हम immunoglobulin के साथ नच के भौतिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए दृष्टिकोण वर्तमान में interferometry, इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry, और एक्स-रे क्रि द्वारा गुना ।
कोशिकाओं की सतह पर नच संकेत, आसंजन और परिवहन सहित सेलुलर समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ल्यूकोसाइट्स पर, इन नच अधिकारी immunoglobulin (़) परतों के कई और प्रतिरक्षा मांयता और विनियमन के लिए केंद्रीय रहे हैं । यहां, हम मानव बी सेल रिसेप्टर CD22 के extracellular डोमेन के डिजाइन, अभिव्यक्ति और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए एक मंच मौजूद है । हम प्रस्ताव है कि इन दृष्टिकोण मोटे तौर पर स्तनधारी ग्लाइकोप्रोटीन ectodomains के लक्षण वर्णन के लिए लागू कर रहे है ़ डोमेन युक्त । दो सस्पेंशन मानव भ्रूण गुर्दा (HEK) सेल लाइनों, HEK293F और HEK293S, क्रमशः नच पोस कॉंप्लेक्स और उच्च mannose glycans व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाता है । ये रिकॉमबिनेंट नच अलग glycoforms के साथ ligand बाइंडिंग पर glycan साइज और बंदिशों के असर की जांच की अनुमति देते हैं । हम जैविक रूप से प्रासंगिक लाइगैंडों और चिकित्सीय एंटीबॉडी उंमीदवारों के लिए बाध्यकारी ग्लाइकोप्रोटीन के कैनेटीक्स और ऊष्मा का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं । रिकॉमबिनेंट HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित नच glycan एकरूपता, कम लचीलापन और endoglycosidase एच उपचार के लिए संवेदनशीलता के कारण क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी हैं. हम चरण निर्धारण और ligand बाध्यकारी, क्रमशः के विश्लेषण के लिए भारी परमाणुओं और छोटे अणुओं के साथ ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल भिगोने के लिए तरीके वर्तमान । प्रायोगिक प्रोटोकॉल यहां चर्चा की स्तनधारी नच के लक्षण वर्णन के लिए अपने समारोह में अंतर्दृष्टि दे और चिकित्सा की कार्रवाई के तंत्र की जांच के लिए वादा पकड़ो ।
भूतल प्रोटीन सेलुलर समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अपने extracellular डोमेन के माध्यम से, इन झिल्ली प्रोटीन सेल सेल बातचीत, आसंजन, परिवहन और संकेत1,2मिलाना कर सकते हैं । इन प्रोटीन का extracellular स्थानीयकरण उन्हें कैंसर और स्व-प्रतिरक्षित रोगों सहित रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के उपचार के लिए चिकित्सकीय के विकास के लिए आकर्षक लक्ष्य बनाता है3,4,5 , 6 , 7. मानव झिल्ली प्रोटीन ectodomains की सबसे आम परतों में से एक immunoglobulin की तरह (़) गुना है, जो सात या अधिक β-दो β-चादरें8,9में व्यवस्थित किस्में द्वारा बनाई है । आमतौर पर, ़-युक्त नच बहु-डोमेन संरचनाएं ़ डोमेन के साथ कर रहे है क्रमिक रूप से झिल्ली प्रोटीन10के extracellular भाग पर व्यवस्था की । इन सेल-सरफेस प्रोटीन्स, खासतौर पर एन और ओ-लिंक्ड glycosylation के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में उनके रेगुलेशन, फोल्डिंग, स्राव और फंक्शन11में आवश्यक भूमिकाएँ निभाते हुए दिखाया गया है । अपने कार्य के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए और बेहतर चिकित्सकीय डिजाइन कि उंहें लक्षित कर सकते हैं, तकनीक की आवश्यकता है कि उनके विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं । यहां, हम तकनीकों का एक संयोजन है कि भौतिक (interferometry (BLI) और इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)) और संरचनात्मक (एक्स-रे क्रि) ़-युक्त के extracellular डोमेन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति पेश झिल्ली नच, अकेले और जटिल में उनके जैविक रूप से प्रासंगिक लाइगैंडों और चिकित्सीय अणुओं (चित्रा 1) के साथ ।
N-लिंक्ड glycosylation स्तनधारी प्रोटीन पर सबसे आम पोस्ट-अनुवाद संशोधनों में से एक है, और endoplasmic जालिका और Golgi12,13के भीतर प्रोटीन परिपक्वता के दौरान होता है । कोशिका लाइनों, जैसे मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) २९३ कोशिकाओं, ग्लाइकोसिलेटेड स्तनधारी प्रोटीन की बड़ी मात्रा के रिकॉमबिनेंट अभिव्यक्ति के लिए विकसित किया गया है14,15. यह सेल लाइन एक निलंबन स्वरूप है, जो अनुयाई सेल लाइनों की तुलना में बड़ी मात्रा में प्रोटीन उत्पादन को स्केलिंग की आसानी के लिए अनुमति देता में विकसित किया गया है । यहां, हम दो HEK293 सेल लाइनों का उपयोग: HEK293F और HEK293 Gnt मैं-/ (HEK293S), जो एन के अभाव से अलग-acetylglucosaminyl ट्रांस्फ़्रेज़ मैं (Gnt) उत्तरार्द्ध में । बारी में, जटिल glycans का उत्पादन (के रूप में HEK293F में देखा) संभव नहीं है और इसके बजाय उच्च mannose-प्रकार glycans (मुख्य रूप से आदमी5GlcNAc2) N पर स्थित glycan साइटों18,19,20 . समानांतर में इन दो सेल लाइनों का उपयोग जैविक समारोह और चिकित्सीय लक्ष्यीकरण पर glycan आकार और जटिलता के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है । दरअसल, HEK293F कोशिकाओं में उत्पादित नच बड़े, HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित एक ही ग्लाइकोप्रोटीन की तुलना में अधिक जटिल glycans होगा. HEK293S कोशिकाओं में उत्पादित नच अधिक क्रिस्टलीकरण के लिए उत्तरदायी हैं, क्योंकि कम रासायनिक और उनके एन से जुड़े glycans के गठन विविधता. आगे सघन सुधार करने के लिए, HEK293S (लेकिन नहीं HEK293F) कोशिकाओं में उत्पादित नच एंजाइम endoglycosidase एच (इंडो एच) के साथ इलाज किया जा सकता है, जो उच्च mannose के दरार में परिणाम glycans ऐसी है कि केवल एक एकल N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety प्रत्येक N-लिंक्ड glycosylation साइट21,22पर बनी हुई है । अंय विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है सीमित करने के लिए N-glycan संसाधन, जैसे glycosyltransferase अवरोधकों के अतिरिक्त के रूप में ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति, kifunensine सहित23। वैकल्पिक दृष्टिकोण देशी नच की अभिव्यक्ति शामिल (HEK293F कोशिकाओं में) एंजाइमी deglycosylation का उपयोग कर पेप्टाइड एन-glycosidase एफ (PNGaseF) के बाद. हालांकि, PNGaseF के साथ deglycosylation को देशी परिस्थितियों के तहत कम प्रभावी और कुछ प्रोटीन में एकत्रीकरण बढ़ दिखाया गया है; मामलों में जब प्रोटीन उपचार के बाद घुलनशील रहता है, यह अपनी क्रिस्टलीकरण के लिए हानिकारक हो सकता है जो एसपारटिक एसिड24, के लिए asparagine अवशेषों के विछुटकारे के कारण इसकी सतह पर नकारात्मक शुल्क प्राप्त । भविष्यवाणी की n-glycosylation साइटों को भी, alanine या glutamine अवशेषों के लिए सबसे अधिक बार किया जा सकता है, इन साइटों पर n-लिंक्ड glycosylation को रोकने के लिए और उच्च सजातीयता के ग्लाइकोप्रोटीन नमूने उत्पंन करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, नच अन्य eukaryotic सेल संस्कृतियों में उत्पादित किया जा सकता है, जिसमें खमीर, कीट, और संयंत्र प्रणालियों, या अन्य स्तनधारी सेल लाइनों जैसे चीनी हंसटर डिम्बग्रंथि (चो) कोशिकाओं16,17.
कई स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर, pHLsec सहित, सेल मीडियम25में रिकॉमबिनेंट ग्लाइकोप्रोटीन ectodomains के स्राव के लिए अनुमति देते हैं । HEK293 कोशिकाओं से नच का स्राव सेल lysis की आवश्यकता के बिना तेजी से और आसान शुद्धिकरण के लिए अनुमति देता है । शुद्धि टैग के अलावा (जैसे, अपने-टैग, Strep-टैग, झंडा-टैग, Myc-टैग, हा-टैग) को N या C लक्ष्य के टर्मिनस को ग्लाइकोप्रोटीन एक एकल कदम संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्धि की अनुमति देता है । बाद में, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के लिए एक monodisperse नमूना उपज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है भौतिक और संरचनात्मक लक्षण वर्णन ।
उपयुक्त परिस्थितियों में एक अत्यंत शुद्ध और सजातीय ग्लाइकोप्रोटीन नमूना अच्छी तरह से diffracting क्रिस्टल में परिणाम कर सकते हैं । एक बार एक पूर्ण एक्स-रे विवर्तन डेटासेट ऐसे क्रिस्टल से प्राप्त किया गया है, प्रारंभिक चरणों ग्लाइकोप्रोटीन के इलेक्ट्रॉन घनत्व की गणना करने के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है. प्रोटीन डाटा बैंक (PDB), चरणबद्ध के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि में संरचनाओं की बढ़ती संख्या के लिए धंयवाद अब तक आणविक प्रतिस्थापन (श्री), जो एक संबंधित प्रोटीन संरचना का उपयोग करता है प्रारंभिक चरणों26प्राप्त करने के लिए बन गया है । हालांकि, जब श्री चरण समस्या को हल करने के लिए विफल रहता है, के रूप में कभी-कभार बहु-आइजी डोमेन के लिए मामला रहा है नच27,28,29, वैकल्पिक तरीकों की आवश्यकता है । इस अनुच्छेद में, हम विस्तार एक विधि के लिए भारी परमाणुओं (हा) के साथ चरणबद्ध है, जो CD22 ectodomain28की संरचना को सुलझाने के लिए आवश्यक था के लिए क्रिस्टल सोख । चरणबद्ध के लिए सही हा की पहचान एक चलने प्रक्रिया है कि एक दिया क्रिस्टल जाली में ग्लाइकोप्रोटीन में हा जेट, उपलब्ध परमाणु पर निर्भर करता है, और सघन समाधान30,31। वैकल्पिक रूप से, cysteine और methionine अवशेषों में प्राकृतिक सल्फर परमाणुओं ग्लाइकोप्रोटीन में अन्य परमाणुओं के लिए एक उच्च पर्याप्त अनुपात में मौजूद है, तो चरणबद्ध के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अगर एक्स-रे विवर्तन डेटा उच्च पर्याप्त अतिरेक३२के साथ एकत्र किया जा सकता है, ३३.
झिल्ली के जैविक समारोह नच अक्सर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन या प्रोटीन-ligand इंटरैक्शन से मध्यस्थता करते हैं, जैसे कार्बोहाइड्रेट के साथ. ligand क्रिस्टल जाली में ग्लाइकोप्रोटीन बंधन साइट के समाधान से फैलाना करने के लिए काफी छोटा है, जब बेहतर ligand मान्यता को समझने के लिए एक ग्लाइकोप्रोटीन-ligand सह-क्रिस्टल संरचना प्राप्त करने के लिए, प्रयोगों को भिगोने के लिए सफल हो सकते हैं.
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल सिंथेटिक चिकित्सीय लाइगैंडों३४,३५ और एंटीबॉडी चिकित्सीय के साथ३६,३७सतह नच की बातचीत को समझने के लिए भी प्रासंगिक हैं । जब संरचनात्मक जानकारी के साथ संयुक्त, बाध्यकारी कैनेटीक्स और ऊष्मा को समझने और कार्रवाई के अपने तंत्र में सुधार करने के लिए शक्तिशाली हो सकता है । एक तकनीक है कि एक ग्लाइकोप्रोटीन के लिए बाध्यकारी चिकित्सीय एंटीबॉडी के काइनेटिक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है BLI३८,३९है । BLI एक मैटीरियल ligand के साथ एक बाध्यकारी साथी के साथ संघ और पृथक्करण कैनेटीक्स को मापने के लिए, अंततः एक संतुलन पृथक्करण स्थिर (KD) का निर्धारण करने के लिए उपयोग करता है । BLI एक आकर्षक दृष्टिकोण है क्योंकि नच की छोटी मात्रा (< 100 µ g) की आवश्यकता होती है, प्रयोग का समय तेज (~ 10-15 min प्रति रन) होता है, और यह स्वचालित हो सकता है । आईटीसी नच व बाइंडिंग पार्टनर्स४०,४१,४२,४३के बीच समानताएं की पढ़ाई के लिए भी उपयोगी है । जबकि आईटीसी अधिक समय और प्रतिएजेंट है, बहुमूल्य जानकारी बातचीत की ऊष्मा के बारे में प्राप्त किया जा सकता है (ΔG, ΔH, ΔS, और stoichiometry) । आईटीसी कमजोर बातचीत का अध्ययन करने के लिए भी बहुत उपयोगी है जो प्रायः सतह नच के क्षणिक बाइंडिंग से लाइगैंडों से जुड़े होते हैं. इसके अलावा, इन तकनीकों विभिंन निर्माणों के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग N-लिंक अलग सेल लाइनों में ग्लाइकोप्रोटीन व्यक्त से प्राप्त glycoforms के प्रभाव का आकलन । HEK293F में उत्पादित नच के साथ BLI और आईटीसी का प्रदर्शन, HEK293S और इंडो एच के साथ इलाज जैविक गतिविधि और चिकित्सीय सगाई में glycans की भूमिका का एक में गहराई से दृश्य प्रदान कर सकते हैं.
हम सफलतापूर्वक इन प्रोटोकॉल लागू करने के लिए extracellular डोमेन (ECD) मानव CD2228, sialic एसिड बाध्यकारी ़ के एक ग्लाइकोप्रोटीन सदस्य की तरह lectins (Siglecs) परिवार की विशेषता है कि बी सेल को बनाए रखने के लिए आवश्यक है homeostasis४४ . हम में प्रदर्शन गहराई निर्माण डिजाइन क्रिस्टलीकरण की सुविधा के लिए और एक्स-रे डेटासेट पारा के साथ भिगोने के द्वारा चरणबद्ध । हम भी अपने ligand sialic एसिड के साथ CD22 क्रिस्टल लथपथ (α 2-6 sialyllactose) प्रतिरक्षा रिसेप्टर की एक संरचना-ligand जटिल प्राप्त करने के लिए और इस प्रकार glycan mimetics४५,४६की संरचना-निर्देशित डिजाइन के लिए खाका प्रदान की । इसके अलावा, हम विरोधी CD22 चिकित्सीय एंटीबॉडी epratuzumab के अंश प्रतिजन बंधन (फैब) उत्पंन-एक चिकित्सकीय उंमीदवार के लिए चरण III नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान में गैर है Hodgkin लिंफोमा४७-BLI द्वारा अपनी बाध्यकारी समानता निर्धारित करने के लिए और आईटीसी ते अंतर ग्लाइकोसिलेटेड CD22 ECD गावातील. ये अध्ययन epratuzumab सगाई में N-लिंक्ड glycosylation के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका से पता चला, बेकार बी कोशिकाओं पर CD22 मांयता के लिए संभावित प्रभाव के साथ ।
झिल्ली लंगर नच सेल समारोह के लिए महत्वपूर्ण है और आकर्षक चिकित्सीय लक्ष्य हैं । यहां, हम दोनों अकेले और छोटे अणु लाइगैंडों और फैब टुकड़े के साथ जटिल में झिल्ली नच के ECD के संरचनात्मक और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम सफलतापूर्वक तीन एन टर्मिनल के क्रिस्टल संरचना का निर्धारण करने के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है-मानव CD2228के extracellular भाग के सबसे ़ डोमेन, बी कोशिकाओं पर एक महत्वपूर्ण सह रिसेप्टर जांच७९में विनोदी प्रतिरक्षा रखने में शामिल. हम भी अपनी प्राकृतिक ligand α 2-6 sialyllactose के साथ CD22 के बंधन साइट की विशेषता है, और मानव एंटीबॉडी के प्रति एक चिकित्सीय CD22 की मांयता की विधा परिभाषित । इन परिणामों Siglecs परिवार के एक प्रमुख सदस्य है कि बी कोशिकाओं पर अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है की संरचना-समारोह संबंध में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और नए CD22 लक्षित छोटे अणु और एंटीबॉडी आधारित के विकास की दिशा में एक आणविक रोडमैप चिकित्सा विज्ञान. हालांकि इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एक आइजी युक्त बी सेल रिसेप्टर के लिए इस्तेमाल किया गया था, हम प्रस्ताव है कि हमारे दृष्टिकोण एक विशिष्ट डोमेन संगठन के साथ किसी भी झिल्ली ग्लाइकोप्रोटीन के संरचनात्मक और भौतिक लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है । ऐसे मामलों में, डिजाइन और मिश्रित N-लिंक्ड glycan उत्परिवर्तनों का निर्माण (या तो Gln या ाला) के लिए एक क्रिस्टल विकास और उच्च संकल्प विवर्तन के लिए उपयुक्त निर्माण खोजने के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है ।
एक सजातीय और शुद्ध ग्लाइकोप्रोटीन नमूना प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है क्रिस्टल विकास और एक्स-रे विवर्तन, के रूप में अच्छी तरह के रूप में बहाव के लिए भौतिक लक्षण वर्णन । N-नच पर वर्तमान से जुड़े glycans स्वाभाविक विषम हैं, और ग्लाइकोप्रोटीन है कि क्रिस्टल गठन रोकते कर सकते है के भीतर और एक और रासायनिक विविधता पैदा कर सकता है । इस माइक्रो-विविधता, रणनीति है कि बिंदु उत्परिवर्तनों को हटाने के लिए बंदरगाह एन से जुड़े glycans, या उत्परिवर्ती सेल लाइनों (जैसे HEK293S के रूप में) का उपयोग endoglycosidases के साथ उपचार के बाद (जैसे EndoH) काफी कर सकते है की भविष्यवाणी के अवशेषों को कम करने के लिए सुधार क्रिस्टलीकरण सफलता15,21,22। इस प्रोटोकॉल में हम घुलनशील नच और Fabs की शुद्धि की चर्चा करते हैं जो कोशिका supernatant में स्रावित होते हैं । ग्लाइकोप्रोटीन स्राव, कोशिका lysis या कठोर रसायनों या डिटर्जेंट के अलावा की आवश्यकता के बिना शुद्धता की दिशा में एक अपेक्षाकृत सरल मार्ग प्रदान करता है । सेल supernatant, सेल संचयन निंनलिखित प्राप्त तो सीधे एक कॉलम है कि ब्याज के प्रोटीन के लिए अपनत्व है पर चला जाता है (जैसे, Ni-ंत् के लिए अपने-टैग नच के लिए, या नियंत्रण रेखा फैब टुकड़े के लिए समानता) । हालांकि, उपयोग के कॉलम और सेल supernatant (जैसे, पीएच) की शर्तों के आधार पर, स्तंभ के लिए ब्याज की प्रोटीन की बाध्यकारी क्षमता प्रभावित हो सकता है । यदि यह मामला है, यह ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक हो सकता है और स्तंभ के लिए बाइंडिंग में सुधार करने के लिए कक्ष supernatant exchange बफ़र । इसके अलावा, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि शुद्धीकरण के दौरान गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रोटीन शुद्धता का आकलन करने में मदद करने के लिए कार्यरत है । एक एसडीएस-पृष्ठ जेल या सभी नमूनों के पश्चिमी दाग (पहले, के दौरान और शुद्धिकरण कदम के बाद) चल रहा है कि प्रस्तावित शुद्धिकरण योजना ब्याज के प्रोटीन के लिए उपयुक्त है में अंतर्दृष्टि उपज सकते हैं । यदि दूषित बैंड एसडीएस पर दिखाई दे रहे हैं-पृष्ठ, या यदि कई प्रजातियों शुद्धि के दौरान प्राप्त कर रहे हैं (जैसे, आकार अपवर्जन पर कई चोटियों), अतिरिक्त शुद्धि कदम माना जाना चाहिए, जैसे, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, लाभ के लिए पवित्रता में और बहाव क्रिस्टलीकरण८०की संभावना में वृद्धि ।
macromolecular क्रिस्टलीकरण के लिए, यह अक्सर ब्याज की उच्च पैदावार प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है उच्च प्रोटीन सांद्रता में संभावित क्रिस्टलीकरण की स्थिति की एक बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देने के लिए उपयुक्त क्रिस्टल हिट लगता है । आम तौर पर, HEK293 सेल लाइनों यहां चर्चा की (HEK293F और HEK293S) मजबूत अभिव्यक्ति प्रणालियों रहे हैं, और आसानी से किया जा सकता है के लिए आवश्यक के रूप में अधिक नमूना उत्पादन । हालांकि, यह संभव है कि ब्याज की प्रोटीन इन सेल लाइनों के भीतर पर्याप्त व्यक्त नहीं कर सकते हैं । इन मामलों में, अन्य सेल लाइनों, जैसे Expi293 कोशिकाओं८१,८२, प्रोटीन अभिव्यक्ति के बेहतर स्तर दिखाने के लिए पाया गया है और एक विकल्प के रूप में माना जाना चाहिए.
यदि अच्छी तरह से आदेश दिया, diffracting क्रिस्टल उच्च शुद्धता के बावजूद ब्याज की प्रोटीन के कई निर्माण के परीक्षण के बाद प्राप्त नहीं कर रहे हैं, यह क्रिस्टलीकरण तकनीक का विस्तार करने के लिए आवश्यक हो सकता है करने के लिए क्रिस्टल गठन को बढ़ावा देने । यह दिखाया गया है कि एंटीबॉडी और nanobodies के फैब टुकड़े उत्कृष्ट क्रिस्टलीकरण बढ़ाने हो सकता है, और अच्छी तरह से बढ़ावा देने के क्रिस्टल पैकिंग८३,८४,८५का आदेश दिया । इन टुकड़ों को व्यक्त किया जा सकता है और सजातीयता को शुद्ध, और ब्याज की प्रोटीन के साथ एक जटिल में इस्तेमाल के लिए क्रिस्टलीकरण को बढ़ावा देने के । महत्वपूर्ण बात, खंड 10 में वर्णित के रूप में फैब टुकड़े का उत्पादन गैर कार्यात्मक नियंत्रण रेखा dimers८६के रूप में एक प्रवृत्ति हो सकती है । ये dimers हैं तथा शुद्धिकरण के दौरान इन्हें हटाया जाना चाहिए. हमारे अनुभव में, LC dimers अक्सर आकार अपवर्जन पर एक अलग प्रतिधारण मात्रा है, या आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी पर एक अलग चोटी के रूप में elute, और इस तरह फैब शुद्धि से हटाया जा सकता है-लेकिन यह हमेशा मामला नहीं है । यदि इन तकनीकों को फैब शुद्धि से LC dimers को दूर करने के लिए अपर्याप्त हैं, अतिरिक्त शोधन विधियों, जैसे प्रोटीन G संबध शुद्धि, पवित्रता में सुधार करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
फैब टुकड़े के साथ सह के लिए वैकल्पिक, अच्छी तरह से प्रलेखित तकनीक जैसे यादृच्छिक मैट्रिक्स microseeding प्राप्त करने की संभावना में सुधार कर सकते है अच्छी तरह से आदेश दिया क्रिस्टल६३,७०। इस विधि क्रिस्टलीकरण हालत में कुचल, उपइष्टतम क्रिस्टल की छोटी मात्रा के अलावा शामिल है, एक क्रिस्टल nucleate प्रदान करने के लिए क्रिस्टल विकास को बढ़ावा देने के । यह ब्याज, या समान डोमेन वास्तुकला और तृतीयक संरचना के साथ लोगों के प्रोटीन के क्रिस्टल का उपयोग किया जा सकता है । इसके अलावा, यादृच्छिक मैट्रिक्स microseeding के प्रयास में प्रदर्शन किया जा सकता है अकेले प्रोटीन सघन, या जटिल में एक फैब टुकड़ा या ब्याज की छोटी अणु के साथ । क्रायो में हाल ही में अग्रिम-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी इस तकनीक को उपयुक्त सुविधाओं के साथ अणुओं के लिए उच्च संकल्प संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए एक्स-रे क्रि के लिए एक आकर्षक विकल्प८७,८८, ८९,९०,९१.
जब एक्स-रे विवर्तन डेटासेट के चरणबद्ध श्री द्वारा विफल रहता है, हा भिगोने के लिए विषम फैलाव या isomorphous प्रतिस्थापन द्वारा चरण समस्या को हल करने की आवश्यकता हो सकती है । प्रोटीन के अमीनो एसिड अनुक्रम का निरीक्षण बाध्यकारी के लिए इष्टतम पीएच सहित हा derivatization, के लिए रणनीति के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं । विशेष रूप से, प्रोटीन के भीतर ख़राब cysteines विशेष रूप से बांध कर सकते है हा यौगिकों कि पारा होते हैं । हा यौगिकों के साथ देशी क्रिस्टल भिगोने इष्टतम हा यौगिक की पहचान निर्धारित करने के लिए एक चलने प्रक्रिया है, अपनी एकाग्रता, और आवश्यक मशीन समय. प्रारंभिक भिगोने का प्रयास अच्छी तरह से उपज नहीं है, तो diffracting क्रिस्टल चरणबद्ध के लिए उपयुक्त एक हा युक्त, यह अमीनो एसिड प्रतिस्थापन की संभावना में सुधार करने के लिए लागू करने के लिए आवश्यक हो सकता है हा बाध्यकारी और विषम संकेत में सुधार होगा । उदाहरण के लिए एक मुक्त cysteine अवशेषों को कुशलता से पारा, Au, पीटी या पंजाब में बांध शामिल उत्परिवर्तनों शामिल हैं । ई. कोलाई में एक seleno-methionine पूरक मीडिया में विषम चरणबद्ध के लिए प्रोटीन की अभिव्यक्ति बड़े पैमाने पर विषम चरणबद्ध के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन एक बराबर प्रणाली है कि मज़बूती से seleno-methionine निलंबन९२,९३में स्तनधारी कोशिकाओं के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है, और भविष्य के विकास का एक क्षेत्र है शामिल हैं ।
एक बार ब्याज की ग्लाइकोप्रोटीन की unliganded संरचना प्राप्त की है, छोटे अणु लाइगैंडों के साथ क्रिस्टल भिगोने प्रतिरक्षा रिसेप्टर की एक संरचना-ligand परिसर प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । इन आंकड़ों के तर्कसंगत डिजाइन के लिए एक खाका प्रदान करते है और अधिक विशिष्ट और उच्च अपनत्व लाइगैंडों कि छोटे अणु चिकित्सीय उपचार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लाइकोप्रोटीन के जैविक समारोह में उच्च संकल्प अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । जब ब्याज की छोटी अणु लाइगैंडों के साथ ग्लाइकोप्रोटीन क्रिस्टल सोख करने का प्रयास, unliganded क्रिस्टल संरचना के निरीक्षण से संकेत मिलता है कि भिगोना संभव होना चाहिए सकते हैं । यदि बंद क्रिस्टल पैकिंग संपर्क ligand-बाध्यकारी साइट या आसपास ligand बंधन पर गठन के परिवर्तन से गुजरना की उंमीद क्षेत्रों के आसपास पाया जाता है, भिगोने की संभावना समस्याग्रस्त हो जाएगा । इस मामले में, प्रोटीन-ligand परिसर के सह-क्रिस्टलीकरण जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों के इस पत्र में वर्णित 08 beamlines का उपयोग प्रदर्शन किया गया आईडी और 08-बी एम के लिए कनाडा के प्रकाश स्रोत है, जो कनाडा के नवाचार के लिए फाउंडेशन, प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है पर कनाडा, Saskatchewan विश्वविद्यालय, Saskatchewan की सरकार, पश्चिमी आर्थिक विविधीकरण कनाडा, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा, और स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों । हम संरचनात्मक और भौतिक कोर सुविधा, बीमार बच्चों के लिए अस्पताल, आईटीसी और BLI उपकरणों के लिए उपयोग के लिए स्वीकार करना चाहते हैं । J.E.O. स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों से बंटिंग Postdoctoral फैलोशिप BPF-१४४४८३ द्वारा समर्थित किया गया था । T.S. एक कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति है मास्टर पुरस्कार और एक वाणी कनाडा स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थानों से स्नातक छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है । यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थानों से ऑपरेटिंग ग्रांट PJT-१४८८११ (जे.-पीजे) द्वारा समर्थित किया गया था । यह शोध शुरू किया गया था, भाग में, कनाडा अनुसंधान कुर्सियों कार्यक्रम (जे-पीजे)से धन के लिए धंयवाद ।
0.22 μm Steritop filter | EMD Millipore | SCGPS02RE | |
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel | Bio-Rad | 4561084 | |
10x glycobuffer 3 | New England Biolabs | P0702S | Comes with Endo H reagent |
10x Kinetics Buffer | PALL FortéBio | 18-1092 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
1 mL round bottom 96 well block | ThermoFisher | 260251 | |
22 mm cover slip | Hampton research | HR3-231 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
96-3 well INTELLIPLATE low volume reservior | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | ||
ÄKTA Start | GE Healthcare | ||
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC901008 | |
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC801008 | |
Auto-iTC200 | Malvern | ||
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes | Fisher Scientific | MCT150C | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm | Hampton research | HR4-945 | |
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm | Hampton research | HR4-947 | |
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm | Hampton research | HR4-970 | |
Digital Dry Bath | Bio-Rad | 1660562EDU | |
E. coli DH5α | Invitrogen | 18258012 | |
Endo H | New England Biolabs | P0702S | |
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP | TriForest Labware | FBC05000S | |
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap | VWR | 89095-258 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL | Greiner Bio-One | 607180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL | Greiner Bio-One | 760180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL | Greiner Bio-One | 606180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL | Greiner Bio-One | 768180 | |
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus | VWR | 10118-842 | |
Freestyle 293F cells | Thermo Fisher Scientific | R79007 | |
Freestyle Expression medium | Thermo Fisher Scientific | 12338001 | |
Heavy Atom Screens Au | Hampton research | HR2-444 | |
Heavy Atom Screens Hg | Hampton research | HR2-446 | |
Heavy Atom Screens M1 | Hampton research | HR2-448 | |
Heavy Atom Screens M2 | Hampton research | HR2-450 | |
Heavy Atom Screens Pt | Hampton research | HR2-442 | |
HEK 293S | ATCC | ATCC CRL-3022 | |
HisTrap Affinity Column | GE Healthcare | 17525501 | |
HiTrap KappaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17545811 | |
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17548211 | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-1 | |
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-2 | |
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-3 | |
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-4 | |
Mercuric chloride | Sigma | 1044170100 | |
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black | Greiner Bio-One | 655209 | |
Minstrel DT UV | Formulatrix | ||
Multitron Pro shaker | Infors HT | MP25-TA-CO2HB | |
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nanosep 3K Omega centrifugal device | PALL Life Science | OD003C33 | |
Ni-NTA biosensors | PALL FortéBio | 18-5102 | |
Octet RED96 | PALL ForteBio | ||
Oryx 4 crystallizaiton robot | Douglas Instrument | ORY-4/1 | |
Platinum chloride | Sigma | 520632-1g | |
Precision Plus Protein Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
Quick Coomassie Stain | Protein Ark | GEN-QC-STAIN-1L | |
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express | EMD Millipore | SCGP00525 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17517201 | |
Tantalum bromide cluster | Jena bioscience | PK-103 | |
Top96 Crystallization Screen | Rigaku Reagents | 1009846 | |
Tryphan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
VDX 24-well with sealant | Hampton research | HR3-172 | |
α2-6 sialyllactose | Sigma Aldrich | A8556-1mg |