Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Questo protocollo fornisce ai ricercatori con un nuovo strumento per monitorare la fedeltà della trascrizione in molteplici organismi di modello.

Abstract

Trascrizione accurata è necessaria per la fedele espressione dell'informazione genetica. Sorprendentemente, però, piccolo è conosciuto circa i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione. Per colmare questa lacuna nella conoscenza scientifica, abbiamo recentemente ottimizzato il dosaggio di cerchio-sequenziamento per rilevare errori di trascrizione in tutto il trascrittoma di Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo di fornire ai ricercatori con un nuovo potente strumento per mappare il paesaggio di errori di trascrizione nelle cellule eucariotiche, in modo che i meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione possono essere chiariti in dettaglio senza precedenti.

Introduction

Il genoma fornisce un preciso progetto biologico della vita. Per implementare correttamente questo programma d'azione, è importante per il genoma deve essere trascritto per primo con grande precisione. Tuttavia, la trascrizione è improbabile che sia privo di errori. Ad esempio, RNA polimerasi lungamente sono state conosciute per essere soggetta a errori in vitro1,2, e recentemente è stato indicato che commettono errori in vivo come pure3,5,6, specialmente quando si confronta con DNA danni7,8,9,10. Prese insieme, queste osservazioni indicano che gli errori di trascrizione avviene con continuità in tutte le cellule viventi, suggerendo che potrebbe essere una potente fonte di proteine mutate.

Questo processo, chiamato mutagenesi trascrizionale, differisce dal classica mutagenesi in due modi. In primo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione interessano sia in cellule post-mitotiche che mitotiche, come essi non dipendono dalla replicazione del DNA. Lo studio dei meccanismi che influenzano la fedeltà della trascrizione, pertanto, fornirà informazioni preziose sul carico mutazione di cellule post-mitotiche e mitotiche. È interessante notare che, gli errori di trascrizione recentemente sono stati implicati nella promozione di proteina aggregazione11,12,13 e sono stati supposti per contribuire a entrambi di carcinogenesi10 e la sviluppo di resistenza agli antibiotico nei batteri14.

In secondo luogo, in contrasto con le mutazioni genetiche, gli errori di trascrizione sono natura transitori. Loro esistenza temporanea è particolarmente impegnativo, perché rende gli errori di trascrizione estremamente difficile da rilevare. Ad esempio, mentre diversi laboratori hanno messo a punto saggi reporter prezioso per lo studio di mutagenesi trascrizionale, queste analisi sono solo in grado di misurare gli errori di trascrizione in un numero limitato di contesti e organismi modello4,15. Per superare queste limitazioni, molti ricercatori si sono rivolti a tecnologia di sequenziamento di RNA (RNA-seq), che permette teoricamente gli errori di trascrizione da registrare in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie. Tuttavia, questi studi sono facilmente confusi dai manufatti di costruzione di libreria, quali errori di trascrizione inversa, errori di amplificazione di PCR e la natura soggetta a errori di impostazione della sequenza stessa. Per esempio, reverse transcriptases commit circa un errore ogni ~ 20.000 basi, mentre la RNA polimerasi (RNAPs) sono tenute a compiere un solo errore ogni 300.000 basi5,6. Poiché il tasso di errore di trascrizione d'inversione da solo nani il tasso di errore della polimerasi del RNA all'interno delle cellule, è praticamente impossibile distinguere gli errori di trascrizione vera da artefatti causati dalla preparazione libreria in dati di RNA-Seq tradizionali ( Figura 1a).

Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una versione ottimizzata del cerchio-sequenziamento (Cirseq, o C-seq d'ora in poi) dosaggio5,16. Questo test consente di rilevare gli errori di trascrizione e altre rare varianti nel RNA in tutto il trascrittoma5. L'analisi di sequenziamento circolare porta questo nome perché un passo fondamentale in questa analisi ruota intorno circularization di RNA. Una volta che gli obiettivi del RNA sono circolarizzazione, sono inverso trascritto in una rotolamento cerchio moda, per produrre molecole di cDNA lineare che contengono numerose copie dello stesso modello di RNA. Se un errore era presente in uno di questi modelli, questo errore potrebbe anche essere presente in ogni singola ripetizione contenute all'interno della molecola di cDNA. Al contrario, gli errori introdotti dal trascrizione inversa, amplificazione di PCR o sequenziamento tendono a verificarsi in modo casuale e così sarà presenti in solo uno o due ripetizioni. Così, generando una sequenza di consenso per ogni molecola di cDNA e distinguere errori casuali da errori che si verificano in tutte le ripetizioni, manufatti di costruzione di libreria possono essere separati in modo efficace da errori di trascrizione vera (Figura 1b).

Se usato correttamente, il dosaggio di C-seq può essere utilizzato per rilevare con precisione il tasso di base sostituzioni, inserimenti ed eliminazioni in RNA in tutto il trascrittoma di qualsiasi specie (ad esempio, Vedi Traverse e Ochman17). Ad esempio, abbiamo usato il test C-seq per fornire misurazioni di genoma del tasso di errore di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans con una sola risoluzione base5 (osservazioni non pubblicate). Originariamente utilizzato per accuratamente sequenza RNA virus popolazioni, questa versione ottimizzata del dosaggio C-seq è stata semplificata per minimizzare condizioni difficili durante la preparazione di libreria che contribuiscono agli elementi di costruzione di libreria. Inoltre, utilizzando una serie di kit disponibili in commercio, la velocità effettiva del dosaggio è notevolmente migliorata, così come la facilità d'uso. Se usato correttamente, questo test è in grado di rilevare con precisione migliaia di errori di trascrizione per replica, migliorando così notevolmente il precedente studi6. Nel complesso, questo metodo fornisce un potente strumento per lo studio di mutagenesi trascrizionale e permetterà all'utente di acquisire nuove conoscenze sui meccanismi che controllano la fedeltà della trascrizione in una vasta gamma di organismi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparazione

  1. RNasi sono onnipresenti; Pertanto, pulire accuratamente l'area di lavoro spruzzando giù con un reagente di decontaminazione (ad esempio, RNasi via) ed etanolo al 70%. Spruzzo giù qualsiasi pipette, penne o tubo rack per rimuovere potenziali fonti di contaminazione RNasi.
  2. Per impedire ulteriore RNAsi di contaminare i campioni, indossare un camice da laboratorio o t-shirt manica lunga durante la sperimentazione. Evitare il contatto tra i guanti e l'interno di qualsiasi tubi che verrà utilizzato, soprattutto quando il loro recupero da una scatola o busta.
  3. Prima la trascrizione d'inversione, cambiare spesso i guanti.
    Nota: Per risultati ottimali, non mettere in pausa l'esperimento prima della trascrizione d'inversione.

2. cella e cultura animale e collezione

  1. Raccolta e crescita di saccharomyces cerevisiae
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da lievito, innanzitutto inoculare una singola colonia di S. cerevisiae in 3 mL di medium contenente Estratto di lievito, adenina, peptone e destrosio (YAPD) e incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo di rotolamento.
    2. Al mattino, a ri-inoculare la cultura in 50 mL di terreno YAPD a una densità ottica (OD) di 0,1 e crescere le cellule fino a raggiungere un OD di 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 cellule/mL).
    3. Raccogliere la cultura intera 50 mL (circa 350 x 106 cellule) in una provetta conica da 50 mL e girare le celle in basso per 3 min a 2.100 x g. Rimuovere il mezzo YAPD con cautela e lavare la pallina una volta con PBS 1X.
    4. Quindi, risospendere il pellet in 480 µ l di tampone di Lisi, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1), pH 6,8. Vortexare il campione alla massima velocità per 5 s e il trasferimento di un tappo a vite 1,5 mL tubo con 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata (in dotazione con il kit). Passare al punto 3 del presente protocollo per la lisi delle cellule e l'estrazione del RNA totale.
      Nota: Tutti i reagenti necessari per passo 2.1.4 sono forniti nel kit di estrazione di RNA lievito consigliato. Questi reagenti funzionano ugualmente bene per lieviti, vermi e Vola in modo che dopo la raccolta del lievito (punto 2.1), vermi (punto 2.2) o mosche (punto 2.3), un approccio unificato può essere utilizzato per generare librerie C-seq (fase 3 – 10).
  2. Cultura di Caenorhabditis elegans e collezione
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da worms, deposito di 30 vermi adulti su un piatto fresco di agar notata con OP50 batteri.
      Nota: Cinque piastre sono sufficienti per 1 replicare.
    2. I vermi della coltura per 4 giorni e raccogliere i vermi lavando delicatamente le piastre con 5 mL di M9 media e piscina i vermi in un tubo conico di singolo 50 mL.
    3. Girare i vermi giù a 100 x g per 2 minuti creare un pellet. Decelerare la centrifuga alla minima velocità possibile, in modo da non disturbare il pellet.
    4. Delicatamente spostare i vermi in una provetta da 1,5 mL, lavarli due volte in 1,5 mL di terreno di M9 e centrifugare la provetta a 100 x g per 1 min rimuovere batteri e generare un pellet pulito 100 µ l di vermi.
    5. Risospendere i vermi in 480 µ l di tampone di Lisi, 48 µ l di 10% SDS e 480 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico. Vortexare il campione alla massima velocità per 5 s e il trasferimento di un tappo a vite 1,5 mL tubo contenente 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata. Passare al punto 3 del presente protocollo per la lisi di vermi e l'estrazione di RNA totale.
  3. Collezione e della coltura di drosophila melanogaster
    1. Se una libreria di C-seq è desiderata da mosche, mosche di 20 – 25 in flaconcini contenenti destrosio o un supporto basato su melassa della coltura. Aliquotare le mosche oltre 3 fiale, così che ogni flaconcino contiene circa 8 mosche.
    2. Per raccogliere le mosche, collocare il flaconcino in un secchio di ghiaccio fino a quando le mosche sono sedate. Poi, raccoglierli con un pennello in una provetta da 1,5 mL. Non raccogliamo le mosche dal trattamento di CO2 .
    3. Lasciate che le mosche calde a temperatura ambiente (TA) e di aggiungere rapidamente una miscela premade di 500 µ l di tampone di Lisi, 50 µ l di 10% SDS e 500 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico al tubo. Utilizzare un micropestle per macinare le mosche con circa 15 colpi, accompagnate da un forte movimento di torsione quando il pestello raggiunge il fondo del tubo.
    4. Versare il composto di mosche e supporto di lisi nel tappo a vite 1,5 mL tubo contenente 750 µ l di microsfere di zirconio ghiacciata e vortice e alla massima velocità per 5 s. procedere al punto 3 del presente protocollo per la lisi delle mosche e l'estrazione di RNA totale.

3. purificazione di RNA totale

Nota: A questo punto, tutti i tre protocolli convergono, e un approccio unificato può essere utilizzato per generare le librerie C-seq.

  1. Avvitare bene il tappo e fissare il tubo di un Vortex con un adattatore o un nastro adesivo. Vortice il tubo alla massima velocità per 10 min a lisare i campioni. Quindi, centrifugare il campione a 16.100 x g per 5 min separare i solventi organici dalla fase acquosa.
  2. Con attenzione rimuovere 400 – 500 µ l della fase acquosa senza disturbare l'interfase bianco, nuvoloso e aggiungerlo a un tubo conico da 15 mL contiene 1,9 mL di tampone di associazione. Li mescolare nel Vortex.
  3. Aggiungere 1,25 mL di etanolo al 100% e mescolare il campione nel Vortex. Trasferire 700 µ l del campione una cartuccia di filtro montata in un tubo di raccolta e spin il campione a 14.500 x g per 30 s. Ripetere fino a quando tutti del campione viene passato attraverso la cartuccia.
    Nota: A questo punto, il campione può girare leggermente opaco. Se troppe celle, vermi o mosche sono state lisate, precipitati potrebbero apparire che possono intasare il filtro.
  4. Lavare il filtro una volta con 700 µ l di soluzione di lavaggio 1 e due volte con 500 µ l di soluzione di lavaggio 2 o 3. Finire i lavaggi facendo girare i campioni a 14.500 x g per 2 minuti rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso.
  5. Trasferire la cartuccia di filtro in una provetta di delfino di 1,5 mL e aggiungere 108 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (65 ° C).
    Nota: Non esporre mai i campioni di RNA a temperature superiori a 65 ° C prima di una trascrizione inversa, come fare così provocherà citosina agli eventi di deaminazione di uracile che sono impossibili da distinguere da errori di trascrizione.
  6. Degradare la contaminazione del DNA in RNA isolato (vedere passaggi 2.1 – 3.4) con l'aggiunta di 11 µ l di 10 x dnasi buffer, 2 µ l di inibitore di RNAsi e 4 µ l di dnasi I (8 U) e li Incubare a 37 ° C per 30 min.
  7. Dopo la digestione, aggiungere 11 µ l di reagente di inattivazione della dnasi. Vortice la miscela e lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 min. Quindi, centrifugare il campione a 15.000 x g per 3 min a pellet il reagente di inattivazione e raccogliere 110 µ l del surnatante senza disturbare il pellet. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 mL.
    Nota: Il reagente di inattivazione della dnasi può essere abbastanza difficile da dispensare correttamente, così visivamente la punta della pipetta dopo ogni azione di pipettaggio. Se il reagente di inattivazione diventa troppo viscoso a dispensare, aggiungere 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) pari a 1/5 del volume residuo.
  8. (Controllo qualità) Misurare la concentrazione di RNA totale usando uno spettrofotometro. Quindi mettere da parte 1 µ l di RNA totale e diluirla a una concentrazione di 10 ng / µ l in acqua (NF) priva di nucleasi. Eseguire il RNA su uno strumento di analisi del nucleotide appropriato con un nastro di RNA ad alta sensibilità per garantire che il RNA non è degradato e ha un valore di eRIN di almeno 8.5 o superiore (Figura 2B).

4. mRNA arricchimento

  1. Eseguire l'arricchimento di mRNA con un miniprep mRNA kit (Vedi Tabella materiali). Aggiungere 140 µ l di acqua di NF al campione per un volume totale di 250 µ l. Quindi, aggiungere 250 µ l di buffer di associazione: 2x, mescolare accuratamente il campione nel vortex e 15 µ l di perle di oligo (dT).
  2. Mescolare il campione pipettando su e giù e incubare a 65 ° C per 2 min. Quindi, posizionare il campione a temperatura ambiente per 10 min. Infine, centrifugare il campione a 16.100 x g per 2 min a pellet i complessi di perlina: mRNA.
  3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di soluzione di lavaggio. Trasferire la soluzione in una colonna di spin e girarla per 1 min a 15.000 x g. Scartare il flusso continuo e lavare il campione con un ulteriori 500 µ l di soluzione di lavaggio. Poi, girare il campione per 2 min a 15.000 x g per rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso dai filtri spin.
  4. Trasferire il filtro spin in una provetta di delfino e risospendere il pellet in colonna con 80 µ l di soluzione per eluizione preriscaldato (65 ° C). Incubare il campione per 1,5 minuti a 65 ° C ed eluire esso di filatura per 1 min a 15.000 x g.
  5. Misurare la concentrazione di RNA purificato mediante un spettrofotometro o strumento simile che permette per la quantificazione della concentrazione di RNA e di qualità.

5. RNAsi III frammentazione e RNA ripulire

Nota: (Importante) per la preparazione di molecole di RNA circolare appropriati per la generazione di librerie C-seq, il RNA deve essere frammentato per circa 60 – 80 basi di lunghezza. Mentre i metodi precedenti hanno usato una frammentazione chimica al frammento di RNA, frammentazione chimica con metalli pesanti introduce danni per i campioni di RNA che possono essere erroneamente interpretati come errori di trascrizione durante l'analisi finale. Per aggirare questo problema, si basano invece su una frammentazione utilizzando RNAsi III per generare piccoli frammenti. Un ulteriore vantaggio di questo approccio enzimatico è che crea estremità compatibile necessaria per la legatura, prevenente l'esigenza di una fine-riparazione dopo la frammentazione chimica.

  1. Impostare la reazione di frammentazione di RNA con 1 µ g di RNA purificato, 10 µ l di tampone di reazione, 5 µ l di RNAsi III e abbastanza NF acqua per portare il volume fino a 100 µ l (Vedi Tabella materiali). Aggiungere l'enzima Ultima e dispensare la miscela su e giù almeno 10 volte per mescolare. Incubare il campione a 37 ° C per 25 min, che tende a produrre frammenti di RNA di circa 60-80 basi di lunghezza.
  2. Una volta completata l'incubazione di 25 min, ripulire la reazione immediatamente con un oligo clean-up e concentratore kit (Vedi Tabella materiali) per prevenire qualsiasi ulteriore digestione. Aggiungere 200 µ l di tampone di oligo-associazione per il campione, mescolare nel vortex e 800 µ l di etanolo al 100%. Mescolare il campione nel vortex e trasferirlo in una colonna di spin fornito in una provetta di raccolta.
  3. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 s e lavare con 750 µ l di tampone di lavaggio per rimuovere RNAsi III. Centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 s, scartare il flusso continuo e lavare il campione ancora una volta con 750 µ l di tampone di lavaggio come descritto sopra. Dopo il secondo passaggio è stato scartato, centrifugare la colonna a 15.000 x g per 2 minuti rimuovere qualsiasi etanolo in eccesso.
  4. Trasferire la colonna ad un tubo fresco 1,5 mL ed eluire il campione in 24 µ l di acqua NF di girare a 10.000 x g per 1 min.
  5. Controllo di qualità: Prendere 2 µ l dei frammenti di RNA purificati e diluirla 2 volte aggiungendo 2 µ l di acqua NF ad esso. Eseguire il RNA frammentato su un nastro di schermo per garantire che il RNA frammentato è nella gamma di 50 – 100 basi in lunghezza (Figura 2C).

6. RNA Circularization e cerchio di rotolamento trascrizione inversa

  1. Per circolarizzare i frammenti di RNA, calore-denaturare 20 µ l di campione a 65 ° C per 1 min e posizionarlo sul ghiaccio immediatamente per 2 min. Quindi, aggiungere 4 µ l di 10 x T4 RNA ligasi buffer, 4 µ l di 10 mM ATP, 1 µ l di inibitore di RNasi, 1 µ l di acqua di NF e 8 µ l di 50% glicole polietilenico (PEG).
  2. Mescolare accuratamente il campione nel Vortex, quindi aggiungere 2 µ l di 10 U / µ l di T4 RNA ligasi I. Mix il campione nuovamente pipettando esso e viene quindi incubato a 25 ° C per 2 h in un termociclatore con la temperatura del coperchio fissato a 30 ° C.
  3. Dopo 2 h, aggiungere 10 µ l di acqua di NF al campione e pulire il campione con un kit di pulizia e concentrazione di oligo secondo le specifiche del produttore. Eluire il campione in 20 µ l di acqua di NF.
  4. Per invertire trascrivere le molecole di RNA circolare, aggiungere 4 µ l di 10 mM dNTPs, 4 µ l di 50 ng / µ l random esameri e 9 µ l di acqua di NF a 9 µ l di RNA. Mescolare il tutto accuratamente pipettando, denaturare il campione a 65 ° C per 1 min e posizionarlo sul ghiaccio per 2 min Store il rimanente RNA come back-up.
  5. Aggiungere 8 µ l di tampone di sintesi del primo-filo x 5, 2 µ l di 0,1 mM DTT e 4 µ l di transcriptase d'inversione di 200 U / µ l e mescolare il tutto di pipettaggio. Incubare il campione a 25 ° C per 10 minuti, seguito da un'incubazione di 20 min a 42 ° C con il coperchio fissato a 5 ° C superiore alla temperatura di incubazione.
    Nota: Una trascrittasi inversa con le capacità del dislocamento di filo deve essere utilizzata in questa fase per consentire una rotolamento trascrizione inversa di cerchio.
  6. Aggiungere 10 µ l di acqua di NF al campione e ripulirlo con il kit di clean-up e concentrazione di oligo secondo le raccomandazioni del produttore. Eluire il campione in 42 µ l di soluzione per eluizione.
  7. Controllo di qualità: Diluire 2 µ l del singolo filamento cDNA in 2 µ l di acqua NF ed eseguire l'esempio su uno strumento di analisi del nucleotide con un nastro di RNA ad alta sensibilità. Se la trascrizione d'inversione ha funzionato correttamente, una libreria di cDNA molecole, che vanno da circa il 60 – 1.500 basi di lunghezza, deve essere visibile. Idealmente, la maggior parte cDNA è nella gamma di 500 – 1.000 basi (figura 2d).

7. seconda sintesi del cDNA del filo e fine riparazione

  1. Utilizzare un secondo kit di sintesi strand per generare una libreria di cDNA double-stranded. I campioni su ghiaccio e aggiungere 30 µ l di acqua di NF a 38 µ l di campione. Aggiungere 8 µ l di 10 x secondo Strand Buffer e 4 µ l di secondo Strand enzima, quindi mescolare il campione pipettando delicato prima sua incubazione a 16 ° C per 2,5 h.
  2. Ripulire i campioni con l'oligo clean-up e concentrazione kit secondo le raccomandazioni del produttore per le reazioni di 100 µ l ed eluire i campioni in 38 µ l di acqua di NF.
  3. Impostare la reazione di fine-riparazione aggiungendo 20 µ l di acqua NF a 35,5 µ l di cDNA double-stranded, 6,5 µ l di tampone di reazione di riparazione di fine e 3 µ l di fine Prep enzima Mix. Attentamente controllare il buffer di reazione per precipitati bianchi e dissolverli di scaldamani se presente.
  4. Miscelare la reazione di fine-riparazione pipettando e incubare a 20 ° C per 30 min, seguita da una seconda incubazione di 30 minuti a 65 ° C. Impostare la temperatura del coperchio termociclatore a 5 ° C superiore alla temperatura di incubazione.

8. adattatore legatura e la selezione della dimensione delle librerie preparate

  1. Utilizzare un modulo di preparazione libreria multi-step per le preparazioni di biblioteca finale (Vedi Tabella materiali). In primo luogo, diluire gli adattatori per generazione sequenziamento 10 volte in 10 mM Tris-HCl a una concentrazione finale di 1,5 µM. Aggiungere 2,5 µ l di adattatore diluito e 1 µ l di potenziatore della legatura per ogni campione, quindi mescolare nel Vortex.
  2. Aggiungere 15 µ l di Blunt/TA ligasi Master Mix, mescolare pipettando e incubare a 20 ° C per 15 min. Aggiungere 3 µ l di enzima reagente l'asportazione uracile-specifici, quindi incubare a 37 ° C per 15 min. Dopo la legatura è completa, aggiungere 13,5 µ l di acqua di NF al campione per un volume totale di 100 µ l e procedere alla selezione dimensione.
    Nota: Si consiglia di dimensione-selezionare per molecole di cDNA che sono nella gamma di 600 – 800 basi di lunghezza. Se le molecole di RNA frammentate erano circa 60 – 80 basi di lunghezza, selezionando per molecole che sono 600 – 800 basi di lunghezza garantirà che la maggior parte delle molecole selezionate contengono almeno tre ripetizioni in tandem, che è ideale per la lavorazione a valle e analisi.
  3. Per selezionare per le molecole che sono 600 – 800 bp in lunghezza, aggiungere 30 µ l di sedimento biglie magnetiche (Vedi Tabella materiali), acclimatati alla RT, per ogni campione e Miscelare pipettando. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL e incubare a + RT 5 min.
  4. Il campione viene posto su un supporto magnetico per 5 min separare le perle dal surnatante. Trasferire il surnatante (che contiene le molecole di cDNA desiderato) per un nuovo 1,5 mL tubo e smaltire i branelli magnetici (che vengono associati alle molecole di cDNA grande).
  5. Aggiungere una nuova aliquota di 15 µ l di biglie magnetiche a ciascuno i campioni, mescolare accuratamente pipettando e incubare per 5 min a RT. posto i campioni su un rack magnetico e li Incubare per 5 minuti a TA. Quindi, rimuovere delicatamente e smaltire i surnatanti, facendo attenzione a non disturbare le perline.
    Nota: Non smaltire i branelli magnetici, che ora contengono il cDNA di destinazione desiderata.
  6. Aggiungere 200 µ l di 80% preparata etanolo a ciascuno dei campioni senza disturbare i branelli magnetici pellettati e incubare per 30 s. scartare l'etanolo e lavare i campioni ancora una volta con 80% di etanolo. Quindi, completamente rimuovere ogni traccia di etanolo dai campioni e asciugare le perline per 5 min ma fare attenzione a non asciugare troppo i branelli. Se le perle sono overdried, crepe apparirà in pellet.
  7. Per eluire i campioni dalle perline, rimuovere i tubi dal supporto magnetico e 19 µ l di 10 mM Tris-HCl. Dispensare su e giù più volte a risospese le perline e incubare i campioni per 5 min a TA. Se le perle erano overdried, incubare per > 10 min.
  8. Collocare i campioni nel supporto magnetico e incubare per 5 min separare le perle dal surnatante. 15 µ l del supernatante contenente le librerie di cDNA purificata, dimensione selezionata dai tubi di rimuovere delicatamente e trasferirlo in una provetta di fresco da 1,5 mL.

9. PCR amplificazione e purificazione finale perlina

  1. Aggiungere 5 µ l di primer universale e 5 µ l di primer indice univoco (Vedi tabella materiali) a ciascuno purificato libreria del cDNA e mescolarli accuratamente pipettando. Attentamente controllare il mix master della polimerasi per cristalli e altri precipitati e caldo il mix master a mano fino a sciogliere i precipitati.
    1. Aggiungere 25 µ l di mix master della polimerasi al campione, mescolare pipettando e seguire le condizioni in bicicletta sotto per l'amplificazione di PCR. Eseguire la denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 s e quindi eseguire un doppio passo reazione di PCR di denaturante i campioni a 98 ° C per 10 s e ricottura/estensione dei prodotti di PCR a 65 ° C per 75 s (12x), seguito da un'estensione finale a 65 ° C per 5 min e un'indefinita a 4 ° C.
  2. Pulire le librerie finale aggiungendo 45 µ l di sedimento biglie magnetiche direttamente per la reazione di PCR, mescolarli pipettando e li presso RT per 5 min, trasferimento Incubare il campione in una provetta da 1,5 mL e posizionarlo in un supporto magnetico. Incubare per 5 min, scartare il surnatante e lavare due volte con preparati 80% etanolo per 30 s.
  3. Dopo il secondo lavaggio, completamente rimuovere l'etanolo dall'esempio e asciugare all'aria il pellet perlina per 5 min ed eluire esso in 35 µ l di 0.1 x TE. Risospendere le perline pipettando li e li Incubare a RT per 5 min, posto il campione sul supporto magnetico e dopo 5 min, trasferire 30 µ l del surnatante in una provetta di fresco 1,5 mL. Memorizzare le librerie a-80 ° C.
  4. Controllo di qualità: Diluire 1 µ l della biblioteca finale a 9 µ l di acqua NF ed eseguire l'esempio su uno strumento di analisi del DNA dedicato con un chip di alto-sensibilità; la maggior parte dei cDNA dovrebbe essere nella gamma di 600 – 800 bp in lunghezza (Figura 2e).
  5. Dopo l'eluizione, spedire i campioni per il sequenziamento su una piattaforma di sequenziamento massivamente parallelo utilizzando 250 bp accoppiato-fine letture, o 300 bp single-end.

10. bioinformatica analisi del cerchio dati di sequenziamento

Nota: Analizzare ed interpretare i dati grezzi del dosaggio C-seq richiede una pipeline di bio-informatico dedicata. Un disegno schematico della pipeline che è stato utilizzato per le nostre analisi è raffigurato in Figura 3. Scarica questa pipeline a https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. In primo luogo, tagliare le letture per Rimuovi scheda sequenze e bassa qualità chiamate base con cutadapt18, utilizzando una soglia di Punteggio di qualità di 20.
  2. Quindi, identificare le ripetizioni codificate dalla molecola di RNA concatemerized usando un algoritmo appropriato per rilevare eventuali ripetizioni con una dimensione minima di 30 nucleotidi e un massimo di 2 mancate corrispondenze tra ripetizioni18. Derivare una sequenza consenso da queste ripetizioni e tenere traccia di tutte le chiamate di base e i punteggi di qualità associata ad ogni posizione.
    Nota: Perché la trascrizione d'inversione può iniziare in qualsiasi posizione sulla molecola di RNA circolare, l'inizio di una ripetizione non corrisponde necessariamente all'estremità 5 ' della molecola del RNA frammentata (in appresso denominato "il punto di legatura"). Di conseguenza, la sequenza di consenso non mapping continuamente contro il trascrittoma corrispondente, che richiede l'identificazione del punto di legatura.
  3. Per identificare il punto di legatura, mappare un concatemer della sequenza consenso contro il trascrittoma di riferimento utilizzando l'allineamento di scoppio-come strumento (BLAT)19.
    1. Concatenare due istanze della sequenza consenso per garantire che la sequenza mappata contenga almeno un'occorrenza ininterrotta completa della iniziale sequenza di frammento di RNA. Ruotare quindi la sequenza di consenso per avviare dalla posizione di punto di legatura predetto.
  4. Mappa le sequenze consenso ruotato contro il genoma utilizzando TopHat20 e utilizzare gli allineamenti per rilevare eventuali polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che potrebbero essere scambiate per errori di trascrizione.
  5. Chiamare gli errori di trascrizione delle sequenze consenso ruotato mappata e verificare se gli errori del candidato superano quattro prove ulteriori.
    1. Innanzitutto, assicurarsi che un errore di trascrizione non coincide con un SNP (un requisito tipico è che almeno 20 letture devono coprire una particolare base e non più di 5% della legge può sostenere un'alternativa chiamata base).
    2. In secondo luogo, verificare che la sequenza di consenso è derivata da almeno 3 ripetizioni in tandem, ognuno dei quali chiama la stessa coppia di base; e in terzo luogo, assicurarsi che la somma dei punteggi di qualità di tale posizione deve essere oltre 100.
  6. Per un quarto e finale verifica, ruotare la sequenza di consenso in tutte le possibili combinazioni (simulando tutte le possibili posizioni del punto di legatura) e mappa ogni versione contro il genoma di riferimento utilizzando TopHat.
    Nota: Se una delle sequenze ruotate trova una perfetta corrispondenza nel genoma, il corrispondente punto di legatura è ora considerato quella corretta e la chiamata di errore di trascrizione dovrebbe essere respinta.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Come tutti gli approcci di sequenziamento massivamente parallelo, ogni esperimento di C-seq produce un ingombrante, grandi set di dati. Per gli utenti di prima volta, può essere difficile gestire questi set di dati; Pertanto, si raccomanda che tutti gli utenti di contattare un esperto bio-pianista prima la sperimentazione. In media, l'aspettativa è che gli utenti genererà circa 55 – 70 Giga basi (Gbases) per eseguire su più piattaforme di sequenziamento massivamente parallelo. Per questo protocollo, in genere, 12 – 30 campioni erano multiplex per corsa affinché per ciascun campione sono stati acquistati circa 2 – 6 Gbases. Dopo la rifinitura le sequenze di adattatore e la bassa qualità base chiamate (< 20) da questo dataset, circa il 70% delle dimensioni dei dati iniziali è rimasto.

Queste basi sono poi ulteriormente analizzate per studiare l'efficienza della frammentazione di RNA e circularization di determinare le dimensioni delle ripetizioni che sono stati generati. La maggior parte si ripete tendono ad essere 45 – 80 basi di lunghezza (Figura 4A) e circa il 50% delle basi che sono stati sequenziati fanno parte di queste ripetizioni (Figura 4B). Poiché la maggior parte di queste basi sono presente in letture che contengono 3 ripetizioni o più, il numero di basi uniche che sono in sequenza è circa un terzo del numero totale delle basi sequenziato. In media, > 75% di queste sequenze di consenso possono essere mappati al genoma di riferimento. Infine, circa il 25% di queste basi sono coperte da letto 20 volte o più, che in definitiva significa che circa il 10% dei dati può essere utilizzato per il rilevamento di errore. Un esempio di questa analisi è dato in Figura 4, che rappresenta le informazioni di sequenza che è state acquisite durante la messa a punto di questo protocollo per 1 replica di una singola libreria di C-seq che è stata sequenziata relativamente poco profondo e rappresenta il più basso limite dei dati che gli utenti possono aspettarsi di acquisire.

Circa 5.000-25.000 errori per corsa tendono ad essere identificato, anche se questi numeri possono variare notevolmente a seconda del tasso di errore stesso (maggiore è il tasso di errore, verranno rilevati gli errori più), la dimensione del trascrittoma (il più grande il trascrittoma, le basi meno saranno coperti da 20 letture, limitando i dati di sequenziamento che possono essere utilizzati per il rilevamento di errore) e la profondità alla quale esso è sequenziale (sequenziamento profondo renderà più probabile che una data base sarà coperti da letto 20 volte o più). Questi errori tendono ad essere distribuiti in tutta l'intero genoma, così che in media ~ 47% degli errori si trovano in mRNA molecole generati dalla RNA polimerasi II (RNAP II), ~ 49% si trovano in molecole di rRNA generati da RNAP io e il restante ~ 3% situati nel RNA generato da RNAP III e la polimerasi del RNA mitocondriale. Tuttavia, questi rapporti possono variare significativamente a seconda del tipo di cellula o organismo sotto inchiesta (Figura 4). Ad esempio, tipi di cellule che si basano pesantemente sulla funzione mitocondriale, come cardiomiociti, contengono RNA mitocondriale significativamente di più rispetto ad altri tipi di cellule, aumentando notevolmente il numero di molecole di RNA mitocondriale che sono in sequenza e quindi il numero degli errori rilevati.

Una volta che è stato compilato un elenco di errori e loro sedi in tutto il genoma sono noti, questi errori possono essere utilizzati per identificare i parametri che controllano il tasso di errore di trascrizione in ogni organismo. Ad esempio, la posizione di questi errori di trascrizione può essere correlata con numerose caratteristiche del genoma, come la presenza di DNA si ripete, contesti genetici specifici, o il tasso di espressione, per capire come queste caratteristiche alterano la fedeltà del trascrizione5. L'aspettativa è che in futuro, però, gli utenti saranno in grado di determinare come innumerevoli funzionalità aggiuntive influiscono fedeltà trascrizionale, tra cui marcatori epigenetici, il 3-d organizzazione del genoma, disponibilità nutriente, età o l'esposizione a tossici composti, per chiarire il contributo dei fattori genetici e ambientali per la fedeltà della trascrizione.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica del RNA-seq contro C-segg. (A) RNA-seq tradizionali esperimenti RNA isolato da un campione di interesse, frammento di RNA, e retromarcia trascrivere prima della preparazione finale biblioteca e sequenziamento. Tuttavia, queste procedure di preparazione introducono numerosi artefatti tecnici nella libreria sotto forma di errori di trascrizione inversa, PCR amplificazione errori ed errori di sequenziamento. (B) questo C-seq ottimizzato permette per la correzione di questi artefatti tecnici di circularizing le molecole di RNA frammentate prima della trascrizione inversa, che permette loro di essere inverso trascritto in una rotolamento cerchio moda per produrre lineare molecole di cDNA che contengono diverse copie del modello originale di RNA in tandem ripetere. Queste ripetizioni in tandem quindi possono essere utilizzati per distinguere gli errori di trascrizione vera da artefatti, come gli errori di trascrizione vera (star) sarà presenti in tutte le ripetizioni nella stessa posizione, considerando che gli artefatti come invertire gli errori di trascrizione (quadrati) e PCR sono presenti in uno o due ripetizioni di qualsiasi molecola di cDNA dato solo errori di amplificazione (cerchio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: rappresentante risultati per preparazione biblioteca. Questi pannelli mostrano una electrophoretogram per nastro magnetico (A), un'alta sensibilità RNA schermo scaletta (Vedi Tabella materiali), (B) il totale di RNA purificato da Saccharomyces cerevisiae, RNA frammentato RNAsi III (C) e ( D) di rotolamento del cerchio cDNA retrotrascritto. (E), la libreria di cDNA selezionate dimensione finale gira su un'analisi di sensibilità alta double-stranded del DNA chip (Vedi Tabella materiali). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: schematico della bioinformatica pipeline utilizzata per analizzare i dati di sequenziamento cerchio. Dopo le letture di sequenziamento di Cantu, ripetizioni sono identificati, e una sequenza di consenso viene generata utilizzando la chiamata di base più probabile in una determinata posizione. Quindi, il punto di legatura del modello iniziale di RNA viene identificato e la sequenza di consenso è allineata al genoma di riferimento affinché i potenziali errori di trascrizione possono essere identificati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempio di risultati per pipeline di C-Seq. (A), questo pannello mostra la distribuzione delle dimensioni delle sequenze consenso ottenuta da un tipico esperimento di C-Seq. (B) questo pannello mostra il numero di basi, letture e percentuale di letture in sequenza in ogni fase della pipeline di bioinformatica del C-Seq. (C) questo pannello mostra il numero di errori di trascrizione rilevato e la percentuale di errori attribuiti a RNA polimerasi I, polimerasi II del RNA, RNA polimerasi III e mitocondriale RNA polimerasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la preparazione delle librerie C-seq per il rilevamento di errori di trascrizione in Saccharomyces cerevisiae, la Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Questo protocollo ha numerosi vantaggi rispetto ai protocolli esistenti, come pure le tecniche alternative.

Negli ultimi 15 anni, sono stati sviluppati numerosi sistemi reporter che si basano su luciferase7,8 o Cre-Lox ricombinazione3,4,15,21 per rilevare la trascrizione errori. Questi sistemi reporter sono stati inestimabili a ricercatori comprensione della fedeltà trascrizionale perché hanno permesso di geni, alleli e meccanismi molecolari di identificare che regolano direttamente la fedeltà della trascrizione. Tuttavia, essi solo riferire sugli errori nei modelli artificialmente danneggiate, o all'interno di contesti genetici altamente specifici, che limita le domande scientifiche possono rispondere. Un importante vantaggio del protocollo C-seq è che monitora la fedeltà della trascrizione in tutta l'intero trascrittoma5, ampliando enormemente le conoscenze scientifiche dell'accuratezza con cui si esprime l'informazione genetica. In secondo luogo, perché il test C-seq utilizza RNA come relativo materiale di origine, è probabile che questo dosaggio può essere adattato a qualsiasi organismo di scelta, prevenente l'esigenza di generare costrutti complicati reporter per ogni modello transgenico. Questo protocollo ha anche vantaggi sulle esistenti sequenziamento massivamente parallelo approcci17,22. In particolare, la maggior parte di questi approcci fanno uso di metalli pesanti per le librerie frammento di RNA. Tuttavia, questi metodi di frammentazione introducono artefatti del RNA che sono indistinguibili da vera trascrizione errori5. Per risolvere questo problema, questo protocollo frammenti di RNA enzimaticamente con RNAsi III, che ha il vantaggio aggiunto che lascia le estremità compatibile per auto-legatura, notevolmente semplificando circularization di RNA e aumentando la sensibilità del dosaggio ~ 10 volte.

Allo stesso tempo, il saggio di C-seq ha la propria quota di limitazioni. In primo luogo, anche se il test misura gli errori di trascrizione in tutta l'intero genoma, una grande componente dei dati tende a essere derivato da geni altamente espressi, come trascrizioni da questi geni tendono a dominare la maggior parte delle librerie di RNA. Un altro fattore che inclina l'analisi verso geni altamente espressi è la soglia costruita nella pipeline di bioinformatica che impedisce le mutazioni genetiche e RNA editing eventi da confondere le misure finali. Questa soglia impone che solo le basi che sono state sequenziate 20 volte o più possono essere utilizzate per l'analisi finale. Una seconda limitazione riguarda diversità di biblioteca. Come la maggior parte dei kit utilizzata per l'estrazione di RNA, il kit qui utilizzato non in modo efficiente purifica piccole molecole di RNA, che limita il numero di letture derivati da molecole sintetizzate da RNAP III. La diversità della libreria sequenza finale è ulteriormente limitata tramite il passaggio di purificazione mRNA impiegato qui. Anche se molecole generati da RNAP posso essere efficientemente sequenziato, la maggior parte dei rimanenti RNA mitocondriale, tRNAs e RNA non codificanti è persi durante questo passaggio. Per catturare queste molecole più frequentemente, un kit diverso che specificamente purifica piccole molecole di RNA deve essere utilizzato, o tipi cellulari dovrebbero essere mirati che sono arricchite per queste molecole. Si prega di notare, però, che la maggior parte di questi problemi possano essere risolti dal sequenziamento più profondo del solito, o simultaneamente sequenziamento del DNA dalle cellule stesse, anche se entrambe queste soluzioni richiedono un investimento finanziario più grande dagli investigatori.

Inoltre, gli sviluppi tecnologici futuri sono pronti a migliorare test C-seq a un livello fondamentale. Ad esempio, estendendo la lettura-lunghezza della tecnologia di sequenziamento esistente, sarà possibile alle molecole più lunghe sequenza, che significa che più ripetizioni possono essere utilizzati per verificare la fedeltà della trascrizione. Tali miglioramenti si tradurrà automaticamente in una maggiore profondità di sequenziamento e un aumento della percentuale di letture che possono essere utilizzati per l'analisi a valle. Un ragionamento simile può essere fatto per qualsiasi tecnologia di sequenziamento che permette per altre molecole ad essere sequenziata in parallelo. Inoltre, numerosi componenti del dosaggio C-seq rimangono per essere ottimizzato, tra cui l'efficacia di RNA circularization, il rigore della selezione della dimensione e della natura che richiede tempo del test stesso. Infine, si raccomanda vivamente che tutti gli utenti accedono a uno strumento dedicato, ad alta sensibilità per l'analisi dell'acido nucleico e risoluzione dei problemi potenziali (Vedi Tabella materiali). Senza questo strumento, può essere estremamente difficile determinare a che punto sorgono problemi potenziali, rendendoli in tal modo impossibile fissare.

Anche se l'intero protocollo è abbastanza spietato (piccoli errori tendono ad avere conseguenze significative), ci sono diversi passaggi che sono assolutamente fondamentali per il successo del test C-seq. Uno dei requisiti più importanti è che il RNA isolato è trattato più delicatamente possibile. Maggior parte dei metodi di estrazione di RNA e kit di elaborazione a valle preoccupano poco la composizione chimica del RNA oltre gli standard di industria di base, che è sufficiente per analisi molecolari più. Tuttavia, il dosaggio di C-seq ha il compito di individuare un errore di trascrizione unico tra le centinaia di migliaia di basi WT, aumentando notevolmente la necessità di ridurre lo stress molecolare. Anche lo stress che ha un impatto solo 1 in 10.000 basi può introdurre artefatti che invalidano completamente i risultati. Ad esempio, gli utenti devono mai evitare/limitare esporre il RNA a qualsiasi temperatura oltre 65 ° C. In secondo luogo, ogni utente deve ottimizzare accuratamente il tempo necessario per la frammentazione di RNA con RNAsi III. È assolutamente fondamentale per il successo del dosaggio che le molecole finali sono circa 60 – 80 basi di lunghezza. Più brevi molecole possono essere difficile mappare il genoma, e più molecole non permetterà per 3 ripetizioni indipendenti da sequenziare all'interno di una lettura di bp 250. Infine, si consiglia di non congelare e scongelare il RNA più di una volta durante l'intero protocollo. Invece, isolare il RNA e sintetizzare il cDNA in un solo giorno. A causa del tempo e sforzo coinvolto con questo impegno, la complessità del protocollo stesso e il numero di campioni che vengono spesso elaborati in una sola volta, è consigliabile che gli due investigatori lavorano insieme per generare queste librerie.

Quando è successo, questi esperimenti renderà possibile di rilevare con precisione gli errori di trascrizione in qualsiasi organismo, sotto qualsiasi condizione sperimentale. Ad esempio, confrontando il controllo e gli individui malati a vicenda, è possibile determinare se alcune malattie sono associate con gli errori di trascrizione, che possono rivelare un nuovo componente dell'eziologia di numerose patologie umane. Altri parametri che potrebbero essere sondate sono invecchiamento organismal, nutrizione, genotipo e fattori ambientali come l'esposizione a sostanze chimiche tossiche. Inoltre, poiché questo test rileva gli errori di trascrizione in tutto il trascrittoma, permetterà ai ricercatori di sezionare i diversi meccanismi che contribuiscono alla fedeltà della RNA polimerasi I, II e III, nonché la polimerasi del RNA mitocondriale. Di conseguenza, ci aspettiamo che questo protocollo si aprirà un nuovo campo di mutagenesi alla sperimentazione diffusa, caratterizzata dallo studio delle mutazioni nel RNA anziché nel DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questa pubblicazione è stata resa possibile dai finanziamenti da parte di grant T32ES019851 (a C. Fritsch), R01AG054641 e un ricercatore giovane AFAR concedere (Vermulst M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Tags

Genetica problema 139 processi genetici espressione genica trascrizione genetico trascrizione inversa trascrittoma mutagenesi sostituzione dell'amminoacido fenomeni e processi fenomeni genetici mutagenesi trascrizione RNA-Seq S. cerevisiae c. elegans d. melanogaster sequenziamento RNA polimerasi errori
Sorveglianza di genoma di errori di trascrizione in organismi eucarioti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P.,… More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter