Summary
Этот протокол обеспечивает исследователей с новым инструментом для мониторинга верности транскрипции в несколько модельных организмов.
Abstract
Для добросовестного выражение генетической информации требуется точная транскрипция. Удивительно, однако, мало что известно о механизмах, которые управляют верности транскрипции. Чтобы заполнить этот пробел в научных знаниях, мы недавно оптимизирован круг последовательности проба для выявления ошибок транскрипции на протяжении транскриптом Saccharomyces cerevisiae, дрозофилыи Caenorhabditis Элеганс. Этот протокол обеспечит исследователей с новый мощный инструмент для сопоставления пейзаж транскрипции ошибки в эукариотических клетках, что механизмы, которые управляют верности транскрипции можно освещены в беспрецедентных деталях.
Introduction
Геном обеспечивает точные биологические план жизни. Чтобы реализовать этот план правильно, это важно для геном транскрибируется с большой точностью. Однако маловероятно быть безошибочной транскрипции. Например РНК-полимеразы уже давно известны к ошибкам в пробирке1,2, и недавно было показано, что они совершают ошибки в естественных условиях также3,5,6, особенно, когда сталкивается с ДНК повреждения7,8,9,10. Взятые вместе, эти наблюдения показывают, что транскрипция ошибки возникают непрерывно во всех живых клетках, предполагая, что они могут быть мощным источником мутировавших белков.
Этот процесс называется transcriptional мутагенеза, отличается от классической мутагенез двумя способами. Во-первых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки влияют на митотическая и пост митотическая клетки, как они не зависят от репликации ДНК. Изучение механизмов, которые влияют на верность транскрипции таким образом, даст ценную информацию о мутации нагрузки митотическая и пост митотическая клеток. Интересно, что ошибки транскрипции недавно были вовлечены в поощрении белка агрегации11,12,13 и были предположил вносить обоих канцерогенеза10 и развитие резистентности к антибиотикам бактерий14.
Во-вторых в отличие от генетических мутаций, транскрипция ошибки являются временными по своему характеру. Их временное существование является особенно сложным, потому что он делает ошибки транскрипции чрезвычайно трудно обнаружить. Например в то время как несколько лаборатории разработали ценные репортер анализов для изучения transcriptional мутагенеза, эти анализы являются только возможность измерить транскрипции ошибки в ограниченном количестве контекстов и модель организмы4,15. Чтобы преодолеть эти ограничения, многие исследователи обратились к технологии последовательности РНК (РНК seq), которая теоретически позволяет транскрипции ошибки быть записан в течение транскриптом любых видов. Однако эти исследования легко осложняется библиотека строительство артефактов, таких как обратная транскрипция ошибки, ошибки амплификации PCR и подверженных ошибкам характер последовательности сам. Например реверс transcriptases совершить примерно одна ошибка каждые ~ 20000 баз, в то время как РНК полимеразы (RNAPs), как ожидается, сделать только одну ошибку каждый 300.000 базы5,6. Потому что ошибка скорость обратной транскрипции только карлики погрешность РНК полимеразы внутри клетки, это практически невозможно отличить истинное транскрипции ошибки от артефактов, вызванных библиотека подготовку в традиционных РНК-Seq данных ( Рисунок 1a).
Для решения этой проблемы, мы разработали оптимизированной версии круг-последовательности (Cirseq, или C-seq отныне) пробирного5,16. Этот assay позволяет пользователю обнаружить ошибки транскрипции и другие редкие варианты в РНК на протяжении транскриптом5. Assay последовательности циркулярное письмо носит это имя, потому что ключевой шаг в этот assay вращается вокруг РНК рецензий. После того, как circularized РНК цели, они обратной транскрипции в подвижного круга моды, производить линейное cDNA молекул, которые содержат многочисленные копии один и тот же шаблон РНК. Если ошибка находился в одном из этих шаблонов, эта ошибка будет также присутствовать в каждый один повторить содержащийся в молекуле cDNA. В противоположность этому ошибки, представленный обратной транскрипции, амплификации PCR или последовательности обычно возникают случайно и таким образом будет присутствовать только один или два повторяется. Таким образом путем создания консенсуса последовательность для каждого cDNA молекулы и отличать случайные ошибки от ошибок, которые происходят в все повторяется, Библиотека строительство артефакты эффективно может быть отделена от истинной транскрипции ошибок (рис. 1b).
Если используется должным образом, C-seq assay может использоваться для точно определить уровень базового замен, вставок и удалений в РНК на протяжении транскриптом любых видов (см. Например, Траверс и Ochman17). Например мы использовали C-seq assay предоставлять генома общесистемной измерения коэффициента ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans с разрешением единый базовый5 (неопубликованные наблюдения). Первоначально используется для точного последовательности РНК вируса населения, это оптимизированная версия C-seq пробирного была оптимизирована для сведения к минимуму суровых условиях во время подготовки библиотеки, которые способствуют библиотека строительство артефакты. Кроме того с помощью ряда коммерчески доступные наборы, пропускная способность assay значительно улучшилось, а также ее удобство. Если используется должным образом, этот assay может точно определить транскрипции ошибок в репликации, тем самым значительно улучшая на предыдущих исследований6тысячи. В целом этот метод является мощным инструментом для изучения transcriptional мутагенеза и позволит пользователю получить новые идеи в механизмы, контролирующие точность транскрипции в широком диапазоне организмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка
- Полиадениновый вездесущий; Поэтому, тщательно очистить рабочую область путем распыления его вниз с реактивом обеззараживания (например, РНКазы ПРОЧЬ) и на 70% спирте. Спрей вниз любой пипетки, ручки или трубы стойки для удаления потенциальных источников загрязнения РНКазы.
- Для дальнейшего предотвращения полиадениновый от загрязнения образцов, носите пальто лаборатории или джемпер во время экспериментов. Избегайте контакта между Перчатки и внутри трубы, которые будут использоваться, особенно при извлечении их из коробки или сумку.
- Перед обратной транскрипции часто менять перчатки.
Примечание: Для получения оптимальных результатов, не прерывалось эксперимент до обратной транскрипции.
2. ячейки и животных культуры и коллекции
-
Saccharomyces cerevisiae роста и коллекции
- Если библиотека C-seq из дрожжей, сначала прививок одной колонии S. cerevisiae в 3 мл средних содержащих экстракт дрожжей, аденин, Пептон и декстрозы (YAPD) и проинкубируйте его на ночь на 30 ° C в прокатки барабан.
- Утром, повторно прививать культуру в 50 мл YAPD средних оптической плотности (OD) 0.1 и расти ячейки до тех пор, пока они достигают ОД 0,5 – 0,7 (~ 7 х 106 клеток/мл).
- Сбор культуры всего 50 мл (примерно 350 х 106 клеток) в 50 мл Конические трубки и спина клетки вниз на 3 мин на 2100 x g. Осторожно удалите средство YAPD и помыть лепешка с PBS 1 x.
- Затем Ресуспензируйте гранулы в 480 мкл буфера lysis, 48 мкл 10% SDS и 480 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (25:24:1), pH 6.8. Вихрь образца на максимальной скорости 5 s, и передачи его колпачок 1,5 мл трубки с 750 мкл ледяной циркония бусины (входят в комплект). Перейдите к шагу 3 настоящего протокола для лизиса клеток и общее извлечение RNA.
Примечание: Все реагентов, необходимых для шага 2.1.4 предоставляются в рекомендуемой дрожжи РНК добыча комплект. Эти реагенты работать одинаково хорошо для дрожжей, червей и мух так, что после сбора дрожжей (шаг 2.1), Вормс (шаг 2.2) или мух (шаг 2.3), единый подход может использоваться для создания библиотек C-seq (шаги 3 – 10).
-
Caenorhabditis elegans культура и коллекции
- Если библиотека C-seq от червей, депозит 30 взрослых червей на свежие плита агара, пятнистый с ОР50 бактериями.
Примечание: Пять пластины являются достаточными для 1 репликации. - Культура червей на 4 дня и собирать червей, осторожно промывки пластин с 5 мл M9 СМИ и бассейн червей в единый 50 мл Конические трубки.
- Спиновые глисты вниз на 100 x g на 2 мин для создания гранул. Замедления центрифуги на минимальной скорости, возможно, чтобы не нарушить гранулы.
- Осторожно переместить червей в 1,5 мл трубку, мыть их два раза в 1,5 мл M9 СМИ и центрифуги трубки на 100 x g 1 мин для удаления бактерий и генерировать чистой 100 мкл Пелле червей.
- Ресуспензируйте червей в 480 мкл буфера lysis, 48 мкл 10% SDS и 480 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта. Вихрь образца на максимальной скорости 5 s и передачи его колпачок 1,5 мл трубки содержащих 750 мкл ледяной циркония бусины. Перейдите к шагу 3 настоящего протокола для лизиса червей и общее извлечение RNA.
- Если библиотека C-seq от червей, депозит 30 взрослых червей на свежие плита агара, пятнистый с ОР50 бактериями.
-
Drosophila melanogaster культуры и коллекции
- Если библиотека C-seq от мух, культура 20 – 25 мух в пузырьки, которые содержат декстрозы или средство на основе патоки. Аликвота мухи над 3 ампул, так что каждый флакон содержит около 8 мух.
- Чтобы собирать мух, место флакона в ведёрке со льдом до седативные мух. Затем соберите их с кистью в 1,5 мл. Не собирать мух, CO2 лечение.
- Пусть летит теплой комнатной температуры (RT) и быстро добавить готовые смеси 500 мкл буфера lysis, 50 мкл 10% SDS и 500 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта в трубку. Используйте micropestle чтобы молоть вверх мух с примерно 15 ударов, в сопровождении фирмы скручивания движения, когда толкателем достигает нижней части трубки.
- Вылейте смесь мух и лизис СМИ в колпачок 1,5 мл трубки содержащих 750 мкл ледяной циркония бусы и вихрь на максимальной скорости, для 5 s. переходите к шагу 3 настоящего протокола для lysis мух и общее извлечение RNA.
3. Общая РНК
Примечание: на данный момент, сходятся все три протокола, и единый подход может использоваться для создания библиотек C-seq.
- Плотно завинтите крышку и Подсоедините трубку к Вортекс с адаптер или клейкой лентой. Вихревой трубе на максимальной скорости на 10 минут, чтобы лизируйте образцы. Затем Центрифугуйте образцы на 16,100 x g 5 мин для разделения органических растворителей из водной фазы.
- Тщательно удалить 400 – 500 мкл водной фазе не нарушая интерфаза белый, облачный и добавить его в 15 мл конические трубка, содержащая 1.9 мл буфера привязки. Тщательно перемешайте их, vortexing.
- Добавьте 1,25 мл 100% этанола и перемешайте образец по vortexing. Передавать 700 мкл пример фильтра картриджа, собранные в коллекции трубку и спина образца на 14,500 x g для 30 s. повторять до тех пор, пока все образца передается через картридж.
Примечание: на данный момент, образец может оказаться немного непрозрачной. Если слишком много ячеек, червей или мухи были лизированы, преципитаты может показаться, что может засорить фильтр. - Промойте фильтр один раз с 700 мкл промывочного раствора 1 и дважды с 500 мкл промывочный раствор 2 или 3. Закончите стирок, крутя образцов 14500 x g за 2 мин удалить любые излишки этанола.
- Передать трубку Дельфин 1,5 мл картриджа фильтра и 108 мкл подогретую Элюирующий раствор (65 ° C).
Примечание: Никогда не подвергайте образцов РНК до температуры выше 65 ° C до обратной транскрипции, как делать так будет провоцировать цитозина урацила дезаминирование события, которые невозможно отличить от ошибок транскрипции. - Снизить загрязнение ДНК в изолированных РНК (см. шаги 2.1-3.4) путем добавления 11 мкл 10 x DNase буфере, 2 мкл битор РНКазы и 4 мкл DNase I (8 U) и инкубировать их при 37 ° C за 30 мин.
- После переваривания 11 мкл Реагента DNase инактивации. Вихревой смесь и дайте ему сидеть в РТ за 5 мин. Затем центрифуга образца на 15000 x g 3 мин Пелле инактивацию реагент и собирать 110 мкл супернатант не нарушая гранулы. Передать супернатант 1,5 мл.
Примечание: DNase инактивацию реагент может быть довольно трудно накапайте должным образом, так что визуально проверить наконечник пипетки после каждого дозирования действий. Если реагент инактивации становится слишком вязким для пипетки, добавьте 10 мм трис-HCl (рН 7,4) равен 1/5 оставшихся тома. - (Контроль качества) Измерьте концентрацию общего РНК с помощью спектрофотометра. Затем отложите 1 мкл всего РНК и разбавляют до концентрации 10 нг/мкл в свободной от нуклеиназы воды (NF). Запустите РНК на инструмент анализа соответствующей нуклеотидной с высокой чувствительности РНК ленты для обеспечения что РНК не снижается и Эрин значение по крайней мере 8.5 или выше (Рисунок 2Б).
4. мРНК обогащения
- Выполните мРНК обогащения с мРНК алкалический комплекта (см. Таблицу материалы). Мкл 140 NF воды в общий объем 250 мкл пример. Затем, 250 мкл 2 x привязки буфера, тщательно перемешать образца, vortexing и 15 мкл бусины oligo (dT).
- Смешать образца, закупорить вверх и вниз и Инкубируйте на 65 ° C на 2 мин. Затем поместите образец в РТ за 10 мин. Наконец центрифуга образца на 16,100 x g за 2 мин до Пелле шарик: мРНК комплексов.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл промывочного раствора. Передача решения в столбец спин и спина его за 1 мин на 15000 x g. Отказаться от потока через и мыть образца с дополнительных 500 мкл промывочного раствора. Затем спина образца для 2 мин на 15000 x g для удаления любой избыток этанола из спин фильтров.
- Передача вращения фильтр дельфин трубка и Ресуспензируйте гранулы в столбце с 80 мкл подогретую Элюирующий раствор (65 ° C). Проинкубируйте образцы для 1,5 мин при температуре 65 ° C и элюировать, крутя его за 1 мин на 15000 x g.
- Измерьте концентрацию очищенный РНК с помощью спектрофотометра или аналогичный инструмент, который позволяет для количественного определения концентрации РНК и качества.
5. РНКазы III фрагментации и РНК очистка
Примечание: (Важно) подготовить циркуляр молекулы РНК, подходящие для создания библиотеки C-seq, РНК необходимо фрагментировать примерно 60-80 баз в длину. В то время как предыдущие методы использовали химические фрагментации фрагмент РНК, химические фрагментации с тяжелыми металлами, вводит ущерб образцов РНК, которые могут быть неправильно распознаны как транскрипции ошибки во время заключительного анализа. Чтобы обойти эту проблему, вместо полагаться на фрагментацию, используя РНКазы III для создания небольших фрагментов. Дополнительным преимуществом этого ферментативные подхода является, что она создает совместимый концы, необходимых для перевязки, избавит от необходимости ушивания конец после химического фрагментации.
- Настройка реакции фрагментации РНК с 1 мкг очищенный РНК, 10 мкл буфера реакции, 5 мкл РНКазы III и достаточно NF воды довести объем до 100 мкл (см. Таблицу материалы). Последние добавления фермента и Пипетка смеси вверх и вниз по крайней мере 10 раз перемешать. Проинкубируйте образцы при 37 ° C за 25 мин, которая имеет тенденцию производить РНК фрагменты примерно 60-80 баз в длину.
- После инкубации 25 мин, очистить реакции сразу с олиго clean-up и концентратор kit (см. Таблицу материалы) для предотвращения любого дальнейшего переваривания. Добавьте 200 мкл буфера oligo привязки к образцу, перемешать, vortexing и 800 мкл, 100% этанола. Mix образца vortexing и передать его на предоставленный спин столбец в коллекции трубку.
- Центрифуга для выборки в 10 000 x g 30 s и мыть его с 750 мкл буфера мытья для удаления РНКазы III. Центрифуга для выборки в 10 000 x g за 30 сек, отменить потока через и мыть образца еще раз с 750 мкл буфера мыть, как описано выше. После второго потока через был проигнорирован, центрифуга столбца на 15000 x g за 2 мин удалить любые излишки этанола.
- Передать свежие 1,5 мл столбце и элюировать образца в 24 мкл воды NF, крутя его на 10000 x g за 1 мин.
- Проверка качества: Возьмите 2 мкл очищенного фрагменты РНК и разбавить вдвое, добавив 2 мкл NF воды к нему. Запустите фрагментированных РНК на экране ленты для обеспечения что фрагментарный РНК находится в диапазоне 50-100 баз в длину (рис. 2 c).
6. РНК рецензий и подвижного круга обратная транскрипция
- Циркуляры фрагменты РНК, тепло денатурируют 20 мкл образца при температуре 65 ° C за 1 мин и поместите его на льду сразу на 2 мин. Затем добавьте 4 мкл 10 x буфер лигаза T4 РНК, 4 мкл АТФ 10 мм, 1 мкл АБС битор РНКазы, 1 мкл воды NF и 8 мкл 50% полиэтиленгликоля (PEG).
- Тщательно перемешать образца, vortexing, затем добавить 2 мкл 10 U/мкл T4 РНК лигаза I. смеси образца снова, его закупорить и Инкубируйте на 25 ° C в течение 2 ч в Термоциклер с температурой крышку на 30 ° C.
- Через 2 ч 10 мкл воды NF образца и очистки образца с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно спецификациям производителя. Элюировать образца в 20 мкл воды NF.
- Чтобы обратить вспять транскрибировать круговые молекулы РНК, добавить 4 мкл дНТФ 10 мм, 4 мкл 50 случайных hexamers нг/мкл и 9 мкл воды NF 9 мкл РНК. Все тщательно перемешать, дозирование, денатурировать образца при температуре 65 ° C за 1 мин и поместите его на льду на 2 мин Store оставшиеся РНК как резервные.
- Добавить 8 мкл 5 x синтез перв стренги буфера, 2 мкл 0,1 мм DTT и 4 мкл 200 U/мкл обратной транскриптазы и перемешать, закупорить. Инкубируйте образца при 25 ° C для 10 мин, затем 20 минут инкубации при 42 ° C с крышкой на 5 ° C выше температуры инкубации.
Примечание: Обратная транскриптаза с возможностями перемещения нити должен использоваться на данном этапе для подвижного круга обратной транскрипции. - 10 мкл воды NF образца и очистить его вверх с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно рекомендациям изготовителя. Элюировать образца в 42 мкл Элюирующий раствор.
- Проверка качества: Развести 2 мкл сингл мель cDNA в 2 мкл воды NF и запустить этот образец на инструменте анализа нуклеотидов РНК лентой высокой чувствительности. Если обратной транскрипции работал должным образом, Библиотека cDNA молекул, начиная от примерно 60 – 1500 баз в длину, должны быть видны. В идеале большинство cDNA находится в диапазоне 500-1000 баз (Рисунок 2d).
7. второй синтез cDNA стренги и окончания ремонта
- Используйте второй комплект синтеза прядь для создания библиотеки двойной мель cDNA. Поместите образцы на льду и 30 мкл воды NF в 38 мкл пример. Затем добавьте 8 мкл 10 x второй стренги буфера и 4 мкл второй стренги фермента и смешивать образца, нежный дозирование до инкубации на 16 ° C в течение 2,5 ч.
- Очистить образцы с олиго clean-up и концентрации комплекта согласно рекомендациям изготовителя для 100 мкл реакций и элюировать примеров в мкл 38 NF воды.
- Настройка реакции конце ремонт, добавив 20 мкл воды NF 35.5 мкл двойной мель cDNA, 6,5 мкл конце ремонта реакции буфера и 3 мкл конец Prep фермент смесь. Тщательно проверьте реакцию буфер для белого осадка и растворить их руки потепления, если он присутствует.
- Смешать ремонтно конце реакции, закупорить и проинкубируйте его при 20 ° C в течение 30 мин, затем второй инкубации 30 мин при температуре 65 ° C. Установите температуру Термоциклер крышки на 5 ° C выше температуры инкубации.
8. адаптер перевязки и выбор размера подготовленных библиотек
- Используйте модуль библиотеки многоступенчатой подготовки для подготовки окончательного библиотеки (см. Таблицу материалы). Во-первых, разбавить адаптеры для следующего поколения секвенирования 10 раз в 10 мм трис-HCl до конечной концентрации 1,5 мкм. Затем добавить 2,5 мкл разбавленного адаптера и 1 мкл лигирование усилитель для каждого образца и смешивать их, vortexing.
- 15 мкл Блант/TA лигаза Мастер микс, смешать его, закупорить и проинкубируйте его при 20 ° C на 15 мин. Затем 3 мкл урацил конкретных иссечение реагент фермента и проинкубируйте его при 37 ° C 15 мин. После перевязки, 13,5 мкл воды NF в суммарный объем 100 мкл пример и приступить к выбор размера.
Примечание: Это лучше Размер выберите для cDNA молекул, которые находятся в диапазоне 600 – 800 баз в длину. Если фрагментирован молекулы РНК примерно 60-80 баз в длину, выбрав для молекул, которые являются 600 – 800 баз в длину обеспечит что большинство отдельных молекул содержат по крайней мере три тандемные повторы, который идеально подходит для глубокой переработкой и анализ. - Чтобы выбрать для молекул, которые являются 600 – 800 bp в длину, добавьте 30 мкл ресуспензированы магнитные бусы (см. Таблицу материалы), приспособиться к RT, каждый образец и смешивать, закупорить. Передать образец 1,5 мл трубки и Инкубируйте на RT на 5 мин.
- Поместите образец на магнитные постоять 5 мин для отделения бисера от супернатант. Передача (который содержит требуемый cDNA молекул) супернатант новый 1,5 мл трубки и распоряжаться магнитные бусы (которые связаны с большими cDNA молекул).
- Добавить свежие Алиготе 15 мкл магнитных шариков для каждой пробы, тщательно перемешать, дозирование и проинкубируйте 5 мин на месте RT. образцы на магнитные стойки и проинкубируйте 5 мин на RT. Затем тщательно и утилизируют supernatants, убедившись в том, чтобы не мешать шарики.
Примечание: Не выбрасывайте магнитные бусы, которые теперь содержат желаемому cDNA. - Добавить 200 мкл 80% свежеприготовленные этанола для каждого из образцов не нарушая гранулированных магнитные бусы и Инкубируйте 30 s. отмены этанола и стирать образцы еще раз с 80% этанола. Тогда полностью удаления следов этанола из образцов и просушите бусы на 5 мин, но будьте осторожны, чтобы не слишком сухой бисер. Если шарики являются Пересушенный, трещины появятся в гранулы.
- Элюировать образцы из бисера, удалить трубы из магнитного стенд и 19 мкл 10 мм трис-HCl. Накапайте его вверх и вниз несколько раз для высокомобильна бисер и Проинкубируйте образцы для 5 мин на RT. Если бусины были Пересушенный, инкубировать их > 10 мин.
- Поместите образцы обратно на магнитного стенд и инкубировать их на 5 минут отделить бисер от супернатант. Тщательно удалить 15 мкл супернатанта, содержащего очищенный, размер выбран cDNA библиотек от трубы и передать его на свежий 1,5 мл.
9. ПЦР-амплификации и последний шарик очистки
-
Добавить 5 мкл универсальная грунтовка и 5 мкл уникальный индекс грунта (см. таблицу материалы) для каждого очищенного кДНК библиотеки и смешайте их тщательно закупорить. Тщательно проверьте мастер смесь полимеразы кристаллы и другие осадки и теплые мастер смесь вручную до тех пор, пока преципитаты распустить.
- Добавьте 25 мкл полимеразы мастер смеси для образца, смешивать их, закупорить и следовать Велоспорт условия ниже для амплификации PCR. Запустить первоначальный Денатурация при 98 ° C за 30 сек и затем выполнить двойной шаг реакции PCR denaturating образцы на 98 ° C 10 s и отжига/расширение продуктов ПЦР на 65 ° C для 75 s (12 x), а затем окончательное расширение при 65 ° C за 5 мин и бессрочное владение при 4 ° C.
- Очистить вверх окончательный библиотек, добавив 45 мкл ресуспензированы магнитные бусы непосредственно к реакции PCR, смешать их дозирование и инкубировать их в RT на 5 мин передачи образца до 1,5 мл и поместить его в магнитного стенд. Инкубируйте 5 мин, удалить супернатант и мыть дважды с свежеприготовленные 80% этанола для 30 s.
- После второго мыть полностью удалить этанола из образца и воздушно-сухой шарик Пелле за 5 мин и элюировать в 35 мкл 0.1 x TE. Ресуспензируйте бисер, закупорить их и инкубировать их в RT на 5 мин место образца на магнитную подставку и через 5 мин, передать свежие 1,5 мл тюбик 30 мкл супернатант. Хранить библиотек в-80 ° C.
- Проверка качества: Разбавьте 1 мкл окончательного библиотеки в 9 мкл воды NF и запуск образца на выделенный инструмент анализа ДНК с высок чувствительности чип; Большинство cDNA должно быть в диапазоне 600 – 800 bp в длину (рис. 2е).
- После элюции отправляем образцы для виртуализации на платформе массивно параллельной последовательности, используя 250 bp в паре конец читает, или 300 гласит один конец bp.
10. био информатики анализ круга последовательности данных
Примечание: Анализ и интерпретация необработанные данные из C-seq assay требует выделенный био информатики трубопровода. Схема трубопровода, который был использован для нашего анализа изображена на рисунке 3. Скачайте этот трубопровод на https://github.com/LynchLab/MAPGD.
- Во-первых обрежьте читает удалить адаптер последовательности и низкого качества базы звонков с cutadapt18, используя качество Оценка порога 20.
- Затем, определите повторяется, закодированные с помощью соответствующего алгоритма для обнаружения любых повторений с минимальным размером 30 нуклеотидов молекулы РНК concatemerized и максимум 2 несоответствия между повторяет18. Наследовать эти повторы последовательность консенсуса и отслеживать все базы звонков и связанные качества оценки на каждой позиции.
Примечание: Поскольку обратной транскрипции можно начать в любой позиции на circularized молекулы РНК, начала повторять не обязательно соответствуют 5 ′ конца фрагментированных молекулы РНК (далее именуемые как точек перешнуровка). Соответственно последовательность консенсуса не будет непрерывно Карта против соответствующего транскриптом, которая требует идентификации точек перешнуровка. -
Для определения точек перешнуровка, карта concatemer последовательность консенсуса против транскриптом ссылку, с помощью взрыва как выравнивание инструмент (БЛАТ)19.
- Сцепляет два экземпляра последовательности консенсуса для обеспечения что сопоставленный последовательность содержит по крайней мере один полный непрерывное появление начальный фрагмент последовательности РНК. Затем поверните последовательность консенсуса для начала в точке предсказал перевязки.
- Карта последовательности повернутый консенсус против геноме используя шляпе20 и использовать ряды для обнаружения любых единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP), которые могут быть ошибочно приняты за транскрипции ошибок.
-
Вызовите транскрипции ошибки из сопоставленных повернутый консенсуса последовательностей и проверить ли ошибки кандидата пройти четыре дополнительные тесты.
- Во-первых убедитесь, что ошибка транскрипции не перекрываются с SNP (типичная требование, что по меньшей мере 20 гласит должны охватывать конкретный базовый и не более, чем 5% гласит может поддерживать альтернативные базовый вызов).
- Во-вторых убедитесь, что последовательность консенсуса является производным от по крайней мере 3 тандем повторяется, каждая из которых требует той же паре базы; и в-третьих, убедитесь, что сумма показателей качества этой позиции должны быть более 100.
- Четвертый и заключительный проверить, вращать последовательность консенсуса во всех возможных комбинациях (имитируя все возможные позиции точек перешнуровка) и карта каждой версии против геном ссылку, с помощью шляпе.
Примечание: Если один из повернутого последовательностей находит идеальный матч в геноме, соответствующая точка перевязка в настоящее время считается правильным и транскрипции ошибка вызова должны быть отвергнуты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как все массивно параллельной последовательности подходов каждый эксперимент C-seq производит громоздким, большой набор данных. Для пользователей, впервые он может быть сложным для обработки этих наборов данных; Таким образом рекомендуется, что все пользователи связаться опытных био informatician до экспериментов. В среднем ожидается, что пользователи будут генерировать примерно 55 – 70 гига базы (Gbases) на запуск на большинстве платформ, массивно параллельной последовательности. Для этого протокола как правило, 12 – 30 образцов были мультиплексируются в перспективе так, что для каждого образца были приобретены около 2-6 Gbases. После обрезки адаптер последовательности и низкого качества базы звонков (< 20) из этого набора данных, по-прежнему ~ 70% от размера исходных данных.
Эти базы затем анализируется далее исследовать эффективность РНК фрагментации и рецензий, определяя размер повторений, которые были созданы. Большинство повторяет клонат быть 45 – 80 баз в длину (рис. 4A) и примерно 50% баз, которые были виртуализированных являются частью этих повторений (Рисунок 4B). Поскольку большинство из этих баз в чтений, которые содержат 3 повторений или более, количество уникальных баз, которые виртуализируются находится около одной трети от общего числа баз виртуализации. В среднем > 75% этих последовательностей консенсус может быть сопоставлен обратно ссылке генома. Наконец приблизительно 25% из этих баз покрыты 20 читает или более, что в конечном итоге означает, что около 10% данных может использоваться для обнаружения ошибок. Пример этого анализа приводится на рисунке 4, который представляет сведения о последовательности, которая была приобретена во время настройки этого протокола для 1 репликации одной библиотеки C-seq, который был секвенирован сравнительно неглубоко и представляет нижнюю ограничение данных, пользователи могут рассчитывать на приобретение.
Приблизительно 5 000 – 25 000 ошибок выполнения, как правило, определяться, хотя эти цифры могут существенно различаться в зависимости от ошибок, сам (чем выше частота ошибок, будет обнаружено больше ошибок), размер транскриптом (больше транскриптом, меньше базы будут охвачены 20 гласит, ограничивая последовательности данных, которые могут быть использованы для обнаружения ошибок) и глубина, на которой он виртуализации (глубже последовательности будет сделать его более вероятно, что данная база будет охватываться 20 читает или более). Эти ошибки, как правило, распределены по всей генома, так что в среднем ~ 47% ошибок расположены в мРНК, молекулы, порожденных РНК-полимераза II (РНК-Полимераза II), ~ 49% расположены в молекулы рРНК, порожденных РНК-Полимераза и оставшиеся ~ 3% расположены в РНК генерируемые РНК-Полимераза III и митохондриальной РНК-полимеразы. Однако эти показатели могут значительно отличаться в зависимости от типа клетки или организма под следствием (рис. 4 c). Например типы клеток, которые полагаются тяжело на митохондриальной функции, такие как кардиомиоцитов, содержат значительно более митохондриальной РНК, чем другие типы клеток, значительно увеличивая количество митохондрий молекул РНК, которые виртуализируются и таким образом ошибок, обнаруженных.
После того, как был составлен список ошибок, и известны их местах по всему геному, эти ошибки могут использоваться для определения параметров, которые контролируют уровень ошибок транскрипции в каждом организме. Например расположение этих транскрипции ошибок может быть соотнесена с многочисленными особенностями генома, такие, как наличие ДНК повторяется, конкретных генетических контекстах, или выражение скорость, чтобы понять, как эти возможности изменить верности Транскрипция5. Ожидается, что в будущем, однако, пользователи смогут определить, как бесчисленное множество дополнительных возможностей влиять на transcriptional верности, в том числе эпигенетические маркеры, 3-D Организации генома, наличия питательных веществ, возраст или воздействия токсичных соединения, для уточнения вклада генетических и экологических факторов в верности транскрипции.
Рисунок 1: Схематическое представление РНК seq против C-след (A) традиционные РНК seq эксперименты изолировать РНК из выборки интерес, фрагмент РНК, и обратное транскрибировать его до подготовки окончательного библиотеки и последовательности. Однако эти процедуры подготовки внедрять многочисленные технические артефакты в библиотеку в виде ошибок обратной транскрипции, амплификации PCR и последовательности ошибок. (B) это оптимизированный C-seq пробирного позволяет для коррекции этих технических артефактов, circularizing фрагментированных молекулы РНК до обратной транскрипции, который позволяет им быть обратной транскрипции в подвижного круга моды производить линейное cDNA молекул, которые содержат несколько копий исходного шаблона РНК в тандеме повторить. Эти тандемные повторы может затем использоваться для отличать истинный транскрипции ошибки от артефактов, как истинный транскрипции ошибки (звезда) будет присутствовать в все повторяется в том же месте, тогда как артефакты такие как обратной транскрипции ошибки (квадрат) и ПЦР амплификация ошибки (круг) присутствуют только в один или два повторения любого заданного cDNA молекулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель результаты для подготовки библиотека. Эти панели показывают, electrophoretogram для (A) высокая чувствительность РНК экран ленты лестница (см. Таблицу материалов), (B) общий РНК, очищенного от Saccharomyces cerevisiae, фрагментарный характер РНКазы III РНК (C) и ( D) подвижного круга обратной транскрипции cDNA. (E) окончательный размер отдельных кДНК библиотеки работает на высокой чувствительности двуцепочечной ДНК анализ чип (см. Таблицу материалы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: схема нефтепровода био информатики, используются для анализа данных последовательности круг. После обрезки считывает последовательность, повторяет идентифицируются, а последовательность консенсуса генерируется с использованием скорее базовый вызов в любом месте. Затем лигирование точки первоначального шаблона РНК идентифицируется и последовательность консенсуса выравнивается в геноме ссылки так, что могут быть определены потенциальные ошибки транскрипции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример результатов для C-Seq трубопровода. (A) Эта группа показывает распределение по размерам консенсус последовательностей полученные от типичной C-Seq эксперимент. (B) Эта группа показывает количество баз, читает и процент гласит, виртуализированных в каждом шаге C-Seq биоинформатики трубопровода. (C) Эта группа показывает количество транскрипции ошибок, обнаруженных и процент ошибок приписывается РНК-полимеразы I, РНК-полимераза II, РНК полимеразой III и митохондриальной РНК-полимеразы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описываем оптимизированный протокол для подготовки библиотек C-seq для обнаружения ошибок транскрипции в Saccharomyces cerevisiaeи Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans. Этот протокол имеет многочисленные преимущества по сравнению с существующими протоколами, а также альтернативные методы.
За последние 15 лет были разработаны многочисленные репортер систем, которые полагаются на Люцифераза7,8 или Cre-Lox рекомбинации3,4,,1521 обнаружить транскрипции ошибки. Эти системы репортер были бесценны для исследователей понимания transcriptional верности, потому что они позволили генов, аллелей и молекулярные механизмы должны быть определены, которые непосредственно регулируют верности транскрипции. Однако они только доклад о ошибки в искусственно поврежденных шаблоны, или в течение весьма конкретных генетических контекстов, который ограничивает научные вопросы, которые они могут ответить. Важным преимуществом протокола C-seq является, что он контролирует точность транскрипции на протяжении всего транскриптом5, значительно расширить научные знания о точности, с которой выражается генетическая информация. Во-вторых потому что C-seq assay использует РНК как его исходного материала, вполне вероятно, что этот assay может быть адаптирована к любой организм, по выбору, устранит необходимость создания сложных репортер конструкции для каждой трансгенные модели. Этот протокол также имеет преимущества перед существующими массивно параллельной последовательности подходов17,22. Прежде всего, большинство из этих подходов сделать использование тяжелых металлов в фрагмент РНК библиотек. Однако эти методы фрагментации ввести артефакты в РНК, которые неотличимы от истинной транскрипции ошибки5. Для решения этой проблемы, этот протокол фрагменты РНК ферментативно с РНКазы III которая имеет дополнительное преимущество, что она оставляет совместимый концы для самолигирование, значительно упрощая РНК рецензий и повышая чувствительность assay ~ 10 раз.
В то же время C-seq assay есть свои ограничения. Во-первых даже несмотря на то, что assay меры транскрипции ошибки на протяжении всего генома, большой компонент данных, как правило, быть производным от генов, которые сильно выражены, как стенограммы из этих генов, как правило, доминируют большинство библиотек РНК. Еще одним фактором, что искажает анализ к сильно выраженной генов является порог, встроенный в конвейере био информатики, который предотвращает генетических мутаций и РНК, редактирование событий от привходящих окончательный измерения. Этот порог диктует, что может использоваться только основы, которые были упорядочены или более 20 раз для окончательного анализа. Второе ограничение касается разнообразия библиотеки. Как большинство комплектов, используемые для извлечения РНК комплект, используемый здесь не очищают эффективно малых молекул РНК, которая ограничивает количество считываний, полученных от молекул, синтезированных РНК-Полимераза III. Разнообразие окончательного последовательности библиотеки ограничивается дальнейшего шага очистки мРНК, работающих здесь. Даже несмотря на то, что молекулы, порожденных РНК-Полимераза я могу быть эффективно виртуализации, большинство из оставшихся митохондриальной РНК, tRNAs и РНК-кодирования теряются во время этого шага. Для захвата более часто, должен использоваться другой комплект, который специально очищает малых молекул РНК, или типы клеток должны быть ориентированы эти молекулы, которые обогащаются для этих молекул. Пожалуйста, обратите внимание, однако, что большинство из этих проблем могут быть решены последовательности глубже, чем обычно, или одновременно секвенирования ДНК от же клеток, хотя оба эти решения требуют больших финансовых инвестиций следователями.
Кроме того будущие технологические разработки готовы улучшить C-seq пробу на фундаментальном уровне. Например расширяя чтения длина существующей технологии виртуализации, он будет возможность последовательности больше молекул, это означает, что больше повторений может использоваться для определения точности транскрипции. Такие усовершенствования автоматически приведет к большей последовательности глубины и увеличение доли чтений, которые могут использоваться для анализа ниже по течению. Аналогичный аргумент может быть сделано для любой технологии виртуализации, которая позволяет больше молекул, чтобы упорядочивать в параллельный. Кроме того многочисленные компоненты C-seq assay по-прежнему быть оптимизированы, включая эффективность рецензий, жесткость выбор размера и трудоемкий характер анализа самого РНК. Наконец настоятельно рекомендуется все пользователи получают доступ к выделенный, высок чувствительности инструмент для анализа нуклеиновых кислот и устранения потенциальных неполадок (см. Таблицу материалы). Без этого инструмента он может быть чрезвычайно трудно определить, в какой точке возникают потенциальные проблемы, тем самым делая их невозможно исправить.
Хотя весь протокол является довольно неумолимый (небольшие ошибки, как правило, имеют значительные последствия), есть несколько шагов, которые абсолютно необходимы для успешного анализа C-seq. Одним из наиболее важных требований является, что изолированные РНК рассматривается как можно более аккуратно. Большинство методов извлечения РНК и последующей обработки комплекты уход мало о химическом составе РНК за пределами основных отраслевых стандартов, что вполне достаточно для самых молекулярного анализа. Однако C-seq пробирного возложена задача выявления единого транскрипции ошибка среди сотен тысяч WT баз, значительно увеличивая необходимость уменьшения молекулярной стресс. Даже стресс, который воздействует только 1 10000 баз можно ввести артефактов, которые полностью недействительными результаты. Например пользователи должны никогда не избежать/предел РНК подвергать любой температуре свыше 65 ° C. Во-вторых каждый пользователь должен тщательно оптимизировать время, необходимое для фрагментации РНК с РНКазы III. Это абсолютно необходимы для успешного анализа, что окончательный молекулы являются примерно 60-80 баз в длину. Более короткие молекулы могут быть трудно сопоставить с геном, и 3 независимых повторяется для виртуализации в течение 250 чтения bp не позволит больше молекул. Наконец рекомендуется не заморозить и разморозить РНК более чем один раз в течение всего протокола. Вместо этого изолировать РНК и синтез cDNA в один день. Из-за время и усилия, связанные с этой приверженности, сложность самого протокола и количество выборок, которые часто обрабатываются одновременно рекомендуется, что двух следователей работать вместе для создания этих библиотек.
При успешном завершении, эти эксперименты, позволит точно обнаружить ошибки транскрипции в любом организме, ни при каких экспериментальных условиях. Например сравнивая управления и больных людей друг к другу, это может быть возможность определить, является ли определенные заболевания связаны с транскрипции ошибки, которые могут выявить новый компонент этиологии многочисленных человеческих патологий. Другие параметры, которые могут быть исследован являются научные старения, питания, генотип и экологические факторы, как воздействие токсичных химических веществ. Кроме того потому что этот assay обнаруживает ошибки транскрипции на протяжении транскриптом, это позволит исследователям анализировать различные механизмы, способствующие верности РНК-полимеразы I, II и III, а также митохондриальной РНК-полимеразы. Соответственно мы ожидаем, что этот протокол будет открыть новое поле мутагенез широко экспериментам, характеризуется исследование мутаций в РНК, а не в ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это издание стало возможным благодаря финансирование от Грант T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 и следователь молодой Афар предоставить (M. Вермюльст).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µL) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
