Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Benaderingen voor de biofysische en structurele karakterisatie van glycoproteïnen presenteren wij met de immunoglobuline vouw door biolayer interferometrie, isothermische titratie calorimetrie en röntgendiffractie.

Abstract

Glycoproteïnen op het oppervlak van cellen spelen een kritieke rol in cellulaire functie, met inbegrip van signalering, hechting en vervoer. Op leukocyten, verscheidene van deze glycoproteïnen bezitten immunoglobulin (Ig) plooien en staan centraal in de immuun erkenning en verordening. Hier presenteren we een platform voor het ontwerp, de expressie en de biofysische karakterisering van de extracellulaire domein van menselijke B-cel receptor CD22. Wij stellen voor dat deze benaderingen gelden in grote lijnen voor de karakterisatie van zoogdieren glycoproteïne ectodomains met Ig domeinen. Twee schorsing menselijke embryonale nier (HEK) cellijnen, HEK293F en HEK293S, worden gebruikt om uit te drukken glycoproteïnen herbergen van complexe en high-mannose glycanen, respectievelijk. Deze recombinante glycoproteïnen met verschillende glycoforms laten onderzoeken van het effect van glycan grootte en samenstelling op ligand binding. We bespreken de protocollen voor het bestuderen van de kinetiek en thermodynamica van glycoproteïne binding aan biologisch relevante liganden en therapeutisch antilichaam kandidaten. Recombinante glycoproteïnen geproduceerd in de HEK293S cellen zijn vatbaar voor kristallisatie te wijten aan glycan homogeniteit, verminderde flexibiliteit en gevoeligheid voor endoglycosidase H behandeling. We presenteren de methoden voor het inweken van glycoproteïne kristallen met zware atomen en kleine moleculen voor fase bepaling en analyse van ligand bindende, respectievelijk. De experimentele protocollen besproken houdt hier belofte voor de karakterisatie van zoogdieren glycoproteïnen inzicht geven in hun functie te onderzoeken van het werkingsmechanisme van therapeutics.

Introduction

Oppervlakte eiwitten spelen een kritieke rol in de cellulaire functie. Door hun extracellulaire domeinen, kunnen deze membraaneiwitten moduleren cel interacties, hechting, vervoer en signalering van1,2. De extracellulaire lokalisatie van deze proteïnen maakt hen aantrekkelijk doelstellingen voor de ontwikkeling van therapieën voor de behandeling van een breed scala aan ziekten, waaronder kanker en auto-immune ziekten3,4,5 , 6 , 7. een van de meest voorkomende plooien van menselijke membraan eiwit ectodomains is de immunoglobuline-achtig (Ig) vouw, die wordt gevormd door zeven of meer β-strengen gerangschikt in twee β-sheets8,9. Ig-bevattende glycoproteïnen zijn meestal meerdere domeinstructuren met Ig domeinen sequentieel zijn gerangschikt op het extracellulaire gedeelte van het membraan eiwit10. Posttranslationele modificaties van deze cel-oppervlakte-proteïnen, met name N - en O-gebonden glycosylatie, hebben aangetoond dat het spelen een essentiële rol in hun verordening, vouwen, secretie en functie11. Ter verbetering van ons begrip van hun functie en beter ontwerp therapeutics die hen kan richten, technieken vereist zijn waarmee voor hun gedetailleerde moleculaire karakterisering. Hier presenteren we een combinatie van technieken die het mogelijk voor de biofysische maken (biolayer interferometrie (BLI) en isothermische titratie calorimetrie (ITC)) en structuur (röntgendiffractie) karakterisering van het extracellulaire domein van de Ig-bevattende membraan glycoproteïnen, alleen en in complex met hun biologisch relevante liganden en therapeutische moleculen (Figuur 1).

N-gebonden glycosylatie is één van de meest voorkomende wijzigingen na vertaling op eiwitten van zoogdieren, en treedt op tijdens de rijping van de eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en het Golgi12,13. Cellijnen, zoals menselijke embryonale nier (HEK) 293 cellen, zijn ontwikkeld voor de recombinante expressie van grote hoeveelheden geglycosyleerde zoogdieren eiwitten14,15. Deze cellijn is ontwikkeld in een indeling van de schorsing, die het mogelijk voor het gemak maakt van schaalvergroting van de productie van eiwitten om grotere hoeveelheden in vergelijking met aanhangend cellijnen. Hier, gebruiken we twee HEK293 cellijnen: HEK293F en HEK293 Gnt ik- / - (HEK293S), die onderling verschillen door het ontbreken van N-acetylglucosaminyl transferase ik (Gnt ik) in het laatste. Op zijn beurt, productie van complexe glycanen (zoals gezien in HEK293F) is niet mogelijk, en in plaats daarvan hoge mannose-type glycanen (overwegend Man5GlcNAc2) bevinden zich glycan N-linked sites18,19,20 . Met behulp van deze twee cellijnen parallel kunt bestuderen van het effect van glycan grootte en ingewikkeldheid op biologische functie en therapeutische targeting. Inderdaad, glycoproteïnen geproduceerd in HEK293F cellen zal hebben grotere, complexere glycanen ten opzichte van de dezelfde glycoproteïne dat wordt geproduceerd in de HEK293S cellen. Glycoproteïnen geproduceerd in de HEK293S cellen zijn meer vatbaar voor kristallisatie, vanwege de verminderde chemische en conformationele heterogeniteit van hun N-gebonden glycanen. Om het crystallizability verder te verbeteren, glycoproteïnen in HEK293S (maar niet HEK293F) cellen geproduceerd kunnen worden behandeld met het enzym endoglycosidase H (Endo-H), wat in de splitsing van hoge mannose glycanen zodanig resulteert dat slechts een enkele N-acetylglucosamine (GlcNAc) deel daarvan blijft op elke N-gebonden glycosylatie site21,22. Andere methoden kunnen ook worden gebruikt om te beperken van N-glycan verwerking binnen de cellen, zoals de toevoeging van glycosyltransferase remmers tijdens glycoproteïne expressie, met inbegrip van kifunensine23. Alternatieve benaderingen omvatten de expressie van inheemse glycoproteïnen (in HEK293F cellen), gevolgd door enzymatische deglycosylation met behulp van peptide N-glycosidase F (PNGaseF). Echter de deglycosylation met PNGaseF is aangetoond dat minder effectief onder inheemse voorwaarden en verhogingen aggregatie in sommige eiwitten; in gevallen wanneer het eiwit oplosbaar na de behandeling blijft, verwerft het negatieve ladingen op het oppervlak als gevolg van de deamidation van het residu asparagine asparaginezuur24, die misschien wel schadelijk voor de kristallisatie. Voorspelde N-glycosylation sites kunnen ook worden gemuteerd, meestal voor alanine of glutamine residuen, ter voorkoming van N-gebonden glycosylatie op deze sites en voor het genereren van glycoproteïne monsters van het hoge homogeniteit. U kunt ook kunnen glycoproteïnen worden geproduceerd in andere eukaryotische cel-culturen, met inbegrip van gist, insect, en plant systemen of andere zoogdieren cellijnen zoals Chinese hamster ovariële (CHO) cellen16,17.

Veel zoogdieren expressievectoren, met inbegrip van pHLsec, zorgen voor de afscheiding van recombinante glycoproteïne ectodomains in de cel middellange25. Secretie van glycoproteïnen van HEK293 cellen zorgt voor snelle en gemakkelijke reiniging zonder de noodzaak voor lysis van de cel. Toevoeging van zuivering tags (bijvoorbeeld zijn-tag, Strep-tag, vlag-tag, Myc-tag, HA-tag) aan de N- of C-terminus van het doel kunt glycoproteïne zuivering door een-voor-stapmodus affiniteitchromatografie. Vervolgens kan grootte uitsluiting chromatografie worden gebruikt om de opbrengst van een monodispers monster voor biofysische en structurele karakterisering.

Een zeer zuivere en homogene glycoproteïne steekproef onder passende omstandigheden kan leiden tot goed diffracting kristallen. Zodra een volledige röntgendiffractie dataset is verkregen van dergelijke kristallen, moeten eerste fasen worden vastgesteld voor de berekening van de dichtheid van de elektronen van de glycoproteïne. Dankzij een steeds groeiend aantal structuren in de Protein Data Bank (PDB), is de meest gebruikte methode voor geleidelijke veruit moleculaire vervanging (MR), die gebruik maakt van een verwante eiwitstructuur te verkrijgen van de eerste fasen26geworden. Wanneer MIJNHEER niet oplossen van het probleem van de fase, zoals af en toe het geval is voor multi-Ig domein glycoproteïnen27,28,29, zijn alternatieve methoden echter vereist. In dit artikel detailleren wij een methode kristallen met zware atomen (HA) weken afbouwen, die nodig was voor het oplossen van de structuur van de CD22 ectodomain28. Het identificeren van het recht HA voor geleidelijke afschaffing is een iteratief proces dat afhangt van de HA reactiviteit, beschikbaar atomen in de glycoproteïne in een bepaalde kristalrooster en de kristallisatie oplossing30,31. Als alternatief, natuurlijke zwavel atomen in cysteïne en methionine residuen kunnen worden gebruikt voor de geleidelijke als aanwezig zijn bij een hoog genoeg verhouding aan andere atomen in de glycoproteïne en röntgendiffractie gegevens kunnen worden verzameld met hoog genoeg redundantie32, 33.

De biologische functie van membraan glycoproteïnen is vaak gemedieerd door eiwit-eiwitinteractie of eiwit-ligand interacties, zoals met koolhydraten. Als het ligand klein genoeg om te verspreiden van de oplossing naar de site van de bindende glycoproteïne in het kristalrooster is, kan inweken experimenten succesvol te verkrijgen van een glycoproteïne-ligand co kristalstructuur ligand erkenning beter te begrijpen zijn.

De protocollen die hier gepresenteerd zijn ook relevant voor het begrijpen van de interacties van oppervlakte glycoproteïnen met synthetische therapeutische liganden34,35 en antilichaam therapeutics36,37. Wanneer gecombineerd met structurele informatie, kunnen bindende kinetiek en thermodynamica krachtige te begrijpen en verbeteren van hun mechanismen van actie. Een techniek die het mogelijk maakt voor de kinetische analyse van therapeutische antistoffen binden aan een glycoproteïne is BLI38,39. BLI maakt gebruik van biosensoren met een geïmmobiliseerdet ligand voor het meten van de associatie en dissociatie kinetiek met een bindende partner, uiteindelijk het bepalen van een dissociatie evenwichtsconstante (KD). BLI is een aantrekkelijke aanpak omdat kleine hoeveelheden glycoproteïnen vereist zijn (< 100 µg), experiment tijd is snel (~ 10-15 min per run), en het kan worden geautomatiseerd. ITC is ook handig voor het bestuderen van verwantschappen tussen glycoproteïnen en bindende partners40,41,42,43. Terwijl ITC meer tijd en reagens intensieve is, kan waardevolle informatie worden verkregen met betrekking tot de thermodynamica van de interactie (ΔG, ΔH, ΔS en stoichiometrie). ITC is ook zeer nuttig zijn voor zwakke interacties die vaak geassocieerd met de voorbijgaande binding van oppervlakte glycoproteïnen aan liganden worden studeren. Bovendien kunnen deze technieken worden gebruikt in combinatie om te evalueren van de binding van verschillende constructies en beoordelen van het effect van verschillende N-linked glycoforms verkregen uit te drukken de glycoproteïne in verschillende cellijnen. Uitvoeren van BLI en ITC met glycoproteïnen geproduceerd in HEK293F, HEK293S en behandeld met Endo H bieden een diepgaande blik op de rol van glycanen in biologische activiteit en therapeutische betrokkenheid.

Wij met succes toegepast deze protocollen karakteriseren het extracellulaire domein (ECD) van menselijke CD2228, een glycoproteïne-lid van de sialic-zuur-bindende Ig-achtige lectines (Siglecs) familie die is essentieel voor het behoud van de B-cel homeostase44 . Wij uitgevoerd diepgaande construct ontwerp om kristallisatie en geleidelijk de X-ray dataset door HA inweken met Hg. Wij ook geweekte CD22 kristallen met haar ligand sialic zuur (alpha2-6 sialyllactose) te verkrijgen van een structuur van het immuun receptor-ligand-complex en aldus vastgestelde de blauwdrukken voor het structuur-geleide ontwerp van glycan mimetics45,46. Bovendien, we genereerden de fragment antigeen bindende (Fab) van de anti-CD22 therapeutisch antilichaam epratuzumab - een therapeutische kandidaat momenteel in fase III klinische proeven voor non-Hodgkin lymfoom47- om te bepalen zijn bindende affiniteit door BLI en ITC aan differentieel geglycosyleerde CD22 ECD construeert. Deze studies bleek een cruciale rol voor N-gebonden glycosylatie in de betrokkenheid van de epratuzumab, met mogelijke gevolgen voor de CD22 erkenning op disfunctionele B cellen.

Protocol

1. constructie ontwerp voor glycoproteïne ECD

  1. Evalueren van het aminozuur opeenvolging van menselijke CD22 (Uniprot) met behulp van de InterPro en Phyre2-servers te identificeren voorspelde domein elementen en grenzen gelegen binnen de eiwit48,49.
  2. De volgorde van de menselijke CD22, ontbreekt de signaal-peptide, transmembraan en cytosolische domeinen (residuen 20-687, hierna CD22 extracellulaire domein, CD22 ECD) in de pHLsec zoogdieren expressie vector25 met behulp van restrictie-enzymen AgeI en KpnI (kloon Figuur 2 A) 50.
    Opmerking: De pHLsec-vector is geoptimaliseerd voor de overexpressie van oplosbare, secreted proteïnen in zoogdiercellen25. Deze vector bevat een signaal van de afscheiding te voorzien in de extracellulaire secretie van oplosbare glycoproteïnen. pHLsec bevat een tag6 x C-terminal (zijn) zodanig affiniteit zuivering van cel supernatant geïmmobiliseerdet metal affinity chromatografie referentiemethoden.
  3. Clone afgeknotte constructies van CD22 ECD met sequentiële verwijderingen van de domeinen van C-terminal Ig: domeinen 1-6 (residuen 20-687), domeinen 1-5 (residuen 20-592), 1-4 (residuen 20-504) domeinen en domeinen 1-3 (20-330 residuen) (cijfers 2B en 2 C)50 .
  4. Evalueren van de primaire volgorde van CD22 ECD met behulp van de NetNGlyc-server te identificeren voorspelde N-gebonden glycosylatie plaatsen huidig in de constructie-51.
  5. Met behulp van plaats-geleide mutagenese, door standaardprotocollen52 of overlappende PCR53, muteren elke voorspelde N-gebonden glycosylatie site (Asn aan Gln en/of Asn aan Ala) als u wilt maken van constructies van CD22 ECD die één of meerdere bevatten N-gebonden glycosylatie mutaties.
  6. Na verificatie van de opeenvolging van gekloonde constructies, transformeren in bevoegde E. coli DH5α cellen54 en maxi-prep het DNA (volgens de aanwijzingen van de fabrikant) om voor te bereiden voor Transfectie.

2. HEK293F en HEK293S celinstelling

Opmerking: Alle manipulatie van HEK293F of HEK293S cellen met de nodige reagentia en apparatuur moet worden uitgevoerd in een bioveiligheid niveau 2 faciliteit in een geschikte bioveiligheid kabinet. Het buitenoppervlak van alle items moet worden gesteriliseerd met een 70% ethanol oplossing of gelijkwaardig reagens.

  1. Verkrijgen van HEK293F en HEK293S schorsing cellen (Zie Tabel van materialen) en opslaan bij-80 ° C tot klaar voor gebruik.
  2. Warme media (Zie Tabel van materialen) gedurende 1 uur in een waterbad 37 ° C. Breng 24 mL van verwarmde media een kolf 125 mL verbijsterd cel cultuur, met een geventileerde cap.
  3. 1 mL cel aliquoot verkrijgen bij-80 ° C en transfer naar het ijs.
  4. Incubeer de cellen in een waterbad 37 ° C gedurende ongeveer 1 min., om gedeeltelijk het ontdooien van de cellen. 1 mL van de cellen van de flacon overbrengen naar de kolf met verbijsterd cel cultuur van 125 mL is die het medium bevat.
  5. Sluit de cel cultuur kolf met de geventileerde dop en plaats de kolf in een shaker ingesteld op 37 ° C, 130 rpm, luchtvochtigheid van 70% en 8% CO2.

3. HEK293 Cel onderhoud

Opmerking: Celdichtheid en levensvatbaarheid van cellen moet gecontroleerd ongeveer 24 uur na het ontdooien. Deze stap zorgt u ervoor dat de cellen na inoculatie terugzet; eerste levensvatbaarheid moet > 80%.

  1. Zorgvuldig 10 µL van cellen uit de 125 mL-kolf met het verse schorsing cellen verwijderen en breng dit in een steriele 1,5 mL microtube. Sluit de kolf en terug te sturen naar de incubator.
  2. Pipetteer 10 µL van Trypan blauwe oplossing in de 1,5 mL microtube met de cellen en meng 10 µL overbrengen in de kamer van de tellen dia.
  3. Zet de tellen dia in een cel van de automatische teller en waarden voor celdichtheid (in eenheden van cellen mL-1) en de levensvatbaarheid van de cellen (in procenten).
  4. Bereken het volume van cellen die nodig zou zijn om te enten een verse 200 mL cultuur op een definitieve dichtheid van ~0.8 x 106 cellen mL-1 met behulp van de volgende vergelijkingen:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
    Opmerking: Het kan duren ~ 5 d te verkrijgen van een geschikt celdichtheid voor inoculatie in een cultuur van 200 mL.
  5. Zodra de celdichtheid voor inoculatie van een cultuur van 200 mL volstaat, warming-up media gedurende 1 uur in een 37 ° C water bad en breng de verwarmde media in het biosafety kabinet.
  6. Met behulp van een serologische precisiepipet, zorgvuldig overbrengen van het vereiste volume van media (zoals berekend in vergelijking 2) in een maatkolf van 500 mL verbijsterd cel cultuur met een geventileerde cap.
  7. Met behulp van een serologische precisiepipet, Pipetteer het vereiste volume van schorsing cellen (berekend in vergelijking 1) in de kolf met verbijsterd cel cultuur van 500 mL is die het medium bevat.
  8. Cap de nieuw 200 mL onderhoud materieel en terug te sturen naar de incubator. Het groeien van cellen met een dichtheid van ongeveer 3 x 106 cellen mL-1. Passage cellen bij een dichtheid van 0.8 x 106 cellen mL-1 elke 2-3-d te handhaven van een stabiel cultuur van cellen (zoals beschreven in sectie 3.4-3.7). Laat niet de cellen maximaal een bevolkingsdichtheid van ~ 4 x 106 cellen mL-1.

4. de transfectie van HEK293 cellen voor glycoproteïne expressie

  1. Berekenen van het volume van cellen en media die nodig is voor een cultuur van 200 mL voor Transfectie op 0,8 x 10 cellen6 mL-1 (met behulp van de vergelijkingen 1 en 2 van punt 3.4).
    Opmerking: Het aantal 200 mL-transfections die kunnen worden uitgevoerd afhankelijk van de celdichtheid van het onderhoud materieel.
  2. Breng de vereiste hoeveelheid media en cellen voor Transfectie in een nieuwe maatkolf van het cultuur van de cel van de 500 mL met een geventileerde cap en de voorraad van de cel terug te keren naar de incubator.
  3. Incubeer de cellen gedurende 1 uur vóór de Transfectie aan de cellen om te acclimatiseren na splitsing toestaan.
  4. Breng 50 µg van DNA in een steriele 50 mL conische buis en Verdun met 5 mL van de media. Vacuüm filteren het verdunde DNA met behulp van een 0,22 µm filtratie-systeem in een andere steriele buis.
  5. Mix verdund, DNA in een verhouding van 1:1 massa: volume met transfectiereagens gefilterd. Zachtjes swirl de DNA: transfectie reagens oplossing om te mengen en de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten uit te broeden.
  6. DNA: transfectie reagens oplossing rechtstreeks toevoegen aan de cellen. Incubeer transfected cellen bij 37 ° C, 130 rpm, luchtvochtigheid van 70% en 8% CO2 in een shaker voor 5-7 d.

5. optimalisatie van cel transfectie voorwaarden

Opmerking: Om te optimaliseren cel transfectie voorwaarden voor maximale glycoproteïne opbrengst, transfect cellen over een verscheidenheid van eerste cel dichtheden en beoordelen van eiwit opbrengst na verloop van tijd (Figuur 3A). Transfect cellen zoals beschreven in sectie 4,6 tot en met 2 x 106 cellen op de eerste cel dichtheden variërend van 0,5 x 10 mL-1 55. Proef transfections kunnen worden verkleind tot 25 mL totaalvolume (in 125 mL verbijsterd cel cultuur kolf) met 6 µg van DNA om ruimte en reagentia te besparen. Ook kan de hoeveelheid DNA geoptimaliseerde55.

  1. Elke dag na transfectie (dagen 1-7), Pipetteer een aliquoot deel van 500 µL van de cultuur van de cel in een steriele 1,5 mL microtube (in het kabinet van bioveiligheid).
  2. Spin aliquoted cellen bij 12.000 x g gedurende 5 minuten in een microcentrifuge onmiddellijk na het verzamelen. Overdracht van supernatant een nieuwe 1,5 mL microtube en bewaren bij 4 ° C totdat alle monsters worden verkregen.
  3. Kwantificeren van secreted glycoproteïne door densitometrie
    1. Zodra alle monsters worden verkregen, aliquoot 20 µL van elk monster in een nieuwe 1,5 mL microtube en meng met 6 µL van niet-reducerende 4 x Laemmli monster buffer.
    2. Kook de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een thermo-blok. Spin monsters voor 1 min op 12.000 x g in een microcentrifuge.
    3. Laden 20 µL van elk monster per putje in een 10-well 4-15% kleurovergang SDS-pagina gel. Omvatten een rijstrook voor eiwit grootte markeringen. Stel gel bij 250 V voor 20 min in een buffer Tris/Glycine/SDS.
    4. Na de voltooiing van het uitvoeren, overbrengen gel Coomassie vlek (Zie Tabel of Materials) voor 20 min.-vlek gel in ddH2O voor 20 min. afbeelding gel.
    5. Densitometrie met ImageJ, na standaardprotocollen57,58uitvoeren
    6. Compileren en gegevens met 'dagen na transfectie' uitgezet op de x-as en 'densitometrie waarden' op de y-as (Figuur 3A).
      Opmerking: U kunt ook als eiwit expressie onvoldoende voor visualisatie door SDS-PAGE is, technieken zoals het westelijke bevlekken mogelijk gebruikte56.
  4. Kwantificeren van secreted glycoproteïne door BLI
    1. Met behulp van Ni-NTA biosensoren, kwantificeren de hoeveelheid secreted glycoproteïne met behulp van BLI59.
    2. Compileren en gegevens met 'dagen na transfectie' uitgezet op de x-as en 'eiwitconcentratie (µg/mL)' op de y-as (Figuur 3A).

6. zuivering van oplosbare glycoproteïne van Supernatant van HEK293

  1. Oogsten van cellen door centrifugeren bij 6,371 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. Behouden van de bovendrijvende substantie met secreted CD22 ECD en filteren met behulp van een 0,22 µm filter.
  2. Laden van supernatant bij 4 mL min-1 op een vooraf geëquilibreerd (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol) Ni-NTA kolom (5 mL volume) met behulp van een benchtop chromatografie systeem.
    Opmerking: Andere zuivering affiniteit gebaseerde technieken kunnen worden gebruikt, op basis van de affiniteit codes in constructie ontwerp in deel 1 opgenomen.
  3. Na bezinken laden, was de affiniteit kolom met 3-4 kolom hoeveelheid (CV) was buffer (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol).
  4. Elueer gezuiverde glycoproteïne uit de kolom met behulp van een helling van 4-100% (4 CVs) van elutie buffer (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol) terwijl het verzamelen van breuken (Figuur 3B).
  5. Zwembad breuken met de eluted piek in een centrifugaal filtratie apparaat met een 10 kDa nominale moleculair gewichtslimiet (NMWL) en concentraat door centrifugatie bij 4000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten of totdat het monster een volume van 500 µL tot.
  6. Geconcentreerde glycoproteïne injecteren met een 500 µL monster loop en de belasting op 0,5 mL min-1 op een vooraf equilibrated (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl) krachtige grootte uitsluiting kolom (ongeveer 24 mL volume) op een snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC) systeem bij 4 ° C terwijl het verzamelen van breuken (Figuur 3C).
  7. Uitvoeren van SDS-pagina gel van geëlueerd breuken breuken met de glycoproteïne identificeren en bundelen van overeenkomstige breuken. De SDS-pagina gel kan worden uitgevoerd zoals beschreven in sectie 560.

7. Deglycosylation van gezuiverde glycoproteïne

  1. Meten van de concentratie van gezuiverde eiwit na grootte uitsluiting chromatografie met behulp van de extinctie op 280 nm gedeeld door het uitsterven coëfficiënt (bijvoorbeeld 1.418 M-1 cm-1 voor CD22 ECD).
    Opmerking: De coëfficiënt van de theoretische uitsterven van proteïnen van belang kan worden berekend met behulp van servers zoals ExPASy ProtParam61.
  2. Incubeer gezuiverde eiwit met Endo H gedurende 1 uur bij 37 ° C, bij een verhouding van 1 mg van gezuiverde eiwit met 10 µL van commerciële enzym in 1 X Endo H buffer (volgens de aanwijzingen van de fabrikant).
    Opmerking: Endo H cleaves hoge mannose glycanen geproduceerd in HEK293S waardoor een enkele GlcNAc-groep op elke glycosylation site21. Endo H doet niet klieven van glycanen op eiwitten geproduceerd in de HEK293F cellen22, maar andere enzymen kunnen worden gebruikt voor dit doel (b.v.,PNGaseF24).
  3. Deglycosylated ECD tot 500 µL concentreren en gel filtratie chromatografie draaien op een krachtige uitsluiting kolom grootte (ongeveer 24 mL volume) op 0,5 mL min-1 op een FPLC te verwijderen van Endo H en scheiden van elke resulterende aggregaten.
  4. Het deglycosylated eiwit bij 4 ° C bewaren tot gebruik in downstream experimenten.

8. de kristallisatie van glycoproteïnen

Opmerking: Uitvoeren van kristallisatie proeven met behulp van commercieel verkrijgbare schermen en opgezet zitten drop experimenten met behulp van een robot kristallisatie.

  1. Concentraat zuiver, deglycosylated ECD naar 10 mg mL-1 met behulp van een centrifugaal filtratie apparaat met 10 kDa NMWL 4000 x g (4 ° C) tot de gewenste concentratie wordt verkregen.
  2. De eiwitconcentratie bepalen met behulp van extinctie op 280 nm en te delen door de coëfficiënt van uitsterven.
  3. Centrifuge monster bij 12.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C vóór kristallisatie proeven te verwijderen van ongewenste stof of andere verontreinigingen uit monster.
  4. Vul het reservoir putjes van 96-Wells vergadering kristallisatie platen met 80 µL van kristallisatie oplossing uit een commerciële kristallisatie scherm neerzetten.
    Opmerking: We gebruiken sparse-matrix commerciële schermen die zijn ontworpen op basis van de meest succesvolle kristallisatie voorwaarden met betrekking tot de structuren die zijn neergelegd in het voorontwerp van begroting.
  5. Met behulp van een robot kristallisatie, afzien druppels in het putje van de plaat kristallisatie met een daling van het totale volume van 200 nL bij een verhouding van gezuiverde eiwit: kristallisatie oplossing van 1:1.
  6. Zodra de gehele plaat heeft zijn afgeleverd, verzegelen de plaat met tape en plaats in een plaat imager voor inspectie door zichtbaar en ultraviolet licht.
  7. Inspecteer kristallisatie platen onmiddellijk na de installatie, en in de volgende weken, gebruik van zowel zichtbare als ultraviolet licht vast te stellen voorwaarden, zodat de eerste glycoproteïne crystal hits.
  8. Kristallen verkregen oorspronkelijke kristallisatie hits met behulp van mooie schermen op basis van de toestand van de crystal hit of willekeurige matrix micro-zaaien methoden62,63,,64,,65verder te optimaliseren.
  9. Cryo-beschermen alle kristallen ontbreekt voldoende cryo-protectant binnen de kristallisatie voorwaarde door het kristal onderdompelen in moeder alcoholische oplossing aangevuld met 20% (v/v) glycerol oplossing (of gelijkwaardige cryo-protectant, zoals ethyleen glycol of polyethyleenglycol 400).
  10. Mount kristallen in cryoloops en flash bevriezen ze in vloeibare stikstof vóór de verzameling van gegevens op een binnenlandse bron diffractometer of met behulp van synchrotronstraling.

9. geleidelijke met zware Atom bewerking

Opmerking: Voordat iedere manipulatie van HA verbindingen, veiligheidsaspecten moeten worden beschouwd. HA verbindingen die worden gebruikt in de eiwit kristallografie worden geselecteerd voor hun sterke affiniteit met biologische moleculen en risico's voor de menselijke gezondheid van langdurige blootstelling. Toepassing zijnde maatregelen treffen voor HA-verbindingen, zoals vermeld in hun materiaal Safety Data Sheets.

  1. Om te testen verschillende HA verbindingen, reproduceren concentraties en incubatie tijden, goed diffracting kristallen verkregen in sectie 8 in een 24-well kristallisatie plaat met behulp van de hangende neerzetten damp diffusie methode66.
  2. Beslissen welke HA zal worden gebruikt voor crystal bewerking. Servers (bijvoorbeeld het zware-atoom databasesysteem67) kunnen helpen met de samengestelde selectie HA, ervoor te zorgen zij geschikt is voor de eiwitten en kristallisatie voorwaarde.
    Opmerking: HA schermen zijn ook commercieel beschikbaar voor eenvoudige screening van de meest effectieve HA compounds voor de geleidelijke invoering. Een set van "magic zeven" HA verbindingen zijn eerder beschreven om te hoge waarschijnlijkheid van succes voor HA bewerking68hebben.
  3. Werkstation voor HA inweken (Figuur 4A) ingesteld. Met behulp van een cryoloop, snel overbrengen in kristallen een 0,2 µL neerzetten op een 22 mm cover slip met HA oplossing verdund in de kristallisatie toestand zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van HA van 1-20 mM varieert. Zegel van de daling en incubeer gedurende verschillende lengtes van tijd (Figuur 4B). Een goed startpunt is 5, 10, 60 en 90 min en overnachting.
  4. Inspecteer het instrument visueel kristallen met een lichte Microscoop om mogelijke scheuren of veranderingen in kleur, die op nadelige effecten op de glycoproteïne kristal of crystal bewerking duiden kan te identificeren.
  5. Mount kristallen in cryoloops en rug-soak kristallen voor 30 s in drie opeenvolgende 0.2 µL druppels met moeder liquor oplossing aangevuld met 20% (v/v)-glycerol (of alternatieve cryo-protectant)69. De kristallen terug-inweken verwijdert HA samengestelde die was niet-specifiek gebonden en partiële bezetting veroorzaakt door zwakke HA bindende vermindert. Flash bevriezen kristallen in vloeibare stikstof (Figuur 4B).
  6. Voor het verzamelen van de gegevens gebruik verwerking, structuur oplossing en verfijning, eerder beschreven protocollen26,70,71,72.

10. inweken glycoproteïne kristallen met haar Ligand

  1. Goed diffracting kristallen verkregen in sectie 8 in een 24-well kristallisatie plaat met de hangende neerzetten damp diffusie methode te reproduceren.
  2. Voorbereiden van een stamoplossing van 50 mM ligand in 20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl.
    Opmerking: De concentratie van het ligand moet worden opgesteld volgens de affiniteit met haar glycoproteïne. Als de affiniteit onbekend is, zou het moeten een methode zoals ITC (deel 12.2) gebruiken om te bepalen van de affiniteit vóór begin inweken experimenten. Zorg ervoor dat de ligand oplosbaar in de gewenste concentratie in de vereiste buffer.
  3. Uiteenlopendeconcentratiesverkrijgbaar van het ligand toevoegen aan de daling met ECD kristallen en verzegel de daling voor de incubatie bij tijd lengtes variërend tussen 5 min 5 d.
  4. Visueel bijhouden kristallen met een lichte Microscoop te identificeren van mogelijke veranderingen in de morfologie.
  5. Mount kristallen in cryoloops en cryo-beschermen hen in moeder liquor oplossing aangevuld met 20% (v/v) glycerol (of andere cryo-protectant zoals ethyleen glycol of laagmoleculaire polyethyleenglycol 400)69.
  6. Voor gegevensverzameling, verwerking, structuur oplossing en verfijning, gebruiken eerder beschreven protocollen73,74,75.

11. productie van Fragment antigeen bindende (Fab)

  1. Subclone genen die met de Fab zware ketting (HC) en lichtketting (LC) sequenties van anti-ECD antilichamen, bijvoorbeeldepratuzumab corresponderen.
    Opmerking: U kunt ook IgG kan worden cleaved door het enzym papaïne voor het genereren van Fab fragmenten76.
  2. Transfect cellen zoals beschreven in sectie 4, met de volgende wijzigingen:
    1. Gebruik een totale massa van DNA voor transfectie van Fab fragmenten van 90 µg per 200 mL van de cultuur.
    2. Transfect HC en LC plasmiden in een verhouding van 2:1 om de hoeveelheid LC dimeer vorming te verminderen.
  3. Na 7 d van incubatie, oogsten van cellen, behouden supernatant en filteren met een 0,22 µm vacuüm-gedreven filtratie apparaat.
  4. Equilibreer anti-LC (kappa of lambda) affiniteit kolommen in PBS buffer met behulp van een benchtop chromatografie systeem.
    Opmerking: Als LC dimeer vorming een probleem tijdens het zuiveringsproces ongehinderd, eiwit G de chromatografie van de affiniteit kan worden gebruikt als alternatief voor kappa/lambda LC affiniteit zuivering.
  5. Laden supernatant op affiniteit kolom 4 mL min-1. Was de kolom met 3-4 CVs van PBS na monster laden.
  6. Elueer eiwit uit kolom een isocratic elutie met 100 mM glycine, pH 2.2, onmiddellijk het neutraliseren van de eluted breuken met 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9.0 in elke fractie.
    Opmerking: De eluted Fab kan verder gezuiverd worden door ionenwisselingschromatografie en/of grootte uitsluiting chromatografie met behulp van een FPLC bij 4 ° C.

12. karakterisering van Fab en kleine molecuul te binden aan de glycoproteïne

  1. Biolayer interferometrie
    1. 50 mL 1 x kinetiek buffer (1 x PBS, 0.002% (v/v) Tween-20, 0,01% (g/v) BSA) voor te bereiden.
    2. Hydrate zes Ni-NTA biosensoren in 200 µL van 1 x kinetiek buffer gedurende 10 minuten in een pre bevochtiging plaat.
    3. Verdun zijn-gelabeld ECD in 1 mL 1 x kinetiek buffer op een eindconcentratie van 25 ng µL-1. Pipetteer seriële verdunningen van gezuiverde Fab in 200 µL 1 x kinetiek buffer, met een hoge concentratie van 500 nM, en latere seriële verdunningen van 250 nM, 125 nM en 62,5 nM.
    4. Aliquot reagentia in polypropyleen 96-Wells-microplate zwarte platte bodem zoals afgebeeld in Figuur 5A, waar elk goed 200 µL van de aangegeven oplossing bevat.
    5. Het verzamelen van gegevens met behulp van de kinetiek testen in de Data-acquisitie software, zoals eerder beschreven38,39,77 (Figuur 5A).
      1. Kortom, breng de biosensoren in putten met 1 x kinetiek buffer op basislijn voor 60 s voordat het laden 25 ng µL-1 van glycoproteïne voor 240 s (of tot een drempel van 1.0 nm wordt bereikt) bij 1000 omwentelingen per minuut.
      2. Na een tweede basislijn van 60 s in 1 x kinetiek buffer, breng de biosensoren in putten met de seriële verdunning van Fab. De 180 s vereniging fase wordt later gevolgd door een 180 s dissociatie stap in 1 x kinetiek buffer.
        Opmerking: Biosensoren kunnen worden hergebruikt als het bovenstaande protocol wordt gevolgd door een regeneratie stap, die uit drie cycli bestaat van het wassen van de biosensoren in strippen buffer (PBS met 500 mM imidazol) voor 5 s gevolgd door 5 s in 1 x kinetiek buffer voor neutralisatie. Biosensoren kunnen worden hergebruikt tot ~ 10-20 keer tijdens dezelfde dag, of tot slechte gegevens kwaliteit wordt waargenomen.
    6. Het analyseren van de gegevens met gebruik van de software van de analyse (Figuur 5A):
      1. Onder tabblad 1, importeren en selecteer gegevens.
      2. Onder tabblad 2, stap 1: Gegevensselectie, selecteer 'Sensor Selection' en hoogtepunt referentie wells (rijen E en F, Figuur 5A), klik met de rechtermuisknop en stel om te verwijzen naar goed. Klik onder stap 2: Aftrekken, selecteer 'referentie Wells'. Onder stap 3: Y-as uitlijnen, selecteert u 'Baseline' in tijdsbereik van 0.1 tot 59,8 s. Schakel bij stap 4: Inter stap correctie, selecteert u 'Uitlijnen op dissociatie.' Klik bij stap 5: Proces, selecteer 'Savitzky-Golay filtering' en druk op procesgegevens.
      3. Onder de Tab 3, selecteer 'Associatie en dissociatie' onder stap analyseren met een 1:1 model. Selecteer 'Global montage' en 'Groeperen op kleur'. Klik met de rechtermuisknop curven, selecteert u 'Verander kleur', alle krommen ingesteld op de kleur van uw keuze. Selecteer 'Fit bochten'. Als de gegevens goed zijn uitgerust, kan een verslag door het selecteren van "Opslaan verslag" worden geëxporteerd.
    7. Herhaal experiment met glycoproteïne geproduceerd in HEK293F en HEK293S cellen (hoofdstuk 5) en na de Endo H behandeling (afdeling 7) te beoordelen van het effect, indien aanwezig, van verschillende glycoforms op Fab erkenning. Bovendien herhaal het experiment met ECD opschoningen zodat u inzicht krijgt in de domein(en) gebonden door de Fab.
  2. Isothermische titratie calorimetrie van Fab-glycoproteïne interactie
    Opmerking: ITC experimenten die hier worden beschreven zijn uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde ITC-instrument. Experimenten worden uitgevoerd in een 1 mL ronde onderkant 96-Wells blok.
    1. Dialyze de ECD en Fab in een enkele 4 L bekerglas van 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl bij 4 ° C's nachts met een roer-bar.
    2. Concentreren dialyzed ECD en Fab 5 µM en 50 µM, respectievelijk, een centrifugaal filter met 10 kDa NMWL, ervoor te zorgen om te wassen van de membranen van de concentrator driemaal met 5 mL dialyse buffer bij 4000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C vóór gebruik.
      Opmerking: Elke komen niet overeen in buffer tussen de monsters in de cel en spuit kan leiden tot ongewenste warmte worden vrijgegeven tijdens de ITC experiment en het resultaat in gegevens van slechte kwaliteit.
    3. Voor experiment 1: Voeg 400 µL van ECD a1 worden geladen in de cel, en 120 µL van de Fab goed a2 worden geladen in de spuit. Goed A3 leeg om terug te keren de volgende gemengd monster experimenteren voltooiing. Elke daaropvolgende experiment kan worden toegevoegd aan de plaat in dezelfde volgorde (dat wil zeggen, experimenteren 2: cel - A4, spuit - A5, lege well - A6; Figuur 5 B).
      Opmerking: Omvatten buffer in buffer besturingselementen (om te bevestigen het instrument is goed gedragen) aan het begin en einde van elke run, evenals de ligand (in spuit) in buffer (in cel) besturingselementen voor het berekenen van de hitte van de verdunning voor het monster in de spuit. Dit berekende hitte van verdunning moet vervolgens worden afgetrokken van de ruwe experimentele gegevens tijdens de analyse van de gegevens (Figuur 5B).
    4. Een totaal van 16 injecties worden uitgevoerd met een volume van 2,5 μL voor elke injectie. De duur van de injectie is 5 s, met 180 s afstand tussen injecties. De cel temperatuur instellen tot 25 ° C, met een opzwepende snelheid van 750 rpm en filter gedurende 5 s.
      Opmerking: Gebaseerd op de affiniteit en thermodynamica van de ECD:Fab interactie, kan het wijzigen van de concentratie van het monster, aantal injecties of cel temperatuur nodig zijn.
    5. Het analyseren van de gegevens met de software van de analyse, zoals eerder beschreven40,41,43 (Figuur 5B).
    6. Herhaal het experiment ten minste in duplicaten, berekening gemiddelde KD waarden en standaardfouten. Herhaal experiment met ECD van verschillende glycoforms (artikelen 5 en 6) te beoordelen van het effect, indien aanwezig, van de glycoforms op de thermodynamica van de Fab: glycoproteïne interactie.
  3. Voor isothermische titratie calorimetrie van ligand-glycoproteïne interacties, zet de ITC-experiment zoals beschreven in sectie 12.2, met de volgende wijzigingen:
    1. Dialyze in 4 L van dialyse buffer ECD's nachts. Los de ligand met dialyse buffer na voltooiing van dialyse.
    2. ITC experimenten bij aanzienlijk hogere concentraties om het detecteren van lage-affiniteit interacties te kunnen uitvoeren. Uitvoeren voor de ECD en ligand interactie, ITC experimenten bij concentraties van 100 µM van ECD in de cel en 1 mM van ligand in de spuit.

Representative Results

Verschillende constructies van CD22 ECD werden met succes in de pHLsec expressie vector gekloond en overexpressie in zoogdieren HEK293F en HEK293S cellijnen (Figuur 2 en 3A). Alle constructies werden gezuiverd tot grootte homogeniteit door grootte uitsluiting chromatografie en leverde een zeer zuiver voorbeeld voor kristallisatie studies (figuur 3B en 3 C). De CD22-constructie die hebben geleid tot goed diffracting kristallen was d1-d3 moet worden afgekapt (residuen 20-330), met vijf van de zes locaties van de voorspelde N-gebonden glycosylatie van Asn gemuteerd naar Ala (N67A, N112A, N135A, N164A en N231A), geproduceerd in de HEK293S cellen, zodanig dat alleen de site van glycosylatie op positie N101 werd behouden (deze constructie heet CD2220-330, 5A). Kristallen zijn verkregen onder verschillende omstandigheden van de MCSG-1 sparse-matrix scherm, maar de beste kristallen waren van een voorwaarde met 30% (g/v) polyethyleenglycol 4000, 0,2 M lithium chloride en 0,1 M Tris, pH 8,5. Deze inheemse kristallen eiwitkristallen 2.1 Å resolutie; met behulp van de bekende structuren van Ig domeinen van verwante Siglec eiwitten opbrengst oplossingen in heer zoekopdrachten niet.

Phasing informatie verwerven, doorweekt we inheemse kristallen met een panel van HA-verbindingen die Hg, Pt, Os, Ta en Br opgenomen in concentraties variërend van 1-20 mM van HA samengestelde voor een incubatietijd van 5 min tot en met 1 d (Figuur 4). We gecontroleerd kristallen voor veranderingen in de morfologie, en vond dat kristallen met HA samengestelde bij 20 mM gedrenkt resulteerde in de snelle kraken en ontbinding van de kristallen. We bevroor een totaal van 63 kristallen die behouden hun vorm na instellen incubatie tijden die doorweekt met tantaal bromide cluster, platina chloride, kwik acetaat en kwik chloride waren. Kristallen doorweekt met 7 mM kwik chloridevrij voor 30 min toonde afwijkend signaal op een scan van de fluorescentie bij de Canadese licht bron (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) en waarbinnen multi golflengte abnormale dispersie X-ray gegevensverzameling op een honkslag kristal. Deze datasets stond ons op te lossen van de onderbouw van het kwik van CD2220-330, 5A, waaruit bleek een enkele kwik-atoom gebonden aan een vrije cysteïne op positie C308 en uiteindelijk konden we bouwen de structuur van CD2220-330, 5A in de gefaseerde de kaart die van elektronen dichtheid met behulp van AutoBuild78.

Zodra de unliganded structuur was opgelost, waren we geïnteresseerd in het oplossen van de structuur van CD22 gebonden aan haar ligand, alpha2-6 siallylactose. We berekend eerst de affiniteit van de CD22 richting alpha2-6 sialyllactose met behulp van ITC te karakteriseren de bindende thermodynamica van de interactie. We waargenomen een affiniteit van ~ 280 µM en gebruikt deze informatie om te identificeren van een beginconcentratie (~ 100 x KD) van ligand te gebruiken voor het inweken van onze inheemse CD2220-330, 5A kristallen. We de CD2220-330, 5A kristallen met 25 mM siallylactose voor 5 min, 2 h, 14 h, 40 h en 5 d geweekt en gecontroleerd op veranderingen in de morfologie van het kristal. Een totaal van ~ 75 kristallen waren bevroren van verschillende tijdstippen en verzonden aan de CLS synchrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) voor externe gegevensverzameling. Een totaal van zes X-ray datasets werden verzameld uit goed diffracting kristallen. De structuur van elke dataset X-ray werd opgelost door MIJNHEER met behulp van de unliganded CD2220-330, 5A structuur als een eerste Zoek model. De resulterende dichtheid van het elektron voor alle gegevenssets werd vervolgens geïnspecteerd voor positieve dichtheid in de Fo-Fc-kaart die zou overeenkomen met alpha2-6 sialyllactose voor afhankelijk binnen de bindende site van CD22. Opmerkelijk, alle datasets verzameld, zelfs die uit kristallen gedrenkt na slechts 5 min van de incubatietijd, vervatte positieve dichtheid overeenkomt met de ligand in de bindende site. Algemene structuren van de unliganded en de liganded CD22 waren zeer vergelijkbaar met minimale conformationele wijzigingen, die zou kunnen het succes van inweken experimenten met alpha2-6 sialyllactose verklaren.

We volgende gekenmerkt de antigene oppervlak van CD22 erkend door therapeutisch antilichaam epratuzumab in BLI en ITC experimenten (Figuur 5). Kinetiek en thermodynamica profielen van epratuzumab Fab binding aan CD22-constructs met verschillende glycoforms bleek een groeiende affiniteit met CD22 met verminderde N-linked glycan grootte, met maximaal een 14-fold verbetering van affiniteit voor kleinere glycanen (327 nM vs 24 nM in BLI; 188 nM vs 58 nM in ITC). De CD22 N-linked glycan die de toegang van het antilichaam aan de epitoop werd geïdentificeerd door BLI met behulp van single-point mutanten van CD22 en de epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co kristal structuur28op te lossen.

Figure 1
Figuur 1 . Overzicht van glycoproteïne karakterisering van construct ontwerp voor biofysische en structurele karakterisering. (1) primaire sequentieanalyse van representatieve glycoproteïne. In het grijs, het extracellulaire domein (ECD); in het groen, de transmembrane (TM)-segment; en in het blauw, het cytosolische domein van de glycoproteïne. Voorspelde N-gebonden glycanen worden aangeduid. (2) klonen van ECD constructies. (3) uitdrukking van ECD constructies in zoogdiercellen. (4) glycoproteïne zuivering. Uitgedrukt in HEK293F eiwitten bevatten complexe glycanen, moeten eiwitten, uitgedrukt in HEK293S hoge mannose glycanen. Enzymatische behandeling van glycoproteïnen geproduceerd in HEK293S cellen met Endo H resultaten in glycoproteïnen met alleen een GlcNAc deel daarvan op N-gebonden glycosylatie sites. (5 bis) glycoproteïnen worden getest op hun binding aan antilichamen door biolayer interferometrie (BLI) en isothermische titratie calorimetrie (ITC). Affiniteit met kleine liganden kan ook worden gemeten door het ITC. (5b) kristallisatie proeven van glycoproteïnen met homogene N-gebonden glycanen, zoals die In sommige gevallen, uitgedrukt in HEK293S en deglycosylated met Endo H. (6) Mutatie van N-gebonden glycosylatie sites is noodzakelijk om het verkrijgen van kristallen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Ontwerp van CD22 ectodomain DNA voor expressie in zoogdiercellen construeert. A) vertegenwoordiging van de plasmide van de pHLsec gebruikt voor voorbijgaande transfectie van CD22 ECD constructies. AgeI en KpnI sites gebruikt voor het klonen worden aangegeven met rode dozen. B) de CD22 ECD bevat zeven Ig domeinen (d1-d7) en 12 voorspelde N-gebonden glycosylatie sites (in blauw). Vier constructies werden ontworpen van de CD22-ECD. C) 1% agarose gel tonen PCR waarbij van CD22 ECD bouwt voor het klonen in de pHLsec zoogdieren expressie vector. Eerste lane bevat 1 kb DNA marker. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. 

Figure 3
Figuur 3 . Meningsuiting en zuivering van glycoproteïnen. A) Effect van de celdichtheid op expressie opbrengsten. Glycoproteïne expressie in kleinschalige 25 mL cultuur van HEK293F schorsing cellen transfected met behulp van drie verschillende startende dichtheden van cellen (0,5 x 106 cellen mL-11.0 x 106 cellen mL-1en 1.5 x 106 cellen mL -1). Kwantificering uitgevoerd door densitometrie van SDS-pagina in de linker paneel en kwantitatieve BLI in het rechter paneel. Waarden zijn representatief voor een glycoproteïne voorbereiding. B) Chromatogram van de eerste stap van de zuivering voor construeren CD2220-330, 5A van 600 mL van het supernatans dat met behulp van een Ni-NTA affiniteit kolom. De glycoproteïne was geëlueerd met behulp van een helling van imidazool (grijze lijn), waar 100% correspondeert met de elutie buffer, waarin 500 mM imidazool. Gepoolde fracties worden afgebeeld met verticale lijnen. C) grootte-uitsluiting chromatografische voor construeren CD2220-330, 5A met behulp van een high-performance gel filtratie kolom. Gepoolde fracties van de piek van de elutie worden afgebeeld met verticale lijnen. Inzet: Coomassie gebeitste SDS-pagina gel tonen de zuiverheid van de glycoproteïne. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . Crystal inweken met zware atomen. A) monster workstation voor het inweken van inheemse kristallen met HA verbindingen. Alle vereiste hulpmiddelen worden aangeduid. B) stappen gevolgd om te genieten van de kristallen van construeren CD2220-330, 5A met HA verbindingen. Stap 1, Open putje met kristallen en overdracht kristallen met behulp van een lus aan een daling van 0,2 µL op een cover slip met HA oplossing verdund in de kristallisatie toestand zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van HA van 1-10 mM varieert. Stap 2, verzegelen van de daling van de kristallisatie plaat en incubeer kristallen met de HA samengestelde voor verschillende perioden. Stap 3, mount het doorweekte kristal in de lus en rug-weken voor 30 s in drie opeenvolgende 0.2 µl druppels met de moeder liquor oplossing aangevuld met 20% (v/v) glycerol afgeleverd op een cover slip. Stap 4, flash bevriezen van het kristal gemonteerd op een lus met vloeibare stikstof en plaatst u deze in een puck voor verzending naar de synchrotron beamline. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 . Biolayer interferometrie en isotherme titratie calorimetrie metingen. A) vertegenwoordiger BLI experiment. Bovenste paneel: voorbeeld van plaat setup voor een kinetiek experiment, waar de volgende worden aangeduid: 1 x kinetiek buffer (B), zijn6 x-tagged glycoproteïne laden (L), representatieve Fab concentraties (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 mM regeneratie buffer (R), en 1 x kinetiek neutralisatie buffer (B). Elk bevat goed 200 µL van oplossing. Het nummer van de deelactiviteit voor de kinetiek experiment wordt aangegeven bij de bovenkant van de plaat. Midden paneel: Representatieve onbewerkte gegevens van BLI experiment uitgevoerd met behulp van Ni-NTA biosensoren en de plaat die is beschreven in het bovenste deelvenster. Stapnummers overeen met basislijn (1) zijn6 x glycoproteïne laden (2), basislijn (3), vereniging in seriële verdunning van Fab (4) en dissociatie (5). Regeneratie stappen zijn niet vertegenwoordigd (stap 6-7). Onderste paneel: Representatieve geanalyseerde gegevens waaruit ruwe associatie en dissociatie (blauwe lijn) met de corresponderende 1:1 passen (rode lijn). B) bovenste paneel: vertegenwoordiger plaat setup voor een enkele ITC uitgevoerd over een geautomatiseerde ITC instrument met zeven experimenten in een 96-Wells ronde onderkant blok. Elk experiment bestaat uit drie putten. De eerste put (rood) komt overeen met monster voor de cel (400 µL), de tweede put (groen) komt overeen met het monster voor de spuit (120 µL). De derde goed leeg gelaten en de gemengde monsters wordt teruggeleid naar dit goed na voltooiing van het experiment. Experimenten 1, 2 en 7 zijn buffer in buffer besturingselementen. 3-5 experimenten vertegenwoordigen drievoudige expermenteren glycoproteïne (P) in de cel en Fab of ligand (L) in de spuit. Experiment 6 vertegenwoordigt een ligand hitte van verdunning controle en moet worden afgetrokken van de experimenten 3-5 tijdens de gegevensanalyse. Onderste paneel: Representatieve rauwe (boven) en verwerkte (onder) ITC gegevens waaruit Fab (epratuzumab) binden aan CD22 ECD geproduceerd in de HEK293F cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Membraan-verankerd glycoproteïnen kritisch zijn voor cel functie en aantrekkelijke therapeutische doelen zijn. Hier presenteren we een protocol voor de structurele en biofysische karakterisatie van het ECD van membraan glycoproteïnen, alleen én in complex met klein molecuul liganden en Fab-fragmenten. We hebben met succes dit protocol gebruikt om te bepalen van de kristalstructuur van de drie domeinen van het N-terminal-meeste Ig van het extracellulaire gedeelte van menselijke CD2228, een kritische co receptor op B cellen die betrokken zijn bij het houden van de Humorale immuniteit in selectievakje79. Wij hebben ook gekenmerkt van de bindende site van CD22 met zijn natuurlijke ligand alpha2-6 sialyllactose, en de wijze van erkenning van een therapeutisch antilichaam naar menselijke CD22 gedefinieerd. Deze resultaten bieden inzicht in de structuur-functie relatie van een belangrijk lid van de Siglecs familie die uitdrukking op de B-cellen en een moleculaire routekaart op weg naar de ontwikkeling van nieuwe CD22 gerichte klein molecuul en antilichaam gebaseerde heeft beperkt Therapeutics. Terwijl dit protocol met succes voor een Ig-bevattende B-cel receptor gebruikt werd, stellen wij voor dat onze aanpak kan worden toegepast voor de structurele en biofysische karakterisatie van een membraan glycoproteïne met een verschillend domein-organisatie. In dergelijke gevallen door ontwerp en combinatorische N-linked glycan mutaties (hetzij Gln of Ala) kunnen worden geëvalueerd om te zoeken naar een constructie geschikt voor kristalgroei en hoge resolutie diffractie te bouwen.

Verkrijgen van een homogene en zuiver glycoproteïne steekproef is van cruciaal belang voor kristalgroei en röntgendiffractie, alsmede voor downstream biofysische karakterisering. N-gebonden glycanen aanwezig op glycoproteïnen zijn per definitie heterogeen, en kan leiden tot conformationele en chemische heterogeniteit binnen de glycoproteïne dat kristal vorming kan afschrikken. Verklein dit micro-heterogeniteit en kunnen strategieën die invoering van puntmutaties Schakel Asn residuen voorspeld dat de haven van N-gebonden glycanen, of met behulp van mutant cellijnen (zoals HEK293S), gevolgd door behandeling met endoglycosidases (zoals EndoH) aanzienlijk kristallisatie succes15,21,22te verbeteren. In dit protocol bespreken we de zuivering van oplosbare glycoproteïnen en Fabs die worden uitgescheiden in de cel bezinken. Glycoproteïne secretie biedt een relatief eenvoudige route naar zuiverheid, zonder de noodzaak voor lysis van de cel of de toevoeging van agressieve chemicaliën of schoonmaakmiddelen. De cel supernatant, verkregen volgende cel oogsten wordt vervolgens direct boven een kolom die affiniteit voor de proteïne van belang (b.v., Ni-NTA voor zijn-gelabeld glycoproteïnen of LC affiniteit voor Fab-fragmenten heeft) uitgevoerd. Echter, afhankelijk van de kolom van het gebruik en de voorwaarden van de cel supernatant (bijvoorbeeld pH), het bindend vermogen van het eiwit van belang zijn voor de kolom kan worden beïnvloed. Als dit het geval is, wellicht te concentreren en buffer uitwisseling de cel supernatant ter verbetering van de binding aan de kolom. Bovendien is het sterk aanbevolen dat de kwaliteitscontrole stappen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd aangewend worden om te helpen beoordelen van eiwit zuiverheid. Een SDS-pagina gel of de westelijke vlek van alle monsters (vóór, tijdens en na de zuivering stappen) uitvoeren kan opleveren inzicht of de zuivering van de voorgestelde regeling geschikt voor de proteïne van belang is. Contaminerende bands zijn zichtbaar op SDS-pagina, of als verschillende soorten worden verkregen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd (bijvoorbeeld diverse toppen op grootte uitsluiting), extra zuivering stappen moet worden overwogen, bijvoorbeeld ionenwisselingschromatografie, om te krijgen in zuiverheid en verhoging van de kans op downstream kristallisatie80.

Voor macromoleculaire kristallisatie is het vaak essentieel zijn voor het verkrijgen van hoge opbrengsten van de proteïne van belang te voorzien in de screening van een groot aantal potentiële kristallisatie voorwaarden bij eiwitrijk concentraties te vinden van de geschikte crystal hits. In het algemeen de HEK293 cellijnen hier besproken (HEK293F en HEK293S) zijn robuuste expressiesystemen, en kunnen gemakkelijk worden opgeschaald naar produceren meer monster als dit nodig is. Het is echter mogelijk dat de proteïne van belang niet voldoende binnen deze cellijnen uiten kan. In deze gevallen, andere cellijnen, zoals Expi293 cellen81,82, zodat superieure niveaus van eiwit expressie zijn bevonden en moeten worden beschouwd als een alternatief.

Als welgeordende, buigingsinrichting kristallen niet na testen van verschillende constructies van de proteïne van belang ondanks hoge zuiverheid verkregen zijn, is het mogelijk dat het nodig is om uit te breiden van kristallisatie technieken ter bevordering van de vorming van kristallen. Het is gebleken dat Fab fragmenten van antilichamen en nanobodies uitstekende kristallisatie versterkers, en bevordering van welgeordende crystal verpakking83,84,85. Deze fragmenten kunnen worden uitgedrukt en gezuiverd tot homogeniteit en gebruikt in een complex met de proteïne van belang ter bevordering van kristallisatie. Fab fragmenten geproduceerd zoals beschreven in sectie 10 kunnen nog belangrijker is, hebben de neiging om vormen van niet-functionele LC Dimeren86. Deze Dimeren verontreinigingen zijn en moeten worden verwijderd tijdens het zuiveringsproces ongehinderd. In onze ervaring, LC Dimeren vaak hebben een verschillende retentievolume op uitsluiting van de grootte, of Elueer als een duidelijke piek op ionenwisselingschromatografie, en dus kunnen worden verwijderd uit de Fab reiniging - maar dit niet altijd het geval is. Als deze technieken niet volstaan om LC Dimeren van de Fab zuivering, kunnen extra zuivering methoden, zoals de zuivering van de affiniteit van eiwit G, worden toegepast ter verbetering van de zuiverheid.

Alternatief voor co-complexvorming met Fab-fragmenten, goed gedocumenteerde technieken zoals willekeurige matrix microseeding kunnen het verbeteren van kansen op het verkrijgen van welgeordende kristallen63,70. Deze methode omvat de toevoeging van kleine hoeveelheden verpletterd, suboptimaal kristallen in de kristallisatie conditie, een kristal mononucleate ter bevordering van kristalgroei te verstrekken. Dit kan worden uitgevoerd met behulp van de kristallen van de proteïne van belang, of degenen met soortgelijke domein architectuur en tertiaire structuur. Bovendien kan willekeurige matrix microseeding worden uitgevoerd in de pogingen om het kristalliseren van het eiwit alleen, of in complex met een Fab fragment of kleine molecule van belang. Recente vooruitgang in cryo-elektronenmicroscopie maken deze techniek ook een aantrekkelijk alternatief voor röntgendiffractie voor het verkrijgen van hoge-resolutie structuurgegevens voor moleculen met passende functies87,88, 89,90,91.

Wanneer van de heer fasering van röntgendiffractie datasets mislukt, kan HA inweken nodig zijn de fase-probleem op te lossen door abnormale dispersie of isomorfe vervanging. Inspectie van de aminozuur-reeks van het eiwit kan voorzien HA bewerking, met inbegrip van optimale pH voor bindende aanwijzingen over de strategie. In het bijzonder kunnen ongepaarde cysteines binnen het eiwit specifiek binden HA verbindingen die kwik bevatten. Inweken van inheemse kristallen met HA verbindingen is een iteratief proces om te bepalen van de identiteit van de optimale HA compound, de concentratie en de vereiste incubatietijd. Als eerste inweken pogingen niet goed diffracting kristallen met een geschikt voor geleidelijke HA opbrengst doen, wellicht om aminozuur vervangingen ter verbetering van de kans op HA bindende en abnormale signaal verbeteren. Voorbeelden zijn mutaties tot een gratis cysteine residu als u efficiënt afhankelijk maken van Hg, Au, Pt of Pb. weergave van de eiwitten voor abnormale phasing-in de media van een seleno-methionine aangevuld bij E. coli uitgebreid voor afwijkende fasering gebruikt is, echter een gelijkwaardig systeem waarin betrouwbaar seleno-methionine is niet beschikbaar voor zoogdiercellen in schorsing92,93, en is een gebied van toekomstige ontwikkeling.

Zodra de unliganded structuur van de glycoproteïne van belang is verkregen, kan de kristallen met klein molecuul liganden inweken worden uitgevoerd om te verkrijgen van een structuur van het immuun receptor-ligand-complex. Deze gegevens geven een blauwdruk voor het rationele ontwerp van meer specifieke en hoge-affiniteit liganden die kan worden gebruikt als kleine-molecuul therapeutics evenals biedt hoge resolutie inzichten in de biologische functie van de glycoproteïne. Wanneer u probeert om te genieten van glycoproteïne kristallen met klein molecuul liganden van belang, kunt inspectie van de kristalstructuur unliganded aangeven of het inweken mogelijk moet zijn. Als sluit crystal-verpakking contactpersonen worden gevonden rond de ligand-bindende plaats of rond gebieden moeten ondergaan conformationele veranderingen op ligand bindend, inweken zal waarschijnlijk worden problematisch. In dit geval moeten andere methoden zoals co-kristallisatie van het eiwit-ligand-complex worden uitgevoerd.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

Röntgendiffractie experimenten beschreven in dit document werden uitgevoerd met behulp van de straallijnen 08-ID en 08-BM bij de Canadese lichtbron, die wordt ondersteund door de Stichting van Canada voor innovatie, natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada, de Universiteit van Saskatchewan, de regering van Saskatchewan, Canada westerse economische diversificatie, de Raad Canada van nationale onderzoeksprogramma en de Canadian Institutes of Health Research. Wij willen de structurele & biofysische Core faciliteit, het ziekenhuis voor zieke kinderen, erkent voor de toegang tot de ITC en BLI instrumenten. J.E.O. werd gesteund door Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. T.S. is een geadresseerde van een Canada afgestudeerde beurs Master Award en een Vanier Canada Graduate beurs van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. Dit werk werd gesteund door de operationele subsidie PJT-148811 (J.-P.J.) van de Canadese instituten van het gezondheidsonderzoek. Dit onderzoek werd uitgevoerd, gedeeltelijk dankzij de financiering van de Canada Research Chairs programma (J.-P.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
  2. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. J Membr Biol. 248 (4), 611-640 (2015).
  3. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. J Clin Invest. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  4. Hyde, C. A. C., et al. Targeting extracellular domains D4 and D7 of vascular endothelial growth factor receptor 2 reveals allosteric receptor regulatory sites. Mol Cell Biol. 32 (19), 3802-3813 (2012).
  5. Tai, W., Mahato, R., Cheng, K. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery. J Control Release. 146 (3), 264-275 (2010).
  6. Zarei, O., Benvenuti, S., Ustun-Alkan, F., Hamzeh-Mivehroud, M., Dastmalchi, S. Strategies of targeting the extracellular domain of RON tyrosine kinase receptor for cancer therapy and drug delivery. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (12), 2429-2446 (2016).
  7. Rosman, Z., Shoenfeld, Y., Zandman-Goddard, G. Biologic therapy for autoimmune diseases: an update. BMC Med. 11 (1), 88 (2013).
  8. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  9. Barclay, A. N. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - A master superfamily of interaction molecules. Semin Immunol. 15 (4), 215-223 (2003).
  10. Barclay, A. N. Ig-like domains: evolution from simple interaction molecules to sophisticated antigen recognition. Proc Natl Acad Sci. 96 (26), 14672-14674 (1999).
  11. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833 (11), 2430-2437 (2013).
  12. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  13. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S., Al, E. Glycosylation in the ER and Golgi complex. Mol Cell Biol. (4), Section 17.7 (2000).
  14. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  15. Lee, J. E., Fusco, M. L., Ollmann Saphire, E. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nat Protoc. 4 (4), 592-604 (2009).
  16. Betenbaugh, M. J., Tomiya, N., Narang, S., Hsu, J. T. A., Lee, Y. C. Biosynthesis of human-type N-glycans in heterologous systems. Curr Opin Struct Biol. 14 (5), 601-606 (2004).
  17. Yang, Z., et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nat Biotechnol. 33 (8), 842-844 (2015).
  18. Bláha, J., Kalousková, B., Skořepa, O., Pažický, S., Novák, P., Vaněk, O. High-level expression and purification of soluble form of human natural killer cell receptor NKR-P1 in HEK293S GnTI-cells. Protein Expr Purif. 140, 36-43 (2017).
  19. Bláha, J., Pachl, P., Novák, P., Vaněk, O. Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through high-density transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr Purif. 109, 7-13 (2015).
  20. Chaudhary, S., Pak, J. E., Gruswitz, F., Sharma, V., Stroud, R. M. Overexpressing human membrane proteins in stably transfected and clonal human embryonic kidney 293S cells. Nat Protoc. 7 (3), 453-466 (2012).
  21. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: Solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  22. Davis, S. J., Crispin, M. Solutions to the glycosylation problem for low- and high-throughput structural glycoproteomics. Funct Struct Proteomics Glycoproteins. , 127-158 (2011).
  23. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  24. Zheng, K., Bantog, C., Bayer, R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 3 (6), 568-576 (2011).
  25. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 62 (10), 1243-1250 (2006).
  26. Adams, P. D., et al. The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 55 (1), 94-106 (2011).
  27. May, A. P., Robinson, R. C., Vinson, M., Crocker, P. R., Jones, E. Y. Crystal structure of the N-terminal domain of sialoadhesin in complex with 3' sialyllactose at 1.85 Å resolution. Mol Cell. 1 (5), 719-728 (1998).
  28. Ereño-Orbea, J., et al. Molecular basis of human CD22 function and therapeutic targeting. Nat Commun. 8 (1), 764 (2017).
  29. Yu, X. -L., et al. Crystal structure of HAb18G/CD147: implications for immunoglobulin superfamily homophilic adhesion. J Biol Chem. 283 (26), 18056-18065 (2008).
  30. Garman, E., Murray, J. W. Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr - Sect D Biol Crystallogr. 59 (11), 1903-1913 (2003).
  31. Agniswamy, J., Joyce, M. G., Hammer, C. H., Sun, P. D. Towards a rational approach for heavy-atom derivative screening in protein crystallography. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (4), 354-367 (2008).
  32. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (20), 431-440 (2015).
  33. Olieric, V., et al. Data-collection strategy for challenging native SAD phasing. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 421-429 (2016).
  34. Rillahan, C. D., et al. Disubstituted sialic acid ligands targeting Siglecs CD33 and CD22 associated with myeloid leukaemias and B cell lymphomas. Chem Sci. 5 (6), 2398-2406 (2014).
  35. Mesch, S., et al. From a library of MAG antagonists to nanomolar CD22 ligands. ChemMedChem. 7 (1), 134-143 (2012).
  36. Chiu, M. L., Gilliland, G. L. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 38, 163-173 (2016).
  37. Elgundi, Z., Reslan, M., Cruz, E., Sifniotis, V., Kayser, V. The state-of-play and future of antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 122 (2016), 2-19 (2017).
  38. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms. J Vis Exp. (122), e55659 (2017).
  39. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  40. Brautigam, C. A., Zhao, H., Vargas, C., Keller, S., Schuck, P. Integration and global analysis of isothermal titration calorimetry data for studying macromolecular interactions. Nat Protoc. 11 (5), 882-894 (2016).
  41. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J Vis Exp. (55), e2796 (2011).
  42. Livingstone, J. R. Antibody characterization by isothermal titration calorimetry. Nature. 384 (6608), 491-492 (1996).
  43. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  44. Macauley, M. S., Crocker, P. R., Paulson, J. C. Siglec-mediated regulation of immune cell function in disease. Nat Rev Immunol. 14 (10), 653-666 (2014).
  45. Zaccai, N. R., et al. Structure-guided design of sialic acid-based Siglec inhibitors and crystallographic analysis in complex with sialoadhesin. Structure. 11 (5), 557-567 (2003).
  46. Pantophlet, R., et al. Bacterially derived synthetic mimetics of mammalian oligomannose prime antibody responses that neutralize HIV infectivity. Nat Commun. 8 (1), 1601 (2017).
  47. Leonard, J. P., et al. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 antibody, in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: phase I/II clinical trial results. Clin Cancer Res. 10 (16), 5327-5334 (2004).
  48. Finn, R. D., et al. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Res. 45, 190-199 (2017).
  49. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  50. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  51. Gupta, R., Jung, E., Brunak, S. NetNGlyc: Prediction of N-glycosylation sites in human proteins. , (2004).
  52. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
  53. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  54. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  55. Akula, I., Julien, J. -P. Optimization of glycoprotein expression by transient transfection in HEK293 F/S suspension cells. , Available from: https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/FectoPRO-Technical-Note-031716.pdf (2015).
  56. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  57. Tan, H. Y., Ng, T. W. Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Opt Commun. 281 (10), 3013-3017 (2008).
  58. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  59. Jonnalgadda, K., Markley, L., Estes, S., Prajapati, S., Takkar, R., Kumaraswamy, S. Rapid, reliable quantitation of Fc-fusion protein in cell culture supernatants. , Available from: https://www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf (2018).
  60. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology: Separating protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2018).
  61. Wilkins, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 112, 531-552 (1999).
  62. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. J Vis Exp. (78), e50548 (2013).
  63. Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R., Gilliland, G. L. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (8), 927-933 (2010).
  64. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallogr Sect F, Struct Biol Commun. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  65. Luft, J. R., et al. Efficient optimization of crystallization conditions by manipulation of drop volume ratio and temperature. Protein Sci. 16 (4), 715-722 (2007).
  66. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), e2285 (2011).
  67. Sugahara, M., Asada, Y., Ayama, H., Ukawa, H., Taka, H., Kunishima, N. Heavy-atom Database System: A tool for the preparation of heavy-atom derivatives of protein crystals based on amino-acid sequence and crystallization conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (9), 1302-1305 (2005).
  68. Boggon, T. J., Shapiro, L. Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure. 8 (7), 143-149 (2000).
  69. Vera, L., Stura, E. A. Strategies for protein cryocrystallography. Cryst Growth Des. 14 (2), 427-435 (2014).
  70. Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, crystallization and structure determination of C. difficile PPEP-1 via microseeding and Zinc-SAD. J Vis Exp. (118), e55022 (2016).
  71. Leslie, A. G. W., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  72. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 303-318 (2016).
  73. Cooper, D. R., Porebski, P. J., Chruszcz, M., Minor, W. X-ray crystallography: Assessment and validation of protein-small molecule complexes for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (8), 771-782 (2011).
  74. Hassell, A. M., et al. Crystallization of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 63 (1), 72-79 (2006).
  75. Muller, I., et al. Guidelines for the successful generation of protein-ligand complex crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 73 (2), 79-92 (2017).
  76. Zhao, Y., et al. Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells. Protein Expr Purif. 67 (2), 182-189 (2009).
  77. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383 (2014).
  78. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (1), 61-69 (2008).
  79. Walker, J. A., Smith, K. G. C. CD22: An inhibitory enigma. Immunology. 123 (3), 314-325 (2008).
  80. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  81. Jain, N. K., et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr Purif. 134, 38-46 (2017).
  82. Fang, X. T., Sehlin, D., Lannfelt, L., Syvänen, S., Hultqvist, G. Efficient and inexpensive transient expression of multispecific multivalent antibodies in Expi293 cells. Biol Proced Online. 19 (1), 11 (2017).
  83. Löw, C., et al. Nanobody mediated crystallization of an archeal mechanosensitive channel. PLoS One. 8 (10), 77984 (2013).
  84. Hunte, C., Michel, H. Crystallization of membrane proteins mediated by antibody fragments. Curr Opin Struct Biol. 12 (4), 503-508 (2002).
  85. Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Carson, J., Hermans, P., Julien, J. -P. Structural basis of enhanced crystallizability induced by a molecular chaperone for antibody antigen-binding fragments. J Mol Biol. 430 (3), 322-336 (2018).
  86. Spooner, J., et al. Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1472-1477 (2015).
  87. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: The nuts and bolts. Curr Opin Struct Biol. 46, 1-6 (2017).
  88. Merk, A., et al. Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  89. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  90. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  91. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  92. Hendrickson, W. a, Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  93. Walden, H. Selenium incorporation using recombinant techniques. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (4), 352-357 (2010).

Tags

Biochemie kwestie 137 glycoproteïnen N-gebonden glycosylatie kristallisatie biolayer interferometrie isothermische titratie calorimetrie crystal inweken antigeen bindende fragment.
Karakterisering van glycoproteïnen met de vouw van de immunoglobuline door middel van röntgendiffractie en biofysische technieken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ereño-Orbea, J., Sicard, T.,… More

Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter