Vi præsenterer tilgange til biofysiske og strukturel karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin fold af biolayer interferometri, isotermisk titrering kalorimetri og uorganisk kemi.
Glykoproteiner på overfladen af celler spiller en kritisk rolle i cellefunktion, herunder signalering, vedhæftning og transport. På leukocytter, flere af disse glykoproteiner besidder immunglobulin (Ig) folder og er centrale for immun anerkendelse og regulering. Vi præsenterer her, en platform for design, udtryk og Biofysisk karakterisering af den ekstracellulære domæne af humane B-celle receptoren CD22. Vi foreslår, at disse metoder er stort set gælder for karakterisering af pattedyr glycoprotein ectodomains indeholdende Ig domæner. To suspension menneskelige embryonale nyre (HEK) cellelinjer, HEK293F og HEK293S, der bruges til at udtrykke glykoproteiner huser komplekse og high-mannose glycans, henholdsvis. Disse rekombinante glykoproteiner med forskellige glycoforms giver mulighed for at undersøge effekten af glycan størrelse og sammensætning på ligand bindende. Vi diskutere protokoller for at studere kinetik og termodynamik af glycoprotein binding til biologisk relevante ligander og terapeutiske antistof kandidater. Rekombinant glykoproteiner produceret i HEK293S celler er indstillet til at krystallisering glycan homogenitet, nedsat fleksibilitet og modtagelighed for endoglycosidase H behandling. Vi præsentere metoder til iblødsætning glycoprotein krystaller med tunge atomer og små molekyler til fase bestemmelse og analyse af ligand bindende, henholdsvis. De eksperimentelle protokoller diskuteret hold her løfte til karakterisering af pattedyr glykoproteiner at give indsigt i deres funktion og undersøge om therapeutics virkningsmekanisme.
Overflade proteiner spiller en kritisk rolle i cellulære funktion. Gennem deres ekstracellulære domæner, kan disse Membranproteiner modulere celle-celle interaktioner, vedhæftning, transport og signalering1,2. Den ekstracellulære lokalisering af disse proteiner gør dem attraktive mål for udvikling af lægemidler til behandling af en lang række sygdomme, herunder kræft og autoimmune sygdomme3,4,5 , 6 , 7. en af de mest almindelige folder af menneskelige membran protein ectodomains er immunglobulin-lignende (Ig) fold, som er dannet ved syv eller flere β-tråde arrangeret i to β-sheets8,9. Ig-holdige glykoproteiner er typisk multi-domæne strukturer med Ig domæner sekventielt arrangeret på den ekstracellulære del af membran protein10. Posttranslationelle modifikationer af disse celle-overflade proteiner, især N – og O-linked glykosylering, har vist sig at spille vigtige roller i deres forordning, foldning, sekretion og funktion11. For at forbedre vores forståelse af deres funktion og bedre design therapeutics, der kan målrette dem, teknikker er påkrævet at gøre det muligt for deres detaljerede Molekylær karakterisering. Vi præsenterer her, en kombination af teknikker, der giver mulighed for den biofysiske (biolayer interferometri (BLI) og isotermisk titrering kalorimetri (ITC)) og strukturfondene (røntgenkrystallografi) karakterisering af ekstracellulære domæne Ig-holdige membran glykoproteiner, alene og i kompleks med deres biologisk relevante ligander og terapeutiske molekyler (figur 1).
N-linked glykosylering er en af de mest almindelige post oversættelse ændringer på pattedyr proteiner, og der opstår under protein modning i det endoplasmatiske reticulum og Golgi12,13. Cellelinjer, såsom menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, er blevet udviklet for rekombinante udtryk for store mængder af glykosyleret pattedyr proteiner14,15. Denne cellelinje er blevet udviklet i en suspension format, som giver mulighed for at lette optrapning protein produktion til større mængder i forhold til vedhængende cellelinjer. Her, vi udnytte to HEK293 cellelinjer: HEK293F og HEK293 Gnt jeg– / – (HEK293S), som adskiller sig ved fravær af N-acetylglucosaminyl-transferase (Gnt jeg) i sidstnævnte. Til gengæld produktion af komplekse glycans (som ses i HEK293F) er ikke mulig og i stedet høj mannose-type glycans (overvejende mand5GlcNAc2) bor på N-linked glycan websteder18,19,20 . Ved hjælp af disse to cellelinjer parallelt giver mulighed for at studere effekten af glycan størrelse og kompleksitet på biologiske funktion og terapeutiske målretning. Faktisk vil glykoproteiner produceret i HEK293F celler have større, mere komplekse glycans i forhold til den samme glycoprotein produceret i HEK293S celler. Glycoproteiner produceret i HEK293S celler er mere åbne over for krystallisering, på grund af den reducerede kemiske og konformationelle heterogenitet af deres N-knyttet glycans. Yderligere at forbedre crystallizability, glykoproteiner produceret i HEK293S (men ikke HEK293F) celler kan blive behandlet med enzym endoglycosidase Hansen (Endo Hansen), hvilket resulterer i kløvningen af høj mannose glycans sådan at kun en enkelt N-acetylglukosamin (GlcNAc) gruppe forbliver på hvert N-linked glykosylering site21,22. Andre metoder kan også bruges til at begrænse N-glycan behandling inden for cellerne, såsom tilføjelsen af glycosyltransferase hæmmere under glycoprotein udtryk, herunder kifunensine23. Alternative tilgange involverer udtryk for indfødte glycoproteiner (i HEK293F celler) efterfulgt af enzymatisk deglycosylation ved hjælp af peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dog har deglycosylation med PNGaseF vist sig at være mindre effektiv under indfødte betingelser og øger sammenlægning i nogle proteiner; i tilfælde når proteinet forbliver vandopløseligt efter behandling, får det negative afgifter på dens overflade på grund af Deamidering af asparagin rest til aspartinsyre24, som kan være skadelige for dets krystallisation. Forudsagte N-glykosylering websteder kan også være muteret, oftest for alanin eller glutamin rester, at forhindre N-linked glykosylering på disse websteder og generere glycoprotein prøver af høj ensartethed. Alternativt, glykoproteiner kan fremstilles i andre eukaryote cellekulturer, herunder gær, insekt, og plante systemer eller andre pattedyr cellelinjer som kinesisk hamster ovarie (CHO) celler16,17.
Mange pattedyr udtryk vektorer, herunder pHLsec, tillader sekretion af rekombinant glycoprotein ectodomains i celle medium25. Sekretion af glykoproteiner fra HEK293 celler giver mulighed for hurtig og nem rensning uden behov for celle lysering. Tilsætning af rensning tags (f.eks. hans-tag, Strep-tag, Flag-tag, Myc-tag, HA-tag) til målet N eller C endestation glycoprotein tillader rensning af en trinvis affinitet kromatografi. Efterfølgende kan størrelse udstødelse kromatografi bruges til at give en monodisperse prøve for biofysiske og strukturel karakterisering.
En meget ren og homogen glycoprotein prøve under passende betingelser kan resultere i godt diffracting krystaller. Når en fuld røntgen diffraktion datasæt er opnået fra sådanne krystaller, skal indledende faser være fast besluttet på at beregne elektron tætheden af glycoprotein. Takket være et stadigt stigende antal strukturer i Protein Data Bank (FBF) blevet den mest anvendte metode til gradvis langt molekylære udskiftning (MR), som bruger en relaterede protein struktur til at opnå indledende faser26. Men når hr. ikke løse fase, som det undertiden har været tilfældet for multi-Ig-domæne glykoproteiner27,28,29, alternative metoder er nødvendige. I denne artikel detalje vi en metode til at suge krystaller med tunge atomer (HA) for udfasning, der var nødvendige for at løse strukturen af CD22 ectodomain28. At identificere ret HA for udfasning er en iterativ proces, der afhænger af HA reaktivitet, tilgængelige atomer i glycoprotein i en given krystalgitter og krystallisering løsning30,31. Alternativt, naturlig svovl atomer i cystein og methionin rester kan bruges til udfasning hvis stede ved en høj nok forholdet til andre atomer i glykoprotein, og røntgen diffraktion data kan indsamles med høj nok redundans32, 33.
Den biologiske funktion af membran glykoproteiner er ofte medieret af protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kulhydrater. Når liganden er lille nok til at diffuse fra løsningen til glycoprotein bindingssted i krystalgitter, kan iblødsætning forsøg lykkes at få et glykoprotein-ligand Co krystalstruktur for bedre at forstå ligand anerkendelse.
De protokoller, der præsenteres her, er også relevant for at forstå samspillet mellem overflade glykoproteiner med syntetisk terapeutiske ligander34,35 og antistof therapeutics36,37. Når det kombineres med strukturelle oplysninger, kan bindende kinetik og termodynamik være stærk til at forstå og forbedre deres virkningsmekanismer. En teknik, der giver mulighed for kinetic analyse af terapeutiske antistoffer binder til et glykoprotein er BLI38,39. BLI bruger biosensorer med et immobiliseret ligand til at måle association og dissociation kinetik med en bindende partner, i sidste ende bestemme en ligevægt dissociationskonstant (KD). BLI er en attraktiv tilgang, fordi små mængder af glykoproteiner er påkrævet (< 100 µg), eksperiment tiden er hurtigt (~ 10-15 min. pr. run), og det kan automatiseres. ITC er også nyttigt for at studere tilhørsforhold mellem glykoproteiner og bindende partnere40,41,42,43. Mens ITC er mere tid og reagens intensiv, kan værdifulde oplysninger indhentes vedrørende termodynamik i interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS og støkiometrisk). ITC er også meget nyttigt for at studere svage interaktioner, der er ofte forbundet med forbigående bindingen af overflade glykoproteiner til ligander. Desuden, disse teknikker kan bruges sammen til at evaluere bindingen af forskellige konstruktioner og vurdere effekten af forskellige N-knyttet glycoforms fremstillet af udtrykker glycoprotein i forskellige cellelinier. Udfører BLI og ITC med glycoproteiner produceret i HEK293F, HEK293S og behandlet med Endo H kan give en grundig opfattelse af glycans rolle i biologiske aktivitet og terapeutiske engagement.
Vi anvendt med succes disse protokoller for at karakterisere den ekstracellulære domæne (ECD) af menneskelige CD2228, et glykoprotein medlem af familien sialic syre-bindende Ig-lignende lektiner (Siglecs) der er afgørende for at opretholde B-celle homøostase44 . Vi udført dybtgående konstruktion design at lette krystallisering og gradvis X-ray datasæt af HA iblødsætning med Hg. Vi også gennemblødt CD22 krystaller med dets ligand sialic syre (en2-6 sialyllactose) at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks og således fastsatte struktur-styrede udformningen af glycan mimetics45,46blueprints. Derudover vi genereret fragment antigen bindende (Fab) af anti-CD22 terapeutiske antistof epratuzumab – en terapeutisk kandidat i øjeblikket i fase III kliniske forsøg for non-Hodgkins lymfom47– for at bestemme dets bindende affinitet af BLI og ITC til varierende glykosyleret CD22 ECD konstruktioner. Disse undersøgelser afslørede en afgørende rolle for N-linked glykosylering i epratuzumab engagement, med potentielle konsekvenser for CD22 anerkendelse på dysfunktionelle B-celler.
Membran-forankrede glykoproteiner er vigtige for cellefunktion og attraktive terapeutiske mål. Her præsenterer vi en protokol for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af ECD af membran glykoproteiner, både alene og i kompleks med lille molekyle ligander og Fab fragmenter. Vi har med succes brugt denne protokol til at bestemme krystalstruktur af de tre N-terminal-de fleste Ig domæner i den ekstracellulære del af menneskelige CD2228, et kritisk samarbejde receptor på B-celler involveret i at holde humorale immunitet i check79. Vi har også kendetegnet bindingssted af CD22 med dens naturlige ligand en2-6 sialyllactose og defineret tilstand af anerkendelse af et terapeutisk antistof mod human CD22. Disse resultater giver indsigt i struktur-funktion relationer af et centralt medlem af familien Siglecs, der har begrænset udtryk på B-celler og en molekylær køreplan for udviklingen af nye CD22 målrettet små molekyle og antistof-baseret Therapeutics. Mens denne protokol blev brugt med succes til en Ig-holdige B-celle receptoren, foreslår vi, at vores tilgang kan anvendes for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af enhver membran glycoprotein med et særskilt domæne organisation. I sådanne tilfælde, konstruere design og kombinatorisk N-linked glycan mutationer (enten til Localisation eller Ala) kan evalueres for at finde en konstruktion velegnet til crystal vækst og høj opløsning diffraktion.
At opnå en homogen og ren glycoprotein prøve er af kritisk betydning for crystal vækst og røntgen diffraktion samt for downstream biofysiske karakterisering. N-knyttet glycans til stede på glykoproteiner er i sagens natur heterogen, og kan forårsage konformationelle og kemiske forskelle inden for den glykoprotein, der kan afskrække krystal formation. For at reducere denne mikro-heterogenitet, kan strategier, der indfører punktmutationer for at fjerne Asn rester forudsagt for at havnen N-knyttet glycans, eller ved hjælp af mutant cellelinjer (f.eks HEK293S) efterfulgt af behandling med endoglycosidases (såsom EndoH) betydeligt forbedre krystallisering succes15,21,22. I denne protokol diskutere vi rensning af opløselige glykoproteiner og funktionelle luftrumsblokke, der er udskilt i cellen supernatanten. Glycoprotein sekretion giver en relativt simpel rute mod renhed, uden behov for celle lysis eller tilsætning af barske kemikalier eller rengøringsmidler. Den celle supernatanten, indhenter følgende celle høst er derefter køre direkte over en kolonne, der har affinitet for protein af interesse (f.eks. Ni-NTA for hans markeret glykoproteiner eller LC affinitet for Fab fragmenter). Dog afhængig af kolonnen i brug og betingelserne i cellen supernatanten (fx pH), kan den bindende evne til protein af interesse for kolonnen blive påvirket. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at koncentrere sig og buffer exchange cellen supernatanten for at forbedre binding til kolonnen. Derudover anbefales det, at kvalitetskontrollen trin under rensningen være ansat til at hjælpe med at vurdere protein renhed. Kører en SDS-PAGE gel eller vestlige skamplet af alle prøver (før, under og efter rensning trin) kan give indsigt i hvorvidt den foreslåede rensning ordning er velegnet til protein af interesse. Hvis kontaminerende bands er synlige på SDS-PAGE, eller hvis flere arter er opnået under rensning (f.eks. flere toppe på størrelse udelukkelse), yderligere rensning foranstaltninger bør overvejes, fx ionbytning kromatografi, at få i renhed og øge chancerne for downstream krystallisering80.
For makromolekylære krystallisering er det ofte afgørende for at opnå høje udbytter af protein af interesse at tillade screening af et stort antal potentielle krystallisering betingelser ved høje protein koncentrationer at finde egnet krystal hits. Generelt, de HEK293 cellelinjer drøftet her (HEK293F og HEK293S) er robust udtryk systemer, og let kan skaleres til at producere mere prøve efter behov. Det er imidlertid muligt, at protein af interesse ikke kan udtrykke tilstrækkeligt inden for disse cellelinjer. I disse tilfælde, andre cellelinjer, såsom Expi293 celler81,82, er blevet fundet for at vise overlegne niveau af protein udtryk og bør betragtes som et alternativ.
Hvis velordnet, diffracting krystaller ikke er fremstillet efter afprøvning af flere konstruktioner af protein om interesse trods høj renhed, kan det være nødvendigt at udvide krystallisering teknikker for at fremme krystal formation. Det har vist sig at Fab fragmenter af antistoffer og nanobodies kan være fremragende krystallisering smagsforstærkere, og fremme velordnet krystal pakning83,84,85. Disse fragmenter kan udtrykt og renset til homogenitet og anvendes i et kompleks med protein af interesse for at fremme krystallisering. Vigtigere, kan Fab fragmenter produceret som beskrevet i afsnit 10 have en tendens til at danne ikke-funktionelle LC dimerer86. Disse dimerer er forurenende stoffer og bør fjernes under rensningen. Vores erfaring, LC dimerer ofte har en anden opbevaring volumen på størrelse udstødelse, eller elueres som en særskilt peak på ionbytning kromatografi, og dermed kan blive fjernet fra Fab rensning – men det ikke er altid tilfældet. Hvis disse teknikker er utilstrækkelige til at fjerne LC dimerer fra Fab rensning, kan yderligere rensning metoder, såsom Protein G affinitet rensning, anvendes til at forbedre renhed.
Alternativ til co-kompleks med Fab fragmenter, veldokumenterede teknikker såsom random matrix microseeding kan forbedre chancerne for at få ordnet krystaller63,70. Denne metode omfatter tilføjelse af små mængder af knust, suboptimal krystaller i den krystallisering tilstand, giver en krystal nucleate at fremme crystal vækst. Dette kan udføres ved hjælp af krystaller af protein af interesse, eller dem med lignende domæne arkitektur og tertiære struktur. Derudover kan random matrix microseeding udføres i forsøg på at krystallisere protein alene eller i kompleks med en Fab fragmentet eller lille molekyle af interesse. De seneste fremskridt i kryo-elektronmikroskopi også gøre denne teknik et attraktivt alternativ til røntgenkrystallografi for at opnå høj opløsning strukturelle oplysninger for molekyler med passende funktioner87,88, 89,90,91.
Når udfasning af røntgen diffraktion datasæt mislykkes ved hr., kan HA iblødsætning være nødvendigt at løse fase af unormale spredning eller isomorphous udskiftning. Inspektion af aminosyresekvens af protein kan give et fingerpeg om strategien for HA forædling, herunder optimale pH for bindende. Uparret cysteines inden for proteinet kan navnlig specifikt binde HA forbindelser, der indeholder kviksølv. Iblødsætning indfødte krystaller med HA forbindelser er en iterativ proces til at bestemme identiteten af den optimale HA sammensatte, sin koncentration og den krævede inkubationstiden. Hvis første iblødsætning forsøg ikke give godt diffracting krystaller indeholdende en HA egnet til udfasning, kan det være nødvendigt at indføre aminosyre udskiftninger for at forbedre sandsynligheden for HA bindende og forbedre unormal signal. Eksempler kan nævnes mutationer for at medtage en gratis cystein rest effektivt binder Hg, Au, Pt eller Pb. angivelse af proteiner for anomale indfasningen seleno-methionin suppleret medier i E. coli er flittigt brugt til anormale afvikling, men en tilsvarende system, der pålideligt inkorporerer seleno-methionin er ikke let tilgængelige for mammale celler i suspension92,93, og er et område af fremtidige udvikling.
Når unliganded strukturen af glycoprotein af interesse er opnået, kan iblødsætning krystaller med lille molekyle ligander udføres for at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks. Disse data giver en blueprint for den rationelt design af mere specifikke og høj-affinitet ligander, der kan bruges som små-molekyle therapeutics samt giver høj opløsning indsigt i den biologiske funktion af glycoprotein. Når du forsøger at suge glycoprotein krystaller med lille molekyle ligander af interesse, kan inspektion af unliganded krystalstruktur indikere om iblødsætning skal være muligt. Hvis tæt krystal-pakning kontakter er fundet omkring den liganden bindingssted eller omkring regioner forventes at gennemgå konformationelle ændringer på ligand bindende, iblødsætning vil sandsynligvis være problematisk. I dette tilfælde skal andre metoder såsom Co krystallisering af protein-ligand komplekset udføres.
The authors have nothing to disclose.
Røntgen diffraktion eksperimenter beskrevet i denne hvidbog blev udført ved hjælp af beamlines, 08-ID og 08-BM på den canadiske lyskilde, som støttes af Canada Foundation for Innovation, naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, den Universitetet i Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, vestlige økonomiske diversificering Canada, Canadas National Research Rådets og de canadiske institutter for sundhedsforskning. Vi vil gerne anerkende den strukturelle & biofysiske Core facilitet, Hospital for syge børn, for adgang til instrumenterne, ITC og BLI. J.E.O. blev støttet af Banting postdoc stipendium BPF-144483 fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. T.S. er en modtager af en Canada Graduate stipendium Master’s Award og en Vanier Canada Graduate stipendium fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Dette arbejde blev støttet af opererer grant PJT-148811 (J.-P.J.) fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Denne forskning blev gennemført, til dels takket være støtte fra Canada forskning stole program (J.-P.J.).
0.22 μm Steritop filter | EMD Millipore | SCGPS02RE | |
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel | Bio-Rad | 4561084 | |
10x glycobuffer 3 | New England Biolabs | P0702S | Comes with Endo H reagent |
10x Kinetics Buffer | PALL FortéBio | 18-1092 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
1 mL round bottom 96 well block | ThermoFisher | 260251 | |
22 mm cover slip | Hampton research | HR3-231 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
96-3 well INTELLIPLATE low volume reservior | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | ||
ÄKTA Start | GE Healthcare | ||
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC901008 | |
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC801008 | |
Auto-iTC200 | Malvern | ||
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes | Fisher Scientific | MCT150C | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm | Hampton research | HR4-945 | |
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm | Hampton research | HR4-947 | |
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm | Hampton research | HR4-970 | |
Digital Dry Bath | Bio-Rad | 1660562EDU | |
E. coli DH5α | Invitrogen | 18258012 | |
Endo H | New England Biolabs | P0702S | |
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP | TriForest Labware | FBC05000S | |
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap | VWR | 89095-258 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL | Greiner Bio-One | 607180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL | Greiner Bio-One | 760180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL | Greiner Bio-One | 606180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL | Greiner Bio-One | 768180 | |
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus | VWR | 10118-842 | |
Freestyle 293F cells | Thermo Fisher Scientific | R79007 | |
Freestyle Expression medium | Thermo Fisher Scientific | 12338001 | |
Heavy Atom Screens Au | Hampton research | HR2-444 | |
Heavy Atom Screens Hg | Hampton research | HR2-446 | |
Heavy Atom Screens M1 | Hampton research | HR2-448 | |
Heavy Atom Screens M2 | Hampton research | HR2-450 | |
Heavy Atom Screens Pt | Hampton research | HR2-442 | |
HEK 293S | ATCC | ATCC CRL-3022 | |
HisTrap Affinity Column | GE Healthcare | 17525501 | |
HiTrap KappaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17545811 | |
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17548211 | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-1 | |
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-2 | |
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-3 | |
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-4 | |
Mercuric chloride | Sigma | 1044170100 | |
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black | Greiner Bio-One | 655209 | |
Minstrel DT UV | Formulatrix | ||
Multitron Pro shaker | Infors HT | MP25-TA-CO2HB | |
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nanosep 3K Omega centrifugal device | PALL Life Science | OD003C33 | |
Ni-NTA biosensors | PALL FortéBio | 18-5102 | |
Octet RED96 | PALL ForteBio | ||
Oryx 4 crystallizaiton robot | Douglas Instrument | ORY-4/1 | |
Platinum chloride | Sigma | 520632-1g | |
Precision Plus Protein Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
Quick Coomassie Stain | Protein Ark | GEN-QC-STAIN-1L | |
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express | EMD Millipore | SCGP00525 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17517201 | |
Tantalum bromide cluster | Jena bioscience | PK-103 | |
Top96 Crystallization Screen | Rigaku Reagents | 1009846 | |
Tryphan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
VDX 24-well with sealant | Hampton research | HR3-172 | |
α2-6 sialyllactose | Sigma Aldrich | A8556-1mg |