Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

इस प्रोटोकॉल के एक नए उपकरण के साथ कई मॉडल जीवों में प्रतिलेखन की निष्ठा पर नजर रखने के शोधकर्ताओं प्रदान करता है ।

Abstract

सटीक प्रतिलेखन आनुवंशिक जानकारी के वफादार अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है । आश्चर्य की बात है हालांकि, थोड़ा तंत्र है कि प्रतिलेखन के प्रति निष्ठा नियंत्रण के बारे में जाना जाता है । वैज्ञानिक ज्ञान में इस अंतर को भरने के लिए, हम हाल ही में सर्कल sequencing परख Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और Caenorhabditis के transcriptome भर में प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए अनुकूलित एलिगेंस। इस प्रोटोकॉल एक शक्तिशाली नए उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करने के लिए eukaryotic कोशिकाओं में प्रतिलेखन त्रुटियों के परिदृश्य नक्शा इतना है कि तंत्र है कि प्रतिलेखन के प्रति निष्ठा नियंत्रण अभूतपूर्व विस्तार में आविर्भाव किया जा सकता है ।

Introduction

जीनोम जीवन का एक सटीक जैविक खाका प्रदान करता है । इस खाका को सही ढंग से लागू करने के लिए, यह जीनोम के लिए महत्वपूर्ण है महान परिशुद्धता के साथ लिखित हो । हालांकि, प्रतिलेखन त्रुटि मुक्त होने की संभावना नहीं है । उदाहरण के लिए, आरएनए polymerases लंबे इन विट्रो1,2में त्रुटि प्रवण होने के लिए ज्ञात किया गया है, और हाल ही में यह दिखाया गया था कि वे vivo में त्रुटियों के रूप में अच्छी तरह से3,5,6, विशेष रूप से जब डीएनए क्षति के साथ सामना7,8,9,10। एक साथ ले लिया, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि प्रतिलेखन त्रुटियों सभी जीवित कोशिकाओं में लगातार होते हैं, सुझाव है कि वे रूपांतरित प्रोटीन का एक शक्तिशाली स्रोत हो सकता है ।

यह प्रक्रिया, शब्द transcriptional mutagenesis, दो मायनों में शास्त्रीय mutagenesis से अलग है । पहले, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विपरीत, प्रतिलेखन त्रुटियों दोनों mitotic और पोस्ट-mitotic कोशिकाओं को प्रभावित, के रूप में वे डीएनए प्रतिकृति पर निर्भर नहीं है । तंत्र का अध्ययन है कि प्रभाव प्रतिलेखन की निष्ठा, इसलिए होगा, दोनों mitotic और पोस्ट-mitotic कोशिकाओं के उत्परिवर्तन लोड में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं । दिलचस्प है, प्रतिलेखन त्रुटियों को हाल ही में प्रोटीन एकत्रीकरण11,12,13 के संवर्धन में फंसाया गया है और दोनों कैंसरजनन10 और में योगदान करने के लिए परिकल्पना की गई है बैक्टीरिया14में एंटीबायोटिक प्रतिरोध का विकास ।

दूसरा, आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के विपरीत, प्रतिलेखन त्रुटियों प्रकृति में क्षणिक हैं । उनके अस्थाई अस्तित्व विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए बेहद मुश्किल बना देता है । उदाहरण के लिए, जबकि कई प्रयोगशालाओं transcriptional mutagenesis के अध्ययन के लिए मूल्यवान रिपोर्टर परख तैयार की है, इन परख केवल संदर्भों और मॉडल जीवों की एक सीमित संख्या में प्रतिलेखन त्रुटियों को मापने के लिए कर रहे है4,15। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, कई शोधकर्ताओं ने आरएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकी (आरएनए-seq) को बदल दिया है, जो सैद्धांतिक रूप से प्रतिलेखन त्रुटियों को किसी भी प्रजाति के transcriptome भर में दर्ज करने की अनुमति देता है । हालांकि, इन अध्ययनों से आसानी से ऐसे रिवर्स प्रतिलेखन त्रुटियों, पीसीआर प्रवर्धन त्रुटियों के रूप में पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों, द्वारा स्थापित कर रहे हैं, और खुद को अनुक्रमण की त्रुटि प्रवण प्रकृति । उदाहरण के लिए, रिवर्स transcriptases हर ~ २०,००० कुर्सियां लगभग एक त्रुटि प्रतिबद्ध है, जबकि आरएनए polymerases (RNAPs) केवल एक त्रुटि हर ३००,००० कुर्सियां5,6बनाने की उंमीद कर रहे हैं । क्योंकि रिवर्स प्रतिलेखन की त्रुटि दर अकेले आरएनए polymerases कोशिकाओं के अंदर की त्रुटि दर बौने, यह वस्तुतः पारंपरिक आरएनए-Seq डेटा में पुस्तकालय की तैयारी की वजह से कलाकृतियों से सच प्रतिलेखन त्रुटियों को अलग करने के लिए असंभव है ( चित्र 1a) ।

इस समस्या को हल करने के लिए, हम सर्कल के एक अनुकूलित संस्करण-sequencing (Cirseq, या सी-seq) परख5,16विकसित की है । इस परख उपयोगकर्ता प्रतिलेखन त्रुटि और अंय transcriptome5भर में आरएनए में दुर्लभ वेरिएंट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है । परिपत्र अनुक्रमण परख इस नाम किया जाता है क्योंकि इस परख में एक महत्वपूर्ण कदम आरएनए circularization के आसपास घूमती है । एक बार आरएनए लक्ष्य परिपत्रित कर रहे हैं, वे रिवर्स एक रोलिंग सर्कल फैशन में प्रतिलिखित हैं, रैखिक सीडीएनए अणुओं है कि एक ही आरएनए टेम्पलेट की कई प्रतियां शामिल उत्पादन करने के लिए. यदि कोई त्रुटि इन टेंपलेट्स में से एक में मौजूद था, यह त्रुटि भी सीडीएनए अणु के भीतर समाहित हर एक दोहराने में मौजूद होगा । इसके विपरीत, त्रुटियों रिवर्स प्रतिलेखन, पीसीआर प्रवर्धन, या अनुक्रमण द्वारा शुरू की बेतरतीब ढंग से पैदा करते हैं, और इस प्रकार केवल एक या दो दोहराने में मौजूद हो जाएगा । इस प्रकार, प्रत्येक सीडीएनए अणु के लिए एक आम सहमति अनुक्रम पैदा करके, और त्रुटियों कि सभी दोहराता में पाए जाते हैं, पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों प्रभावी ढंग से सही प्रतिलेखन त्रुटियों (आंकड़ा 1b) से अलग किया जा सकता से यादृच्छिक त्रुटियों भेद ।

यदि ठीक से इस्तेमाल किया, सी-seq परख सही आधार प्रतिस्थापन, सम्मिलन, और किसी भी प्रजाति के transcriptome भर में आरएनए में हटाने की दर का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ट्रैवर्स और Ochman17देखें). उदाहरण के लिए, हम सी-seq परख का इस्तेमाल किया है Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और एक आधार संकल्प 5 के साथ Caenorhabditis एलिगेंस में प्रतिलेखन की त्रुटि दर की जीनोम चौड़ा माप प्रदान (अप्रकाशित प्रेक्षणों) । मूलतः के लिए सही अनुक्रम आरएनए वायरस आबादी का इस्तेमाल किया, सी के इस अनुकूलित संस्करण-seq परख पुस्तकालय की तैयारी है कि पुस्तकालय निर्माण कलाकृतियों के लिए योगदान के दौरान कठोर शर्तों को कम करने के लिए सुव्यवस्थित किया गया है । इसके अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के एक नंबर का उपयोग करके, परख का प्रवाह बहुत सुधार हुआ है, साथ ही साथ अपने उपयोगकर्ता मित्रता । अगर ठीक से इस्तेमाल किया, इस परख सही नकल प्रति प्रतिलिपि त्रुटियों के हजारों का पता लगाने के कर सकते हैं, जिससे बहुत पिछले अध्ययन6पर सुधार । कुल मिलाकर, इस विधि transcriptional mutagenesis अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है और उपयोगकर्ता तंत्र है कि जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रतिलेखन की निष्ठा पर नियंत्रण में उपंयास अंतर्दृष्टि हासिल करने की अनुमति देगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी

  1. RNases सर्वव्यापी हैं; इसलिए, कार्यक्षेत्र को अच्छी तरह से साफ करके उसे एक संदूषण रिएजेंट (उदा., RNase दूर) और ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव करें । RNase संदूषण के संभावित स्रोतों को हटाने के लिए किसी भी पिपेट, कलम, या ट्यूब रैक नीचे स्प्रे ।
  2. इसके अलावा नमूनों को दूषित करने से RNases को रोकने के लिए, एक प्रयोगशाला कोट या लंबी आस्तीन टी शर्ट प्रयोग के दौरान पहनते हैं । दस्ताने और किसी भी ट्यूबों है कि इस्तेमाल किया जाएगा, खासकर जब उंहें एक बॉक्स या बैग से प्राप्त करने के अंदर के बीच संपर्क से बचें ।
  3. रिवर्स प्रतिलेखन करने से पहले, दस्ताने अक्सर बदल जाते हैं ।
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, रिवर्स प्रतिलिपि करने से पहले प्रयोग को थामने नहीं है ।

2. सेल और पशु संस्कृति और संग्रह

  1. Saccharomyces cerevisiae वृद्धि र संग्रह
    1. एक सी-seq पुस्तकालय खमीर से वांछित है, तो पहले खमीर निकालने, adenine, peptone, और डेक्सट्रोज (YAPD) से युक्त मध्यम के 3 मिलीलीटर में एस cerevisiae की एक एकल कॉलोनी inoculate, और यह एक रोलिंग ड्रम में 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी ।
    2. सुबह में, फिर से YAPD माध्यम के ५० मिलीलीटर में संस्कृति ०.१ के एक ऑप्टिकल घनत्व (आयुध डिपो) को inoculate और कोशिकाओं को बढ़ने तक वे 0.5 के एक आयुध डिपो-0.7 (~ 7 x 106 कोशिकाओं/एमएल) तक पहुंचने ।
    3. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पूरे ५० मिलीलीटर संस्कृति (लगभग ३५० x 106 कोशिकाओं) लीजिए और 3 मिनट के लिए नीचे २,१०० एक्स जीमें कोशिकाओं स्पिन । ध्यान से YAPD माध्यम निकालें और एक बार गोली धो 1x पंजाबियों के साथ ।
    4. फिर, lysis बफर, ४८ µ एल के 10% एसडीएस के ४८० µ एल में गोली resuspend, और ४८० µ के एल Phenol: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl शराब (25:24:1), पीएच ६.८ । भंवर 5 एस के लिए अधिकतम गति से नमूना है, और यह एक १.५ मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब के लिए स्थानांतरण ७५० µ एल के साथ बर्फ ठंडा zirconia मोती (किट के साथ आपूर्ति की) । सेल lysis और कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए इस प्रोटोकॉल के चरण 3 के लिए आगे बढ़ें ।
      नोट: सभी कदम 2.1.4 के लिए आवश्यक एजेंट की सिफारिश की खमीर आरएनए निष्कर्षण किट में प्रदान की जाती हैं । ये रिएजेंट खमीर, कीड़े के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं, और मक्खियों के लिए इतना है कि खमीर के संग्रह के बाद (चरण २.१), कीड़े (कदम २.२) या मक्खियों (चरण २.३), एक एकीकृत दृष्टिकोण को उत्पंन किया जा सकता है सी-seq पुस्तकालयों (कदम 3-10) ।
  2. Caenorhabditis एलिगेंस संस्कृति और संग्रह
    1. एक सी-seq पुस्तकालय कीड़े से वांछित है, तो OP50 बैक्टीरिया के साथ देखा आगर की एक ताजा प्लेट पर 30 वयस्क कीड़े जमा ।
      नोट: पांच प्लेटें 1 दोहराने के लिए पर्याप्त हैं ।
    2. संस्कृति 4 दिनों के लिए कीड़े और धीरे M9 मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ प्लेटें धोने से कीड़े इकट्ठा, और एक एकल ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कीड़े पूल ।
    3. एक गोली बनाने के लिए 2 मिनट के लिए १०० x g पर कीड़े नीचे स्पिन । धीमा सबसे कम संभव गति पर केंद्रापसारक है, तो के रूप में गोली परेशान नहीं है ।
    4. धीरे एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कीड़े चाल, उंहें M9 मीडिया के १.५ मिलीलीटर में दो बार धो लो, और 1 मिनट के लिए १०० x g पर ट्यूब के लिए बैक्टीरिया को हटाने और कीड़े के एक साफ १०० µ एल गोली उत्पंन ।
    5. lysis बफर के ४८० µ एल में कीड़े resuspend, ४८ µ एल के 10% एसडीएस, और ४८० µ एल के Phenol: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl शराब । भंवर 5 एस के लिए अधिकतम गति पर नमूना और यह एक १.५ मिलीलीटर पेंच टोपी ट्यूब के लिए स्थानांतरण ७५० µ एल युक्त बर्फ की ठंड zirconia मोतियों की । कीड़े और कुल आरएनए निष्कर्षण के lysis के लिए इस प्रोटोकॉल के चरण 3 के लिए आगे बढ़ें ।
  3. Drosophila melanogaster संस्कृति र संग्रह
    1. यदि एक सी-seq पुस्तकालय मक्खियों से वांछित है, संस्कृति 20-25 शीशियों में मक्खियों कि या तो डेक्सट्रोज या एक गुड़ आधारित माध्यम होते हैं । Aliquot 3 शीशियों पर मक्खियों, ताकि प्रत्येक शीशी लगभग 8 मक्खियों शामिल हैं ।
    2. मक्खियों को इकट्ठा करने के लिए, एक बर्फ बाल्टी में शीशी जगह जब तक मक्खियों बेहोश कर रहे हैं । फिर, उंहें एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक ब्रश के साथ इकट्ठा । सह2 उपचार द्वारा मक्खियों इकट्ठा मत करो ।
    3. मक्खियों के कमरे के तापमान (आरटी) के लिए गर्म है, और जल्दी से lysis बफर के ५०० µ एल, 10% एसडीएस के ५० µ एल के एक निर्मित मिश्रण जोड़ने के लिए, और ५०० µ एल के Phenol: क्लोरोफॉर्म: Isoamyl ट्यूब के लिए शराब । लगभग 15 स्ट्रोक के साथ मक्खियों को पीसने के लिए एक micropestle का प्रयोग करें, एक फर्म घुमा गति के साथ जब मूसल ट्यूब के नीचे पहुंचता है ।
    4. एक १.५ मिलीलीटर पेंच कैप ट्यूब में मक्खियों और lysis मीडिया का मिश्रण डालो ७५० बर्फ के µ l-शीत zirconia मोती, और यह भंवर के लिए अधिकतम गति से 5 एस. मक्खियों के lysis के लिए इस प्रोटोकॉल के चरण 3 और कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें ।

3. कुल आरएनए शुद्धि

नोट: इस बिंदु पर, सभी तीन प्रोटोकॉल एकाग्र, और एक एकल, एकीकृत दृष्टिकोण सी-seq पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. कसकर पर टोपी पेंच और एक अनुकूलक या चिपचिपा टेप के साथ एक भंवर के लिए ट्यूब देते हैं । भंवर 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से ट्यूब नमूने लाइसे करने के लिए । फिर, 5 मिनट के लिए १६,१०० x जी पर नमूना केंद्रापसारक जलीय चरण से कार्बनिक सॉल्वैंट्स अलग ।
  2. ध्यान से 400 को हटाने-500 µ l जलीय चरण के एल, सफेद बादलों के साथ परेशान बिना, और यह एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए जोड़ बाध्यकारी बफर की १.९ मिलीलीटर. उंहें अच्छी तरह से भंवर द्वारा मिश्रण ।
  3. १००% इथेनॉल के १.२५ मिलीलीटर जोड़ें और भंवर द्वारा नमूना मिश्रण । हस्तांतरण ७०० एक फिल्टर एक संग्रह ट्यूब में इकट्ठे कारतूस के लिए नमूने के µ एल और 30 एस के लिए १४,५०० x g पर नमूना स्पिन जब तक नमूना के सभी कारतूस के माध्यम से पारित कर दिया है ।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूना थोड़ा अपारदर्शी हो सकता है । यदि बहुत अधिक कोशिकाओं, कीड़े, या मक्खियों लीजड ड थे, हाला कि फिल्टर को रोकना हो सकता है प्रकट हो सकता है ।
  4. धो समाधान 1 के ७०० µ एल के साथ एक बार फिल्टर धोने, और दो बार धोने समाधान 2 या 3 के ५०० µ l के साथ । 2 मिनट के लिए १४,५०० x g पर नमूनों कताई द्वारा बहाकर समाप्त करने के लिए किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को दूर ।
  5. एक १.५ मिलीलीटर डॉल्फिन ट्यूब के लिए फिल्टर कारतूस हस्तांतरण और गरम रेफरेंस समाधान (६५ डिग्री सेल्सियस) के १०८ µ एल जोड़ें ।
    नोट: एक रिवर्स प्रतिलेखन से पहले ६५ डिग्री सेल्सियस से अधिक तापमान के लिए आरएनए नमूनों का पर्दाफाश कभी नहीं, ऐसा करने के रूप में uracilी की घटनाओं है कि प्रतिलेखन त्रुटियों से भेद करने के लिए असंभव है cytosine भड़काना होगा ।
  6. पृथक आरएनए में डीएनए संदूषण नीचा (कदम 2.1-3.4 देखें) 11 µ एल जोड़ने के द्वारा 10x DNase मैं बफर, 2 µ RNase अवरोध करनेवाला के एल, और 4 µ l के DNase मैं (8 यू), और उन्हें ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए मशीन.
  7. पाचन के बाद, जोड़ें 11 DNase निष्क्रियता रिएजेंट के µ एल । भंवर मिश्रण और इसे 5 मिनट के लिए आरटी पर बैठते हैं । फिर, 3 मिनट के लिए १५,००० एक्स जी पर नमूना केंद्रापसारक निष्क्रियता एजेंट गोली और गोली परेशान बिना supernatant के ११० µ एल इकट्ठा । supernatant को १.५ एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें ।
    नोट: DNase निष्क्रियण एजेंट ठीक से प्लास्टिक करने के लिए काफी मुश्किल हो सकता है, तो नेत्रहीन प्रत्येक pipetting कार्रवाई के बाद पिपेट टिप का निरीक्षण । निष्क्रिय करने के लिए प्लास्टिक चिपचिपा एजेंट हो जाता है, तो 10 मिमी Tris-HCl (pH ७.४) के बराबर 1/5 शेष खंड जोड़ें ।
  8. (गुणवत्ता की जांच) एक spectrophotometer का उपयोग कर कुल आरएनए की एकाग्रता को मापने । फिर अलग सेट कुल आरएनए के 1 µ एल और यह एक एकाग्रता के लिए पतला 10 एनजी/µ एल में nuclease मुक्त (NF) पानी. आरएनए नीचा नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक उच्च संवेदनशीलता आरएनए टेप के साथ एक उचित न्यूक्लियोटाइड विश्लेषण उपकरण पर आरएनए चलाने के लिए और अधिक से कम ८.५ या उच्चतर (चित्रा बी) के एक आयलैंड मूल्य है.

४. mRNA संवर्धन

  1. एक mRNA miniprep किट के साथ mRNA संवर्धन प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक कुल मात्रा के लिए नमूना के लिए NF पानी की १४० µ l जोड़ें २५० µ l फिर, 2x बाध्यकारी बफर के २५० µ एल जोड़ें, भंवर द्वारा अच्छी तरह से नमूना मिश्रण है, और oligo (डीटी) मोतियों की 15 µ एल जोड़ें ।
  2. यह ऊपर और नीचे pipetting और 2 मिनट के लिए ६५ ° c पर यह मशीन द्वारा नमूना मिश्रण । उसके बाद, 10 मिनट के लिए RT पर नमूना रखें । अंत में, 2 मिनट के लिए १६,१०० एक्स जी में नमूने को मनका गोली: mRNA परिसरों के केंद्रापसारक ।
  3. supernatant त्यागें और ५०० µ धो समाधान के एल में गोली resuspend । एक स्पिन कॉलम के लिए समाधान हस्तांतरण और 1 मिनट के लिए यह स्पिन १५,००० x gपर । प्रवाह के माध्यम से त्यागें और धोने के समाधान के एक अतिरिक्त ५०० µ एल के साथ नमूना धो लो । फिर, स्पिन फिल्टर से किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को दूर करने के लिए १५,००० x g पर 2 मिनट के लिए नमूना स्पिन ।
  4. एक डॉल्फिन ट्यूब के लिए स्पिन फिल्टर स्थानांतरण और गरम रेफरेंस समाधान (६५ डिग्री सेल्सियस) के ८० µ एल के साथ कॉलम में गोली resuspend । ६५ डिग्री सेल्सियस पर १.५ मिनट के लिए नमूना मशीन और यह elute पर 1 मिनट के लिए कताई द्वारा यह १५,००० x जी।
  5. आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता के ठहराव के लिए अनुमति देता है कि एक spectrophotometer या इसी तरह के उपकरण का उपयोग कर शुद्ध आरएनए की एकाग्रता को मापने.

5. RNase III विखंडन और आरएनए साफ

नोट: (महत्वपूर्ण) सी-seq पुस्तकालयों को पैदा करने के लिए उपयुक्त परिपत्र आरएनए अणु तैयार करने के लिए, आरएनए लंबाई में लगभग 60-80 ठिकानों को खंडित किया जाना चाहिए. पिछले तरीकों एक रासायनिक विखंडन का इस्तेमाल किया है जबकि शाही सेना, भारी धातुओं के साथ रासायनिक विखंडन आरएनए नमूने है कि अंतिम विश्लेषण के दौरान प्रतिलेखन त्रुटियों के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती करने के लिए नुकसान का परिचय । इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, बजाय एक फ़्रेग्मेंटेशन RNase III का उपयोग करने के लिए छोटे टुकड़े उत्पंन पर भरोसा करते हैं । इस एंजाइमी दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह संगत समाप्त होता है बंधाव के लिए आवश्यक बनाता है, obviating रासायनिक विखंडन के बाद एक अंत मरंमत के लिए की जरूरत है ।

  1. शुद्ध आरएनए के 1 µ g के साथ आरएनए विखंडन प्रतिक्रिया, 10 µ एल ऑफ रिएक्शन बफर, 5 µ एल ऑफ RNase III, और पर्याप्त NF पानी १०० µ l तक वॉल्यूम को लाने के लिए ( सामग्री की तालिकादेखें). पिछले एंजाइम जोड़ें और मिश्रण करने के लिए नीचे और नीचे से कम 10 बार पिपेट । 25 मिनट, जो लंबाई में लगभग ६०-८० ठिकानों के आरएनए टुकड़े का उत्पादन करने के लिए जाता है के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
  2. एक बार 25 मिनट की मशीन पूरा हो गया है, एक oligo साफ अप और ध्यानी किट के साथ तुरंत प्रतिक्रिया साफ ( सामग्री की तालिकादेखें) किसी भी आगे पाचन को रोकने के लिए । नमूना के लिए oligo-बाध्यकारी बफर के २०० µ एल जोड़ें, यह अच्छी तरह से भंवर द्वारा मिश्रण, और १००% इथेनॉल के ८०० µ एल जोड़ें । एक संग्रह ट्यूब में एक प्रदान की स्पिन कॉलम को भंवर और यह हस्तांतरण द्वारा नमूना मिश्रण ।
  3. 30 एस के लिए १०,००० x जी पर नमूना केंद्रापसारक और धो बफर के ७५० µ एल के साथ धो RNase III को दूर करने के लिए । 30 एस के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक, प्रवाह के माध्यम से त्यागें, और एक बार फिर से धो के रूप में ऊपर वर्णित बफर के ७५० µ एल के साथ और अधिक नमूना । के बाद दूसरी प्रवाह के माध्यम से खारिज कर दिया गया है, 2 मिनट के लिए १५,००० x g पर कॉलम के लिए किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल को दूर करना ।
  4. एक ताजा १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए कॉलम हस्तांतरण और 1 मिनट के लिए १०,००० x g पर कताई द्वारा NF पानी के 24 µ एल में नमूना elute ।
  5. गुणवत्ता की जांच: शुद्ध आरएनए टुकड़े के 2 µ एल लो और इसे करने के लिए NF पानी की 2 µ एल जोड़कर इसे 2-गुना पतला । खंडित आरएनए की लंबाई में 50 – 100 ठिकानों की सीमा में है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक स्क्रीन टेप पर खंडित आरएनए चलाएँ (चित्रा 2c).

6. आरएनए Circularization और रोलिंग सर्कल रिवर्स प्रतिलेखन

  1. आरएनए अंशों को circularize करने के लिए, 1 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना के 20 µ l को गर्म करें और इसे बर्फ पर तुरंत 2 मिनट के लिए रखें । उसके बाद, 10x टी-4 आरएनए ligase बफर, 4 µ एल के 10 मिमी एटीपी, 1 µ एल के RNase अवरोधक, NF पानी की 1 µ एल के µ एल जोड़ें, और 8 µ एल के ५०% पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी).
  2. नमूना अच्छी तरह से भंवर से मिश्रण, तो 2 µ एल के 10 U/टी-4 आरएनए के µ एल जोड़ें Ligase I. नमूना फिर से यह pipetting द्वारा मिश्रण और एक thermocycler में 2 ज के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर यह ढक्कन सेट 30 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ.
  3. 2 एच के बाद, नमूना के लिए NF पानी की 10 µ एल जोड़ें और निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार एक oligo साफ-अप और एकाग्रता किट के साथ नमूना साफ । Elute ने एनएफ वॉटर के 20 µ l में सैंपल भरे ।
  4. रिवर्स करने के लिए परिपत्र आरएनए अणुओं को टाइप करना, 4 µ एल के 10 मिमी dNTPs, 4 µ l के ५० एनजी/µ l यादृच्छिक hexamers, और 9 µ l NF पानी की 9 µ एल के लिए आरएनए. pipetting द्वारा अच्छी तरह से सब कुछ मिलाएं, 1 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर नमूना प्रकृति, और यह बर्फ पर 2 मिनट के लिए जगह है । शेष आरएनए को बैक-अप के रूप में संग्रहीत करें.
  5. 5x के 8 µ l जोड़ें पहला किनारा संश्लेषण बफर, ०.१ मिमी डीटीटी के 2 µ एल, और 4 µ एल के २०० यू/µ एल रिवर्स transcriptase और pipetting द्वारा सब कुछ मिश्रण. 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन, 5 डिग्री सेल्सियस पर सेट ढक्कन के साथ ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक 20 मिनट की मशीन द्वारा पीछा मशीन तापमान से अधिक है ।
    नोट: कतरा विस्थापन क्षमताओं के साथ एक रिवर्स transcriptase एक रोलिंग सर्कल रिवर्स प्रतिलेखन के लिए अनुमति देने के लिए इस कदम पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  6. नमूने के लिए NF पानी की 10 µ एल जोड़ें और निर्माता की सिफारिशों के अनुसार oligo साफ अप और एकाग्रता किट के साथ इसे साफ । Elute ने रेफरेंस सॉल्यूशन के ४२ µ एल में सैंपल भरे ।
  7. गुणवत्ता की जांच: 2 µ l को पतला कर के 2 µ l में सीडीएनए NF पानी और एक उच्च संवेदनशीलता आरएनए टेप के साथ एक न्यूक्लियोटाइड विश्लेषण साधन पर इस नमूने को चलाने. यदि रिवर्स प्रतिलेखन ठीक से काम किया, सीडीएनए अणुओं की एक पुस्तकालय, मोटे तौर पर 60 से लेकर-लंबाई में 1500 कुर्सियां, दिखाई जानी चाहिए । आदर्श रूप में, सबसे सीडीएनए 500 की रेंज में है – 1000 कुर्सियां (चित्रा 2d) ।

7. दूसरा किनारा सीडीएनए संश्लेषण और अंत मरंमत

  1. एक दूसरा किनारा संश्लेषण किट एक डबल-कतरा सीडीएनए पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए उपयोग करें । बर्फ पर नमूने प्लेस और अपने नमूने के ३८ µ एल के लिए NF पानी की 30 µ एल जोड़ें । फिर, 8 µ 10x दूसरा किनारा बफर और दूसरा किनारा एंजाइम के 4 µ एल के एल जोड़ने के लिए, और २.५ एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर अपनी मशीन से पहले कोमल pipetting द्वारा नमूना मिश्रण ।
  2. १०० µ एल प्रतिक्रियाओं के लिए निर्माता की सिफारिशों के अनुसार oligo साफ-अप और एकाग्रता किट के साथ नमूनों को साफ और NF पानी के ३८ µ l में नमूने elute ।
  3. ३५.५ µ एल के डबल-असहाय सीडीएनए, अंत की मरंमत प्रतिक्रिया बफर के ६.५ µ एल और अंत तैयारी एंजाइम मिश्रण के 3 µ एल के लिए NF पानी की 20 µ एल जोड़कर अंत-मरंमत प्रतिक्रिया सेट करें । ध्यान से सफेद हाला के लिए प्रतिक्रिया बफर की जांच करें और उंहें हाथ वार्मिंग से भंग अगर वर्तमान ।
  4. pipetting द्वारा अंत की मरंमत की प्रतिक्रिया मिश्रण और 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर यह गर्मी, ६५ डिग्री सेल्सियस पर एक दूसरे 30 मिनट की मशीन द्वारा पीछा किया । thermocycler ढक्कन के तापमान को 5 डिग्री सेल्सियस से अधिक पर सेट करें ।

8. एडेप्टर बंधाव और तैयार पुस्तकालयों के आकार का चयन

  1. अंतिम पुस्तकालय की तैयारी के लिए एक बहु कदम पुस्तकालय तैयारी मॉड्यूल का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । सबसे पहले, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एडेप्टर को पतला 10 मिमी Tris-एचसीएल में १.५ µ मीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए 10 गुना । फिर, पतला एडाप्टर के २.५ µ l जोड़ें और प्रत्येक नमूने के लिए बंधाव बढ़ाने के 1 µ l और उन्हें भंवर से मिश्रण.
  2. कुंद/टा Ligase मास्टर मिश्रण के 15 µ एल जोड़ें, यह pipetting द्वारा मिश्रण और 15 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर यह मशीन । फिर, uracil-विशिष्ट उत्पाद एजेंट के 3 µ एल जोड़ें एंजाइम और 15 मिनट के लिए ३७ ° c पर यह मशीन । बंधाव पूरा होने के बाद, १०० µ एल की कुल मात्रा के लिए नमूने के लिए NF पानी की १३.५ µ l जोड़ें और आकार चयन करने के लिए आगे बढ़ें ।
    नोट: यह आकार के लिए सबसे अच्छा है-सीडीएनए अणुओं है कि 600 की सीमा में है के लिए चयन-लंबाई में 800 कुर्सियां । यदि खंडित आरएनए अणु थे लगभग 60-लंबाई में 80 कुर्सियां, अणुओं है कि 600 के लिए चयन कर रहे है-लंबाई में 800 कुर्सियां यह सुनिश्चित करेंगे कि चयनित अणुओं की सबसे कम तीन मिलकर दोहराता है, जो बहाव प्रसंस्करण के लिए आदर्श है और विश्लेषण.
  3. अणुओं के लिए चयन करने के लिए कि 600 – 800 बीपी लंबाई में, resuspend चुंबकीय मोतियों की 30 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), आदत आरटी करने के लिए, प्रत्येक नमूने के लिए और pipetting द्वारा मिश्रण. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण और आरटी पर 5 मिनट के लिए यह मशीन ।
  4. supernatant से मोतियों को अलग करने के लिए 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय स्टैंड पर नमूना रखें । स्थानांतरण supernatant (जो वांछित सीडीएनए अणुओं शामिल हैं) के लिए एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब और निपटान के चुंबकीय मोती (जो बड़े सीडीएनए अणुओं के लिए बाध्य कर रहे हैं).
  5. प्रत्येक नमूने के लिए चुंबकीय मोती के 15 µ एल की एक ताजा aliquot जोड़ें, pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण है, और आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन । एक चुंबकीय रैक पर नमूने प्लेस और आरटी में 5 मिनट के लिए उंहें गर्मी । फिर, ध्यान से हटाने और supernatants के निपटान, सुनिश्चित करने के लिए मोती परेशान नहीं कर रही ।
    नोट: चुंबकीय मोतियों का निपटान नहीं है, जो अब वांछित लक्ष्य सीडीएनए होते हैं ।
  6. ८०% की २०० µ एल जोड़ें ताजा के नमूनों में से प्रत्येक के लिए तैयार इथेनॉल छर्रों चुंबकीय मोती और 30 एस के लिए मशीन को भंग बिना । इथेनॉल को त्यागें और एक बार ८०% इथेनॉल के साथ नमूनों को धो लें । फिर, पूरी तरह से नमूनों और हवा से इथेनॉल के किसी भी निशान को हटाने-5 मिनट के लिए मोती सूखी लेकिन अधिक सूखी मोतियों को नहीं सावधान रहना । यदि मोतियों की माला सूख जाए तो छर्रों में दरारें दिखाई देंगी.
  7. मोतियों से नमूने elute के लिए, चुंबकीय स्टैंड से ट्यूबों निकालें और 10 मिमी Tris-एचसीएल के 19 µ एल जोड़ें । यह ऊपर और नीचे कई बार मोतियों को resuspend और आरटी पर 5 मिनट के लिए नमूनों की मशीन के लिए प्लास्टिक । अगर मोती सूखे थे, उंहें > 10 मिनट के लिए मशीन ।
  8. चुंबकीय स्टैंड पर नमूने वापस प्लेस और 5 मिनट के लिए उंहें supernatant से मोतियों को अलग करने के लिए गर्मी । ध्यान से, ट्यूब से शुद्ध, आकार चयनित सीडीएनए पुस्तकालयों युक्त supernatant के 15 µ एल निकालें और यह एक ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण ।

9. पीसीआर प्रवर्धन और अंतिम मनका शुद्धि

  1. यूनिवर्सल प्राइमर के 5 µ एल और एक अद्वितीय सूचकांक प्राइमर के 5 µ एल जोड़ें (सामग्री की तालिका देखें) प्रत्येक शुद्ध सीडीएनए पुस्तकालय के लिए और उंहें अच्छी तरह से pipetting द्वारा मिश्रण । ध्यान से क्रिस्टल और अन्य हाला के लिए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण की जाँच करें, और हाला भंग तक हाथ से मास्टर मिश्रण गर्म ।
    1. नमूना के लिए पोलीमरेज़ मास्टर मिश्रण के 25 µ एल जोड़ें, उन्हें pipetting द्वारा मिश्रण, और पीसीआर प्रवर्धन के लिए नीचे साइकल शर्तों का पालन करें । 30 s के लिए ९८ ° c पर प्रारंभिक विकार चलाएं, और उसके बाद नमूने को ९८ ° c पर 10 s के लिए और पीसीआर उत्पादों की एक एनीलिंग/विस्तार पर ७५ s (12x) के लिए ६५ ° c पर denaturating द्वारा एक दोहरा कदम पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन, 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर एक अंतिम विस्तार के बाद और 4 ° c पर एक अनिश्चितकालीन पकड़ो ।
  2. निलंबित चुंबकीय मोतियों की ४५ µ एल जोड़कर अंतिम पुस्तकालयों को सीधे पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए, उन्हें pipetting द्वारा मिश्रण, और 5 मिनट के लिए आर टी पर उन्हें गर्मी । नमूना एक १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और यह एक चुंबकीय स्टैंड में जगह है । यह 5 मिनट के लिए मशीन, supernatant त्यागें और इसे दो बार धोने के साथ हौसले से तैयार ८०% इथेनॉल के लिए 30 एस
  3. दूसरा धोने के बाद, पूरी तरह से नमूना से इथेनॉल को दूर करने, और हवा-5 मिनट के लिए मनका गोली सूखी और 0.1 x ते के ३५ µ एल में यह elute । उंहें pipetting और आरटी पर 5 मिनट के लिए उंहें मशीन द्वारा मोतियों resuspend । चुंबकीय स्टैंड पर नमूना प्लेस और 5 मिनट के बाद, एक ताजा १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए supernatant के 30 µ एल हस्तांतरण । -८० डिग्री सेल्सियस पर पुस्तकालयों की दुकान ।
  4. गुणवत्ता की जांच: NF पानी की 9 µ l में अंतिम पुस्तकालय के 1 µ एल पतला और एक उच्च संवेदनशीलता चिप के साथ एक समर्पित डीएनए विश्लेषण साधन पर नमूना चलाने; सीडीएनए के बहुमत की सीमा में होना चाहिए 600 – 800 बीपी की लंबाई में (चित्रा 2e).
  5. रेफरेंस के बाद, नमूनों को एक बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण मंच पर अनुक्रमण के लिए २५० बीपी मीन्स-end पढ़ता का उपयोग कर भेजें, या ३०० bp एकल-अंत पढ़ता है ।

10. सर्कल अनुक्रमण डेटा का बायो-formater विश्लेषण

नोट: विश्लेषण और सी से रॉ डेटा की व्याख्या-seq परख एक समर्पित जैव-unformater पाइपलाइन की आवश्यकता है । पाइप लाइन है कि हमारे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था की एक योजनाबद्ध चित्र 3में दर्शाया गया है । इस पाइपलाइन को https://github.com/LynchLab/MAPGD पर डाउनलोड करें ।

  1. पहले, cutadapt18के साथ एडाप्टर अनुक्रम और कम गुणवत्ता वाले आधार कॉल्स को निकालने के लिए पढ़ता है, एक गुणवत्ता स्कोर थ्रेशोल्ड 20 का उपयोग करके ट्रिम कर दीजिए ।
  2. फिर, concatemerized आरएनए अणु द्वारा इनकोडिंग की पहचान करने के लिए एक उचित एल्गोरिथ्म का उपयोग कर किसी भी दोहराता का पता लगाने के लिए 30 न्यूक्लियोटाइड का एक ंयूनतम आकार और एक अधिकतम के बीच 2 बेमेल18दोहराता है । इन दोहराने से एक आम सहमति अनुक्रम प्राप्त है और प्रत्येक स्थिति में सभी आधार कॉल और जुड़े गुणवत्ता स्कोर का ट्रैक रखने के लिए ।
    नोट: क्योंकि रिवर्स प्रतिलेखन परिपत्र आरएनए अणु पर किसी भी स्थिति में शुरू कर सकते हैं, एक दोहराने की शुरुआत जरूरी नहीं के अनुरूप है 5 ' खंडित आरएनए अणु के अंत (इसके बाद बंधाव बिंदु के रूप में भेजा) । तदनुसार, आम सहमति अनुक्रम संगत transcriptome के खिलाफ लगातार नक्शा नहीं होगा, जो बंधाव बिंदु की पहचान आवश्यक ।
  3. बंधाव बिंदु की पहचान करने के लिए, विस्फोट की तरह संरेखण उपकरण (BLAT)19का उपयोग transcriptome संदर्भ के विरुद्ध आम सहमति अनुक्रम का एक concatemer मैप करें ।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि मैप किए गए अनुक्रम में प्रारंभिक आरएनए अंश अनुक्रम का कम से एक पूर्ण निर्बाध प्रकटन हो, सर्वसम्मत अनुक्रम के दो उदाहरणों को श्रेणीबद्ध करें. फिर, भविष्यवाणी बंधाव बिंदु स्थिति पर शुरू करने के लिए आम सहमति अनुक्रम घुमाएँ.
  4. TopHat20 का उपयोग कर जीनोम के खिलाफ घुमाया सहमति दृश्यों नक्शा और किसी भी एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) कि प्रतिलेखन त्रुटियों के लिए गलत हो सकता है का पता लगाने के लिए संरेखण का उपयोग करें ।
  5. मैप्ड रोटेटेड सहमति अनुक्रम से प्रतिलेखन त्रुटियों को कॉल करें और जांचें कि क्या अभ्यर्थी त्रुटियां चार अतिरिक्त परीक्षण पास करते हैं ।
    1. सबसे पहले, सुनिश्चित करें कि एक प्रतिलेखन त्रुटि एक SNP के साथ ओवरलैप नहीं करता है (एक ठेठ आवश्यकता है कि एक विशेष आधार को कवर करने की आवश्यकता है और अधिक से अधिक 5% पढ़ता एक वैकल्पिक आधार कॉल का समर्थन कर सकते हैं) ।
    2. दूसरा, की जांच करें कि आम सहमति अनुक्रम से कम से व्युत्पंन है 3 मिलकर दोहराता, जिनमें से प्रत्येक एक ही आधार जोड़ी कॉल; और तीसरे, सुनिश्चित करें कि उस स्थिति की गुणवत्ता स्कोर का योग १०० से अधिक होना चाहिए ।
  6. एक चौथे और अंतिम जांच के लिए, सभी संभव संयोजनों में आम सहमति अनुक्रम को घुमाएगी (बंधाव बिंदु के सभी संभव पदों का अनुकरण) और TopHat का उपयोग कर संदर्भ जीनोम के खिलाफ प्रत्येक संस्करण नक्शा ।
    नोट: घुमाया दृश्यों में से एक जीनोम में एक परिपूर्ण मैच पाता है, इसी बंधाव बिंदु अब सही एक माना जाता है और प्रतिलेखन त्रुटि कॉल अस्वीकार कर दिया जाना चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सभी बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण दृष्टिकोण की तरह, प्रत्येक सी-seq प्रयोग एक unwieldे, बड़े डेटासेट पैदा करता है । पहली बार उपयोगकर्ताओं के लिए, यह इन डेटासेट को हैंडल करने के लिए कठिन हो सकता है; इस प्रकार, यह अनुशंसित है कि सभी उपयोगकर्ता एक अनुभवी जैव-informatician से पहले प्रयोग से संपर्क करें । औसत पर, उम्मीद है कि उपयोगकर्ताओं को लगभग 55-70 गीगा कुर्सियां (Gbases) सबसे बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण प्लेटफार्मों पर चलाने के प्रति उत्पन्न होगा । इस प्रोटोकॉल के लिए सामान्यतया 12 – 30 नमूने प्रति रन मल्टीप्लेक्स किए गए थे ताकि प्रत्येक नमूने के लिए लगभग 2 – 6 Gbases का अधिग्रहण किया गया. इस डेटासेट से एडेप्टर अनुक्रम और निम्न-गुणवत्ता वाले बेस कॉल्स (< 20) को ट्रिम करने के बाद, प्रारंभिक डेटा आकार का ~ ७०% रह गया ।

इन ठिकानों तो आगे का विश्लेषण कर रहे है आरएनए विखंडन और circularization की क्षमता की जांच करने के लिए दोहराया है कि उत्पंन किया गया के आकार का निर्धारण करके । सबसे दोहराया जाता है 45-लंबाई में 80 कुर्सियां (चित्रा 4a) और कुर्सियां कि अनुक्रम थे की लगभग ५०% है इन दोहराता का हिस्सा है (चित्रा 4B) । चूंकि इन ठिकानों के अधिकांश पढ़ता है कि 3 दोहराता है या अधिक होते हैं, अद्वितीय ठिकानों की संख्या है कि अनुक्रम में है के बारे में अनुक्रम की कुल संख्या का एक तिहाई है में मौजूद हैं । औसत पर, > इन आम सहमति दृश्यों के 75% संदर्भ जीनोम को वापस मैप किया जा सकता है । अंत में, इन ठिकानों के लगभग 25% 20 पढ़ता या अधिक है, जो अंततः मतलब है कि डेटा के बारे में 10% त्रुटि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है द्वारा कवर कर रहे हैं । इस विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 4में दिया गया है, जो sequencing जानकारी का प्रतिनिधित्व करता है जो इस प्रोटोकॉल के सेट अप के दौरान प्राप्त किया गया था 1 दोहराने के लिए एक सी-seq पुस्तकालय है कि अपेक्षाकृत उथले अनुक्रम था और कम का प्रतिनिधित्व करता है उस डेटा की सीमा जिसे उपयोगकर्ता प्राप्त करने की अपेक्षा कर सकते हैं ।

लगभग 5000 – 25000 त्रुटियों के प्रति चलाने की पहचान की जा करने के लिए करते हैं, हालांकि इन संख्याओं काफी त्रुटि दर के आधार पर भिन्न हो सकते हैं (उच्च त्रुटि दर, अधिक त्रुटियों का पता लगाया जाएगा), transcriptome का आकार (बड़ा transcriptome, कम कुर्सियां 20 पढ़ता द्वारा कवर किया जाएगा, अनुक्रमण डेटा है कि त्रुटि का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सीमित), और गहराई जिस पर यह अनुक्रम है (गहरा अनुक्रमण इसे और अधिक संभावना है कि एक दिया आधार 20 पढ़ता या अधिक द्वारा कवर किया जाएगा कर देगा) । इन त्रुटियों को पूरे जीनोम में वितरित किया जा करते हैं, ताकि औसत पर ~ ४७% त्रुटियों के mRNA आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय (RNAP द्वितीय) द्वारा उत्पंन अणुओं में स्थित हैं, ~ ४९% RNAP मैं द्वारा उत्पंन rRNA अणुओं में स्थित हैं, और शेष ~ 3% RNAs में स्थित है RNAP III और mitochondrial आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा उत्पंन । हालांकि, इन अनुपात काफी सेल प्रकार या जांच के तहत जीव के आधार पर भिंन हो सकते है (चित्र 4c) । उदाहरण के लिए, mitochondrial फ़ंक्शन पर भारी निर्भर करने वाले कक्ष प्रकार, जैसे cardiomyocytes, अन्य कक्ष प्रकारों की तुलना में काफी अधिक mitochondrial आरएनए होते हैं, जो अनुक्रम किए गए mitochondrial आरएनए अणुओं की संख्या को बहुत बढ़ाते हैं, और इस प्रकार संख्या त्रुटियों का पता लगाया ।

एक बार त्रुटियों की एक सूची को संकलित किया गया है, और जीनोम भर में अपने स्थानों जाना जाता है, इन त्रुटियों के लिए मापदंडों कि प्रत्येक जीव में प्रतिलेखन की त्रुटि दर को नियंत्रित करने की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इन प्रतिलेखन त्रुटियों के स्थान के जीनोम की कई विशेषताओं के साथ संबद्ध किया जा सकता है, जैसे डीएनए दोहराता की उपस्थिति, विशिष्ट आनुवंशिक संदर्भों, या अभिव्यक्ति दर, समझने के लिए कैसे इन सुविधाओं की निष्ठा को बदल प्रतिलेखन5. उंमीद है कि भविष्य में, हालांकि, उपयोगकर्ताओं को कैसे अनगिनत अतिरिक्त सुविधाओं का निर्धारण करने में सक्षम हो जाएगा epigenetic मार्करों सहित transcriptional निष्ठा, प्रभावित, 3-डी जीनोम के संगठन, पोषक तत्वों की उपलब्धता, उंर, या विषाक्त के लिए जोखिम यौगिकों, प्रतिलेखन की निष्ठा के लिए आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के योगदान को स्पष्ट करने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: आरएनए के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-seq बनाम सी-seq. (क) पारंपरिक आरएनए-seq प्रयोगों के हित का एक नमूना, आरएनए टुकड़ा से आरएनए अलग, और रिवर्स यह अंतिम पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण करने से पहले टाइप करना. हालांकि, इन तैयारी प्रक्रियाओं के रूप में पुस्तकालय में कई तकनीकी कलाकृतियों परिचय रिवर्स प्रतिलेखन त्रुटियों, पीसीआर प्रवर्धन त्रुटियों, और अनुक्रमण त्रुटियों । (ख) यह अनुकूलित सी-seq परख circularizing खंडित आरएनए के अणुओं द्वारा इन तकनीकी कलाकृतियों के सुधार के लिए पहले प्रतिलेखन रिवर्स, जो उंहें एक रोलिंग सर्कल फैशन में टाइप करने के लिए रैखिक उत्पादन रिवर्स की अनुमति देता है के लिए अनुमति देता है सीडीएनए अणुओं कि मिलकर दोहराने में मूल आरएनए टेम्पलेट के कई प्रतियां शामिल. ये मिलकर दोहराता है तो कलाकृतियों से सच प्रतिलेखन त्रुटियों को भेद किया जा सकता है, के रूप में सही प्रतिलेखन त्रुटि (स्टार) एक ही स्थान पर सभी दोहराने में मौजूद हो जाएगा, जबकि ऐसी रिवर्स प्रतिलेखन त्रुटियों के रूप में कलाकृतियों (स्क्वायर) और पीसीआर प्रवर्धन त्रुटियों (सर्कल) केवल एक या दो किसी भी सीडीएनए अणु के दोहराव में मौजूद हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पुस्तकालय की तैयारी के लिए प्रतिनिधि परिणाम । इन पैनलों (क) एक उच्च संवेदनशीलता आरएनए स्क्रीन टेप सीढ़ी ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए एक electrophoretogram दिखाने के लिए, (ख) कुल आरएनए Saccharomyces cerevisiaeसे शुद्ध, (ग) RNase III-खंडित आरएनए, और ( घ) रोलिंग सर्कल रिवर्स-प्रतिलिखित सीडीएनए । (ङ) अंतिम आकार-चयनित सीडीएनए पुस्तकालय एक उच्च संवेदनशीलता डबल-असहाय डीएनए विश्लेषण चिप पर चलाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जैव-formater पाइप लाइन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया सर्किल अनुक्रमण डेटा की योजनाबद्ध । अनुक्रमण की ट्रिमिंग के बाद पढ़ता है, दोहराने की पहचान कर रहे हैं, और एक आम सहमति अनुक्रम किसी भी स्थिति में सबसे अधिक संभावना आधार फोन का उपयोग कर उत्पन्न होता है. फिर, आरंभिक आरएनए टेम्पलेट की बंधाव पॉइंट की पहचान की जाती है और आम सहमति अनुक्रम को संदर्भ जीनोम से संरेखित किया जाता है ताकि संभावित प्रतिलेखन त्रुटियों की पहचान की जा सके. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: C-Seq पाइपलाइन के लिए परिणामों का उदाहरण । (क) यह पैनल एक ठेठ सी-Seq प्रयोग से प्राप्त सहमति अनुक्रम के आकार वितरण को दिखाता है. (ख) यह पैनल कुर्सियां, पढ़ता है, और सी-Seq bioinformatics पाइपलाइन के प्रत्येक चरण में अनुक्रम पढ़ता का प्रतिशत की संख्या दिखाता है । (ग) इस पैनल ने पाया प्रतिलेखन त्रुटियों की संख्या और त्रुटियों का प्रतिशत से पता चलता है आरएनए पोलीमरेज़ मैं, आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय, आरएनए पोलीमरेज़ III, और mitochondrial आरएनए पोलीमरेज़ के लिए जिंमेदार ठहराया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां, हम Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, और Caenorhabditis एलिगेंसमें प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए सी-seq पुस्तकालयों की तैयारी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल मौजूदा प्रोटोकॉल पर कई फायदे हैं, साथ ही वैकल्पिक तकनीक ।

पिछले 15 वर्षों में, कई रिपोर्टर सिस्टम विकसित किया गया है कि luciferase पर भरोसा7,8 या Cre-लोक्स पुनर्संयोजन3,4,15,21 प्रतिलेखन का पता लगाने के लिए त्रुटियों. इन संवाददाता प्रणालियों transcriptional निष्ठा के शोधकर्ताओं समझ के लिए अमूल्य गया है क्योंकि वे जीन, alleles की अनुमति दी, और आणविक तंत्र की पहचान की है कि सीधे प्रतिलेखन की निष्ठा को विनियमित । हालांकि, वे केवल कृत्रिम रूप से क्षतिग्रस्त टेम्पलेट्स में त्रुटियों पर रिपोर्ट, या अत्यधिक विशिष्ट आनुवंशिक संदर्भों के भीतर, जो वैज्ञानिक प्रश्न वे उत्तर दे सकते हैं सीमित करता है । सी-seq प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह पूरे transcriptome5भर में प्रतिलेखन की निष्ठा पर नज़र रखता है, बहुत सटीकता के साथ जो आनुवंशिक जानकारी व्यक्त की है वैज्ञानिक ज्ञान का विस्तार । दूसरे, क्योंकि सी seq परख अपने स्रोत सामग्री के रूप में आरएनए का इस्तेमाल करता है, यह संभावना है कि इस परख पसंद के किसी भी जीव को अनुकूलित किया जा सकता है, obviating एक ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए जटिल रिपोर्टर बनाने की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल भी मौजूदा व्यापक समानांतर अनुक्रमण17,22दृष्टिकोण पर लाभ है । सबसे विशेष रूप से, इन तरीकों की सबसे भारी धातुओं का उपयोग करने के लिए आरएनए पुस्तकालयों टुकड़ा बनाते हैं । हालांकि, इन विखंडन विधि आरएनए कि सच प्रतिलेखन त्रुटियों5से अलग कर रहे है में कलाकृतियों परिचय । इस समस्या को हल करने के लिए, इस प्रोटोकॉल RNase III के साथ आरएनए enzymatically टुकड़े, जो जोड़ा लाभ है कि यह आत्म-बंधाव के लिए समाप्त होता है, बहुत आरएनए circularization को सरल बनाने और परख की संवेदनशीलता को बढ़ाने ~ 10-गुना है ।

एक ही समय में, सी seq परख सीमाओं का अपना हिस्सा है । सबसे पहले, भले ही परख पूरे जीनोम, डेटा का एक बड़ा घटक भर में प्रतिलेखन त्रुटि उपाय है जीन है कि उच्च व्यक्त कर रहे है से प्राप्त हो जाता है, के रूप में इन जीनों से टेप के लिए सबसे आरएनए पुस्तकालयों पर हावी हैं । एक अंय कारक है कि विश्लेषण की ओर अत्यधिक व्यक्त जीन विषम है कि आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और आरएनए अंतिम माप को प्राप्त करने से घटनाओं के संपादन को रोकता है में बनाया दहलीज है । इस सीमा हुक्म है कि केवल कुर्सियां कि 20 बार या अधिक अनुक्रम थे अंतिम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक दूसरे की सीमा की चिंता पुस्तकालय विविधता । सबसे आरएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया किट की तरह, यहां इस्तेमाल किया किट कुशलता से छोटे आरएनए अणु, जो RNAP III द्वारा संश्लेषित अणुओं से व्युत्पंन पढ़ता की संख्या सीमा को शुद्ध नहीं करता है । अंतिम अनुक्रमण पुस्तकालय की विविधता आगे mRNA शुद्धि यहां कार्यरत कदम द्वारा सीमित है । हालांकि RNAP द्वारा उत्पंन अणुओं मैं कुशलतापूर्वक अनुक्रम किया जा सकता है, शेष mitochondrial RNAs, tRNAs, और गैर कोडिंग RNAs के अधिकांश इस कदम के दौरान खो रहे हैं । इन अणुओं अधिक बार कब्जा करने के लिए, एक अलग किट है कि विशेष रूप से छोटे आरएनए अणु शुद्ध इस्तेमाल किया जाना चाहिए, या सेल प्रकार है कि इन अणुओं के लिए समृद्ध कर रहे है लक्षित किया जाना चाहिए । इन समाधानों के दोनों जांचकर्ताओं द्वारा एक बड़ा वित्तीय निवेश की आवश्यकता होगी, हालांकि, हालांकि, कृपया ध्यान दें, कि इन समस्याओं का सबसे सामान्य से, या एक साथ एक ही कोशिकाओं से डीएनए sequencing से अधिक गहरी अनुक्रमण द्वारा हल किया जा सकता है ।

इसके अलावा, भविष्य में तकनीकी विकास के लिए एक बुनियादी स्तर पर सी seq परख में सुधार की ओर अग्रसर हैं । उदाहरण के लिए, मौजूदा अनुक्रमण प्रौद्योगिकी की पढ़ें-लंबाई का विस्तार करके, यह लंबे समय तक अणुओं, जिसका अर्थ है कि अधिक दोहराने के लिए प्रतिलेखन की निष्ठा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संभव हो जाएगा । इस तरह के सुधार स्वचालित रूप से एक बड़ा अनुक्रमण गहराई और बहाव विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पढ़ता के प्रतिशत में वृद्धि में परिणाम होगा । इसी तरह के तर्क किसी भी अनुक्रमण प्रौद्योगिकी है कि और अधिक अणुओं समानांतर में अनुक्रम किया जा करने के लिए अनुमति देता है के लिए बनाया जा सकता है । इसके अलावा, सी के कई घटक-seq परख रहने के लिए अनुकूलित किया जाना, आरएनए circularization की क्षमता, आकार चयन के stringency, और समय लेने वाली स्वयं परख की प्रकृति भी शामिल है । अंत में, यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि सभी उपयोगकर्ताओं को एक समर्पित, उच्च संवेदनशीलता न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण और संभावित समस्या निवारण के लिए उपकरण के लिए पहुँच प्राप्त ( सामग्री की तालिकादेखें). इस उपकरण के बिना, यह बहुत मुश्किल हो सकता है क्या बिंदु पर निर्धारित करने के लिए संभावित समस्याओं उठता है, जिससे उंहें ठीक करने के लिए असंभव बना ।

हालांकि पूरे प्रोटोकॉल काफी माफ है (छोटी गलतियों के लिए महत्वपूर्ण परिणाम होते हैं), वहां कई कदम है कि पूरी तरह से सी की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है seq परख रहे हैं । सबसे महत्वपूर्ण आवश्यकताओं में से एक है कि पृथक आरएनए के रूप में संभव के रूप में धीरे इलाज किया जाता है । अधिकांश आरएनए निष्कर्षण तरीकों और बहाव प्रसंस्करण किट बुनियादी उद्योग मानकों, जो सबसे आणविक विश्लेषण के लिए पर्याप्त है परे आरएनए की रासायनिक संरचना के बारे में थोड़ा ध्यान । हालांकि, सी-seq परख WT अड्डों के हजारों की सैकड़ों के बीच एक ही प्रतिलेखन त्रुटि की पहचान के साथ काम सौंपा है, बहुत से आणविक तनाव को कम करने की जरूरत बढ़ रही है । यहां तक कि तनाव है कि प्रभाव केवल 1 १०,००० कुर्सियां में कलाकृतियों है कि पूरी तरह से परिणाम अमांय परिचय कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, उपयोगकर्ताओं को कभी नहीं बचना चाहिए/सीमा ६५ डिग्री सेल्सियस से अधिक किसी भी तापमान के लिए आरएनए बेनकाब । दूसरे, प्रत्येक उपयोगकर्ता ध्यान से RNase III के साथ आरएनए विखंडन के लिए आवश्यक समय का अनुकूलन करना चाहिए. यह परख की सफलता के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है कि अंतिम अणु लगभग 60-लंबाई में 80 कुर्सियां हैं । छोटे अणुओं के जीनोम को मैप करने के लिए मुश्किल हो सकता है, और अब अणुओं के लिए अनुमति नहीं होगी 3 स्वतंत्र दोहराने के लिए एक २५० बीपी पढ़ने के भीतर अनुक्रम होगा । अंत में, यह पूरी तरह से प्रोटोकॉल के दौरान एक बार से अधिक सेना को फ्रीज और गल नहीं की सिफारिश की है । इसके बजाय, आरएनए अलग और एक ही दिन में सीडीएनए संश्लेषित । क्योंकि समय और प्रयास इस प्रतिबद्धता के साथ शामिल, प्रोटोकॉल ही की जटिलता, और नमूनों की संख्या है कि अक्सर एक बार में संसाधित कर रहे हैं, यह अनुशंसा की जाती है कि दो जांचकर्ताओं को एक साथ काम करने के लिए इन पुस्तकालयों उत्पंन करते हैं ।

जब सफल, इन प्रयोगों यह संभव सही किसी भी जीव में प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाने के लिए, किसी भी प्रयोगात्मक हालत के तहत कर देगा । उदाहरण के लिए, नियंत्रण और रोगग्रस्त व्यक्तियों को एक-दूसरे से तुलना करके, यह निर्धारित करना संभव हो सकता है कि क्या कुछ रोग प्रतिलेखन त्रुटियों से संबद्ध हैं, जो अनेक मानव विकृतियों के एटियलजि का एक नया घटक प्रकट कर सकता है. अंय मापदंडों कि जांच की जा सकती है जीव बुढ़ापे, पोषण, जीनोटाइप, और विषाक्त रसायनों के लिए जोखिम के रूप में पर्यावरणीय कारकों । इसके अलावा, क्योंकि इस परख transcriptome भर में प्रतिलेखन त्रुटियों का पता लगाता है, यह शोधकर्ताओं के विभिंन तंत्र है कि आरएनए पोलीमरेज़ मैं, द्वितीय, और III, साथ ही साथ mitochondrial आरएनए पोलीमरेज़ की निष्ठा में योगदान काटना करने की अनुमति देगा । तदनुसार, हम उंमीद करते है कि इस प्रोटोकॉल mutagenesis का एक नया क्षेत्र व्यापक प्रयोग करने के लिए खुला, आरएनए में परिवर्तन के अध्ययन की विशेषता के बजाय डीएनए में होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस प्रकाशन को अनुदान T32ES019851 (सी. Fritsch), R01AG054641, और एक अफर युवा अन्वेषक अनुदान (एम. Vermulst) से वित्त पोषण द्वारा संभव बनाया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Tags

आनुवंशिकी अंक १३९ आनुवंशिक प्रक्रियाओं जीन अभिव्यक्ति प्रतिलेखन आनुवंशिक रिवर्स प्रतिलेखन Transcriptome Mutagenesis एमिनो एसिड प्रतिस्थापन घटनाएं और प्रक्रियाओं आनुवंशिक घटनाएं Mutagenesis प्रतिलेखन आरएनए-Seq एस । cerevisiae सी. एलिगेंस डी. melanogaster अनुक्रमण आरएनए पोलीमरेज़ त्रुटियाँ
जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P.,… More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter