Summary
Мы показываем три методы приготовления различных тканей для визуализации иммуногистохимических сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
Abstract
Сетчатки pericytes играют важную роль во многих заболеваний глаза. Иммуногистохимическое окрашивание методы сосудов сетчатки и микрососудистой pericytes являются центральными для офтальмологических исследований. Важно выбрать подходящий метод визуализации микрососудистой pericytes. Мы описываем сетчатки микрососудистой перицит иммуногистохимическое окрашивание в крио секции, всего кронштейны и гипотонической изолированных сосудистую, с использованием антител для тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Это позволяет нам подчеркнуть преимущества и недостатки каждого из трех ткани препаратов для визуализации сетчатки микрососудистой pericytes. Крио разделы обеспечивают transsectional визуализация всех слоев сетчатки, но содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature. Целом гора обеспечивает обзор всей сетчатки сосудистую, но визуализация microvasculature может быть хлопотно. Гипотонический изоляции обеспечивает метод визуализировать всю сосудистую сетчатки, удаление нейрональных клеток, но это делает ткани очень хрупкие.
Introduction
Сетчатки pericytes находятся в центре внимания многих научно-исследовательских лабораторий, как эти клетки играют важную роль в целостности сосудистую. Патологических состояний, таких как диабетическая ретинопатия1, ишемия2и глаукомы3 имеют сосудистой характеристики, которые включают функцию pericytes. Pericytes находятся в внутренний сетчатки капиллярной сплетения. Центральной артерии сетчатки, которая поставляет внутреннюю сетчатки разветвляется на два слоя капиллярного сплетений. Внутренняя сосудистого русла находится между клеток ганглия и внутренние ядерного слои. Глубокий слой более плотным и сложных и локализуется между внутренней и наружной ядерных слои4,5. Кроме того некоторые части сетчатки также содержат третья сеть называется радиальной parapapillary капилляров. Эти длинные, прямые капилляров, которые лежат среди нервных волокон и редко анастомозируют с друг с другом или другие два сплетения6. В стенке капилляров pericytes встраиваются в базальной мембраны и линии с abluminal стороны сосудистой эндотелиальных клеток.
К этой дате существует не уникальный биологический маркер эти pericytes, которые могут дифференцировать их от других сосудистых клеток. Часто используемых маркеров, которые представляют на pericytes, но и другие сосудистые клетки тромбоцитарный фактор роста рецепторов β (PDGFRβ) и нерва/глиальных антигена 2 (NG2). Выявление pericytes еще больше осложняется существование перицит подмножеств, которые различаются по морфологии и белка выражение7. В настоящее время лучшие идентификации опирается на комбинацию белковых маркеров и характерным позиционирования перицит в сосудистой стенке. Мы демонстрируем здесь три методы приготовления различных тканей для иммуногистохимическое окрашивание PDGFRβ/NG2 сетчатки микрососудистой pericytes крыса, т.е., крио секций, всего монтирует и гипотонической изоляции сосудистой сети.
С крио секции сетчатки и склера прорваться через зрительный нерв. Это позволяет для визуализации всех слоистых структур нейронов. Собственный десяти слоев сетчатки являются очевидными как Перепутывание ядерного и аксональной/дендритных структуры, которые могут быть визуализированы с пятнами как гематоксилином/эозином или флуоресцентные ядерной 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. Метаболические требования отличаются между слоями9 и он предоставляет метод для определения толщины или полное отсутствие конкретного слоя (например, потеря клеток сетчатки ганглия является одной из отличительных особенностей сетчатки ишемии10, 11). Сосудистую очевиден, как поперечный прорезает сетчатки, что делает его возможным отдельно изучить капиллярного сплетения в соответствующих слоях сетчатки12,13.
Традиционно в целом сетчатки-монтирует проводятся исследования сетчатки сосудистую сеть. С подготовкой этой ткани Сетчатка вырезать и уплощенная как цветок shaped структуры. Метод представляет собой метод подготовки сравнительно быстро ткани, который можно выделить общую архитектуру сетчатки сосудистую и поэтому он часто применяется в расследовании неоваскуляризация в мышиных сетчатки. Успешной визуализации microvasculature в целом монтируется сетчатки также сообщается в развивающихся неонатальной мыши и крысы сетчатки14,,1516,17,18, 19. Эти исследования выявили более определенным pericytic активности с больших капиллярно свободно OBLASTей в взрослого, по сравнению с новорожденным сетчатки14.
Еще один способ визуализации является microvasculature сетчатки после гипотонический изоляции. Этот метод подготовки ткани приводит к сетчатки кровеносных сосудов и капилляров, освобождается нейрональных клеток. Этот тип двумерных изображений изолированной сетчатки сосудистой сети обычно выполняется после переваривания трипсином сетчатки20 и использованы для оценки сосудистые аномалии диабетической ретинопатии, включая потерю перицит и капиллярные 20,дегенерация21,22. Гипотонический изоляции метод предлагает расследования сетчатки сосудистого генов и белков регулирования ответы, как они было сделано с RT-PCR и западных blotting23,24,25. Здесь мы предоставляем протокол для свободно плавать иммуногистохимическое окрашивание гипотонический изолированных сетчатки сосудистую как альтернатива Пищеварение трипсина для изучения микрососудистой pericytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол был оптимизирован и продемонстрировал на мужских особей взрослых белых крыс. Во всех экспериментальных процедурах согласно регламенту в операторе Арво для использования животных в глазной и видение исследований относились животных. Животные были умерщвлены двуокиси углерода и последующих шейки матки дислокации.
1. крыса ткани сетчатки препараты
-
Крио Секция
- Сделайте задний и передний ~0.5 см прорези в веко крыс с помощью скальпеля.
- Дополнительно: Использование диатермии горелки, Марк глаз на внутренний угол для того чтобы ориентироваться в глаза в едином моды во время внедрения и позволяют для разрезания вертикальных криостата через зрительный нерв.
- Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки. - Коротко говоря глаз в 4% формальдегида в фосфат амортизированное saline (PBS) для стабилизации до принятия первоначального отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
- Под микроскопом, разрезать вдоль лимба роговицы с Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами перед погружаясь в 4% формальдегида в PBS для 2 – 4 ч.
- Промыть последовательно, в Sörensen и фосфатного буфера с 10%-ая сахароза и 25%-ая сахароза.
- Внедрите в Yazulla среде, подготовленный с 3% желатина из свиной кожи и 30% альбумина с куриное яйцо белого.
Примечание: Протокол может быть здесь приостановлена с ткани хранения при температуре-20 ° C.
- Сделайте задний и передний ~0.5 см прорези в веко крыс с помощью скальпеля.
-
Целом гора
- Сделайте разрезы см задний и передний ~0.5 в веко крыс с помощью скальпеля.
- Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки. - Коротко говоря глаз в 4% формальдегида в PBS для стабилизации до принятия первоначального отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
- Под микроскопом разрезать вдоль лимба роговицы Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами.
- Отделяйте сетчатки от сетчатки пигментного эпителия к зрительному нерву с щипцами, используя небольшое отверстие движения, чтобы избежать крупных разрывов.
- Бесплатный сетчатки в зрительном нерве Рассечение ножницами и сделать четыре прорези несколько миллиметров длиной от периферии сетчатки к голове зрительного нерва.
- Распространения сетчатки на слайд стекла и разрешена сушка для 5 – 10 мин.
- Исправьте в 4% формальдегида для 20-30 мин, капает формальдегида на сетчатку.
Предупреждение: Не применяется непосредственно на сетчатке, как он может отсоединиться от стекла. - Промойте с PBS. Для получения оптимальных результатов, иммуно пятно сразу после полоскания.
-
Гипотонический изоляции
- Сделайте разрезы см задний и передний ~0.5 в веко крыс с помощью скальпеля.
- Схватить глаз с щипцами и тщательно наклон в сторону, чтобы разоблачить окружающие ткани. Enucleate глаза, распилы Рассечение ножницами в мышечной и соединительной ткани.
Предупреждение: Не тянуть глаза слишком трудно, как чрезмерное давление на зрительного нерва может вызвать отслоение сетчатки. - Сделайте первоначальный отверстие в лимба роговицы, применяя давления света с кончика скальпель.
- Под микроскопом разрезать вдоль лимба роговицы Рассечение ножницами удалить роговицы и удалить объектив с щипцами.
- Отделяйте сетчатки от сетчатки пигментного эпителия к голове зрительного нерва с щипцами, используя небольшое отверстие движения, чтобы избежать крупных разрывов.
- Бесплатный сетчатки в зрительном нерве Рассечение ножницами, место сетчатки в 1 мл деионизованной воды в пластине 24-Ну и погрозит 200 об/мин с орбитой вибрации 1,5 мм на 1 ч при комнатной температуре.
Примечание: Далее, сетчатки появится менее определены на краях. - Добавьте 200 DNAse U 1 отмежеваться лизированных ячейки мусор от сетчатки сосудистую и встряхнуть для еще 30 минут при комнатной температуре.
Примечание: Мусора может начать форме в скважинах. - Промывайте минимум 3 раза в дейонизированной воде 5 минут с встряхивания на 150 – 300 об/мин для удаления мусора нейрональных клеток. Сетчатки должна стать более транспарентной, с каждого полоскания свидетельствует о удаление нейронов сотовой мусора.
- В пластину 24-ну ясно видеть просвечивающий изолированных сетчатки сосудистую используйте темный фон.
- (Необязательно): Если сосудистую не появляются бесплатно нейрональных слоёв (полупрозрачным) на данный момент либо добавить больше промойте шаги, увеличить скорость встряхивания или используйте пипетки для аспирационная жидкость на сосудистую.
ВНИМАНИЕ: Любой из дополнительных шагов может повредить сосудистую.
- Fix 10 мин в 1 мл 4% параформальдегида в PBS при комнатной температуре и промывки 3 раза в PBS.
Примечание: Протокол может быть здесь приостановлена с хранения тканей при 4 ° C.
2. иммуногистохимии
-
Пятнать крио-секций
- Вырезать 10 мкм крио секций желатин встроенный сетчатки как вертикальное секционирование через зрительный нерв и место крио разделы на стекло и высушить (минимум 1 час).
- Погрузите слайд стекла в PBS с 0,25% Тритон X-100 (PBS-T) за 15 мин.
- Капельно 1: 100 PDGFRβ и первичных антител 1: 500 NG2 разводят в PBS-T + 1% BSA на крио секции и инкубировать в камерах инкубации при температуре 4 ° C на ночь.
- Погрузите слайд стекла 2 раза в PBS-T 15 мин и капать масштаба 1: 100 анти Alexa Fluor 594-связаны и 1: 100 анти кролик FITC-связанные вторичные антитела мыши разводят в PBS-T с 3% BSA на крио секций.
- Инкубируйте стеклянное скольжение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Промойте стекло слайд в PBS-T 2 x 15 мин.
Примечание: Необязательно: для двух- и трехместные immunofluorescent окрашивание, последовательные окрашивания могут быть выполнены, повторив процедуру от 2.1.3 2.1.6 два и три раза, соответственно. - Крепление окрашенных крио секции с анти выцветанию монтажа средних содержащие DAPI и coverslip.
-
Окрашивание в целом гора
- Стекать PBS-T на целом гора и инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Слить и капельно 1: 100 PDGFRβ и первичных антител 1: 500 NG2 разводят в PBS-T + 1% BSA и инкубировать в влажные камерах при температуре 4 ° C на ночь.
- Слить и капать на PBS-T для ополаскивания стеклянных слайд в 2 x 15 мин.
- Слить и капать по 1: 100 анти кролик Cy2 - и 1: 100 анти мыши связанный с Cy3 вторичное антитело разводят в PBS-T с BSA 3% для инкубировать 1 час во влажной камере при комнатной температуре в темноте.
- Слить и капать на PBS-T для полоскания в 2 x 15 мин в темноте.
Примечание: Необязательно: для двух- и трехместные immunofluorescent окрашивание, последовательные окрашивания могут быть выполнены, повторив процедуру от 2.2.2 2.2.5 два и три раза, соответственно. - Крепление окрашенных целом гора с анти выцветанию монтажа средних содержащие DAPI и coverslip.
-
Окрашивание гипотонический изолированных сосудистую
- Блокировать гипотонический изолированных сосудистую 1 час с встряхивания на 100 об/мин и комнатной температуре с 500 мкл/хорошо 10% сыворотки осла разводят в PBS.
- Инкубируйте на ночь при комнатной температуре и погрозит 100 об/мин с 600 мкл/хорошо 1 PDGFRβ: 100 и 1: 500 первичных антител NG2 разводят в 10% осла сыворотки в PBS.
- Промыть сетчатки сети 3 x 5 мин в PBS и инкубировать в масштаба 1: 100 анти Alexa Fluor 594-связаны и 1: 100 анти кролик FITC-связанные вторичные антитела мыши разводят в 10% сыворотки осел в PBS тряску при комнатной температуре в течение 1 ч в темноте 100 об/мин.
- Промыть в PBS-T 5 мин и инкубировать в 0.2 нг/мл DAPI в PBS-T 15 мин, следуют полосканий 3 x 5 мин в PBS-T в темноте.
- Вырезать кончик пластиковой Pasteur накапайте, смачивают PBS-T и использовать его для передачи сетчатки сети к слайду камеры 4-ну стекла.
Примечание: Увлажнением шаг имеет важное значение для избежания сетчатки сосудистую, придерживаясь внутри Pasteur накапайте. - Разворачиваться сетчатки сосудистую. Не прикасайтесь сетчатки сосудистую пинцетом, как это может вызвать сосудистую в клубок.
Примечание: Разворачивается может быть сделано путем наклона камеры слайд взад и вперед или аспирационных капель жидкости на сосудистую сетчатки. - Удалите носитель из скважин. Поверхностное натяжение жидкости будет выравниваться сосудистую на нижней части слайда.
- Обеспечить правильное разворачивается под микроскопом, прежде чем удаление пластиковых колодцев от камеры слайд.
- Смонтируйте окрашенных сосудистую с анти выцветанию монтажа средних и coverslip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Успешный протоколы обеспечивают три различных препаратов сетчатки для визуализации микрососудистой pericytes. Каждый из этих методов использует PDGFRβ и NG2 иммунореактивности со локализации и уникальное положение pericytes, обернуть вокруг foridentification эндотелия капилляров.
С крио секции нейронов слоя может быть идентифицирован флуоресцентные плотность DAPI меченого ядра и внутренний и глубоко капиллярной сплетения содержат pericytes отображения PDGFRβ и NG2 иммунореактивности (рис. 1). Уникальное положение pericytes в сосудистой стенке можно рассматривать как круговой или подковы иммунореактивности на периферии сосудов (рис. 1, стрелки) или случайные продольно разрезать судов (рис. 1, стрелки).
Успешной визуализации микрососудистой pericytes в целом горе подготовки взрослых крыс может быть сложным14,20. Иммунореактивности PDGFRβ в целом монтируется взрослых сетчатки только привело к очень слабый сигнал (не показан). Пятнать NG2 изложил внутренний сосудистой сети с интенсивной окраски в abluminal pericytes (рис. 2).
Чтобы получить обзор сосудистой сети взрослых крыс сетчатки, иммуногистохимия гипотонический изолированных крыса сетчатки сосудистой сети предоставляет альтернативный метод в целом гора. Когда успешно выполнена, этот метод подготовки ткани обеспечивает обзор всей сетчатки microvasculature, включая внутренний и глубоко капиллярного сплетения. Иммуногистохимическое окрашивание с маркерами pericytic приводит к всей микрососудистой сети, показывая NG2 иммунореактивности с интенсивным ответ в специфических клеток сосудистой (рис. 3). Некоторые из этих клеток также отображать PDGFRβ иммунореактивности (рис. 3).
Тщательного разворачивается ткани важно получить хороший обзор сетчатки сосудистую. Недостаточное развитие может привести к сосудистую, расположены в нескольких слоях фокус, который делает флуоресцентные визуализации сложных (рис. 4). Разворачивается может быть облегчено мягкий встряхивания, наклона камеры слайд взад и вперед или аспирационных капель жидкости на сосудистую сетчатки. Следует отметить, что анатомии сетчатки капиллярного сплетения приведет к некоторых наложение сосудистого кровати. Следовательно это проблематично отличить внутренний от глубже капиллярного сплетения когда плоский на стеклянное скольжение.
Рисунок 1: двойной иммуногистохимическое окрашивание перицит крио-секции внутренней крыса сетчатки. (A) NG2 (зеленый) иммуногистохимия показывает положительные суда в рамках внутренней части сетчатки. Стрелки указывают круговой и подковообразные иммунореактивности в сосудах. Стрелка указывает, продольно отрезока судна. (B) PDGFRβ (красный) иммуногистохимия Показать реактивности аналогичны NG2 иммунореактивности. Стрелки и стрелки указывают на те же структуры как NG2 пятнать. (C) изображение показывает слияние NG2, PDGFRβ и DAPI (синий) путем наложения три различные фильтры. Выяснилось, что два антитела совместно локализованные (красный + зеленый = желтый). NF: слой нервных волокон, GCL: слоя клеток ганглия, IPL: внутренний сплетениевидный слой, INL: внутренний слой ядерной, ОБН: внешний сплетениевидный слой, ONL: ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: иммуногистохимических перицит окрашивание сетчатки смонтированы всего крыса. Иммунореактивности NG2 (красный) видна вдоль поверхностных сосудов networkwith интенсивное окрашивание в abluminal pericytes. На снимках Объединенные NG2 и DAPI (синий). Нейрональные клетки видны как DAPI-синий ядер между NG2-окрашенных microvasculature. Иммунореактивности PDGFRβ в целом монтируется взрослых сетчатки привели только к очень слабый сигнал и поэтому не включены в эту цифру. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: двойной иммуногистохимическое окрашивание перицит гипотонический изолированных крыса сетчатки сосудистую. (A). изображение показывает гипотонический изолированных крыса сетчатки сосудистой сети иммуногистохимических окрашивали NG2 (зеленый) и PDGFRβ (красный). Полная сеть показал NG2 иммунореактивности. Однако PDGFRβ иммунореактивности было обнаружено в ячейке СОСМ. Вставка A является обзор сетчатки сосудистую сеть, окрашенных с DAPI (синий). (B) изображение показывает же образца как (A) в другом месте и увеличение. Ясно, что PDGFRβ окрашивание отображается только в СОСМ клеток сосудистой сети, указывающее перицит иммунореактивности. Вставка B-изображение, которое показывает высокое увеличение сосудистую окрашивали NG2 (зеленый), PDGFRβ (красный) и объединена с DAPI. Включая DAPI пятнать вместе с NG2 и PDGFRβ показывает три pericytes (PDGFRβ-положительных) и два неопознанных судно стены клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: пример неадекватной развернулось гипотонический изолированных сетчатки сосудистую. Тщательного разворачивается гипотонический изолированных сосудистую имеет важное значение, как недостаточное развитие может привести к сосудистую штабелирования. На снимках DAPI-окрашенных сетчатки сосудистую в том же месте, но в разных фокус слои. (A) DAPI-окрашенных клеток в одном фокус слой показать примерно 25 µm толщиной кровеносный сосуд в сетчатки сосудистую. (B) DAPI-окрашенных клеток в второй слой фокус прояснения тонкие ветвящиеся капилляров на том же сайте, что были уложены на крупных кровеносных сосудов, отображаются в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем три сетчатки подготовка техники, которые могут быть применены в исследовании микрососудистой pericytes сетчатки. Ниже мы предлагаем сравнение между каждым из методов и выделить важные шаги в протоколах.
С крио секционирование, сетчатки режется в сагиттальной секций и следовательно, это позволяет получить многочисленные образцы от же сетчатки. Числительное секций, вытекающие из этого метода делают его идеальным выбором для специфичности антитела и титрование тестирования как он предотвращает ненужные жертвоприношения животных. Подготовительная работа имеет решающее значение для хороших результатов. Это имеет решающее значение для рассечения глаз не тянуть глаз, но и сократить все мышцы вокруг глаз. Если используется сила, существует риск отслоения сетчатки. Потому что глаз Кубок тонкий, одно не должно исправить слишком долго. Погружения с параформальдегида 4% в PBS для 2 – 4 ч будет исправить ткани. Если фиксированная дольше, существует риск уничтожения антигена интереса. Для того, чтобы создать лучшие возможности immunostainings, критически важно для каждого раздела, как плоский как можно против стекла. Поскольку разделы содержат только несколько иногда поперечные срезы microvasculature, этот метод подготовки ткани предлагает только кратковременный визуализация microvasculature. Таким образом этот метод не подходит для исследования общего сосудистого архитектуры и количественной меры pericytes.
Общая сосудистую могут быть окрашены после монтажа всего представить обзор сосудистую. При освоении этой техники, она может быть быстро ткани подготовка процедура, которая требует относительно мало нагрузки. Однако есть несколько моментов, чтобы быть особенно осведомлены о. Сетчатка является хрупким и имеет первостепенное значение для обрабатывать их с осторожностью и избежать рипы и отрубы. Кроме того во время тщательно обработки сетчатки, это ключевое значение во избежание складок и других расселины во время монтажа, может повлиять на визуализации для иммуногистохимии позже. Навесные Сетчатка имеет толщину 250-300 мкм и антитела проникновение нейронных слоев может быть проблематичным. Отношении перицит визуализация, окрашивание NG2 в целом гора протокол может быть достигнуто только с Cy3-связанные вторичные антитела, и PDGFRβ иммунореактивности в целом монтируется взрослых сетчатки привело к такой очень слабый сигнал, что он не был показан в фигура. Следовательно полезность техники окрашивания целом гора сильно препятствует успешной окрашивания зависит в основном от конкретных первичных и вторичных антитела, которые используются. Дальнейшие предложения для оптимизации протокола для визуализированных микрососудистой сплетения взрослых крыс сетчатки является инкубации в основное антитело для более длительного периода времени и/или изменении температуры инкубации26.
Из-за толщины целом смонтированы важно быть осведомлены о направлении сетчатки после четырех разрезов от периферии сетчатки к зрительного нерва голову, чтобы избежать случайное монтирование с внутренней сетчатки, содержащие капилляров Облицовка вниз. Тем не менее подробные визуализации глубже микрососудистой сплетения и pericytes может быть хлопотно с14,этот метод20. В целом гора окрашивание сетчатки, Взрослый трудно в глубже сплетение капилляров, это может привести к сетчатке, появляясь аваскулярный в некоторых частях. Иммуногистохимическое окрашивание смонтированы всего взрослого сетчатки обеспечивает лишь фрагментарный обзор сосудистую с pericytes футеровка судов в поверхностных капилляров сплетения и, следовательно, этот метод может привести к ложным отрицательные результаты в Визуализация сосудистую сетчатки крыс.
Пищеварение трипсина уже давно считается золотым стандартом техника для изоляции и визуализации сетчатки сосудистую20. Гипотонический изоляции обеспечивает альтернативный метод для визуализации всей сложной трехмерной сосудистой сети и стоят те же задачи работы с очень хрупкой ткани, который трудно справиться. Из-за сходства в сетчатки сосудистого продукта между двумя методами гипотонические изоляции сталкивается со многими теми же проблемами, как Пищеварение трипсина20 , включая тщательное вскрытие для предотвращения крупных слезы и осторожного обращения, избегая Дозирование и трогательно пинцетом. Важное различие между методами заключается в фиксации. Пищеварение трипсина обычно делается после фиксации и может успешно применяться на сохранившихся сетчатки, которые были в фиксатором для нескольких лет20. Гипотонический изоляция выполняется до фиксации и таким образом позволяет для осуществления в различных других анализов, как описано в литературе23,24,25. Пищеварение трипсина осуществляется через два дня20, тогда как гипотонический изоляции может быть завершена в течение часов. Кроме того протокол гипотонический изоляции не включают риск чрезмерной пищеварение и ферментативного расщепления мембраны маркеров, необходимые для признания перицит, например PDGFRβ и NG2, что делает этот метод предпочтительнее для последующего Микроваскулярная иммуногистохимическое окрашивание.
Наконец хотя вне непосредственной сферы этой рукописи, существует менее широко известных, но очень полезный метод для изоляции больших, нетронутыми микрососудистой plexi от грызунов из сетчатки27. Сетчатки позиционируется в камере специального стекла и coverslip. После удаления coverslip, microvasculature по-прежнему придает coverslip для создания полностью живым (≈ 98% клеток) ткани печати. Самым большим преимуществом этого метода является, что она позволяет физиологические исследования сосудов и последующей фиксации для иммуноокрашивания. Очевидные ограничения метода является, что он не обеспечивает визуализации/изоляции всей микрососудистой сети как плоский горе сетчатки и гипотонической препаратов. Тем не менее pericytes могут быть визуализированы путем применения этого метода27.
Описанные здесь методы подготовки три ткани являются взаимодополняющими в том смысле, что каждый метод включает в себя преимущества и недостатки для визуализации микрососудистой pericytes. Чтобы выбрать оптимальный метод для изучения микрососудистой pericytes определенных патологических условиях важна оценка каждого методы потенциалов и слабые стороны. Доказанных методов может быть расширена до окрашивания не только для перицит маркеры, но и для визуализации микрососудистой структур в целом. В конце концов это для отдельных исследователь выбрать соответствующий визуализации метод, основанный на вопрос гипотеза исследования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Исследование финансировалось Lundbeck фонд, Дания.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
References
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. Lagali, N. , InTech. (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte? Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
