Summary
このプロトコルは、複数のモデル生物における転写の忠実度を監視する新しいツールと研究者を提供します。
Abstract
正確な表記は、遺伝情報の忠実な表現に必要です。しかし意外にも、少しは転写の忠実度を制御するメカニズムについて知られています。科学の知識で、このギャップを埋めるためには、我々 は最近線虫、ショウジョウバエ、酵母のトランスクリプトームを通して転写エラーを検出するサークル シーケンス分析を最適化線虫。このプロトコルは、前例のない詳細の転写の忠実度を制御するメカニズムを解明することができますので、真核細胞での転写エラーの風景にマップする強力な新しいツールを使って研究を提供します。
Introduction
ゲノムは生命の正確な生物の設計図を提供します。この青写真を正しく実装するには、素晴らしい精度で転写されるゲノムのために重要です。ただし、転写は、エラーが発生する可能性がありますはありません。たとえば、RNA ポリメラーゼがエラーを起こしやすい体外1、2、長い知られている、最近エラー体内だけでなく、3、5,6、犯すことが示されました。特に、DNA 損傷7,8,9,10に直面しています。一緒に取られて、これらの観察は、転写エラー発生する継続的にすべての生きた細胞でタンパク質構造変異の強力なソース可能性があることを示唆していることを示します。
転写変異と呼ばれるこのプロセスは、2 つの方法で古典的な変異によって異なります。最初に、彼らは DNA の複製に依存しない、遺伝子の突然変異とは対照的転写エラーは分裂期と分裂後の細胞を影響します。転写の忠実度に影響を与えるメカニズムを勉強して、したがって、分裂、分裂後の細胞の突然変異荷重に対して貴重な洞察を提供します。興味深いことに、転写エラーが最近タンパク質凝集11,12,13のプロモーションに関与しているし、10両の発癌に寄与するように仮定されたが、細菌14の抗生の抵抗の開発。
第二に、遺伝子の突然変異と対照をなして転写エラー、自然で一時的です。転写エラーを検出するため極めて困難になりますので、彼らの一時的な存在は特に挑戦的です。たとえば、いくつかのラボは、転写の突然変異誘発の研究のための貴重な記者アッセイを考案した、一方これらの試、コンテキストとモデル生物4,15の限られた数の転写エラーを測定することができるのみ。これらの制限を克服するために多くの研究者は、理論により、任意の種のトランスクリプトームを通して記録される転写エラー RNA 塩基配列決定技術 (RNA シーケンス) になっています。ただし、これらの研究は、逆のトランスクリプション エラー、PCR 増幅エラー シーケンス自体のエラーを起こしやすい性質など、図書館建設の成果物によって簡単に混同されます。たとえば、逆転写酵素約 1 つのエラーすべて 〜 20,000 拠点間コミット RNA ポリメラーゼ (RNAPs) は、1 つだけエラーをすべて 300,000 拠点5,6にすると予想されます。従来の RNA シーケンス データ (ライブラリ準備で起因するアーチファクトと真転写エラーを区別することは事実上不可能じゃないので単独で逆のトランスクリプションの誤り率を小さく細胞内 RNA ポリメラーゼのエラー率、図 1 a)。
この問題を解決するために試金5,16円シーケンス (Cirseq、または今後 C seq) の最適化されたバージョンを行った。このアッセイでは、トランスクリプトーム5で RNA の転写エラー、その他の稀な変形を検出することができます。円形配列アッセイは、この試金の重要なステップは、環状 RNA を中心に展開するためにこの名前を運ぶ。RNA ターゲットが円形、一度彼らは同じ RNA テンプレートの数多くのコピーを含む線形 cDNA 分子を生成する、ローリング サークル ファッションを転写したリバースされます。エラーは、これらのテンプレートの 1 つには、このエラーは cDNA 分子内に含まれるすべての単一の繰り返しで現在もでしょう。対照的に、逆のトランスクリプション、PCR 増幅、またはシーケンスによって導入されたエラーはランダムに発生する傾向がある、こうして繰り返されるがのみ 1 つまたは 2 つがあります。したがって、各 cDNA 分子コンセンサス シーケンスを生成してランダム エラーを区別するすべての繰り返しで発生するエラーで、ライブラリ構築アーティファクト効果的にから分離できる真の転写エラー (図 1 b)。
任意の種のトランスクリプトームで RNA の塩基置換、挿入、および削除の速度を正確に検出 C seq 試金を使用することができます適切に使用する場合 (たとえば、トラバース ・ オフマン17を参照)。たとえば、我々 は単一の基本解像度は、5 と酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写の誤り率のゲノム全体の測定値を提供するために C seq 試金を使用しています。(未発表の観察)。最初に正確に RNA ウイルス集団をシーケンスに使用、C seq 試金のこの最適化されたバージョンがライブラリ構築アーティファクトに貢献するライブラリの準備中に過酷な条件を最小限に抑えるために合理化されています。さらに、市販のキットの数を使用して、アッセイのスループットが大幅に向上、その使いやすさだけでなく、適切に使用する場合、この試金は正確にあたり、大幅改善前の研究6転写エラーの何千もを検出できます。全体的にみて、このメソッドは転写変異を研究する強力なツールを提供、幅広い生物の転写の忠実度を制御するメカニズムに新しい洞察力を得るためにユーザーになります。
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Protocol
1. 準備
- RNases are 遍在;したがって、徹底的に除染試薬を噴霧することによってワークスペースを消去 (など, RNase 離れて) および 70% のエタノール。ピペットやペン、RNase の混入の潜在的な原因を解消する管ラック ダウン スプレー。
- RNases をさらにサンプルを汚染から防ぐためには、実験中に実験用の上着や長袖 t シャツを着用します。手袋と箱や袋からそれらを取得するときに特に使用されるチューブの内側との間の接触を避けます。
- 逆のトランスクリプションの前に手袋を頻繁に変更します。
注: 最適な結果を得るには、逆のトランスクリプションの前に実験を停止しません。
コレクション動物文化とセル2。
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出芽酵母の成長とコレクション
- 酵母から C seq ライブラリが必要な場合まず 3 ml 中含有酵母エキス、アデニン、ペプトン、デキスト ロース (YAPD) の単一酵母コロニーを接種してローリング ドラム 30 ° C で一晩それを孵化させなさい。
- 朝は、50 ml の 0.1 の光学濃度 (OD) YAPD 媒体の文化を再接種して 0.5 〜 0.7 (7 ~ 106セル/mL x) の外径に到達するまでセルを育てなさい。
- 50 mL の円錐管に全体 50 mL 文化 (約 350 × 106セル) を収集し、2,100 x gで 3 分の下セルをスピンします。慎重に YAPD 培地を取り除き、一度 1x PBS でペレットを洗浄します。
- その後、換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L、フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1) pH 6.8 の 480 μ L でペレットを再懸濁します。渦 5 s、および転送 (キットに付属) 冷たいジルコニア ビーズ 750 μ L でチューブ 1.5 mL スクリュー キャップに最大速度でサンプル。セル換散および総 RNA の抽出のこのプロトコルの手順 3 に進みます。
注: ステップ 2.1.4 に必要な試薬のすべては推奨される酵母 RNA 抽出キットで提供されます。これらの試薬は均等に働く酵母、ワームと飛ぶように C seq ライブラリ (手順 3 ~ 10) を生成する酵母 (ステップ 2.1)、ワーム (手順 2.2) やハエ (ステップ 2.3) のコレクションの後の統一されたアプローチを使用できます。
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線虫の文化およびコレクション
- ワームから C seq ライブラリが必要な場合は入金寒天 OP50 細菌発見の新鮮な皿の上の 30 の成虫です。
注: 5 つのプレートは、1 の複製に対して十分です。 - ワームを 4 日間の文化し優しく M9 媒体の 5 mL でプレートを洗浄することによりワームを収集し、単一の 50 mL の円錐管にワームをプールします。
- 100 x gペレットを作成する 2 分でダウン ワームをスピンします。遠心分離機でペレットを邪魔しないように、可能な最低速度を減速します。
- そっとワームを 1.5 mL チューブに移動、M9 媒体の 1.5 mL で 2 回洗浄、細菌を除去し、ワームのきれいな 100 μ L ペレットを生成 1 分の 100 x gでチューブを遠心分離機します。
- 換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L、フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールの 480 μ L でワームを再懸濁します。渦 5 s と冷たいジルコニア ビーズ含む 750 μ L をチューブ 1.5 mL スクリュー キャップに転送の最大速度でサンプル。ワームと総 RNA 抽出の換散のためこのプロトコルの手順 3 に進みます。
- ワームから C seq ライブラリが必要な場合は入金寒天 OP50 細菌発見の新鮮な皿の上の 30 の成虫です。
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キイロショウジョウバエ文化とコレクション
- ハエから C seq ライブラリが必要な場合は、ブドウ糖または糖蜜ベース媒体を含むバイアルにハエが 20-25 を文化します。分注ハエ以上 3 バイアル、その各バイアルに約 8 ハエが含まれています。
- ハエを収集するために、ハエを鎮静するまで氷のバケツにバイアルを配置します。その後、1.5 mL チューブのブラシでそれらを収集します。CO2処理によるハエを収集しません。
- 部屋の温度 (RT)、ハエが暖かいしすぐにチューブに換散バッファーの 500 μ L の既成の混合物、10 %sds の 50 μ L、500 μ L フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールを追加します。杵が管の底に達したら動きをねじる会社を伴う約 15 ストロークでハエを粉砕する、micropestle を使用します。
- ハエの混合物を注ぐし、1.5 mL スクリュー キャップに換散メディア チューブ冷たいジルコニア ビーズと渦の 750 μ L 含む 5 s. 続行ハエと総 RNA の抽出のこの議定書、換散のためのステップ 3 を最大速度でそれ。
3. 総 RNA 精製
注: この時点で、すべての 3 つのプロトコルの収束と seq C ライブラリを生成する単一の統一されたアプローチを使用できます。
- スクリュー キャップの上しっかりと、アダプターまたは粘着テープに、vortexer にチューブを取り付けます。ボルテックス チューブ サンプルを溶解に 10 分間、最大速度で。その後、水相から有機溶剤を分離する 5 分間 16,100 x gでサンプルを遠心分離機します。
- 慎重に白、曇りの界面を乱すことがなく水相の 400-500 μ L を削除、1.9 mL の結合バッファーを含む 15 mL の円錐管に追加。ボルテックスによって徹底的にそれらをミックスします。
- 100% エタノールの 1.25 mL を加え、ボルテックスでサンプルを混ぜます。コレクション チューブで組み立てられたフィルター カートリッジに 700 μ L のサンプルを転送し、サンプルのすべてがカートリッジを通過するまで繰り返し」s. で 30 14,500 x gでサンプルをスピンします。
注: この時点で、サンプルにわずかに不透明ななるかもしれない。場合はあまりにも多くの細胞、ワーム、またはハエを溶解し、沈殿が表示可能性があります、フィルターを詰まらせることがあります。 - 洗浄ソリューション 1, 700 μ で 1 回と 2 回 500 μ L 洗浄ソリューション 2 または 3 のフィルターを洗います。洗浄を完了するには、任意の余分なエタノールを削除する 2 分 14,500 x gでサンプルを回転します。
- 1.5 mL イルカ管にフィルター カートリッジを転送し、prewarmed 溶出液 (65 ° C) の 108 μ L を追加します。
注: 転写エラーとを区別することは不可能ウラシル脱アミノ化イベントにシトシンが挑発するが、逆のトランスクリプションの前に 65 ° C 以上の高温に RNA サンプルを公開しないでください。 - 隔離された RNA DNA 汚染が低下する (参照ステップ 2.1-3.4) バッファー私 DNase、RNase 阻害剤の 2 μ L と DNase の 4 μ L × 10 の 11 μ L を追加することによって私が (8 U) 37 ° C、30 分インキュベートして。
- 消化力の後の DNase 不活化試薬 11 μ L を追加します。渦混合物、常温 5 分間座ってみましょう。その後、不活化試薬をペレットし、ペレットを乱すことがなく上澄みの 110 μ L を収集する 3 分間 15,000 × gのサンプルを遠心分離機します。1.5 mL チューブに上清を転送します。
注: DNase 不活化試薬は正しくピペットことはかなり困難である、ピペッティング動作ごとに、後ピペット チップをとても視覚的に検査できます。不活化試薬もピペットに粘性になると、10 mM トリス-HCl (pH 7.4) 残りのボリュームの 1/5 に等しいを追加します。 - (品質チェック)分光光度計を使用して総 RNA 濃度を測定します。総 RNA の 1 μ L を脇、ヌクレアーゼ フリー (NF) 水に 10 ng/μ L の濃度に希釈します。RNA が低下しないおり、少なくとも 8.5 またはより高い (図 2 b) のエリン値を確保するため高い感度 RNA テープで適切な塩基配列解析装置で RNA を実行します。
4. mRNA 濃縮
- MRNA miniprep の mRNA 濃縮を行うキット (材料の表を参照してください)。NF の水の 140 μ L を 250 μ L の総ボリュームのサンプルに追加します。その後、結合バッファー x 2 の 250 μ L、ボルテックス、サンプルを徹底的にミックスし、オリゴ (dT) ビーズの 15 μ L を追加します。
- 上下それをピペットでサンプルをミックスし、2 分の 65 ° C でそれを孵化させなさい。その後、10 分間 RT にサンプルを配置します。最後に、ビーズ: mRNA 複合体をペレットに 2 分間 16,100 x gでサンプルを遠心分離機します。
- 上澄みを廃棄し、洗浄液の 500 μ L でペレットを再懸濁します。スピン列に溶液を移および 15,000 × gで 1 分のスピンします。流れを破棄し、洗浄ソリューションの追加の 500 μ L のサンプルを洗ってください。その後、回転のスピン フィルターから任意の余分なエタノールを削除する 15,000 × gで 2 分間サンプル。
- イルカ チューブにスピン フィルターを転送し、prewarmed 溶出液 (65 ° C) の 80 μ L で列でペレットを再懸濁します。65 ° C で 1.5 分間サンプルをインキュベートし、15,000 × gで 1 分の回転によって溶出します。
- 分光光度計または RNA 濃度と品質の定量化は、同様のツールを使用して浄化された RNA 濃度を測定します。
5. RNase III 断片化と RNA のクリーンアップします。
注: C seq ライブラリを生成するための適切な循環の RNA 分子を準備する (重要) の長さの約 60-80 拠点に RNA を断片化しなければなりません。以前の方法は、RNA のフラグメントに化学断片化を使用しても、重金属の化学の断片化は最終的な分析の中に転写エラーとして誤って解釈されることができる RNA のサンプルに損害を紹介します。この問題を回避するために小さな断片を生成する RNase III を使用して断片化の代わりに依存します。この酵素的アプローチの追加の利点は、結紮、化学の断片化後終わり修理のための必要があるに必要な互換性のある端を作成することです。
- RNA 核破砕反応の浄化された RNA の 1 μ g を設定、10 μ L の反応バッファー、RNase III の 5 μ L と十分な NF 100 μ L にボリュームをもたらす水 (材料の表を参照してください)。最後に酵素を追加し、ミックスを上下に 10 回以上の混合物をピペットします。長さ約 60-80 拠点の RNA 断片を生成する傾向がある 25 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
- 25 分培養が完了したら、一度、オリゴとすぐに反応をクリーンアップ クリーンアップとコンセントレーターを (材料表参照) キットそれ以上の消化を防ぐために。オリゴ バインディング サンプルでは、バッファーを 200 μ l 添加、ボルテックス混和し、100% のエタノールの 800 μ L を追加を追加します。ボルテックスによってサンプルを混合し、コレクション チューブに付属のスピンの列にそれを転送します。
- 30 s や洗浄のための 10,000 x gでサンプルを遠心洗浄バッファーを RNase III を削除して 750 μ L でそれ。遠心 10,000 × g 30 でサンプル s、流れを破棄し、上記のように洗浄バッファーの 750 μ L でもう一度サンプルを洗います。2 番目の通過を破棄した後は、15,000 × g任意の余分なエタノールを削除する 2 分の位置にある列を遠心します。
- 列を新しい 1.5 mL チューブに転送し、1 分 10,000 x gで回して NF 水の 24 μ L のサンプルを溶出します。
- 品質チェック:浄化された RNA のフラグメントの 2 μ L を取り、倍希釈の NF 水 2 μ L を追加することによって。断片化された RNA の長さ (図 2 c) で 50-100 塩基の範囲で確実にスクリーン テープで断片化された RNA を実行します。
6. RNA 環状とローリング サークル逆のトランスクリプション
- RNA 断片を座標系に 20 μ L のサンプル 1 分の 65 ° c の熱変性し、すぐに 2 分間氷の上に置きます。T4 RNA リガーゼのバッファー、10 mM ATP、RNase 阻害剤の 1 μ L、NF 水 1 μ L の 4 μ L x 10 の 4 μ L と 50% ポリエチレング リコール (PEG) の 8 μ L を追加します。
- ボルテックスによってサンプルを徹底的にミックス、それをピペッティングによる T4 RNA リガーゼ I. ミックスの 10 U/μ L の 2 μ L のサンプルを再度追加し、2 蓋 30 ° C で設定温度をたち h 25 ° C でインキュベート
- 2 時間後のサンプルに NF 水の 10 μ L を追加、製造元の仕様に従ってオリゴ クリーンアップと濃度キットとサンプルをクリーンアップします。NF 水の 20 μ L のサンプルを溶出します。
- 逆に円形の RNA 分子を転写、RNA の 9 μ L に 10 mM の dNTPs の 4 μ L、50 ng/μ L のランダムな hexamers の 4 μ L と NF 水の 9 μ L を追加。ピペッティングで徹底的にミックスのすべて、1 分の 65 ° C でサンプルの変性、バックアップとして残りの RNA 2 分店の氷の上に置きます。
- 5 x 最初繊維の統合バッファーの 8 μ L、0.1 mm DTT、2 μ L、200 μ L U/逆転写酵素の 4 μ L を追加し、ピペッティングでミックスのすべて。10 分、5 ° c の孵化の温度よりも高い設定ふた付き 42 ° C で 20 分孵化によって続いて 25 ° C でサンプルをインキュベートします。
注: 繊維変位機能を持つ逆転写酵素は、ローリング サークル逆のトランスクリプションのためにこの手順で使用する必要があります。 - サンプルに NF 水の 10 μ L を追加し、メーカーの推奨事項に従ってオリゴのクリーンアップと濃度のキットでそれをきれいします。溶出液の 42 μ L のサンプルを溶出します。
- 品質チェック:NF 水 2 μ L に一本鎖 cDNA の 2 μ L を希釈し、感度の高い RNA テープ付け塩基配列解析装置でこのサンプルを実行します。逆のトランスクリプションが正常、cDNA 分子のライブラリ場合の長さは、約 60-1,500 拠点からは見えるはずです。理想的には、ほとんどの cDNA は 500-1,000 拠点 (図 2 d) の範囲内です。
7. 第二の鎖 cDNA 合成と終わり修理
- 2 番目の鎖合成キットを使用すると、二本鎖 cDNA ライブラリを生成できます。氷のサンプルを置き、サンプルの 38 μ L に NF 水の 30 μ L を追加します。2 番目のストランド バッファー x 10 の 8 μ L と 2 番目の鎖酵素の 4 μ L を追加し、2.5 h の 16 ° c の孵化前に穏やかなピペッティングによるサンプルをミックスします。
- Oligo のサンプルをクリーンアップ クリーンアップと濃度 100 μ L 反応の製造元の推奨事項に従ってキットし、NF 水の 38 μ L のサンプルを溶出します。
- 終わり修復反応を二本鎖 cDNA の 35.5 μ L、最後修復反応バッファーの 6.5 μ L、終了準備酵素ミックスの 3 μ L NF 水の 20 μ L を追加することによって設定します。慎重に白色沈殿が生成の反応バッファーを確認し、存在する場合手温暖化によってそれらを解消します。
- ピペッティングで終わり修復反応をミックスし、20 ° c、65 ° C で 2 番目 30 分孵化によって続いて 30 分インキュベート5 ° c の孵化の温度より高いたちふたの温度を設定します。
8. アダプター結紮と準備された図書館のサイズ選択
- (材料の表を参照してください) 最後のライブラリの準備のためマルチ ステップ ライブラリ準備モジュールを使用します。最初に、次世代シーケンス 10 倍用のアダプターを希釈 10 mm トリス-HCl を最終濃度 1.5 μ m。各サンプルに希釈したアダプターの 2.5 μ L と結紮エンハンサーの 1 μ L を追加し、ボルテックスでそれらをミックスします。
- 鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 15 μ L を加えてピペッティングにより混合 20 の ° c で 15 分間加温します。ウラシル固有切除試薬酵素の 3 μ L を追加し、37 ° c 15 分間インキュベートします。結紮の完了後、100 μ L の総ボリュームのサンプルに NF 水量 13.5 μ L を追加し、サイズ選択に進みます。
注: をお勧めサイズ-600-800 塩基の長さの範囲内にある cDNA の分子のための選択。断片化された RNA の分子の長さは約 60-80 拠点なら、600-800 塩基の長さの分子のための選択は、選択した分子のほとんどがダウン ストリーム処理に最適な少なくとも 3 つのタンデム繰り返しが含まれて、解析。 - 長さは 600-800 bp は、分子の選択、30 μ L の再懸濁の磁気ビーズ (材料の表を参照してください)、各サンプル、ピペッティングにより混合し、RT に順応を追加します。1.5 mL チューブにサンプルを転送し、5 分 RT インキュベートします。
- 5 分上清からビーズを分離するためのマグネット スタンドにサンプルを配置します。新しい 1.5 mL チューブに磁性体ビーズ (これは大規模な cDNA の分子に区切られる) を破棄する (目的の cDNA 分子を含む) の上澄みを転送します。
- 各サンプルを 15 μ L の磁気ビーズの新しい因数を追加、ピペッティングにより徹底的にミックスし磁気ラックにサンプルした場所で 5 分間インキュベート、室温 5 分間インキュベートします。その後、慎重に取り外し、ビーズの邪魔にならないように、培養上清の処分します。
注: は、目的のターゲットの cDNA を今含んでいる磁気ビーズの捨てないでください。 - 200 μ L 80% の作りたて各サンプルにエタノール ペレットの磁気ビーズを乱すことがなく追加し、インキュベートする 30 s. 破棄エタノール 80% エタノールでもう一度サンプルを洗います。完全にサンプルからエタノールの痕跡を削除し、5 分のビーズを風乾もビーズを過剰に乾燥しないように注意してください。ビーズが overdried ペレットに亀裂が表示されます。
- ビーズからサンプルを溶出するマグネット スタンドからチューブを削除し、10 mm Tris 19 μ L を追加-塩酸ピペットそれアップ ダウン複数回にビードを再停止して右で 5 分間のサンプルをインキュベートビーズが overdried だった場合のためにそれらをインキュベート > 10 分。
- マグネット スタンドに戻るサンプルを置き、上澄みからビーズを分離する 5 分のためにそれらをインキュベートします。慎重にチューブから精製、サイズ選択の cDNA ライブラリを含む上清の 15 μ L を削除し、新しい 1.5 mL チューブにそれを転送します。
9. PCR 増幅と最終的なビード浄化
-
普遍的なプライマーの 5 μ L と一意なインデックスのプライマーの 5 μ L を追加各 cDNA ライブラリーを精製し、ピペッティングして徹底的にそれらを混合 (材料の表を参照してください)。慎重に結晶と他の沈殿物のためのポリメラーゼ マスター ミックスを確認し、沈殿物を溶解するまでマスター ミックスを手で温めます。
- サンプルでは、ポリメラーゼ マスター ミックスの 25 μ L ピペットによってそれらをミックスし、PCR 増幅の下サイクリング条件に従ってを追加します。30 98 ° C で初期変性を実行 s、10 の 98 ° C でサンプル濃度分配によってデュアル ステップ PCR の反作用を行いますと s と 75 65 ° C で PCR の製品の熱処理/延長 s (12 x)、65 ° C 5 分で最後の拡張が続くと4 ° C で不明確な把握
- きれいな 45 μ L の PCR 反応に直接再懸濁の磁気ビーズを追加することによって最終的なライブラリ、ピペッティングで混ぜると 5 分の転送のための RT でそれらに 1.5 mL チューブにサンプルをインキュベート、マグネット スタンドに配置。5 分間インキュベート、上澄みを廃棄し、30 の作りたての 80% エタノールで 2 回洗浄 s。
- 第 2 洗浄後に、完全にエタノールをサンプルから削除し 5 分のビーズ ペレットを風乾し、0.1 x テの 35 μ L の溶出します。それらをピペッティングによるビードを再停止しなさいそれらでインキュベート RT 5 分場所サンプル マグネット スタンド、5 分後、上澄みの 30 μ L を新しい 1.5 mL チューブに転送。-80 ° C のライブラリを保存します。
- 品質チェック:NF 水の 9 μ L で最終的なライブラリの 1 μ L を希釈し、高感度チップ付け専用 DNA 解析装置で、サンプルを実行cDNA の大半は、長さ (図 2 e) 600-800 bp の範囲でする必要があります。
- 溶出後、250 bp ペアエンド リード、または 300 bp シングル エンド読み取りを用いた大量並列シーケンス プラットフォーム上の配列のためサンプルを送信します。
10. バイオ情報解析データを配列の円の
注: 分析・ C seq 試金からの生データを解釈専用バイオ情報パイプラインが必要です。私たちの分析に使用されたパイプラインの模式図は、図 3に描かれています。Https://github.com/LynchLab/MAPGD でこのパイプラインをダウンロードします。
- まず、トリム削除アダプター シーケンス、cutadapt1820 の品質スコアのしきい値を使用して低品質基本電話に読み取り。
- Concatemerized RNA の分子が最小サイズ 30 ヌクレオチドの任意の繰り返しを検出する適切なアルゴリズムを使用してエンコードされた繰り返しを確認し、2 にミスマッチの最大は18を繰り返します。これらの繰り返しからコンセンサス シーケンスを派生しのすべてのデータベース呼び出しやそれぞれの位置に関連付けられている品質スコアを追跡します。
注: 逆のトランスクリプションを合成 RNA 分子の任意の位置で開始することができます、ので繰り返しの開始されません必ずしも (以下、結紮点) 断片化された rna の 5 ' 端に。したがって、コンセンサス シーケンスでは、継続的には結紮点の識別を要する対応するトランスクリプトームに対してマップできません。 -
結紮術のポイントを識別するために爆発のような配置ツール (BLAT)19を使用して参照トランスクリプトームに対するコンセンサス配列のコンカテマーをマップします。
- 一致シーケンスを初期の RNA のフラグメントのシーケンスの少なくとも 1 つの完全連続発生が割り当てられたシーケンスに含まれていることを確保するための 2 つのインスタンスを連結します。その後、始まる予測結紮点位置にコンセンサス配列を回転させます。
- トップハット20を使用してゲノムに対して回転コンセンサス シーケンスをマップし、アライメントを使用して転写エラーと間違われる可能性があります任意単一ヌクレオチド多形 (SNPs) を検出します。
-
マップ回転コンセンサス シーケンスから転写エラーを呼び出し、候補エラー 4 つの追加テストに合格するかどうかをテストします。
- まず、転写エラーが (一般的な要件は、少なくとも 20 の読み取りが特定の基本および代替基本呼び出しをサポート可能性があります読み取りの 5% 以上をカバーする必要がある)、SNP と重複しないことを確認します。
- 第二に、コンセンサス シーケンスがそれぞれの呼び出し同じ塩基対の少なくとも 3 のタンデム繰り返しから派生することを確認します。第三に、その位置の品質スコアの合計は 100 以上である必要がありますを確認します。
- 4 番目と最終チェック (結紮ポイントのすべての可能な位置をシミュレートする) すべての可能な組み合わせのコンセンサス配列を回転、トップハットを使用して参照ゲノムに対して各バージョンのマップします。
注: ゲノムの完全な一致が見つかった回転シーケンスの 1 つ対応する結紮点は今正しいと見なされ、転写エラーの呼び出しを拒否する必要があります。
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Representative Results
大量並列シーケンスのアプローチのすべてのような各 C seq 実験は扱いにくく、大規模なデータセットを生成します。初めてユーザーのためそれはこれらのデータセットを処理することは困難することができます。したがって、実験前に経験豊富なバイオ informatician をすべてのユーザーに連絡をお勧めします。平均では、期待は、ユーザーあたりのほとんどの大量並列シーケンスのプラットフォームの実行 55-70 ギガ基地 (Gbases) 約生成することです。通常、このプロトコルのため、各サンプルの約 2-6 Gbases に買収されたので、あたりの実行 12-30 サンプルされた多重化されます。アダプター シーケンス、低品質基本電話 (< 20) このデータセットからトリミング後の初期データ サイズ 〜 70% に残った。
生成された繰り返しのサイズを決定することにより RNA の断片化と環状の効率を調査するため、これらの基地はさらに分析しています。長さ (図 4 a) 45-80 拠点にする傾向がある、配列された基盤のおよそ 50% (図 4 b) これらの繰り返しの一部では、ほとんどが繰り返されます。以来、これらの基地のほとんどがある 3 繰り返しを含む読み取りまたは、シーケンス処理されたユニークな拠点数はシーケンス拠点の総数の約 3 分の 1。平均では、> 75% これらのコンセンサス配列の参照ゲノムにマップできます。最後に、これらの基地の約 25% は 20 ヒット以上、最終的にエラー検出のためのデータの約 10% が使えることを意味覆われてしまっています。この分析の例を図 4、1 の複製は比較的浅く配列されたより低いを表す単一の C seq ライブラリのためのこのプロトコルのセットアップ中に買収されたシーケンス情報を表すにあります。データを取得することが期待できるユーザーの制限。
これらの数字自体誤り率によって大きく異なりますが、実行ごとに約 5,000-25,000 エラーが識別すること傾向がある (より高いエラー率より多くのエラーが検出されます)、トランスクリプトームのサイズ (大きい、トランスクリプトーム、少ない拠点 20 読み取り、エラー検出のために使用できるシーケンス データを制限することによってカバーされる)、およびシーケンスは処理した深さ (深いシーケンスになる可能性が高く与えられたベースを 20 ヒット以上でカバーされることを)。これらのエラーが平均 〜 47% のエラーは rRNA 分子の rna ポリメラーゼが Rna にあると残りの ~ 3% によって生成されるに RNA ポリメラーゼ II (rna ポリメラーゼ II) 〜 49% によって生成された分子がある mRNA にある、ゲノム全体に分散する傾向があります。ミトコンドリアの RNA ポリメラーゼと rna ポリメラーゼ III によって生成されます。ただし、これらの比率は、セルタイプまたは調査 (図 4) の下で生物によって大きく異なることができます。たとえばなど、心筋細胞のミトコンドリア機能に大きく依存しているセルの種類を含むシーケンス処理されたミトコンドリアの RNA 分子の数とこの数が大きく、他のセルタイプよりも著しくよりミトコンドリア RNAエラーを検出しました。
一度エラーのリストをコンパイルすると、ゲノム全体の場所が知られている、これらのエラーは、各有機体における転写の誤り率を制御するパラメーターを識別するために使用できます。これらの転写エラーの場所がゲノムの多数の機能に関連付けることが DNA の存在を繰り返す、特定の遺伝的コンテキストまたは発現率がこれらの機能での忠実度を変更する方法を理解するなどなどトランスクリプション5。期待は将来的に、しかし、ユーザーことどのように無数の他の機能に影響を与えるエピジェネティックな遺伝子マーカー、ゲノム、養分可給度、年齢、または毒性への暴露の立体組織を含む、転写の忠実度を決定することができます。化合物、転写の忠実度に遺伝および環境要因の貢献を明らかにします。
RNA シーケンス対C シーケンスの模式図図 1:(A) 従来の RNA シーケンス実験関心のサンプルから分離 RNA 断片 RNA とリバースは最後のライブラリの準備およびシーケンスの前にそれを書き写します。ただし、これらの準備手順は、逆のトランスクリプション エラー、PCR 増幅エラー、およびシーケンス エラーの形でライブラリに多数の技術的な成果物を紹介します。(B) この最適化された C seq 試金により、これらの技術の人工物の訂正のため逆のトランスクリプションを線形を生成するローリング サークル転写リバースすることができます前に断片化された RNA 分子をシークラッタタンデムで元の RNA テンプレートの複数のコピーを含む cDNA 分子を繰り返します。アーティファクトなど逆転写エラー (正方形) および PCR に対し真転写エラー (星) が同じ場所ですべての繰り返しに表示されますとは成果物から真の転写エラーを区別するためにこれらのタンデム繰り返しを使用することができますは、増幅エラー (円) は、任意の指定された cDNA の分子の 1 つまたは 2 つの繰り返しにのみされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ライブラリの準備のため代表結果します。(A) 高感度 RNA 画面テープの強度もはしご (材料の表を参照)、(B) 総 RNA の酵母から精製した、(C) RNase III 断片化 RNA および (これらのパネルを見るD) ローリング サークル逆転写 cDNA。高感度の二本鎖 dna (E) 最終サイズが選択した cDNA ライブラリ実行チップ (材料の表を参照)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: バイオ情報パイプライン円シーケンス データを分析するために使用のスケマティック。後配列読み取りをトリミングするには、繰り返し、識別、およびコンセンサス シーケンスは、任意の所定の位置にほとんど基本コールを使用して生成されます。初期の RNA テンプレートの結紮点を識別し、参照ゲノムにコンセンサス配列を配置すると、潜在的な転写エラーを識別できるようにします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: C Seq パイプラインの結果の例です。(A) このパネルは典型的な C Seq 実験から得られるコンセンサス シーケンスのサイズ分布を示しています。(B) このパネルは、拠点、読み取り、および読み取り C Seq バイオインフォマティクス パイプラインの各ステップのシーケンスの割合の数を示します。(C) このパネルは検出される転写エラーの数を示し、類、RNA ポリメラーゼ II、RNA ポリメラーゼ III、およびミトコンドリアの RNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼに起因するエラーの割合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、酵母、ショウジョウバエ、線虫で転写エラーの検出のための C seq ライブラリの準備のための最適化されたプロトコルについて述べる。このプロトコルには、代替技術と同様に、既存のプロトコルでは、多くの利点があります。
過去 15 年間、レポーターの多数のシステム開発されているルシフェラーゼ7,8や Cre Lox 組換え3,4,15,21転写を検出するために依存します。エラー。これらのレポーター システムは、彼らは遺伝子、対立遺伝子、および識別する直接転写の忠実度を調節する分子機構を許可ため転写の忠実度の者を理解する貴重なされています。しかし、彼らのレポート エラー人為的破損したテンプレート、または非常に特定の遺伝的コンテキスト内で彼らは答えることができる科学的な質問を制限します。C seq プロトコルの重要な利点は、全体のトランスクリプトーム5、遺伝情報の確度の科学的知識を大幅拡大を通して転写の忠実度を監視することです。第二に、C seq 試金は、そのソースの材料として RNA を使用するため、トランスジェニック モデルごとに複雑な記者の構成要素を生成する必要がある、選択のすべての生物にこの試金を合わせることができる可能性が高いです。このプロトコルには、既存の大量並列シーケンスのアプローチ17,22上の利点もあります。特に、これらのアプローチのほとんどは、RNA のフラグメント ライブラリに重金属の使用します。ただし、これらの断片化メソッドは true 転写エラー5から見分けがつかない RNA に成果物を紹介します。この問題を解決するためにこのプロトコル酵素 RNase III と、セルフライゲーションの互換性のある端の葉追加の利点である大幅に環状 RNA を簡素化し、アッセイの感度を増加させる RNA の断片 〜 10 倍。
同時に C seq 試金の制限のシェアしています。まず、にもかかわらず、アッセイ測定全体のゲノム中の転写エラー、データの大規模なコンポーネントはこれらの遺伝子から転写、RNA ライブラリのほとんどを支配する傾向があるので、非常に表現される遺伝子に由来する傾向があります。に向けて高発現遺伝子解析を傾斜させるもう一つの要因は、遺伝の突然変異および RNA 編集最終測定を交絡からイベントを防止するバイオ情報パイプラインに組み込まれてのしきい値です。このしきい値は、最終的な分析用 20 回以上された拠点のみすることができますを決定します。第 2 の制限は、ライブラリの多様性を懸念します。ほとんどのキットは RNA の抽出に使用されるのようなここで使用されるキットはない効率的に浄化する小さな RNA 分子由来の rna ポリメラーゼ III によって合成した分子の読み取りの数を制限します。最終的な配列ライブラリの多様性はここで採用されている mRNA の精製ステップによってさらに制限されます。効率的になれる rna ポリメラーゼによって生成された分子シーケンス、残りのミトコンドリア Rna のほとんどにもかかわらず、Trna と非コード Rna 中に失われるこの手順これらの分子をより頻繁に、特に小さな RNA 分子を浄化し別のキットを使用する必要があります、または細胞の種類を対象とする必要がありますこれらの分子の濃縮をキャプチャします。ただし、研究者によって大きい金融投資が必要になりますこれらのソリューションの両方が、いつもより深くシーケンスまたは同時に同じ細胞から DNA のシーケンスによって、これらの問題のほとんどを解決できることに注意してください。
さらに、将来の技術開発は基本的なレベルで C seq 試金を改善するために態勢を整えています。たとえば、既存のシーケンス技術の読み取り距離を拡張する、ことがシーケンス長い分子に転写の忠実度を確認するためにより多くの繰り返しを使用ことができることを意味します。このような改善は、シーケンスの深さと下流の分析に使用することができます読み取りの比率の増加に自動的になります。並列シーケンスにより多くの分子では、任意のシーケンス技術の同じような議論が可能です。さらに、C seq 試金の多数のコンポーネントは、自身を分析時間がかかる性質、サイズ選択の金詰り環状 RNA の効率を含むに最適化する、残る。最後に、すべてのユーザーが核酸分析と潜在的なトラブルシューティング (材料の表を参照) に、高感度の専用ツールにアクセスを得ることを強くお勧めします。このツールがなければどの時点で潜在的な問題が発生、修正することは不可能することを決定する非常に困難なことです。
全体のプロトコルはかなり寛容 (小さなミスは重大な結果を持っている傾向が、) C seq 試金の成功に絶対に不可欠ないくつかのステップがあります。最も重要な要件の 1 つは隔離された RNA ができるだけ優しく扱われることです。ほとんどの RNA 抽出方法やダウン ストリーム処理キットは、最も分子分析のために十分である基本的な業界標準を超える RNA の化学組成について少し注意します。ただし、C seq 試金の分子のストレスを軽減する必要性が大幅に向上、WT 基地の千数百人の間で単一の転写エラーを識別する任務です。10,000 の 1 拠点のみに影響を与えるさらにはストレスは結果を完全に無効にアーティファクトを導入できます。たとえば、ユーザーする必要があります制限しないように避ける/任意の温度 65 ° C 以上に RNA を公開第二に、各ユーザーは、RNase iii RNA 断片化に必要な時間を最適化する必要が慎重に。長さ約 60-80 拠点である最終的な分子アッセイの成功に不可欠です。短い分子をゲノムにマップすることは困難かもしれない、長い分子が 250 bp 読み取り内でシーケンスする 3 独立した繰り返しを可能にしません。最後に、停止およびプロトコル全体の中に RNA を複数回再開しないことをお勧めします。代わりに、RNA を分離し、一日で cDNA を合成します。時間と労力このコミットメント、プロトコル自体の複雑さと頻繁に一度に処理されるサンプルの数のため、研究者 2 名協力してこれらのライブラリを生成することをお勧めします。
成功すると、これらの実験になる任意の実験条件の下で、すべての生物の転写エラーを正確に検出することが可能。統制と互いに病気の個人を比較すると、たとえば、ある特定の病気が転写エラーは、多数の人間の病理学の病因の新しいコンポーネントを明らかに可能性がありますに関連付けられているかどうかを判断することがあります。プローブがその他のパラメーターは、個体の老化、栄養、遺伝子型、および有毒化学物質への曝露などの環境要因。また、このアッセイは、トランスクリプトームを通して転写エラーを検出するためは、私、II、III とミトコンドリアの RNA ポリメラーゼ、RNA ポリメラーゼの忠実性に貢献するさまざまなメカニズムを分析する研究者が可能になります。したがって、このプロトコルが広範な実験、DNA ではなく RNA では突然変異の研究を特徴とする突然変異誘発の新しいフィールドを開くことを期待します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この文書は、(C. フリッチュ) に助成金 T32ES019851 からの資金によって可能になった、R01AG054641 と遠く若手研究者は (M. Vermulst) に付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µL) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
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