Summary
在这里, 我们提出一个协议, 以空间和世俗评估的存在, 在蜱内脏有活力的微生物, 使用改良的全芒原位杂交方法。
Abstract
节肢动物传染媒介传播的传染病继续对全世界的人类健康构成严重威胁。引起这些疾病的病原体, 在殖民载体时不存在孤立;相反, 它们很可能与肠道内的微生物发生相互作用。载体菌群在病原体传播中起着重要的作用。是否细菌在肠道内的Ixodes scapularis蜱, 多人病原体的载体, 包括螺旋体螺旋体,影响蜱传播的病原体是不确定的。我们需要方法来表征与蜱肠相关的细菌组成, 以促进更好地了解在蜱肠道内的潜在的种间相互作用。使用全装入的就地杂交可视化与特定细菌种类相关的 RNA 记录, 可以收集有关完整组织中微生物的丰度和分布的定性数据。该技术可用于检测蜱喂养过程中肠道微生物群落环境的变化, 也可用于分析蜱基因的表达。全蜱内脏的染色在不需要三维重建的情况下, 对组织中目标 RNA 的总空间分布进行信息分析, 对环境污染的影响较小, 往往会混淆基于排序的方法经常用于研究复杂的微生物群落。总的来说, 这项技术是一个有价值的工具, 可以用来更好地了解病原体-微生物群的相互作用及其在疾病传播中的作用。
Introduction
节肢动物传染媒介传播的人类和家畜病原体遍布全球, 占全球20% 的传染性疾病的1, 但对大多数这些病原体没有有效和安全的疫苗可供使用。我们对共生、共生和致病微生物的重要作用的理解, 统称为微生物群2, 在调制和塑造几乎所有后生3的健康方面都在扩大。现在很明显, 病原体的节肢动物载体也窝藏肠道微生物群, 这些与载体相关的微生物群落已经被证明对不同的载体传染病原体有影响4,5。节肢动物微生物群由 eubacteria、古菌、病毒和真核微生物组成, 如原生动物、线虫和真菌6。然而, 主要的研究重点是 eubacteria, 部分原因是可获得的标记基因和参考数据库, 以确定特定的细菌成员。
以Ixodes scapularis为重点, 包括螺旋体螺旋体7、病致病剂等多种人类病原体的蜱向量, 对一种微生物可视化技术进行了优化, 旨在在媒介-病原菌相互作用的背景下, 提高我们对蜱肠道微生物群的认识。在蜱微生物场中仍有几个问题有待回答。肠道是在水平转移病原体背景下, 蜱与传入病原体之间第一次延长相遇的地点;因此, 了解载体肠道微生物群在调节载体-病原体相互作用中的作用将揭示有意义的见解。蜱有一个独特的模式的血液膳食消化, 其中处理的血液膳食成分发生 intracellularly8。肠道腔似乎作为一个容器, 以控制血液的膳食作为蜱饲料, 和养分消化和同化在数天的喂养和继续后饱食。在喂食过程中获得的病原体与 bloodmeal 一起进入肠腔, 因此流明成为蜱、病原体和居民微生物间相互作用的主要部位。随着消化通过饱食和Ixodid蜱蜕皮, 肠道经历结构和功能的变化9。肠道细菌的组成和空间组织也可能随着肠道环境的变化而变化。因此, 重要的是要了解蜱肠道内细菌的结构, 以充分了解蜱、病原体和肠道微生物群的相互作用。
描述宿主相关微生物群的分子技术经常利用高通量并行排序策略10来放大和序列细菌16S 核糖体 DNA (rDNA)。这些排序策略规避了获取特定细菌的无菌文化的需要, 并对样本中所代表的所有细菌成员提供了深入的描述。然而, 这种战略因无法区分环境污染物与善意居民而混淆。此外, 在评估样本 (如蜱) 时, 体积小, 因而含有低菌群特定的 DNA 产量时, 环境污染物放大的可能性增加了11 , 并导致模糊的解释微生物组成。因此, 与特定生存细菌的可视化相结合的功能表征, 对于确定和辨别蜱虫菌群在世俗和空间上都是至关重要的。为了实现这个目标, 我们利用了全安装 RNA原位杂交。这种技术通常用于评估器官和胚胎中的基因表达模式12,13,14 , 并允许定量分析整个样本的兴趣。这不同于传统的就地杂交技术, 利用组织切片, 通常需要对分段材料进行广泛的分析, 用一个计算组件来预测整个器官中的表达式15。当整体装载一般提到整个有机体12, 这里整体装载提到整体内脏或器官。采用全挂载 RNA原位杂交方法评价蜱肠菌群的体系结构的优点多种。蜱肠道由7对憩组成, 每对变化大小为16。功能差异, 如果有的话, 在这些憩, 是不理解的背景下蜱生物学, 蜱微生物群或蜱病原体相互作用。肠道憩的操作将会取代肠道腔内的微生物群, 或与肠道松散相关的人, 导致对微生物的空间定位产生误解。使用荧光标记的 RNA原位杂交在早期通过固定和打开个体肠道憩来检查蜱肠记录17 , 以确保探针杂交和本地化B. 螺旋体记录通过切片石蜡嵌入的整个刻度18。这两种方法都需要在杂交之前对蜱组织进行操作, 这会影响肠道微生物体系结构。
在本报告中, 我们详细描述了使用全装入式原位杂交 (WMISH) 检查可行蜱肠道微生物群的协议。使用全挂载 RNA原位杂交使全球了解肠道不同区域内特定肠道细菌的存在和丰度, 并可能在病原体殖民化的背景下激发对蜱肠生物学的新见解。和传输。此外, 使用 rna 探针针对特定的细菌 rna, 可以检测细菌在蜱肠道。
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Protocol
1. DNA 模板的制备
- 从 NCBI 数据库中下载特定于每个细菌属的 16S rRNA 序列, 并设计聚合酶链反应 (PCR) 相容的正向和反向引物, 将放大特定区域 (~ 200-250 基对长), 如前所述19. 还请参阅开源数据库席尔瓦20、21和 probeBase22在线资源, 用于 rRNA 目标的寡核苷酸探针和引物, 因为某些细菌属的 RNA 探针可能是商业性的。可用。
注意: 选择特定属属的基因区域是很重要的, 并确保所设计的引物不放大相关的细菌属。这是获得基因/属特异性探针杂交的关键。 - 24, 48 或72小时的饲料蜱对小鼠, 解剖蜱内脏和准备 RNA 和 cDNA 从蜱内脏如前所述23。以 cDNA 为模板, 利用 thermocycler 对特异性 amplicons 进行 PCR 放大。在1.5% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品/扩增子的整除, 并确认扩增子在紫外线 (UV) 光照射下使用凝胶成像系统与预期尺寸相对应。
- 克隆细菌16S 核糖体 RNA 扩增子感兴趣的商业可用的 TA 向量(材料表) 包含 RNA 聚合酶促进剂适合噬菌体聚合酶 (SP6, T7 或 T3)。序列化克隆以确认扩增子的标识和克隆对每个启动子的方向性。在此基础上, 确定生成感知或反义 RNA 探针的选择的启动子 (图 1)。
- 进行线性化1毫克质粒与适当的制约酵素在30µLfor 2 h 的反应容量在制造商推荐的温度。选择基于启动子的限制酶, 用于生成感觉或反义探针 (图 1)。验证2µL 1% 琼脂糖凝胶的消化反应的线性化。
- 用一种商用的 PCR 产品柱纯化试剂盒提纯剩余的28µL, 用分光光度法定量测定 dna 浓度。
注意: 一些感测探头可能会导致背景染色远远高于相应的反义探针, 可能需要探索其他选择。替代性的阴性控制包括样品中没有表示的质粒编码序列或另一种能产生独特杂交模式的探针。
2. Digoxygenin 双绞线 RNA 探针的构造
- 通过将7.5 µL 100 毫米 utp、25µL 10 毫米 digoxygenin 双绞线和10µL 每个100毫米的 ATP、GTP 和 CTP 在1.5 毫升离心管中组合, 制备核苷酸组合。
- 使用1µL 的核苷酸组合 (步骤 2.1) 和 0.25-1 µg 模板 DNA, 利用商业上可用的 T7 或 Sp6 RNA 聚合酶套件执行体外转录。将体积高达20µL 水。轻拍管组合和脉冲旋转。孵育37°c 2.5-3 小时。
注: 探针结构已成功的消化质粒浓度低至7µL, 但典型的浓度在这个步骤范围从 15-25 ng/µL。转录反应也可能在一夜之间孵化37摄氏度, 但这并没有显著增加 RNA 的产量。 - 添加1µL 的 DNase (2000 单位/µL) 和孵化37°c 10 分钟。不要超过10分钟, 否则酶就会开始降解 RNA。
- 加入30µL 冰冷 7.5-8 米氯化锂和30µL 的冷冻核酸酶水, 以沉淀 RNA。轻弹管子混合。允许 RNA 的降雨雪在-20 °c 隔夜进行。
- 以 1.7万 x g 为20分钟, 以4摄氏度的离心法收集 RNA。用1毫升新鲜制备的75% 乙醇在焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水中一次清洗颗粒, 然后重复离心。
- 除去并丢弃上清, 将管子倒在干净的纸巾上, 并允许干燥10分钟, 并用重悬在核酸酶水中的颗粒。如果颗粒很容易看到, 并用重悬在25µL。如果球团很小或不可见, 并用重悬在 15-20 µL. 通过分光光度法获得 RNA 浓度的估计。
注意: 典型的 RNA 浓度范围从 200-500 µL。
3. rna 甲醛凝胶电泳 rna 探针的可视化评价 rna 纯度
注意: 甲醛构成吸入危险;因此, 在油烟机中生成 RNA 凝胶分析所需的解决方案。溴溴化物是一种疑似致癌物质;小心处理。
- 准备1% 甲醛琼脂糖凝胶如前所述的24 , 并将凝胶在一个无 RNases 的凝胶盒中。一旦冷却, 填充的凝胶盒与1x 运行缓冲器 (1x 拖把在 pH 值 7.0, 5% 甲醛)。
- 准备样品缓冲器 (5 µL 400 毫克/毫升溴溴化物, 20 µL 10x 拖把, 35 µL 甲醛, 100 µL 甲酰胺)。将2µL 的 RNA 探针 (步骤 2.6) 与8µL 的样本缓冲器结合起来。孵育70°c 10 分钟。
- 通过结合5毫升50% 甘油, 1 毫升10% 甲醛, 40 毫克溴酚蓝, 40 毫克二甲苯蓝, 20 µL EDTA (pH 0.5), 制备 RNA 加载缓冲器。使用后, 将此缓冲区存储在摄氏-20 摄氏度。
- 从步骤3.2 和混合中添加3µL 的加载缓冲区到 RNA 样本。把样品管放在冰上。
- 将整个采样卷从步骤3.4 加载到凝胶中。加载一个整除的单链 rna 梯子旁边, 以验证 RNA 的大小。用100伏或更低的凝胶, 直到蓝色染料迁移约75% 的方式下来的凝胶。使用凝胶成像系统在紫外线照射下对 RNA 进行可视化。
注意: 一个好质量的 RNA 探针应该显示为一个离散带, 具有与探测器的预期大小相对应的移动性 (图 2,车道 1)。如果探测器显示为漫射和油污波段 (图 2, 车道 2), 则不应使用此方法。
4. 蜱肠收集和固定
- 收集Ixodes scapularis若虫, 它已经为小鼠喂食了感兴趣的时间点。
注: 为了这项技术的目的, 蜱喂养48或 72 h 最好的工作。 - 在解剖显微镜下的玻璃滑梯上, 将肠道从蜱中解剖成 MEMFA (表 1), 尽可能避免对器官造成损伤。在 20-30 µL 的 MEMFA 上, 在干净的显微镜滑梯上放置一个刻度。使用一对不育的高碳钢剃刀刀片 #11 切片的头部区域盾牌座的蜱离开身体的蜱。轻轻按压身体, 将肠道憩和涎腺伸出身体角质层。把涎腺和内脏分开, 在剃刀刀片上舀出内脏。
- 把内脏收集到一个1.5 毫升的管子里, 里面有500µL MEMFA。在室温下以1小时或一夜4摄氏度的温和摇摆的方法孵化试管。
注: 蜱腺也可解剖, 同样固定和染色。 - 用1毫升冰冷100% 乙醇轻轻洗涤3次, 使组织脱水。让内脏在每次洗涤之间自然下沉到管子的底部, 因为离心可能会损伤组织。对于长期贮存, 请将样品在100% 乙醇中保持在-20 摄氏度。
5. 网格样品篮和24井篮架的施工
- 用一把加热的单刃刀片在手术刀上切开2毫升或5毫升顶部离心管的底部。
注意: 刀片可能需要在切割完成前多次被加热。 - 110µm 尼龙网格的切方形比新管开口稍大。将网格与管子的底部粘合在一起, 轻轻地压在中低热的热板上, 直到发出良好的密封。让冷却, 确保没有缝隙之间的网格和管, 并修剪多余的网格周围的边缘。
- 在24井板的盖子上切开孔, 这样, 在步骤5.2 中制作的样品篮的唇会坐在洞里, 而不是掉下去, 产生一个设置, 在那里, 样品篮的底部将坐在井中所有的方式, 当他们放在盖子上有个洞。
- 使用这个合适的篮子持有人把篮子从一个板块转移到另一个, 相对容易的整个就地杂交协议。使用两个24井板, 以便当一个孵化正在发生, 另一板块准备下一次清洗。
6.原位杂交: 1 天 (时间: 4-5 h)
- 转移胆量到标记的样品篮子, 分离由实验情况和意欲的 RNA 探针。
注: 每个条件下染色至少5个内脏, 以解释复制之间的自然变化。 - 水化, 通过逐步提高磷酸盐缓冲盐水与0.1% 非离子表面活性剂 (PTw) 的比例, 温和地避免引入气泡进入组织;表 1)在洗涤中的乙醇。
注: 在常温下用温和搅拌完成所有24井篮保持架的清洗, 除非另行注明。整除 500-600 µL 的洗涤液进入每一个井的持有人, 这样, 在每个篮子的胆量完全淹没。用 DEPC 处理的水制备所有溶液, 防止 RNA 降解。- 在500µL 100% 乙醇中清洗样品5分钟。
- 准备至少500µL 每样篮子 75%, 50%, 25% 乙醇在 PTw. 水化样品通过洗涤每乙醇溶液中的5分钟, 从最高的乙醇浓度转移到最低。
- 在 PTw 中每5分钟洗4次样品。
- 用蛋白酶 K (10 µg/毫升) 在 PTw 中 Permeabilize 样品5分钟。
- 准备与 RNA 探针杂交的组织。
- 清洗样品两次, 如6.2 中所述24井篮持有人在常温下与温和搅拌5分钟每500µL 三乙醇胺缓冲 (0.1 米, pH 7.0-8.0) (表 1), 以保持在无胺环境中的样品。
- 用三乙醇胺 (0.1 米, pH 7.0-8.0) 的500µL 0.25% 醋酸酐对样品进行两次处理, 分别为5分钟, 然后分别在 PTw 中清洗两次样品, 每次5分钟。
注: 醋酸酐 acetylates 游离胺中和正电荷, 这对于防止非特定静电相互作用和确保探针对 mRNA 的特异结合至关重要。 - 固定的胆量为20分钟与500µL 4% 多聚甲醛在 PTw, 然后洗5次在 PTw 每5分钟。
- Prehybridize 通过孵化样品在500µL 杂交缓冲/在24井篮持有人在24井板 (表 1) 为 1.5-2.5 h 在60°c 与柔和的鼓动在摇晃的水浴。保存用于 prehybridization 步骤的杂交缓冲区, 以在2天协议 (步骤 7.1) 中重用。
- 通过稀释杂交缓冲中的 RNA 探针, 制备探针杂交溶液, 最终浓度为1µg/毫升。在24井篮持有者的60°c 中用探针杂交解决方案孵化样品, 在摇晃的水浴中过夜 (表 2). 用铝箔紧贴着篮架的盘子, 以防止杂交溶液的蒸发。
7.原位杂交: 2 天 (时间: 4.5-5.5 h)
- 从探针杂交解决方案中取出样本, 并将它们放入保留的杂交缓冲中, 从前一天开始。孵育60摄氏度, 温和搅拌3分钟。
注: 探针杂交解决方案可能存储在-20 摄氏度, 可重复使用多达3次。 - 通过稀释 DEPC 处理水中的 20x SSC (表 1), 制备2x 盐水钠缓冲液 (SSC)。两次清洗样品3分钟与 2x ssc, 然后3倍20分钟与 2x SSC 在60°c, 以消除所有痕迹探针和杂交缓冲。
- 以 RNase A (20 µg/毫升) 和 RNase T1 (10 µg/毫升) 为30分钟, 37 °c, 以除去代表自由非杂交 rna 的单链 rna 探针。
- 室温下用 2x SSC 清洗一次, 10 分钟。通过稀释 DEPC 处理过的水中的 2x ssc 来制备 0.2x ssc, 然后用 0.2x ssc 清洗两次, 30 分钟到60摄氏度, 以去除多余的 RNases。
- 用500µL 马来酸缓冲液清洗两次 (单克隆;表 1)每人10分钟。
- 用阻断溶液孵化样品 (单克隆中的2% 个阻断剂), 1.5-2 小时。
注: 堵塞试剂不易溶解;温和加热有助于溶解。 - 用抗辛碱性磷酸酶--共轭500µL 的抗体, 用1:3、000的稀释液在阻断溶液中代替阻塞溶液, 在室温下孵化约4小时或4摄氏度。
8.原位杂交: 3 天 (时间: 6 小时到一夜之间)
- 用500µL 单克隆抗体对样品进行至少5次洗涤, 以去除过量抗血清。
注: 这些洗涤是灵活的, 可延长到 1-2 小时, 或 3-4 洗涤可能取代一夜间清洗在4°c, 对功效的影响极小。 - 用碱性磷酸酶缓冲液清洗两次5分钟, pH 值 9.5 (AP 缓冲器;表 1)。
- 先用500µL 的显色基底代替碱性磷酸酶 (材料表), 开始颜色反应。用铝箔覆盖样品板, 让染色在室温下进行 3-5 小时或一夜4摄氏度。在解剖显微镜下观察组织以避免 overstaining, 定期监测染色反应。
注意: 当染色完成后, 在显微镜下反义探测样品中, 可以用眼睛检测到紫色的色调, 但是组织不应被允许变得非常暗。染色的进展非常缓慢, 在4摄氏度, 可能需要多达 20-24 小时。 - 通过在500µL 单克隆中洗涤5分钟来停止颜色反应, 然后在 Bouin 的溶液中过夜修复组织。
注意: 在通风罩中处理 Bouin 的溶液;这是一种腐蚀性致癌物质。
9.原位杂交: 4 天 (时间: 3-3.5 h)
- 在 DEPC 处理的水中稀释 20x ssc, 每样 1x ssc 的样品篮中至少准备7毫升。在 1x SSC 中用70% 乙醇洗涤样品4到6倍, 直到组织不再是黄色时, 去掉 Bouin 的溶液。
- 在 1x SSC 中, 每样篮子准备500µL 75%、50% 和25% 乙醇溶液。在每个溶液中清洗样品5分钟, 从最高乙醇浓度到最低水化组织。在 1x SSC 中每两次清洗5分钟。
- 将漂白液中的样品 (表 1) 孵化为通风罩中灯箱上的90分钟。
注意: 这一步允许样品中的任何色素沉着或从 Bouins 溶液中着色, 并增强探针信号, 以清晰可视化。 - 用500µL 1x SSC 清洗样品两次, 5 分钟。
- 通过将样品篮反转到一个新的24井板中, 然后用转移吸管在网底上冲洗70% 乙醇, 以最小的损伤来迁移内脏。如果需要, 存储在-20 摄氏度。
- 要获得对多个样本的染色模式的概述, 如图 3所示,在24井板中保持70% 乙醇中的内脏, 并与任何明亮的场显微镜进行观察。要检查明亮场显微镜下的单个内脏, 如图 4、图 5和图 6所示, 请在盖玻片下的100% 甘油中安装内脏。使用塑料铲轻轻地操纵组织与最小的伤害。
注: 高粘度甘油有助于保护组织免受压迫, 并允许仔细定位憩, 使组织可以在更高的放大的最佳查看。 - 使用显微镜特定的图像捕获软件 (材料表) 在显微镜上捕获图像, 并将其作为 Tiff 图像导出到通用图像编辑软件中。为了量化实验治疗之间的相对染色差异, 下载一个通用图像分析软件 (材料表)。在分析软件中打开图像, 并使用软件中的指令测量染色的像素强度, 并计算染色的直方图图。
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Representative Results
RNA 探针质量的测量和估计在开始染色之前是关键的。体外转录效率高度取决于 DNA 模板的数量和质量。我们经常在甲醛凝胶上可视化 RNA 探针, 以验证转录反应产生的探针的纯度和数量。探测器应显示为明亮的、离散的波段 (图 2)。分光光度法测定 RNA 浓度, 对探针质量有很高的指示性, 与凝胶带的外观有很好的相关性。因此, 一旦熟悉了协议, 就可以跳过凝胶可视化步骤。无论哪种方式, 重要的是要确保产生足够高品质的 RNA, 因为所有的下游步骤都取决于探针的鲁棒性。
这种技术的力量在于促进对蜱微生物群的广泛观察, 包括细菌种类的存在或缺乏, 随着时间的推移细菌丰度的变化, 以及整个组织中物种的定位。染色量和分布的一些变化是正常的生物复制, 以及7对憩的个体内脏 (图 3), 因此, 最好是染色至少五胆量每一个条件, 以获得平均的想法染色图案。通过比较对每个条件的感觉和反义样本的染色, 最好地衡量该协议的总体成功程度。对于这种类型的分析, 意义示例、重要的负控制应具有最小的紫色颜色 (图 4)。相反地, 反义样本应显示具有最小背景的健壮染色, 其强度将取决于特定细菌记录的丰度。组织内的染色模式也会根据这些参数而变化。重要的是, 必须在相同的时间内开发出意义和反义样品, 以便能够直接比较它们, 所以这些样品应该并行处理。过度的颜色反应可能导致大量的背景染色, 其中感官样本开始看起来类似反义 (图 5)。在议定书的这一步骤中, 应特别注意避免 overstaining, 因为一旦发生这种反应, 就无法逆转。
这是至关重要的, 以确保所有的内脏都完全淹没在每个试剂在每一个步骤;不同样品间的变异增加可能是由于接触试剂的不均匀所致。在收集内脏之前, 刻度的时间量也会对结果产生显著影响。食不果腹或只喂食24小时的蜱很难使用;内脏也更容易损坏, 并且没有很好的着色 (图 6), 这是这个方法的一个限制。为 48-72 小时喂食的蜱是最容易使用的, 因为这些内脏的大小与从24小时喂食的蜱的内脏相比, 更大的胆量, 从后来的时间点的内脏也染色优于 24 h 喂食蜱, 可能是由于细菌负担增加在后期 o喂。72-小时组织通常有轻微的背景棕色色调从血液, 但紫色染色明显可见的色调 (图 4)。在低放大率 (5X 或 10X) 的时候, 最好能用明亮的显微镜观察整个组织的染色模式。以更高的放大率 (如63X 的油目标) 查看全挂载组织, 可能会破坏组织, 因为目标将按下幻灯片, 并根据样品的厚度压缩组织。如果需要更高的分辨率成像, 应检查组织切片的可能性。
图 1.探头生成的模板准备示意图.将 16S rRNA 扩增子克隆成包含 T7 和 Sp6 启动子的 TA 克隆载体。进行线性化使用限制酶在站点a或b 上剪切用于体外转录的构造, 使用 T7 或 Sp6 启动子分别生成感觉或反义探针。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2.用凝胶电泳技术进行 RNA 探针的可视化.RNA 探针 (700 ng) 被电泳在甲醛琼脂糖凝胶上, 在紫外光下可视化, 并使用商业凝胶成像系统进行成像。有代表性的好品质, 1 车道;和质量较差的 RNA 探针, 2 车道。
图 3.一个代表性的概述了全装入的原位杂交48的 h-喂养的胆量。从蜱中提取的 48 h 的内脏与保守的16S 核糖体 rna 序列的反义 rna 互补, 显示肠道憩的鉴别染色。缩放栏代表200µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 4.在Ixodes scapularis内脏中成功进行全装入原位杂交的代表性图像。从计时器中提取的来自刻度的内脏用任何一种感官 (阴性控制) 或反义 RNA 探针染色。反义探针是互补的一个保守的16S 核糖体 rna 序列 (通用 16S) 或 16S RNA 序列特定的特定细菌属 (如所示)。肠球菌没有在48小时内产生强健的染色. 鳞片条代表140µm.请单击此处查看此图的更大版本.
图 5.延长显色反应时间导致非特异染色.48小时的虱子的内脏用一种感觉 RNA 探针或反义探针与守恒的 16S RNA 序列进行了探测。组织用碱性磷酸酶基质 BM 紫色过夜在4摄氏度, 然后在室温约4小时, 然后停止反应。刻度条代表140µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6.使用食不果腹或24h 喂食蜱内脏的全装入原位杂交。从食不果腹或24小时喂食的蜱的内脏被染色使用感觉 RNA 探针或反义探针互补的一个保守的 16S RNA 序列或一个特定的序列属立克次体.反义样品中的染色比在以后的时间点观察到的健壮性较差, 内脏也更容易受损。刻度条代表60µm.请单击此处查看此图的较大版本.
| 名字 | 最终浓度 | 最终 pH 值 | 存储便笺 |
| MEMFA | 0.1 M 拖把 | - | 室温 |
| 2毫米 EGTA | |||
| 1毫米硫酸镁 | |||
| 3.7% 甲醛 | |||
| 补间 PBS (PTw) | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | 7。0 | 室温 |
| 0.1% Tween-20 | |||
| 三乙醇胺缓冲 | 1x PBS | 7.0-8。0 | 室温 |
| 0.1 米三乙醇胺 | |||
| 杂交缓冲 | 50% 甲酰胺 | - | -20 °c |
| 5x SSC | |||
| 1毫克/毫升 Torula RNA | |||
| 100µg/毫升肝素 | |||
| 1x. Denhart 的解决方案 | |||
| 0.1% Tween-20 | |||
| 0.1% 章 | |||
| 10毫米 EDTA | |||
| 马来酸缓冲液 (单克隆) | 100毫米马来酸 | 7。0 | 室温 |
| 150毫米氯化钠 | |||
| 碱性磷酸酶 (AP) 缓冲液 | 100毫米三 | 9。5 | -20 °c |
| 50毫米氯化镁 | |||
| 100毫米氯化钠 | |||
| 0.1% Tween-20 | |||
| 5毫米 levamisol | |||
| 漂白液 | 1% 过氧化氢 | - | 准备新鲜 |
| 5% 甲酰胺 | |||
| 0.5x SSC |
表1。协议中使用的解决方案的食谱。
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Discussion
这是首次使用全装入式原位杂交 (WMISH) 技术研究病原体节肢动物载体的微生物群。我们的协议是从一个用于研究开发在果蝇和青蛙胚胎25,26。全挂载 RNA原位杂交已被常规地用于本地化基因转录的空间和世俗的27和可视化的转录可以做的明亮领域或荧光显微镜。我们采用前者对蜱内脏的微生物进行检测。需要注意的是, 尝试使用整个刻度来执行全装入的就地杂交, 其中的头部区域被移除以允许穿透固定器和杂交解决方案是不成功的。这里描述的协议利用解剖的胆量, 并已实施研究特定蜱蛋白对细菌定植的影响中肠23。从 WMISH 获得的信息可与免疫组化相比, 但它的优点是不需要产生蛋白质和抗体的基因或蛋白质的兴趣。基因组信息足以生成 WMISH 试剂。WMISH 和鱼类 (荧光原位杂交) 都能检测出基因的表达。然而, 由于它是一种酶和色原的检测, WMISH 有优势, 颜色发展可以积极监测, 并允许进行的反应, 直到预期的信号和灵敏度达到。它完全适合自动化, 易于扩展到高通量格式。不像鱼类和免疫组化, 不需要切片。WMISH 对鱼类的不利之处在于, 只有2种不同的基因或基因可以同时处理, 并且需要用不同的核苷酸类似物标记探针, 如辛双绞线和荧光素-utp28。与鱼, 6 不同的基因可以被审查在一个化验29。虽然这两种化验都需要相当的时间, 但荧光染料的成本比显色基板高。鱼的化验也需要一个荧光显微镜的图像可视化, 而 WMISH 图像可视化可以执行任何光显微镜。
必须密切遵守《议定书》;然而, 有些步骤需要特别小心。从蜱中中肠剥离而不损害组织需要一些灵巧。这可能是谨慎的收集额外的蜱, 以实践解剖和获得熟练程度。由于不同憩个体内脏染色的异质性 (图 3), 重要的是检查每个肠道的憩, 得出细菌丰度的确凿证据。为了获得关于不同憩中特定细菌的存在、空间分布和丰度的结论性信息, 对每个实验条件进行几个内脏 (至少 5) 的处理也很重要。生产高质量的 RNA 探针对有效组织染色也是至关重要的。还必须确认克隆向量中探针模板的序列, 以确保正确生成反义和感测探针。一个生产性的体外转录反应需要足够的模板 DNA;至少可以使用 100 ng, 但建议采用 0.5-1 µg 进行最佳探针生成。
在本协议中使用样品篮和24井板, 避免了在每次洗涤步骤中对组织进行直接操作, 从而最大限度地减少了染色过程中的损伤。然而, 样品仍然偶尔地丢失或损坏;从样品篮转移到长期贮存容器, 从食不果腹或24小时喂食的虱子, 尤其难以看清, 容易丢失。在处理这些样品时应额外注意。由于这一限制, 我们主要使用了48和72的 h 喂食蜱内脏。在这些时间点 (长于72小时) 的内脏中存在大量的血餐, 干扰了来自于血液中的非特定背景的染色和可视化, 也给这种技术带来了局限性。使用荧光标记的探测器可能会绕过这个问题。
染色过程的最重要方面是建立鲁棒染色和低背景信号之间的平衡。理想的颜色开发的时间可以根据实验条件而变化。因此, 最好在室温下进行颜色反应, 并大约每30分钟对颜色的发展进行监测。该反应也可能被设置为进行隔夜在4°c, 以减缓颜色的发展。然而, 不要让这种反应长期进行, 这是极其重要的。染色反应可能难以通过眼睛进行监测, 因此应在解剖显微镜下检查样品。在用反义 rna 探测的样品上, 紫色调应该是可见的, 而用感觉 rna 探测的样品应该保留最小的颜色。如果检测到的 RNA 探测样品颜色鲜艳, 故障排除步骤应从减少孵化时间与 BM 紫色和增加阻塞时间开始。与反义探针相比, 有时感探针会引起异常高的背景;在这些情况下, 可能需要考虑基因的不同区域来生成 RNA 探针。在给定样本中没有表示的 DNA 序列也可以被视为生成负控制探针的模板。例如, 可以利用 DNA 模板对绿色荧光蛋白区域进行编码, 而不是在蜱基因组或其微生物群中表现出来。
这种技术的一个局限性是, 分析在很大程度上是定性的;但是, 图像分析软件 (材料表) 可以用来测量每个样本中的染色信号量。这将允许在不同的实验条件下对各种细菌的丰度进行半定量比较。虽然这是一个耗时的协议, 需要 3-4 天才能完成, 但这并不费力;每天的实际操作时间平均约为 3-5 小时。然而, 处理许多样品的能力与样品篮子和持有者的使用平行, 允许高通量分析。此外, 这一过程可以使用商业上可用的工具 (材料表)进行自动化, 如果本议定书有望成为研究实验室的一个必要和例行的组成部分, 可利用商业上提供的与自动化兼容的平台 (材料表), 以进一步减少实际操作时间。
被描述的协议使用 digoxygenin 标记的探针, 允许生产比色信号可以使用明亮的领域显微镜成像。虽然我们利用了一个显色基板来检测特定于单个目标的杂交 RNA 探针, 同时也可以通过标记探针与不同的核苷酸类似物 (如辛 UTP 和荧光素-双绞线和不同的显色基板30。组织样本可以依次孵化与碱性磷酸酶耦合抗体对辛和荧光素, 对两个步骤不同的显色反应。这项技术也可以适用于荧光标记的探针, 这可以促进高分辨率成像使用共焦显微镜31 , 并提供了使用不同颜色的多个探头并行的选择。这种技术只能在一个样品中一次专门评估一些微生物。但是, 可以用高通量检测来评估几种样本, 以解决在蜱微生物群中可能代表的多种微生物。
最后, 该技术不仅限于调查蜱及其相关微生物群之间的相互作用。在蜱基因组内的任何感兴趣基因的互补探针可以产生, 并用于检查不同组织中特定基因的丰度和定位。蜱的涎腺也可以处理和分析类似的肠道。总的来说, 这项技术具有广泛的适应能力的研究, 对微生物群落的动态在其他节肢动物病媒感兴趣。
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Disclosures
作者没有披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们衷心感谢耶鲁大学的穆斯塔法 Khokha 博士提供了他的实验室资源的使用。我们感谢明洁吴先生的出色技术援助。EF 是 HHMI 的调查员。这项工作得到了来自约翰 Monsky 和珍妮弗毛巾 Monsky 莱姆疾病研究基金的礼物的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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