Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at rumligt og tidsligt vurdere tilstedeværelsen af levedygtige mikrobiota i kryds modet ved hjælp af en modificeret hele-mount in situ hybridisering tilgang.
Abstract
Smitsomme sygdomme, der overføres af leddyr vektorer fortsætte med at udgøre en væsentlig trussel mod menneskers sundhed på verdensplan. De patogener, der forårsager disse sygdomme, eksisterer ikke isoleret, når de kolonisere vektor; snarere, de sandsynligvis engagere sig i interaktioner med hjemmehørende mikroorganismer i tarm lumen. Vektor mikrobiota har vist sig for at spille en vigtig rolle i patogen transmission for flere vektor-bårne sygdomme. Om bopæl bakterier i tarmen af Ixodes scapularis kryds, vektor af flere menneskelige patogener herunder Borrelia burgdorferi, påvirke kryds transmission af patogener er ikke fastlagt. Vi kræver metoder for kendetegner sammensætningen af bakterier forbundet med kryds tarmen til at fremme en bedre forståelse af potentielle interspecies interaktioner i kryds gut. Ved hjælp af hele-mount i situ hybridisering til at visualisere RNA udskrifter tilknyttet særlige bakteriearter giver mulighed for indsamling af kvalitative data med hensyn til forekomsten og fordelingen af mikrobiota i intakt væv. Denne teknik kan bruges til at undersøge ændringer i gut mikrobiota milieu i løbet af kryds fodring og kan også anvendes til at analysere udtryk for kryds gener. Farvning af hele kryds indvolde udbytte oplysninger om grov rumlige fordeling af target RNA i vævet uden behov for tre-dimensionelle genopbygning og påvirkes mindre af miljøforurening, der ofte tilintetgør sekventering-baseret metoder ofte brugt til at studere komplekse mikrobielle samfund. Samlet set er denne teknik et værdifuldt redskab, der kan bruges til bedre forstå vektor-patogen-mikrobiota interaktioner og deres rolle i smitteoverførsel.
Introduction
Menneskelige og animalske patogener, der overføres af leddyr vektorer findes over hele verden og tegner sig for omkring 20% af smitsomme sygdomme globalt1, men effektive og sikre vacciner mod de fleste af disse patogener er ikke tilgængelige. Vores forståelse af den vigtige rolle, commensal, symbiotisk og patogene mikroorganismer, kollektivt kendt som microbiome2, i modulerende og udformningen af næsten alle metazoans3 sundhed ekspanderer. Det er nu klart, at leddyr vektorer af patogener også havnen gut mikrobiota og disse vektor-associerede mikrobiota har vist sig at påvirke forskellige vektor-bårne patogener4,5. Leddyr microbiome er sammensat af eubacteria, archaea, vira og eukaryote mikrober såsom protozoer, nematoder og svampe6. Men den fremherskende forskningsfokus har været på eubacteria skyldes, dels at tilgængeligheden af markørgener og reference databaser at identificere specifikke bakteriel medlemmer.
Med fokus på Ixodes scapularis, kryds vektor af flere menneskelige patogener herunder Borrelia burgdorferi7, , det agens af Lyme sygdom, optimering af en mikrobiel visualisering teknik var rettet mod forbedre vores forståelse af kryds gut mikrobiota i forbindelse med vektor-patogen interaktioner. Flere spørgsmål forbliver ubesvaret i feltet kryds microbiome. Tarmen er stedet for den første udvidede møde mellem kryds og indgående patogenet i forbindelse med vandret overføres patogener; Derfor vil forståelse af vektor gut mikrobiota i modulerende vektor-patogen interaktioner rolle afsløre meningsfuld indsigt. Tæger har en enestående tilstand af blodmel fordøjelsen, hvor behandlingen af blodmel komponenter finder sted intracellulært8. Tarm lumen tilsyneladende fungerer som et fartøj indeholder blod måltid som tick feeds, og næringsstof fordøjelse og assimilation opstå i hele flere dage af fodring og fortsætte efter repletion. Patogener erhvervet af kryds under fodring Angiv tarm lumen sammen med blodmel og dermed lumen bliver en primære websted af interaktioner mellem kryds, patogen og bosiddende mikrobiota. Som fordøjelse provenuet gennem repletion og Ixodid kryds molting, gennemgår gut strukturelle og funktionelle ændringer9. Sammensætning og den rumlige organisering af tarm bakterier er også tilbøjelige til at variere i koncert med de skiftende gut milieu. Det er derfor vigtigt at forstå arkitekturen i resident bakterier i kryds tarm til fuldt ud at forstå samspillet mellem kryds, patogen og gut mikrobiota.
Molekylære teknikker til at beskrive vært-associerede mikrobiota rutinemæssigt udnytte høj overførselshastighed parallelle sekventering strategier10 for at forstærke og sekvens bakteriel 16S ribosomale DNA (rDNA). Disse sekventering strategier omgå nødvendigheden af at opnå axenic kulturer af specifikke bakterier og giver en detaljeret beskrivelse af alle bakteriel medlemmer repræsenteret i stikprøven. Sådanne strategier er dog forvirret af manglende evne til at skelne mellem miljømæssige forureninger fra Bonafide beboere. Yderligere, når vurderingen af prøver, som flåter, som er små i størrelse og dermed indeholder lav mikrobiota-specifikke DNA udbytter, sandsynligheden for forstærkning af miljøforurenende er øget11 og resultater i den tvetydige fortolkning af Microbiome sammensætning. Funktionelle karakterisering i forbindelse med visualisering af specifikke levedygtige bakterier vil derfor være afgørende at definere og skelne microbiome af kryds, tidsmæssigt og rumligt. Mod dette mål tog vi fordel af hele-mount RNA i situ hybridisering. Denne teknik bruges rutinemæssigt til at vurdere gen expression mønstre i organer og embryoner12,13,14 og giver mulighed for semikvantitativ analyse af udtryk over hele prøven af interesse. Dette adskiller sig fra traditionelle i situ hybridisering teknikker, der anvender væv sektioner og ofte kræver omfattende analyse af sektioneret materiale med en beregningsmæssige forsamling at forudsige udtryk i hele organer15. Mens hele-mount generelt henviser til hele organismer12, refererer her hele-mount til hele indvolde eller organer. Fordelene ved at bruge hele-mount RNA i situ hybridisering tilgang til at vurdere arkitektur af kryds gut mikrobiota er multifold. Kryds gut er sammensat af 7 par af Divertikler, hvert par varierende i størrelse16. Den funktionelle forskelle, kryds hvis nogen blandt disse Divertikler, ikke er forstået i forbindelse med kryds biologi, mikrobiota eller kryds-patogen interaktioner. Manipulationer af tarmen, at briste gut Divertikler vil fortrænge mikrobiota stede i tarm lumen eller dem løst tilknyttet gut og fører til fejlfortolkning af den geografiske lokalisering af mikrobiota. Fluorescens-mærket RNA i situ hybridisering er blevet udnyttet tidligere for at undersøge kryds gut udskrifter17 ved fastsættelse og åbne individuelle gut diverticula at sikre sonde hybridisering og lokalisere B. burgdorferi udskrifter af skæring paraffin-embedded hele flåter18. Begge disse metoder kræver manipulationer af kryds væv inden hybridisering, der ville påvirke gut mikrobiota arkitekturen.
I denne betænkning beskriver vi i detaljer protokollen for at undersøge levedygtige kryds gut mikrobiota bruger hele-mount i situ hybridisering (WMISH). Brug af hele-mount RNA i situ hybridisering muliggør en global forståelse af tilstedeværelsen og overflod af specifikke tarm bakterier i de forskellige regioner i tarmen og kan anspore til nye indsigter i kryds gut biologi i forbindelse med patogenet kolonisering og transmission. Yderligere, brugen af RNA-sonder rettet mod specifikke bakterielle RNA giver mulighed for påvisning af levedygtige bakterier i kryds gut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af DNA skabeloner
- Download 16S rRNA sekvens specifikke hver bakteriel slægter fra NCBI database og design Polymerasekædereaktionen (PCR) kompatibel frem og bak primere, der vil forstærke slægter-specifikke regioner (~ 200-250 basepar lang), som beskrevet tidligere 19. også henvise de open source-databaser SILVA20,21 probeBase22 online ressourcer for rRNA-målrettet oligonukleotid sonder og primere, som RNA-sonder til nogle bakteriel slægter kan være kommercielt tilgængelige.
Bemærk: Det er vigtigt at vælge gen regioner, der er specifikke for specifikke slægter og sikre, at designet primere ikke forstærke relaterede bakteriel slægter. Dette er afgørende for at opnå gen/slægter-specifikke sonde hybridisering. - Feed flåter, 24, 48 eller 72 h på mus, dissekere kryds indvolde og forberede RNA og cDNA fra kryds tarme som beskrevet tidligere23. Brug cDNA som skabelon til PCR forstærke slægter-specifikke amplikoner ved hjælp af en thermocycler. Køre en alikvot af PCR-produkt/amplikon på en 1,5%-agarosegel og bekræfte at amplikonen svarer til den forventede størrelse af visualisering under ultraviolet (UV) lys ved hjælp af en gel imaging system.
- Klon bakteriel 16S ribosomale RNA amplikon af interesse i en kommercielt tilgængelig TA vektor (Table of Materials) indeholdende RNA polymerase initiativtagere egnet til bacteriophage polymeraser (SP6, T7 eller T3). Sekvens kloner til at bekræfte identiteten på amplikonen og retning for indtastning af klon med hensyn til hver af initiativtagerne. På den baggrund afgøre promotor af valg til at skabe mening eller antisense RNA sonder (figur 1).
- Linearize 1 mg af plasmid med en passende begrænsning enzym i en reaktion volumen af op til 30 µLfor 2 h ved temperaturer, der anbefales af fabrikanten. Vælg restriktionsenzymer baseret på selskabet, der vil blive udnyttet til at generere forstand eller antisense sonde (figur 1). Kontrollere linearisering af visualisering af 2 µL af digest reaktion på en 1%-agarosegel.
- Rense de resterende 28 µL af fordøjet DNA ved hjælp af en kommercielt tilgængelig PCR produkt kolonne rensning kit og kvantificere DNA koncentration af Spektrofotometer.
Bemærk: Nogle følelse sonder kan forårsage baggrund farvning meget højere end de tilsvarende antisense sonde og andre muligheder skal undersøges. Alternative negative kontroller omfatter plasmider kodning sekvenser ikke er repræsenteret i stikprøven eller en anden sonde, der giver et karakteristisk mønster af hybridisering.
2. opførelsen af Digoxygenin-UTP RNA-sonder
- Forberede nukleotid mix ved at kombinere 7,5 µL af 100 mM UTP, 25 µL af 10 mM digoxygenin-UTP og 10 µL hver 100 mM ATP og GTP CTP i en 1,5 mL centrifugeglas.
- Udføre i vitro transskription ved hjælp af kommercielt tilgængelige T7 eller Sp6 RNA polymerase kits, ved hjælp af 1 µL af nukleotid mix (trin 2.1) og 0,25 - 1 µg af DNA-template. Bringe volumen op til 20 µL med vand. Svirp røret for at kombinere og puls spin. Der inkuberes ved 37 ° C i 2,5-3 h.
Bemærk: Sonden konstruktion har været vellykket med fordøjet plasmid koncentrationer fra så lavt som 7 ng/µL, men typiske koncentrationer på dette trin spænder fra 15-25 ng/µL. Transskription reaktion kan også være inkuberes natten over ved 37 ° C, men dette væsentligt øger ikke RNA udbytte. - Tilføj 1 µL af DNase (2.000 enheder/µL) og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Overstiger ikke 10 min, eller enzymet kan begynde nedværdigende RNA.
- Tilføj 30 µL af iskold 7,5-8 M lithium chlorid og 30 µL kølet nukleasen-gratis vand at udfælde RNA. Svirp røret til mix. Tillad udfældning af RNA fortsætte natten over ved-20 ° C.
- Indsamle RNA ved centrifugering ved 17.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Vaske pellet engang med 1 mL af frisklavede 75% ethanol i diethylether pyrocarbonate (DEPC) vand, derefter gentage centrifugering.
- Fjerne og supernatanten, vend røret på et rent stykke køkkenrulle, og lad tørre i 10 min. resuspenderes i nukleasen-gratis vand. Hvis pelleten er let synlige, resuspend i 25 µL. Hvis pelleten er meget små eller ikke synlige, resuspend i 15-20 µL. få et estimat af RNA-koncentrationen af Spektrofotometer.
Bemærk: Typisk RNA koncentrationer spænder fra 200-500 ng/µL.
3. visualisering af RNA sonder af RNA formaldehyd gelelektroforese at vurdere RNA renhed
Forsigtig: Formaldehyd udgør en fare for indånding; Derfor generer de løsninger, der kræves til RNA gel analyse i et stinkskab. Ethidiumbromid er mistænkt kræftfremkaldende; håndterer med omhu.
- Forberede en 1% formaldehyd agarosegel, som tidligere beskrevet24 og støbt gel i en gel boks gratis af RNases. Når den er afkølet, udfylde boksen gel med 1 x kører buffer (1 x MOPS på pH 7,0, 5% formaldehyd).
- Forberede prøvebuffer (5 µL 400 mg/mL ethidiumbromid, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL formaldehyd og 100 µL formamid). Kombiner 2 µL af RNA sonde (trin 2.6) med 8 µL af prøvebuffer. Der inkuberes ved 70 ° C i 10 min.
- Forberede RNA Loading bufferen ved at kombinere 5 mL 50% glycerol, 1 mL 10% formaldehyd, 40 mg bromophenol blå, 40 mg xylen cyanol og 20 µL af 0,5 M EDTA (pH 7,5). Efter brug, gemme denne buffer ved-20 ° C.
- Tilsæt 3 µL af Loading bufferen til RNA stikprøve fra trin 3.2 og bland. Holde prøveglassene på is.
- Indlæse hele prøven volumen fra trin 3.4 i gelen. Indlæse en alikvot af enkeltstrenget RNA stigen sideløbende at kontrollere RNA størrelse. Kør gelen på 100 V eller lavere indtil det blå farvestof trækker ca 75% af vejen ned gel. Visualisere RNA under UV-lys ved hjælp af en gel imaging system.
Bemærk: En god kvalitet RNA sonde skal vises som et diskret band med en mobilitet, svarende til den forventede størrelse af sonde (figur 2, lane 1). Hvis sonden vises som en diffus og smeary band (figur 2lane 2) det ikke bør anvendes.
4. tick Gut samling og fiksering
- Indsamle Ixodes scapularis nymfer, der har fodret på mus til tid interessepunkter.
Bemærk: Med henblik på denne teknik, flåter fodret i 48 eller 72 h arbejde bedst. - Dissekere gut fra kryds ind i MEMFA (tabel 1) på et glas dias under en dissektion mikroskop, for at undgå skade på orglet så meget som muligt. Placere et kryds på et rent objektglas i 20-30 µL af MEMFA. Med en steril high-carbon stål barberblad #11 skive regionen hoved på scutum af kryds forlader kroppen af kryds. Tryk forsigtigt på kroppen til at skubbe tarmen Divertikler og spytkirtler ud kroppen neglebånd. Adskille spytkirtlerne og tarmen og øse modet på barberblad.
- Indsamle modet til en 1,5 mL rør indeholdende 500 µL MEMFA. Inkuber rør ved stuetemperatur med blid vuggende for 1 time eller natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Kryds spytkirtlerne kan også være dissekeret og ligeledes fastsættes og farves. - Dehydrere væv af vask forsigtigt 3 gange med 1 mL iskold 100% ethanol. Lad modet synke naturligt til bunden af røret mellem hver vask, da centrifugering kan beskadige vævet. Til langtidsopbevaring, holde prøverne i 100% ethanol ved-20 ° C.
5. konstruktionen af Mesh prøve kurve og 24-godt kurv indehaveren
- Skær bunden ud 2 mL eller 5 mL snap-top centrifugeglas ved hjælp af et opvarmet enæggede barberblad på en skalpel.
Forsigtig: Bladet kan være nødvendigt at være genopvarmet flere gange, før snittet er afsluttet. - Skær kvadraterne af en 110 µm nylon mesh lidt større end de nye rør åbning. Bond trådnet til bunden af røret ved at trykke dem sammen let ind på en varm tallerken på medium-lav varme indtil der foreligger en god tætning. Lad afkøle, sikre, at der er nogen huller mellem trådnet og røret og trim overskydende mesh omkring kanterne.
- Skære huller i dække af en 24-godt plade, sådan, at læbe af prøven kurven i trin 5.2 vil sidde i hullet og ikke falder igennem, giver et set-up, hvor bunden af prøven kurve vil sidde hele vejen i brøndene når de er placeret i den huller i dækslet.
- Brug denne monteret kurv indehaveren til at overføre kurve fra den ene plade til den anden med relativ lethed under hele i situ hybridisering protokollen. Bruge to 24-godt plader, så mens en inkubation sker, anden pladen er forberedt til den næste vask.
6. in Situ hybridisering: dag 1 (Timing: 4-5 h)
- Overførsel modet til at mærket prøve kurve, adskilt af eksperimentelle tilstand og bestemt RNA sonde.
Bemærk: Pletten mindst 5 indvolde pr. betingelse for at tage højde for naturlige variation blandt replikater. - Rehydrere prøver forsigtigt for at undgå at indføre luftbobler i vævet ved gradvist at øge forholdet mellem fosfatbufferet saltopløsning med 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof (PTw; Tabel 1) ethanol i vasker.
Bemærk: Fuldføre alle vasker i 24-godt kurv indehaveren ved omgivende temperatur med blid agitation, medmindre andet er angivet. Alikvot 500-600 µL af vask løsninger i hver brønd af indehaveren sådan at modet i hver kurv helt neddykket. Forberede alle løsninger med DEPC-behandlet vand for at undgå RNA nedbrydning.- Vask prøver i 5 min i 500 µL 100% ethanol.
- Forbered mindst 500 µL pr. sample kurv på 75%, 50% og 25% ethanol i PTw. rehydrere prøverne ved vask i 5 min i hver ethanol opløsning, bevæger sig fra den højeste ethanol koncentrationen til det laveste.
- Vask prøverne 4 gange for 5 min i PTw.
- Permeabilize prøver med Proteinase K (10 µg/mL) i PTw i 5 min.
- Forberede væv til hybridisering med RNA-sonder.
- Vask prøver to gange som beskrevet i 6.2 i 24-godt kurv indehaveren ved omgivende temperatur med blid agitation for 5 min med 500 µL triethanolamin buffer (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tabel 1) for at opretholde prøver i en Amin-frit miljø.
- Behandle prøver to gange med 500 µL 0,25% eddikesyreanhydrid i triethanolamin buffer (0,1 M, pH 7,0-8,0) i 5 min, så vask prøverne to gange i PTw i 5 min.
Bemærk: Den eddikesyreanhydrid acetylates gratis aminer for at neutralisere positive ladning, som er afgørende for at forhindre ikke-specifikke elektrostatiske interaktion og sikre specifikke binding af sonde til mRNA. - Løse indvolde i 20 min. med 500 µL 4% PARAFORMALDEHYD i PTw, derefter vaskes 5 gange i PTw i 5 min.
- Prehybridize af inkubere prøver i 500 µL hybridisering buffer /in 24-godt kurv indehaveren i 24 godt plade (tabel 1) for 1,5-2,5 timer ved 60 ° C med blid agitation i en rystende vandbad. Gem den hybridisering buffer, der bruges til prehybridization skridt for at genbruge i dag 2-protokol (trin 7.1).
- Forbered sondens hybridisering løsninger ved at fortynde RNA-sonder i hybridisering buffer til en endelig koncentration på 1 µg/mL. Inkuberes prøver med sonden hybridisering løsninger i 24-godt kurv indehaveren på 60 ° C med blid agitation natten over i en rystende vandbad (tabel 2). Dække pladen transporterer kurv holder stramt med aluminiumsfolie for at forhindre fordampning af hybridisering løsning.
7. in Situ hybridisering: dag 2 (Timing: 4,5-5,5 h)
- Fjernes prøverne fra sonden hybridisering løsninger og placere dem i den reserverede hybridisering buffer fra den foregående dag. Inkuber ved 60 ° C med blid agitation i 3 min.
Bemærk: Sonde hybridisering løsninger kan opbevares ved-20 ° C til genbrug op til 3 gange. - Forbered 2 x saltvand-natrium citratbuffer (SSC) ved at fortynde 20 x SSC i DEPC-behandlet vand (tabel 1). Vaske prøver to gange i 3 min. med 2 x SSC, så 3 gange i 20 min. med 2 x SSC på 60 ° C til at fjerne alle spor af sonden og hybridisering buffer.
- Behandling med RNase en (20 µg/mL) og RNase T1 (10 µg/mL) i 2 x SSC i 30 minutter ved 37 ° C til at fjerne enkelt strandede RNA sonde der repræsenterer gratis ikke-hybridiseret RNA.
- Vask en gang med 2 x SSC i 10 min ved stuetemperatur. Forberede 0,2 x SSC ved at fortynde 2 x SSC i DEPC-behandlet vand, derefter vaskes to gange med 0,2 x SSC i 30 min. ved 60 ° C til at fjerne overskydende RNases.
- Vaskes to gange med 500 µL af maleinsyre buffer (MAB; Tabel 1) for 10 min hver.
- Inkuber prøver med blokering løsning (2% blokerende reagens i MAB) til 1,5-2 h.
Bemærk: Den blokerende reagens kan være vanskeligt at opløse; blid varme aids opløsning. - Erstatte den blokerende løsning med anti-digoxigenin alkalisk fosfatase-konjugeret 500 µL antistof ved 1:3,000 i blokerende løsning og inkuberes ved stuetemperatur i ca 4 timer eller ved 4 ° C natten over.
8. in Situ hybridisering: dag 3 (Timing: 6 h til overnatning)
- Vask prøver mindst 5 gange i 30 min med 500 µL MAB at fjerne overskydende antistof.
Bemærk: Disse vasker er fleksibel og kan udvides til 1-2 h, eller 3-4 vasker kan erstattes af en overnight vask ved 4 ° C med minimal indvirkning på effektiviteten. - Vask to gange for 5 min med alkalisk fosfatase buffer, pH 9,5 (AP buffer; Tabel 1).
- Begynde den farve reaktion ved at erstatte den sidste vask med 500 µL af den kromogent substrat for basisk fosfatase (Tabel af materialer). Dække prøve plade med alufolie og lad farvning fortsætte ved stuetemperatur for 3 - 5 timer eller natten over ved 4 ° C. Overvåge den farvning reaktion med jævne mellemrum ved at få vist vævet under et dissekere mikroskop for at undgå overstaining.
Bemærk: Når farvning er fuldført, en lilla nuance kan påvises med det blotte øje i antisensstoffer-aftestede prøverne under mikroskopet, men væv må ikke blive meget mørk. Farvning provenuet meget langsomt ved 4 ° C og kan tage op til 20-24 h. - Farve reaktionen standses ved vask i 5 min i 500 µL MAB, så fix vævet natten over i Bouins løsning.
Forsigtig: Håndtere de Bouin løsning i et stinkskab; Det er en ætsende kræftfremkaldende.
9. in Situ hybridisering: dag 4 (Timing: 3-3,5 h)
- Forbered mindst 7 mL pr. sample kurv af 1 x SSC af fortynde 20 x SSC i DEPC-behandlet vand. Fjern de Bouin løsning ved at vaske prøver 4-6 gange med 70% ethanol i 1 x SSC indtil væv, der ikke længere er gul.
- Forberede 500 µL pr. sample kurv af 75%, 50% og 25% ethanol løsninger i 1 x SSC. Vask prøver i 5 min i hver løsning, flytter fra højeste ethanol koncentrationen til laveste at rehydrere væv. Vaskes to gange for 5 min hver i 1 x SSC.
- Inkuber prøver i blegemiddelopløsning (tabel 1) i 90 min. på en lightbox i et stinkskab.
Bemærk: Dette trin giver mulighed for nogen pigmentering i prøver eller farve fra Bouins løsning skal fjernes og forbedrer sonde signal for klare visualisering. - Vaske prøver to gange med 500 µL af 1 x SSC i 5 min.
- Flytte modet med minimal skade af invertere prøve kurv i en brønd med en ny 24-godt plade og vask med 70% ethanol i mesh bunden ved hjælp af en overførsel pipette. Opbevares ved-20 ° C hvis nødvendigt.
- Bevare modet i 70% ethanol i 24 godt-plade og se med nogen lysfelt mikroskop for at få overblik over de farvning mønstre af flere prøver, som vist i figur 3, . At undersøge individuelle indvolde under et mikroskop for lyse-feltet som vist i figur 4, figur 5, og figur 6, montere indvolde i 100% glycerol under coverslips. Brug en plastik spatel til at forsigtigt manipulere væv med minimal skade.
Bemærk: Høj viskositet af glycerol hjælper med at beskytte væv fra skader af kompression og giver mulighed for omhyggelig placering af diverticula at vævet kan ses optimalt på højere forstørrelser. - Capture billeder på mikroskop ved hjælp af mikroskop specifikke image capture software (Table of Materials) og eksporteres som Tiff billeder et generiske billedredigering software. For at kvantificere de relative farvning forskelle mellem eksperimentelle behandlinger, download et standardbillede analyse software (Tabel af materialer). Åbn billedet i analyse software og bruge instrukser inden for software til at måle pixel intensiteten af farvning og beregne histogrammet parceller af farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Måling og vurdering af kvaliteten af RNA-sonder er kritiske forud for begyndelsen farvning. In vitro transskription effektivitet afhænger meget af mængden og kvaliteten af DNA-template. Vi visualiseret rutinemæssigt RNA-sonder på en formaldehyd gel til at kontrollere renhed og mængden af sonden genereret af transskription reaktioner. Sonderne bør fremstå som lyse, diskrete bands (figur 2). Spektrofotometriske målinger af RNA-koncentrationen var meget betegnende for sonden kvalitet og korreleret godt med udseendet af bands på gelen. Således kan gel visualisering skridt hoppet hvis det ønskes når fortrolighed med protokollen er nået. Uanset hvad, det er vigtigt at sikre, at produceret tilstrækkeligt RNA af høj kvalitet, som alle efterfølgende trin afhænger af sonder robusthed.
Styrken af denne teknik er at lette generelle bemærkninger om kryds mikrobiota, herunder tilstedeværelse eller fravær af bakteriearter, ændringer i overflod af bakterier over tid som tick feeds og lokalisering af arter inden for det hele væv. Nogle variation i farvning beløb og distribution er normalt blandt biologiske replikater samt blandt de 7 par af diverticula af individuelle indvolde (figur 3), derfor, det er bedst at plette mindst fem indvolde pr. betingelse for at få en idé om gennemsnittet farvning mønster. Den samlede succes af protokollen måles bedst ved at sammenligne farvning af de følelse og antisensstoffer prøver for hver betingelse. Forstand prøver, vigtige negative kontroller for denne form for analyse, skal have minimal til ingen lilla farve (figur 4). Omvendt kan skal antisense prøver vise robust farvning med minimal baggrund, intensiteten af som vil afhænge af overfloden af de specifikke bakteriel udskrifter er målrettet. Den farvning mønster inden for væv vil også variere baseret på disse parametre. Vigtigere, skal fornuft og antisense prøver udvikles i det samme tidsrum for at direkte sammenligne dem, så disse prøver skal behandles parallelt. Pessimismen farve reaktion kan resultere i en høj mængde af baggrunden farvning, hvor forstand prøver begynder at ligne antisensstoffer (figur 5). Særlig omsorg bør tages på dette trin i protokollen til at undgå overstaining, som der er ingen måde at vende reaktionen, når det sker.
Det er afgørende for at sikre alle indvolde er fuldt neddykket i hver reagens under hvert skridt; en forøgelse af variation på tværs af prøver kan skyldes uens eksponering for reagenser. Mængden af tid, flåter er fodret før modet indsamles også har en betydelig virkning på resultaterne. Flåter, der var unfed eller kun fodres i 24 timer var vanskelig at arbejde med; modet var også mere let beskadiget og ikke pletten godt (figur 6) og en begrænsning af denne tilgang på dette tidspunkt. Flåter fodret for 48-72 h var lettest at arbejde med, på grund af den større størrelse af disse indvolde sammenlignet med indvolde fra flåter fodret i 24 h. indvolde fra senere tidspunkter også farves bedre end 24 h-fed flåter, muligvis på grund af stigninger i bakteriel byrden under de senere faser o f fodring. 72-h væv havde ofte en lille baggrund af brun nuance fra blod, men de lilla pletter var klart synlig over nuance (figur 4). Modet ses bedst ved lav forstørrelse (5 X eller 10 X) skal kunne se de farvning mønstre på tværs af hele væv ved hjælp af en lysfelt mikroskop. Ser hele-mount væv ved højere forstørrelse, som med en 63 X olieobjektiv, løber risikoen for at beskadige vævet som målet ville presse mod diaset og komprimere væv på grund af tykkelsen af prøverne. Eventuelt højere opløsning imaging undersøges mulighederne for væv skæring.
Figur 1 . Skematisk af skabelon forbereder sondens generation. Klon 16S rRNA amplikon i en TA kloning vektor indeholdende T7 og Sp6 initiativtagere. Linearize konstruktion ved hjælp af restriktionsenzymer til at skære på websteder en eller b til in vitro- transskription bruge T7 eller Sp6 initiativtageren til at generere forstand eller antisensstoffer sonder henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Visualisering af RNA sonden af gelelektroforese. RNA-sonder (~ 700 ng) var electrophoresed på en formaldehyd agarosegel, visualiseret i UV-lys, og afbildet ved hjælp af en kommerciel gel imaging system. En repræsentativ god kvalitet, lane 1; og dårlig kvalitet RNA sonde, lane 2.
Figur 3 . En repræsentativ oversigt over hele-mount i situ hybridisering af 48 h-fed indvolde. Indvolde fra flåter fodret for 48 h farves med antisensstoffer RNA supplerer en bevaret 16S ribosomale RNA sekvens viser differential farvning af gut diverticula. Skalalinjen repræsenterer 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Repræsentative billeder af succesfulde hele-mount i situ hybridisering i Ixodes scapularis indvolde. Indvolde fra flåter fodret i de angivne tidsrum var farves ved hjælp af enten sans (negative kontrol) eller antisensstoffer RNA sonder. Antisense sonder var supplement til en bevaret 16S ribosomale RNA sekvens (Universal 16S) eller en 16S RNA sekvens specifikke for en bestemt bakteriel slægt (som nævnt). Enterococcus ikke give robust farvning på 48 h. skala barer repræsenterer 140 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 . Langvarig kromogent reaktionstid fører til uspecifik farvning. Indvolde fra flåter fodret til 48 h var probed med en følelse RNA sonde eller en antisense sonde supplerer en bevaret 16S RNA sekvens. Vævet var inkuberes med alkalisk fosfatase substrat BM lilla natten over ved 4 ° C og derefter ved stuetemperatur i ca 4 timer før du stopper reaktionen. Skala søjler repræsenterer 140 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 . Hele-mount i situ hybridisering bruger unfed eller 24 h fodret kryds indvolde. Indvolde fra unfed eller 24 h-fed flåter var plettet brug følelse RNA-sonder eller antisensstoffer sonder supplement til en bevaret 16S RNA sekvens eller en sekvens, der er specifikke for slægten Rickettsia. Farvning i antisense-prøverne er mindre robust end observeret på senere tidspunkter og modet er også mere let beskadiget. Skala søjler repræsenterer 60 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Endelige koncentrationer | Endelige pH | Opbevaring af noter |
| MEMFA | 0,1 M MOPPER | - | Stuetemperatur |
| 2 mM EGTA | |||
| 1 mM magnesium sulfat | |||
| 3,7% formaldehyd | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1 x PBS, 0,1% Tween-20 | 7.0 | Stuetemperatur |
| 0,1% Tween-20 | |||
| Triethanolamin buffer | 1 x PBS | 7.0-8.0 | Stuetemperatur |
| 0,1 M triethanolamin | |||
| Hybridisering buffer | 50% formamid | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| 100 µg/mL heparin | |||
| 1 x Denharts løsning | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 0,1% KÆBE | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Maleinsyre buffer (MAB) | 100 mM maleinsyre | 7.0 | Stuetemperatur |
| 150 mM natriumchlorid | |||
| Alkalisk fosfatase (AP) buffer | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| 50 mM magnesiumchlorid | |||
| 100 mM natriumchlorid | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 5 mM levamisol | |||
| Blegemiddelopløsning | 1% hydrogenperoxid | - | Forberede friske |
| 5% formamid | |||
| 0,5 x SSC |
Tabel 1. Opskrifter af løsninger, der anvendes i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette er den første brug af en helhed-mount i situ hybridisering (WMISH) teknik til at studere mikrobiota af en leddyr vektor af patogener. Vores protokol blev tilpasset fra en bruges til at undersøge udviklingen i Drosophila og frøen embryoner25,26. Hele-mount RNA i situ hybridisering har været rutinemæssigt anvendes til at lokalisere gen udskrifter rumligt og tidsligt27 og visualisering af udskrifter kan gøres ved at lyse-felt eller fluorescerende mikroskopi. Vi har vedtaget tidligere mod påvisning af mikrobiota i kryds indvolde. Det er vigtigt at bemærke, at forsøg på at udføre hele-mount i situ hybridisering bruger hele flåter hvor regionen hoved var fjernet for at tillade penetration af fiksativ og hybridisering løsninger ikke var vellykket. Protokollen beskrevet her udnytter dissekeret indvolde og er blevet implementeret for at studere virkningerne af specifikke kryds proteiner på bakteriel kolonisering i midgut23. Oplysninger fra WMISH er sammenlignelig med Immunhistokemi men har fordelen ikke at kræve generation af proteiner og antistoffer mod genet eller protein af interesse. Genomisk oplysninger er tilstrækkelige til at generere reagenserne til WMISH. Både WMISH og fisk (Fluorescens i situ hybridisering) kan afsløre genekspressionen. Men fordi den var en enzymatisk og kromogen-baseret analyse, WMISH har den fordel, at farve udvikling kan overvåges aktivt, og reaktionen er lov at fortsætte indtil ønskede signal og følsomhed er opnået. Det er fuldt ud indstillet til automatisering og er let skalerbar til høj overførselshastighed format. I modsætning til fisk og Immunhistokemi er ingen skæring påkrævet. Ulempen ved WMISH over fisk er, at kun 2 forskellige mRNAs eller gener kan blive behandlet samtidig og ville kræve, at sonder være mærket med forskellige nukleotid analoger som digoxigenin-UTP og fluorescein-UTP28. Med fisk, kan op til 6 forskellige mRNAs undersøges i en assay29. Mens begge assays kræver sammenlignelige tid, omkostningerne ved fluorescens farvestoffer er højere end i kromogent substrater. FISK assays ville også kræve et fluorescens mikroskop til billede visualisering, mens WMISH billede visualisering kan udføres med enhver lysmikroskop.
Det er afgørende, at protokollen er fulgt nøje; men der er nogle skridt, der kræver særlig pleje. Dissektion af midgut fra kryds uden at beskadige vævet kræver nogle fingerfærdighed. Det kan være klogt at indsamle ekstra flåter til at praktisere dissektioner og få færdigheder. Heterogenitet af farvning i de forskellige diverticula af individuelle indvolde (figur 3), er det vigtigt at undersøge alle diverticula af hver gut at udlede afgørende beviser for bakteriel overflod. Det er også vigtigt at behandle flere indvolde (mindst 5) for hver eksperimentelle betingelse for at indhente afgørende oplysninger om tilstedeværelse og geografiske fordeling og overflod af specifikke bakterier i forskellige diverticula. Produktion af høj kvalitet RNA-sonder er også afgørende for effektiv væv farvning. Det er afgørende, at også bekræfte sekvensen af skabelonen sonden i kloning vektor til at sikre, at antisensstoffer og følelse sonder genereres korrekt. En produktiv i vitro transskription reaktion kræver tilstrækkelige skabelon DNA; mindst 100 ng kan bruges, men 0,5 - 1 µg anbefales for optimal sonde generation.
Brug af prøven kurve og 24-godt plader i denne protokol undgår direkte manipulation af væv ved hvert wash skridt, som minimerer skader under farvning processen. Imidlertid prøver stadig lejlighedsvis mistet eller beskadiget; indvolde fra unfed eller 24h-fed flåter, er især vanskeligt at se og let at miste ved overførsel fra prøven kurve til en langsigtet opbevaringsbeholder. Ekstra pleje bør tages mens håndtering af disse prøver. På grund af denne begrænsning, har vi primært brugt 48 og 72 h-fed kryds indvolde. Tilstedeværelsen af store mængder af blod måltid i tarmene på disse tidspunkter (længere end 72 h) forstyrrer farvning og visualisering på grund af ikke-specifik baggrund fra blodmel og præsenterer også en begrænsning af denne teknik. Det er sandsynligt, at brugen af fluorescently mærket sonder kan omgå dette problem.
Det vigtigste aspekt af farvnings-proceduren er at skabe balance mellem robust farvning og lave baggrunden signal. Timingen af ideelle farveudviklingen kan variere alt efter de eksperimentelle betingelser. Således, det er bedst at udføre farve reaktion ved stuetemperatur og overvåge farveudviklingen ca hvert 30 min. Reaktionen kan også sættes op til at fortsætte natten over ved 4 ° C for langsom farveudviklingen. Det er imidlertid yderst kritiske ikke til lad reaktionen fortsætte i lang tid. Farvning reaktion kan være vanskelige at overvåge øje, så prøverne bør undersøges under et mikroskop for dissektion. En lilla nuance skal ses på prøver aftestede med antisense RNA, mens prøverne aftestede med følelse RNA bør bevare minimal farve. Hvis forstand RNA-aftestede prøver pletten smukt, bør fejlfindingstrin begynde med at reducere inkubationstiden med BM lilla og øge den blokerende tid. Sommetider kan forstand sonder forårsage anomalously høj baggrund i forhold til de antisense sonder; i disse tilfælde måtte forskellige regioner af genet anses for at generere RNA-sonder. DNA-sekvenser ikke er repræsenteret i en given prøve kan også betragtes som skabeloner til at generere negative kontrol sonder. For eksempel, kan en DNA-skabelon kodning en region i den grønne fluorescerende protein, ikke er repræsenteret i kryds genom eller dens microbiome, udnyttes.
En begrænsning af denne teknik er, at analysen er i vid udstrækning kvalitative; billede analyse software (Tabel af materialer) kan dog bruges til at måle mængden af farvning signal i hver prøve. Dette ville give mulighed for en semi-kvantitative sammenligning af overfloden af forskellige bakteriearter under forskellige forsøgsbetingelser. Mens dette er et tidskrævende protokol, der tager 3-4 dage at fuldføre, er det ikke besværligt; hver dag hands-on tid er i gennemsnit kun omkring 3-5 h. Evnen til at behandle mange prøver parallelt med brug af prøven kurve og indehavere tillader imidlertid høj overførselshastighed analyse. Yderligere, denne proces kan automatiseres ved hjælp af kommercielt tilgængelige instrumenter (Table of Materials) hvis denne protokol forventes at blive en afgørende og rutinemæssig komponent af forskningslaboratorium ved hjælp af kommercielt tilgængelige Automation-kompatible platforme (Table of Materials) til yderligere reducere hands-on tid.
Den beskrevne protokol gør brug af digoxygenin-mærket sonder, der tillader produktion af en kolorimetrisk signal, der kan være afbildet ved hjælp af lysfelt mikroskopi. Mens vi har udnyttet et kromogent substrat for at opdage hybridiserede RNA sonder specifikke for individuelle mål, det er også muligt at registrere flere mål samtidig ved mærkning sonder med forskellige nukleotid analoger, såsom digoxigenin-UTP og fluorescein-UTP og forskellige kromogent substrater30. Vævsprøver kan derefter inkuberes sekventielt med alkalisk fosfatase-koblede antistoffer mod digoxigenin og fluorescein, med forskellige kromogent reaktioner for de to trin. Denne teknik kunne også være tilpasset til fluorescently mærket sonder, som kan lette højere opløsning imaging ved hjælp af konfokalmikroskopi31 og give mulighed for at bruge flere sonder i forskellige farver i parallel. Denne teknik kan kun specifikt vurdere et par mikroorganismer ad gangen i en prøve. Men flere prøver kan vurderes i høj overførselshastighed assays til at løse flere mikroorganismer, der kan repræsenteres i kryds mikrobiota.
Endelig, denne teknik er ikke begrænset til undersøgelse af interaktioner mellem flåter og deres tilknyttede mikrobiota. Sonder supplement til enhver gen af interesse inden for kryds-genom kan genereres og bruges til at undersøge den overflod og lokalisering af specifikke gener i forskellige væv. Spytkirtlerne af kryds kan også behandles og analyseres på samme måde til tarmen. Samlet set har denne teknik bred potentiale for tilpasning til undersøgelser på dynamics af mikrobielle samfund inden for andre leddyr sygdom vektorer af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.
Acknowledgments
Vi takke oprigtigt Dr. Mustafa Khokha, Yale University, for at give brugen af hans laboratorium ressourcer. Vi er taknemmelige for Mr. Ming-Jie Wu fremragende teknisk bistand. EF er en HHMI investigator. Dette arbejde blev støttet af en gave fra John Monsky og Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
