيع طول القراءة من التكنولوجيا القائمة على التسلسل، الممكن لتسلسل الجزيئات أطول، مما يعني أن يكرر أكثر يمكن استخدامها للتأكد من الدقة للنسخ. هذه التحسينات سيؤدي تلقائياً في عمق تسلسل أكبر وزيادة في النسبة المئوية للقراءات التي يمكن استخدامها لتحليل المتلقين للمعلومات. يمكن تقديم حجة مماثلة لأي تكنولوجيا التسلسل الذي يسمح للجزيئات أكثر تكون متسلسلة بالتوازي. وبالإضافة إلى ذلك، تظل المكونات العديدة للتحليل ج-seq الأمثل، بما في ذلك كفاءة على الجيش الملكي النيبالي والصرامة لتحديد حجم وطبيعة التحليل ذاته مضيعة للوقت. وأخيراً، فمن المستحسن أن كافة المستخدمين إمكانية الوصول إلى أداة عالية الحساسية، مكرسة لتحليل الحمض النووي واستكشاف الأخطاء وإصلاحها المحتملة (انظر الجدول للمواد). دون هذه الأداة، يمكن أن يكون من الصعوبة بمكان تحديد ما هي النقطة تنشأ المشاكل المحتملة، مما يجعل من المستحيل إصلاح.
على الرغم من أن البروتوكول بكامله إلى حد ما التي لا ترحم (الأخطاء الصغيرة تميل إلى عواقب كبيرة)، وهناك العديد من الخطوات التي بالغة الأهمية لنجاح التحليل ج-seq. واحدة من أهم المتطلبات أن الجيش الملكي النيبالي المعزول يتم التعامل معها بلطف قدر الإمكان. معظم أساليب استخراج الحمض النووي الريبي ومجموعات التجهيز النهائية الرعاية إلا القليل عن التركيب الكيميائي للحمض النووي الريبي تتجاوز معايير الصناعة الأساسية، وكافية للتحليلات الجزيئية الأكثر. بيد المقايسة ج-seq مكلف بتحديد خطأ في نسخ واحدة من بين مئات آلاف قواعد WT، إلى حد كبير في زيادة الحاجة إلى تقليل الضغط الجزيئي. يمكن إدخال الضغط حتى تؤثر فقط 1 في 10,000 قواعد القطع الأثرية التي يبطل تماما النتائج. على سبيل المثال، المستخدمين يجب أن ابدأ تجنب/حد فضح الجيش الملكي النيبالي إلى أي درجة حرارة أكثر من 65 درجة مئوية. ثانيا، يجب أن بعناية تحسين كل مستخدم الوقت اللازم لتفتيت الحمض النووي الريبي مع "رناسي الثالث". من المهم جداً لنجاح الفحص أن الجزيئات النهائية هي حوالي 60 – 80 في القواعد في الطول. قد يكون من الصعب على خريطة للجينوم جزيئات أقصر، والجزيئات أطول لن تسمح ليكرر المستقلة 3 تكون متسلسلة ضمن قراءة bp 250. أخيرا، أنه من المستحسن عدم تجميد وإذابة الجليد الجيش الملكي النيبالي في أكثر من مرة خلال بروتوكول كامل. بدلاً من ذلك، عزل الجيش الملكي النيبالي، وتوليف كدنا في يوم واحد. بسبب الوقت والجهد المبذول مع هذا الالتزام، وتعقيد البروتوكول نفسه، وعدد العينات التي كثيرا ما تتم معالجتها في وقت واحد، من المستحسن أن اثنين من المحققين العمل معا لإنشاء هذه المكتبات.
عندما تكون ناجحة، هذه التجارب سيجعل من الممكن لدقة الكشف عن أخطاء النسخ في أي كائن حي، تحت أي ظرف من الظروف التجريبية. على سبيل المثال، بمقارنة التحكم والأفراد المريضة إلى بعضها البعض، قد يكون ممكناً لتحديد ما إذا كانت بعض الأمراض المرتبطة بأخطاء النسخ، التي يمكن أن تكشف عن عنصر جديد من مسببات الأمراض البشرية العديدة. معلمات أخرى يمكن سبر هي الشيخوخة العضوي، والتغذية، والوراثي، والعوامل البيئية مثل التعرض للمواد الكيميائية السامة. وعلاوة على ذلك، نظراً لأن هذا التحليل بالكشف عن أخطاء النسخ في جميع أنحاء الترنسكربيتوم، وسوف تسمح الباحثين تشريح مختلف الآليات التي تسهم في الإخلاص للحمض النووي الريبي بوليميراز أنا، والثاني، والثالث، كذلك بوليميريز الحمض النووي الريبي المتقدرية. وبناء على ذلك، فإننا نتوقع أن هذا البروتوكول سيتم فتح حقل جديد من الطفرات للتجريب على نطاق واسع، تتميز بالدراسة من حدوث طفرات في الحمض النووي الريبي بدلاً من الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأمكن هذا المنشور بتمويل من منحة T32ES019851 (إلى فريتش جيم)، R01AG054641، ومحقق شباب عفر منح (إلى فرمولست م.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µL) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
