Summary
Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.
Abstract
Besmettelijke ziekten overgebracht door geleedpotigen vectoren blijven een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid wereldwijd. De oorzaak van deze ziekten, pathogenen bestaan niet in isolement wanneer ze koloniseren de vector; Integendeel, ze waarschijnlijk gaan in interacties met resident micro-organismen in het lumen van de darm. De vector microbiota heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in pathogen transmissie voor verschillende vector-overgedragen ziekten. Of verblijvende bacteriën in de darm van de teek Ixodes scapularis , de vector van verschillende menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi, waaronder teek overdracht van ziekteverwekkers beïnvloeden wordt niet bepaald. Wij vereisen methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de bacteriën die zijn gekoppeld aan de darm van de teek te vergemakkelijken van een beter begrip van de potentiële interspecies interacties in de darm van de teek. Geheel-mount in situ kunt hybridisatie te visualiseren van RNA afschriften die zijn gekoppeld aan bepaalde bacteriesoorten voor de verzameling van kwalitatieve gegevens met betrekking tot de overvloed en distributie van de microbiota in onbeschadigde weefsel. Deze techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van veranderingen in de gut microbiota milieu in de loop van de teek voederen en kan ook worden toegepast om te analyseren van de expressie van genen van de teek. Kleuring van hele teek lef opbrengst informatie over de bruto ruimtelijke verdeling voor target RNA in het weefsel zonder de noodzaak voor driedimensionale wederopbouw en minder wordt beïnvloed door verontreiniging van het milieu, die vaak kunstdiscours de sequencing-gebaseerd methoden vaak gebruikt bij het bestuderen van complexe microbiële gemeenschappen. Over het geheel genomen, deze techniek is een waardevol instrument dat kan worden gebruikt om beter begrijpen vector-pathogen-microbiota interacties en hun rol in de transmissie van de ziekte.
Introduction
Menselijke en dierlijke ziekteverwekkers overgedragen door geleedpotigen vectoren zijn wereldwijd te vinden en zijn goed voor ongeveer 20% van de infectieziekten wereldwijd1, maar effectief en veilig vaccins tegen de meeste van deze ziekteverwekkers zijn niet beschikbaar. Ons begrip van de belangrijke rol van commensale, symbiotische en pathogene micro-organismen, gezamenlijk bekend als de microbiome2, moduleren en de vormgeving van de gezondheid van bijna alle metazoans3 groeit. Het is nu duidelijk dat geleedpotigen vectoren van ziekteverwekkers ook darmflora haven en deze vector-geassocieerde microbiota is aangetoond dat de invloed van uiteenlopende vectoren overgedragen ziekteverwekkers4,5. De geleedpotigen microbiome is samengesteld uit eubacteria, archaea, virussen en eukaryote microben zoals protozoa, aaltjes en schimmels6. Echter, de overheersende onderzoek focus is op eubacteria, gedeeltelijk vanwege de beschikbaarheid van markers en verwijzing databases te identificeren specifieke bacteriële leden.
Met een focus op Ixodes scapularis, de teek vector van meerdere menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi7, inclusief de verwekker van de ziekte van Lyme, de optimalisatie van een microbiële visualisatie techniek was erop gericht verbetering van ons begrip van de darmflora van de teek in het kader van vector-pathogeen interacties. Verschillende vragen moeten worden beantwoord in de teek microbiome veld. De darm is de site van de eerste uitgebreide ontmoeting tussen de teek en de binnenkomende ziekteverwekker in het kader van horizontaal overgedragen ziekteverwekkers; Daarom is inzicht in de rol van vector darmflora bij het moduleren van vector-pathogeen interacties zal onthullen zinvolle inzichten. Teken hebben een unieke wijze van bloedmeel spijsvertering, waar de verwerking van bloedmeel onderdelen neemt intracellulair8plaatsen. Het lumen van de darm schijnbaar fungeert als een vaartuig naar de bloedmeel bevatten als de teek-feeds, en nutriënten spijsvertering en assimilatie blijven na herverpakking voortvloeien gedurende de verschillende dagen van de voeding. De ziekteverwekkers verworven door de teek tijdens het voederen Voer het lumen van de darm samen met de bloedmeel en dus de lumen wordt een primaire site van interacties tussen de teek, pathogenen en resident microbiota. Zoals spijsvertering via de herverpakking en Ixodid teek Rui verloopt, ondergaat de darm structurele en functionele wijzigingen9. De samenstelling en de ruimtelijke organisatie van gut bacteriën is ook waarschijnlijk om te variëren in concert met de veranderende milieu van de darm. Het is daarom belangrijk om te begrijpen van de architectuur van verblijvende bacteriën in de darm van de teek om volledig te begrijpen het samenspel van de teek, pathogenen en darmflora.
Moleculaire technieken voor het beschrijven van host-geassocieerde microbiota routinematig gebruik maken van high-throughput parallelle sequencing strategieën10 volgnummer bacteriële 16S ribosomal DNA (rDNA) te versterken. Deze strategieën sequencing omzeilen de noodzaak tot het verkrijgen van een culturen van specifieke bacteriën en geef een gedetailleerde beschrijving van alle bacteriële leden vertegenwoordigd in de steekproef. Toch zijn dergelijke strategieën verward door het onvermogen om te onderscheiden van milieu verontreinigingen van bona fide bewoners. Verder, bij de beoordeling van de monsters, zoals teken, die in grootte klein zijn en vandaar bevatten lage microbiota-specifieke DNA oplevert, de waarschijnlijkheid van versterking van milieucontaminanten is toegenomen11 en resulteert in de onduidelijke interpretatie van microbiome samenstelling. Functionele karakterisering in combinatie met de visualisatie van specifieke levensvatbare bacteriën zal daarom worden cruciaal voor het definiëren en onderscheiden de microbiome van de teek stoffelijk en ruimtelijk. Richting van dit doel profiteerde we van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie. Deze techniek wordt routinematig gebruikt ter beoordeling van gen expressiepatronen in organen en embryo's12,13,14 en kunt semikwantitatieve analyse van meningsuiting via het gehele monster van belang. Dit verschilt van de traditionele in situ hybridisatie technieken die gebruik maken van weefselsecties en vaak uitgebreide analyse van verdeelde materiaal met een computationele vergadering te voorspellen van de expressie in de hele organen15vereist. Terwijl geheel-mount in het algemeen naar hele organismen12 verwijst, verwijst hier geheel-mount naar hele darmen of organen. De voordelen van het gebruik van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie aanpak om te beoordelen van de architectuur van de teek darmflora zijn multifold. De darm van de teek is samengesteld uit 7 paren van diverticula, elk paar variërend in de grootte16. De functionele verschillen, vink als iemand, onder deze diverticula, niet in de context van de teek biologie begrepen zijn, microbiota of teek-pathogeen interacties. Manipulaties van de darm die scheuren van de darm diverticula zou verdringen microbiota aanwezig zijn in het lumen van de darm of die losjes gekoppeld aan de darm en verkeerde interpretatie van de ruimtelijke lokalisatie van microbiota. Fluorescentie-geëtiketteerden RNA in situ hybridisatie is eerder gebruikt om te onderzoeken afschriften17 van de darm van de teek door vaststelling en individuele gut diverticula om sonde hybridisatie en te lokaliseren van B. burgdorferi te openen transcripties door segmenteren van paraffine-ingebedde hele teken18. Deze beide benaderingen vereisen manipulaties van de weefsels van de teek vóór hybridisatie die afbreuk aan de gut microbiota architectuur doen zou.
In dit verslag beschrijven we in detail het protocol te onderzoeken van levensvatbare teek darmflora met behulp van geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH). Het gebruik van geheel-mount RNA in situ hybridisatie in staat stelt een globaal inzicht in de aanwezigheid en de overvloed van specifieke gut bacteriën in de verschillende regio's van de darm en kan aansporen nieuwe inzichten in de teek gut biologie in het kader van pathogen kolonisatie en doorgeven. Verder is maakt het gebruik van RNA sondes gericht zijn tegen specifieke bacteriële RNA de ontdekking van levensvatbare bacteriën in de darm van de teek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van DNA sjablonen
- Download de 16S rRNA reeks specifieke elke bacteriële geslachten van de NCBI database en ontwerp polymerase-kettingreactie (PCR) compatibel vooruit en omgekeerde inleidingen die geslachten-specifieke regio's (~ 200-250-basenpaar lang) versterken zal, zoals eerder beschreven 19. verwijzen naar de open source databases SILVA20,21 en probeBase22 Onlinebronnen voor rRNA-gerichte oligonucleotide sondes en primers, zoals RNA sondes voor sommige bacteriële geslachten commercieel wellicht beschikbaar.
Opmerking: Het is belangrijk om te selecteren van gene regio's die specifieke aan specifieke geslachten en zorgen dat ontworpen inleidingen niet verwante bacteriële geslachten doen versterken. Dit is cruciaal voor het verkrijgen van gene/geslachten-specifieke sonde hybridisatie. - Feed teken voor 24, 48 of 72 h op muizen, ontleden teek lef en bereiden van RNA en cDNA van teek lef beschreven eerdere23. Gebruik cDNA als sjabloon aan PCR versterken geslachten-specifieke waarbij met behulp van een thermocycler. Voer een aliquoot gedeelte van het PCR-product/amplicon op een 1,5% agarose gel en bevestigen dat de amplicon komt overeen met de verwachte grootte door visualisatie onder ultraviolet (UV)-licht met behulp van een gel imaging systeem.
- Kloon de bacteriële 16S ribosomaal RNA amplicon van belang in een commercieel verkrijgbare TA vector (Tabel of Materials) met RNA polymerase initiatiefnemers geschikt voor bacteriofaag polymerase (SP6, T7 of T3). Het volgnummer van de klonen om de identiteit van de amplicon en de directionaliteit van de kloon met betrekking tot elk van de initiatiefnemers te bevestigen. Op basis hiervan bepalen de promotor van de keuze voor het genereren van betekenis of antisense RNA sondes (Figuur 1).
- Linearize 1 mg van de plasmide met een geschikte restrictie-enzym in een volume van de reactie van maximaal 30 µLfor 2 h bij temperaturen die door de fabrikant aanbevolen. Kies de enzymen van de beperking op basis van de promotor die zal worden gebruikt voor het genereren van de zin of antisense sonde (Figuur 1). Controleer of linearisatie door visualisatie van 2 µL van digest reactie op een 1% agarose gel.
- Zuiveren van de resterende 28 µL van verteerd DNA met behulp van een commercieel beschikbare PCR product kolom zuivering kit en kwantificeren van DNA concentratie door spectrofotometer.
Opmerking: Sommige zin sondes kan achtergrondkleuring veel hoger dan de overeenkomstige antisense sonde en andere opties kunnen moeten worden onderzocht. Alternatieve negatieve controles omvatten plasmiden codering sequenties niet vertegenwoordigd in het monster of een ander sonde die een kenmerkend patroon van hybridisatie oplevert.
2. bouw van Digoxygenin-UTP RNA sondes
- Bereiden de nucleotide mix door het combineren van 7,5 µL van 100 mM UTP, 25 µL van 10 mM digoxygenin-UTP en 10 µL elke 100 mM ATP, GTP en CTP in een centrifugebuis 1,5 mL.
- In vitro transcriptie uitvoeren met behulp van commercieel beschikbare T7 of Sp6 RNA polymerase kits, met behulp van 1 µL van de nucleotide mix (stap 2.1) en 0,25 - 1 µg sjabloon DNA. Breng het volume maximaal 20 µL met water. Flick de buis om te combineren en pulse spin. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2,5-3 uur.
Opmerking: Bouw van de sonde is succesvol geweest met verteerd plasmide concentraties zo laag als 7 ng/µL, maar typisch concentraties bij deze stap variëren van 15-25 ng/µL. De reactie van de transcriptie kan ook 's nachts worden geïncubeerd bij 37 ° C, maar dit niet aanzienlijk verhoogt het rendement van RNA. - Voeg 1 µL van DNase (2.000 eenheden/µL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Niet meer dan 10 min, of het enzym kan beginnen vernederende RNA.
- Voeg 30 µL van ijskoude 7,5-8 M lithium chloride en 30 µL van gekoeld nuclease-gratis water neerslaan van het RNA. Flick de buis te mengen. Toestaan van neerslag van RNA te gaan 's nachts bij-20 ° C.
- Verzamelen van RNA door centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De pellet een keer met 1 mL vers bereide 75% ethanol in Diethyl pyrocarbonate (DEPC) water wassen, herhaal dan centrifugeren.
- Verwijderen en verwijder het supernatant, omkeren van de buis op een schone papieren handdoek en laten drogen voor 10 min. resuspendeer de pellet in nuclease-gratis water. Als de pellet gemakkelijk zichtbaar is, resuspendeer in 25 µL. Als de pellet is zeer klein of niet zichtbaar, resuspendeer in 15-20 µL. een schatting van RNA concentratie verkrijgen door spectrofotometer.
Opmerking: Typische RNA concentraties variëren van 200-500 ng/µL.
3. visualisatie van RNA sondes door elektroforese van het Gel van RNA Formaldehyde te beoordelen van RNA zuiverheid
Let op: Formaldehyde vormt een gevaar voor de inademing; Daarom, genereren de oplossingen nodig voor RNA gel analyse in een zuurkast. Ethidiumbromide is een verdachte kankerverwekkend te worden ingedeeld; voorzichtig behandelen.
- Bereiden een 1% formaldehyde agarose gel als eerder24 beschreven en de gel in een gel in box gratis RNases gegoten. Zodra cool, vul het vak gel met 1 x buffer (1 x MOPS bij pH 7.0, 5% formaldehyde) uitgevoerd.
- De Buffer van de steekproef (5 µL 400 mg/mL ethidiumbromide, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL formaldehyde en 100 µL formamide) voor te bereiden. Combineer 2 µL van RNA sonde (stap 2.6) met 8 µL van monster Buffer. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
- RNA laden Buffer voor te bereiden door het combineren van 5 mL 50% glycerol, 1 mL 10% formaldehyde, 40 mg bromophenol blauw, 40 mg xyleen cyanol en 20 µL van 0.5 M EDTA (pH 7.5). Na gebruik, het opslaan van deze buffer bij-20 ° C.
- Voeg 3 µL van Buffer geladen aan het RNA-monster van stap 3.2 en meng. Houd monster buizen op ijs.
- Laad het hele monstervolume uit stap 3.4 in de gel. Het laden van een aliquoot deel van single-stranded RNA ladder naast om te controleren of de grootte van het RNA. Stel de gel bij 100 V hoger of lager totdat de blauwe kleurstof ongeveer 75% van de weg naar beneden de gel migreert. Visualiseer de RNA onder UV-licht met behulp van een gel imaging systeem.
Opmerking: Een goede kwaliteit RNA sonde moet worden weergegeven als een discrete band met een mobiliteit die overeenkomt met de verwachte omvang van de sonde (Figuur 2, lane 1). Als de sonde wordt weergegeven als een diffuse en smeary band (Figuur 2lane 2) dit niet mag worden gebruikt.
4. Vink Gut collectie en fixatie
- Verzamelen Ixodes scapularis nimfen die hebben gevoed op muizen voor de tijd points of interest.
Opmerking: Voor de toepassing van deze techniek, teken gevoed voor 48 of 72 h werk best. - Het ontleden van de darm van de teek in MEMFA (tabel 1) op een glasplaatje onder een Microscoop dissectie, het vermijden van schade aan het orgel zoveel mogelijk. Plaats een vinkje op een schone microscoopglaasje in 20-30 µL van MEMFA. Met behulp van een paar van steriele high-carbon stalen scheermesje #11 segment de hoofd regio op de scutum van de teek verlaten het lichaam van de teek. Druk zachtjes op het lichaam om de darm diverticula en speekselklieren uit de cuticle lichaam te duwen. Scheid de speekselklieren en de darm en het lef scoop over het scheermesje.
- Lef in een tube van 1,5 mL met 500 µL MEMFA verzamelen. Incubeer de buis bij kamertemperatuur met zachte rockende voor 1 h of overnacht bij 4 ° C.
Opmerking: Speekselklieren van de teek kan ook worden ontleed en op dezelfde wijze vastgesteld en gekleurd. - Het uitdrogen van het weefsel door het wassen voorzichtig 3 keer met 1 mL ijskoud 100% ethanol. Laat het lef natuurlijk zinken naar de bodem van de buis tussen elke wassen, centrifugeren kan schade aan het weefsel. Voor langdurige opslag, houd de monsters in 100% ethanol bij-20 ° C.
5. bouw van Mesh monster manden en 24-well mand houder
- Snijd de bodems off van 2 mL of 5 mL module-top centrifuge buizen een verwarmde single-edged scheermesje met een scalpel.
Let op: Het mes moet misschien meerdere malen worden opgewarmd voordat de cut is voltooid. - Gesneden kwadraten van een 110 µm nylon gaas iets groter dan de nieuwe tube openen. Bond het gaas aan de onderkant van de buis door te drukken op hen samen licht op een warm bord op middellange-laag vuur totdat een goede afdichting is gemaakt. Laat afkoelen, te verzekeren dat er geen gaten tussen de Maas en de buis en trim overtollige Kabelhoes om de randen.
- Gaten in de dekking van een 24-well plaat knippen, zodanig dat de lip van de steekproef mand gemaakt in stap 5.2 zal op het gat zitten en niet vallen door, de opbrengst van een opstelling waar de bodems van de manden van de steekproef helemaal in de putten zitten zal wanneer ze worden geplaatst de gaten in de dekking.
- Gebruik deze houder voorzien mand manden van één plaat overbrengen naar een andere met relatief gemak voor het geheel van de in situ hybridisatie protocol. Gebruik twee 24-Wells-platen zodat terwijl een incubatie voordoet zich, de andere plaat is voorbereid voor de volgende wasbeurt.
6. in Situ hybridisatie: dag 1 (Timing: 4-5 h)
- Overdracht lef om label monster manden, gescheiden door de experimentele conditie en RNA sonde bedoeld.
Opmerking: Vlek ten minste 5 lef per voorwaarde ter verantwoording voor natuurlijke variatie van replicaat-organismen. - Hydrateren de monsters voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen in het weefsel door het geleidelijk aan verhogen van de verhouding met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (PTw; Tabel 1) tot ethanol in de wast.
Opmerking: Complete all wast in de 24-well mand houder bij kamertemperatuur met zachte agitatie, tenzij anders vermeld. Aliquot 500-600 µL van wassen oplossingen in elk putje van de houder van dergelijke dat het lef in elke mand volledig worden ondergedompeld. Bereiden alle oplossingen met DEPC behandelde water om te voorkomen dat de aantasting van het RNA.- De monsters gedurende 5 minuten wassen in 500 µL 100% ethanol.
- Voorbereiden van ten minste 500 µL per monster mand van 75%, 50% en 25% ethanol in PTw. hydrateren de monsters door het wassen gedurende 5 min. in elke oplossing van ethanol, verplaatsen van de hoogste concentratie van ethanol naar de laagste.
- De monsters 4 keer voor elke 5 min in PTw wassen.
- Permeabilize van de monsters met proteïnase K (10 µg/mL) in PTw gedurende 5 minuten.
- Het weefsel voorbereiden door kruising met de sondes van RNA.
- Wassen van de monsters tweemaal zoals beschreven bij punt 6.2 in de 24-well mand houder bij kamertemperatuur met zachte agitatie voor 5 min in 500 µL triethanolamine buffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) (tabel 1) om de monsters in een amine-vrije omgeving.
- Behandeling van de monsters tweemaal met 500 µL 0,25% azijnzuur-anhydride in triethanolamine buffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) voor elke 5 min, dan wassen de monsters tweemaal in PTw voor elke 5 min.
Opmerking: De azijnzuur-anhydride acetylates gratis aminen te neutraliseren van positieve lading, die is van cruciaal belang om te voorkomen van aspecifieke Elektrostatische interacties en specifieke binding van de sonde naar mRNA. - Herstellen van het lef voor 20 min met de 500 µL 4% paraformaldehyde in PTw, dan 5 keer wassen in PTw voor elke 5 min.
- Prehybridize door de monsters in 500 µL hybridisatie buffer /in de houder van de 24-well mand in de 24 goed plaat (tabel 1) gedurende 1,5 tot 2,5 uur bij 60 ° C met zachte agitatie in een waterbad schudden aan het broeden. Sla de kruising buffer gebruikt voor de prehybridization stap om te gebruiken in het protocol van dag 2 (stap 7.1).
- Sonde kruising oplossingen bereid door verdunning van RNA sondes in kruising buffer om een eindconcentratie van 1 µg/mL. Broeden monsters met sonde kruising oplossingen in de 24-well mand houder bij 60 ° C met zachte agitatie overnachting in een schudden waterbad (tabel 2). De afdekplaat uitvoering van de houder van de mand zonder speling met aluminiumfolie om te voorkomen dat de verdamping van de kruising oplossing.
7. in Situ hybridisatie: dag 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
- Verwijder de monsters uit de sonde kruising oplossingen en plaats hen in de buffer van de gereserveerde kruising van de vorige dag. Incubeer bij 60 ° C met zachte agitatie voor 3 min.
Let op: Sonde kruising oplossingen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor hergebruik tot 3 keer. - 2 x saline-Natriumcitraat buffer (SSC) bereid door verdunnen 20 x SSC in DEPC-behandeld water (tabel 1). Wassen van de monsters tweemaal voor 3 min met 2 x SSC, dan 3 keer voor 20 min met 2 x SSC bij 60 ° C om alle sporen van de sonde en kruising buffer te verwijderen.
- Behandelen met RNase een (20 µg/mL) en RNase T1 (10 µg/mL) 2 x SSC gedurende 30 minuten bij 37 ° C om één strandde RNA sonde vertegenwoordigen gratis niet-gekruist RNA.
- Wassen met 2 x SSC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereiden van 0,2 x SSC door verdunnen 2 x SSC in DEPC-behandeld water, daarna wassen tweemaal met 0,2 x SSC gedurende 30 minuten bij 60 ° C te verwijderen van de overtollige RNases.
- Wassen tweemaal met 500 µL van maleïnezuur buffer (MAB; Tabel 1) voor elke 10 min.
- Incubeer monsters met oplossing (2% blokkerende reagens in de MAB) voor 1.5-2 h blokkeren.
Opmerking: Het blokkeren reagens kan worden moeilijk te ontbinden; zachte verwarming helpt ontbinding. - De blokkerende oplossing vervangen door anti-heksenkruid alkalische fosfatase-geconjugeerde 500 µL van antilichaam bij een verdunning van de 1:3,000 in het blokkeren van de oplossing en bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 4 uur of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
8. in Situ hybridisatie: dag 3 (Timing: 6 h naar girale)
- Wassen van de monsters ten minste 5 keer voor elke 30 min met 500 µL MAB te verwijderen overtollige antilichaam.
Opmerking: Deze wast zijn flexibel en kunnen worden uitgebreid tot 1-2 h of 3-4 wasbeurten kunnen worden vervangen voor één overnachting wassen bij 4 ° C met minimale effecten op werkzaamheid. - Wassen tweemaal voor 5 min met alkalische fosfatase buffer, pH 9.5 (AP buffer; Tabel 1).
- Allereerst dat de reactie van kleur ter vervanging van de laatste wasbeurt met 500 µL van het chromogenic substraat voor alkalische fosfatase (Tabel van materialen). De monster afdekplaat met aluminiumfolie en laat de kleuring gaan bij kamertemperatuur voor 3 - 5 h of overnachting bij 4 ° C. De kleuring reactie periodiek controleren door het weefsel onder een ontleden Microscoop om te voorkomen dat overstaining te bekijken.
Opmerking: Wanneer de kleuring voltooid is, een paarse tint is waarneembaar met het blote oog in de antisense-gesondeerd monsters onder de Microscoop, maar het weefsel mogen niet tot zeer donker. Kleuring verloopt zeer langzaam bij 4 ° C en duurt maximaal 20-24 h. - Stop de kleur reactie door het wassen gedurende 5 min. in 500 µL MAB, dan 's nachts herstellen van het weefsel in Bouin de oplossing.
Let op: Verwerken van de Bouin oplossing in een zuurkast; het is een bijtende kankerverwekkend.
9. in Situ hybridisatie: dag 4 (Timing: 3-3,5 h)
- Bereiden van ten minste 7 mL per monster mand voor 1 x SSC door verdunnen 20 x SSC in DEPC-behandeld water. Verwijderen van de Bouin-oplossing door het wassen van de monsters 4 tot 6 keer met 70% ethanol in 1 x SSC tot het weefsel niet meer geel.
- Bereiden van 500 µL per monster mand van 75%, 50% en 25% ethanol oplossingen in 1 x SSC. De monsters gedurende 5 minuten wassen in elke oplossing van hoogste ethanol concentratie verplaatsen naar laagste te hydrateren het weefsel. Wassen tweemaal voor 5 min elke in 1 x SSC.
- Incubeer de monsters in de bleekwater oplossing (tabel 1) voor 90 min op een lightbox in een zuurkast.
Opmerking: Deze stap laat pigmentatie in de monsters of verkleuring van de Bouins oplossing moet worden verwijderd en vergroot het signaal van de sonde voor duidelijke visualisatie. - Wassen van de monsters tweemaal met 500 µL van 1 x SSC voor 5 min.
- Verhuizen van de ingewanden met minimale schade door het omkeren van de steekproef mand in een putje van een nieuwe 24-well-plaat en wassen met 70% ethanol door het gaas bodem met behulp van een precisiepipet overdracht. Bewaren bij-20 ° C indien nodig.
- Handhaven het lef in 70% ethanol in de 24 goed-plaat en de weergave met een helder-veld Microscoop voor een overzicht van de kleuring patronen van meerdere monsters zoals weergegeven in Figuur 3, . Individuele lef onder een heldere-veld Microscoop onderzoeken zoals weergegeven in Figuur 4en Figuur 5, en Figuur 6, mount de lef in 100% glycerol onder coverslips. Gebruik een plastic spatel voorzichtig manipuleren het weefsel met minimale schade.
Opmerking: De hoge viscositeit van glycerol helpt het weefsel te beschermen tegen schade door compressie en maakt de voorzichtig positionering van diverticula zodanig zijn dat het weefsel optimaal worden op de hogere vergrotingen bekeken kan. - Vastleggen van beelden op de microscoop met behulp van de Microscoop specifiek beeld vangt software (Tabel van materialen) en exporteren als TIFF-afbeeldingen naar een generieke beeld het uitgeven software. Download om te kwantificeren van de relatieve kleuring verschillen tussen experimentele behandelingen, een generieke afbeelding analysesoftware (Tabel van materialen). Open de afbeelding in de analysesoftware van de en de instructies in de software gebruiken voor het meten van de intensiteit van de pixel van de kleuring en berekenen histogram percelen van de kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De meting en de schatting van de kwaliteit van de sondes van RNA zijn kritisch voorafgaand aan het begin van de kleuring. In vitro transcriptie efficiëntie hangt sterk de hoeveelheid en de kwaliteit van de DNA-sjabloon. We gevisualiseerd routinematig de sondes van RNA op een formaldehyde-gel om te controleren of de zuiverheid en de hoeveelheid sonde gegenereerd door de reacties van de transcriptie. De sondes moeten worden weergegeven als heldere, discrete bands (Figuur 2). Spectrofotometrische meting van RNA concentratie waren zeer kenmerkend voor de kwaliteit van de sonde en gecorreleerde goed met het uiterlijk van de bands op de gel. Dus, kan de gel visualisatie stap worden overgeslagen, indien gewenst zodra vertrouwdheid met het protocol wordt bereikt. Hoe dan ook, het is belangrijk om ervoor te zorgen dat voldoende RNA van hoge kwaliteit wordt geproduceerd, zoals alle downstream stappen zijn afhankelijk van de robuustheid van de sondes.
De kracht van deze techniek is bij het bevorderen van brede observaties over de teek microbiota, met inbegrip van aan- of afwezigheid van bacteriële soorten, veranderingen in overvloed van de bacteriën na verloop van tijd als de teek-feeds, en lokalisatie van soorten binnen het hele weefsel. Afwisseling in kleuring bedrag en distributie is normaal van biologische replicaat-organismen, alsook tussen de 7 paren van diverticula individuele ingewanden (Figuur 3), dus dat het is best om vlekken van ten minste vijf lef per voorwaarde om een idee van gemiddelde te krijgen kleuring patroon. Het algemene succes van het protocol is best gemeten door het vergelijken van de kleuring van de betekenis en antisense monsters voor elke voorwaarde. De zin monsters, belangrijke negatieve controles voor dit type analyse, moeten minimale tot geen paarse kleur (Figuur 4). Antisense monsters moeten daarentegen worden weergegeven robuuste kleuring met minimale achtergrond, de intensiteit van die zal afhangen van de overvloed van de specifieke bacteriële afschriften worden gericht. De kleuring patroon binnen het weefsel zal ook variëren op basis van deze parameters. Nog belangrijker is, moeten de betekenis en antisense monsters worden ontwikkeld voor de zelfde hoeveelheid tijd te kunnen direct om ze te vergelijken, zodat deze monsters moeten worden verwerkt in parallel. Overontwikkeling van de reactie van kleur kan resulteren in een hoog gehalte aan achtergrond kleuring, waar de zin monsters beginnen te lijken op de antisense (Figuur 5). Bijzondere zorg moet worden genomen bij deze stap in het protocol om te voorkomen dat overstaining, zoals er geen manier om te keren de reactie is zodra het gebeurt.
Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat alle ingewanden zijn volledig ondergedompeld in elk reagens tijdens elke stap; een toename van de variatie in verschillende steekproeven kan worden veroorzaakt door ongelijke Gasbedwelming met reagentia. Het bedrag van de tijd dat het teken worden gevoed voordat de ingewanden zijn verzameld heeft ook een significant effect op de resultaten. Teken die waren unfed of alleen gevoed voor 24 h waren moeilijk om mee te werken; de ingewanden waren ook meer gemakkelijk beschadigd en hebben geen vlekken goed (Figuur 6) en is een beperking van deze aanpak op dit moment. Teken gevoed voor 48-72 uur waren makkelijkst te werken, te wijten aan de grotere omvang van deze lef in vergelijking met lef van teken gevoed voor 24 h. lef uit latere tijdstippen ook gekleurd beter dan 24 h-gevoed teken, mogelijk als gevolg van de stijgingen van de bacteriële belasting tijdens de latere stadia o f het voeden. De 72-uur weefsel had vaak een lichte achtergrond voor bruine tint uit bloed, maar de paarse kleuring was duidelijk zichtbaar over de tint (Figuur 4). De ingewanden zijn best bekeken bij lage vergroting (5 X of 10 X) om te kunnen de kleuring patronen over de gehele weefsel met behulp van een helder-veld microscoop bekijken. Weergeven van geheel-mount weefsel op hogere vergroting, zoals met een 63 X olie doelstelling, loopt het risico van beschadiging van het weefsel, zoals de doelstelling zou tegen de dia drukt en comprimeren van het weefsel te wijten aan de dikte van de monsters. Desgewenst hogere resolutie beeldvorming is moet het potentieel voor het weefsel afdelen worden onderzocht.
Figuur 1 . Schematische sjabloon voorbereiding-sonde generatie. Het klonen van het 16S rRNA amplicon in een TA klonen vector met T7 en Sp6 initiatiefnemers. De constructie met behulp van restrictie-enzymen te snijden op sites een of b voor in vitro Transcriptie T7 of Sp6 promotor gebruiken voor het genereren van betekenis of antisense sondes respectievelijk Linearize. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Visualisatie van de RNA-sonde door gelelektroforese. Sondes van RNA (~ 700 ng) waren electrophoresed op een agarose gel formaldehyde, gevisualiseerd onder UV-licht en beeld met behulp van een commerciële gel imaging systeem. Een representatieve goede kwaliteit, lane 1; en slechte kwaliteit RNA sonde, lane 2.
Figuur 3 . Een representatief overzicht van geheel-mount in situ hybridisatie 48 h-gevoed lef. Guts van teken gevoed voor 48u gekleurd met antisense RNA aanvulling op een reeks van geconserveerde 16S ribosomaal RNA shows differentiële kleuring van gut diverticula. Schaal staaf vertegenwoordigt 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Representatieve beelden van succesvolle geheel-mount in situ hybridisatie in Ixodes scapularis lef. Guts van teken voor de aangegeven hoeveelheid tijd gevoed werden gekleurd met behulp van beide verstand (negatieve controle) of antisense RNA sondes. Antisense sondes waren ter aanvulling van een geconserveerde 16S ribosomaal RNA sequentie (universele 16S) of een 16S RNA sequentie specifiek voor een bepaalde bacteriële geslacht (zoals aangegeven). Enterococcus niet opbrengst robuuste kleuring 48 h. schaal bars vertegenwoordigen 140 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Verlengde chromogenic reactie tijd leidt tot niet-specifieke kleuring. Lef van teken voor 48 uur gevoed werden gesondeerd met een zin RNA sonde of een aanvulling op een reeks van geconserveerde 16S RNA antisense sonde. Het weefsel was geïncubeerd met een alkalische fosfatase substraat BM paarse 's nachts bij 4 ° C en vervolgens bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 4 uur voordat u stopt de reactie. Schaal staven 140 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Geheel-mount in situ hybridisatie met unfed of 24 h gevoed teek lef. Guts van unfed of 24 h-gevoed teken waren gekleurd met zin RNA sondes of antisense sondes ter aanvulling van een geconserveerde 16S RNA-reeks of een reeks specifieke tot het geslacht Rickettsia. Vlekken in de antisense monsters is minder robuust dan waargenomen op latere tijdstippen en het lef zijn ook meer gemakkelijk beschadigd. Schaal staven 60 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Eindconcentraties | Definitieve pH | Opslag notities |
| MEMFA | 0,1 M MOPS | - | Kamertemperatuur |
| 2 mM EGTA | |||
| 1 mM-magnesium-sulfaat | |||
| 3,7% formaldehyde | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1 x PBS, 0,1% Tween-20 | 7.0 | Kamertemperatuur |
| 0,1% Tween-20 | |||
| Triethanolamine buffer | 1 x PBS | 7.0-8.0 | Kamertemperatuur |
| 0,1 M triethanolamine | |||
| Hybridisatie buffer | 50% formamide | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| 100 µg/mL heparine | |||
| 1 x Denhart de oplossing | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 0,1% CHAPS | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Maleïnezuur buffer (MAB) | 100 mM maleïnezuur | 7.0 | Kamertemperatuur |
| 150 mM natriumchloride | |||
| Alkalische fosfatase (AP) buffer | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| 50 mM magnesiumchloride | |||
| 100 mM natriumchloride | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 5 mM levamisol | |||
| Bleekwater oplossing | 1% waterstofperoxide | - | Vers bereiden |
| 5% formamide | |||
| 0,5 x SSC |
Tabel 1. Recepten van oplossingen die in het protocol worden gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit is het eerste gebruik van een geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH) techniek te bestuderen van de microbiota van een geleedpotigen vector van ziekteverwekkers. Ons protocol werd aangepast van een gebruikt bij het bestuderen van de ontwikkeling in Drosophila en kikker embryo's25,26. Geheel-mount RNA in situ hybridisatie is routinematig gebruikt voor het lokaliseren van gene afschriften ruimtelijk en stoffelijk27 en visualisatie van afschriften kunnen worden gedaan door heldere field of fluorescent microscopie. Wij hebben de voormalige naar opsporing van microbiota in teek lef aangenomen. Het is belangrijk op te merken dat probeert uit te voeren gehele-mount in situ hybridisatie met hele teken waarin de hoofd regio werd verwijderd om penetratie van fixeer en kruising oplossingen was niet succesvol. Het protocol hier beschreven maakt gebruik van ontleed lef en om te bestuderen van de effecten van specifieke teek eiwitten op bacteriële kolonisatie in de middendarm23ten uitvoer heeft gelegd. Informatie verkregen uit WMISH is vergelijkbaar met immunohistochemistry maar heeft het voordeel van niet vereist de productie van eiwitten en antilichamen tegen het gen of proteïne van belang. Genomische informatie volstaat voor het genereren van de reagentia voor WMISH. Zowel de WMISH als de vis (fluorescentie in situ hybridisatie) kan detecteren de genexpressie. Echter, omdat het een enzymatische en chromogeen gebaseerde bepaling, WMISH heeft het voordeel dat kleur ontwikkeling actief kan worden gecontroleerd, en de reactie is toegestaan om door te gaan tot het gewenste signaal en gevoeligheid wordt bereikt. Het is volledig vatbaar voor automatisering en is eenvoudig schaalbaar naar high-throughput formaat. VIS en immunohistochemistry is geen segmenteren geen vereiste. Het nadeel van WMISH over vis is dat slechts 2 verschillende mRNAs of genen kunnen gelijktijdig worden aangepakt en vereisen zou dat de sondes worden aangeduid met verschillende nucleotide-analogen zoals heksenkruid-UTP en fluoresceïne-UTP28. Met vis, kan tot 6 verschillende mRNAs worden onderzocht in een assay29. Hoewel beide tests vereisen vergelijkbare tijd, de kosten van fluorescentie kleurstoffen zijn hoger dan die van chromogenic substraten. VIS testen zou ook een fluorescentie Microscoop vereisen voor visualisatie van de afbeelding, terwijl WMISH afbeelding visualisatie kan worden uitgevoerd met een lichte Microscoop.
Het is van cruciaal belang dat het protocol is gevolgd; Er zijn echter enkele stappen die bijzondere zorg vereisen. Dissectie van de middendarm uit de teek zonder beschadiging van het weefsel vergt enige handigheid. Het kan zijn verstandig om het verzamelen van extra teken de ontledingen van de praktijk te verwerven vaardigheid. Als gevolg van de heterogeniteit van de vlekken in de verschillende diverticula individuele ingewanden (Figuur 3), is het belangrijk om te onderzoeken alle diverticula voor elke gut voor het afleiden van overtuigend bewijs van bacteriële overvloed. Het is ook belangrijk voor het verwerken van verschillende ingewanden (minstens 5) voor elke experimentele voorwaarde met het oog op een afdoende informatie over de aanwezigheid, ruimtelijke verdeling en overvloed van specifieke bacteriën binnen verschillende diverticula. Productie van kwalitatief hoogwaardige RNA sondes is ook cruciaal voor effectieve weefsel kleuring. Het is cruciaal om te bevestigen ook de volgorde van de sonde-sjabloon in het klonen vector om ervoor te zorgen dat antisense en zin sondes op passende wijze worden gegenereerd. Een productieve in vitro transcriptie reactie vereist voldoende sjabloon DNA; een minimum van 100 ng mag worden gebruikt, maar 0,5 - 1 µg wordt aanbevolen voor optimale sonde generatie.
Het gebruik van monster manden en 24-Wells-platen in dit protocol vermijdt directe manipulatie van het weefsel bij elke stap van wassen, die schade tijdens de kleuring minimaliseert. Echter zijn monsters nog steeds af en toe verloren of beschadigd; lef van unfed of 24h-fed teken, in het bijzonder, zijn moeilijk te zien en makkelijk te verliezen bij het overzetten van de steekproef manden aan een lange termijn opslagcontainer. Extra zorg moet worden genomen tijdens het verwerken van deze monsters. Vanwege deze beperking, hebben we vooral 48 en 72 h-gevoed teek lef gebruikt. De aanwezigheid van grote hoeveelheden van bloedmeel in het lef in deze tijd-punten (langer dan 72 h) interfereert met de kleuring en visualisatie als gevolg van niet-specifieke achtergrond van de bloed-maaltijd en ook presenteert een beperking van deze techniek. Het is waarschijnlijk dat het gebruik van fluorescently-geëtiketteerden sondes dit probleem mogelijk omzeilen.
Het belangrijkste aspect van de kleuring procedure is het evenwicht tussen robuuste kleuring en lage achtergrond signaal te vinden. De timing van de ontwikkeling van de ideale kleur kan variëren afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Het is dus best uitvoeren de kleur reactie op kamertemperatuur en monitor kleur ontwikkeling ongeveer elke 30 min. De reactie kan ook worden ingesteld om door te gaan 's nachts bij 4 ° C tot het vertragen van de ontwikkeling van de kleur. Het is echter uiterst kritisch niet te laten deze reactie gaan voor lang. De kleuring reactie kunnen moeilijk te controleren met het blote oog, zodat de monsters moeten worden onderzocht onder een Microscoop dissectie. Een paarse tint moet zichtbaar zijn op monsters gesondeerd met antisense RNA, terwijl de monsters gesondeerd met gevoel RNA moet minimale kleur behouden. Als de zin RNA-gesondeerd monsters vlek helder, moet stappen voor probleemoplossing beginnen met de vermindering van de incubatietijd met BM paarse en verhogen de blokkerende tijd. Soms zin sondes kunnen leiden tot anomalously hoge achtergrond in vergelijking met de antisense sondes; in deze gevallen wellicht verschillende regio's van het gen voor het genereren van sondes van RNA worden beschouwd. DNA-sequenties niet vertegenwoordigd in een monster kunnen ook worden beschouwd als sjablonen voor het genereren van de negatieve controle sondes. Bijvoorbeeld, kan een codering van een regio voor de groen fluorescente proteïne, niet vertegenwoordigd in het genoom van de teek of haar microbiome, DNA-sjabloon worden gebruikt.
Een beperking van deze techniek is dat de analyse grotendeels kwalitatieve; afbeelding analysesoftware (Tabel of Materials) kan echter worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid kleuring signaal in elk monster. Hierdoor zou een semi-kwantitatieve vergelijking van de overvloed van de verschillende bacteriesoorten onder verschillende experimentele omstandigheden. Terwijl dit een tijdrovende protocol dat 3-4 dagen is duurt te voltooien, is het niet moeizaam; elke dag hands-on tijd is slechts ongeveer 3-5 h gemiddeld. Echter, de mogelijkheid voor het verwerken van vele monsters parallel met het gebruik van de manden van de steekproef en de houders zorgt voor high-throughput analyse. Verder, dit proces kan worden geautomatiseerd met behulp van commercieel beschikbare instrumenten (tabel van materialen) als dit protocol naar verwachting een essentieel en routine onderdeel van het onderzoekslaboratorium met behulp van commercieel verkrijgbare Automatisering-compatibele platforms (Tabel van materiaal) verder verminderen hands-on tijd.
Het beschreven protocol maakt gebruik van digoxygenin-label sondes waarmee de productie van een colorimetrische signaal dat kan worden beeld met heldere veld microscopie. Hoewel we één chromogenic substraat om te detecteren gehybridiseerde RNA sondes specifiek voor afzonderlijke doelen gebruikt hebben, is het ook mogelijk meerdere doelen tegelijk worden opgespoord door het labelen van sondes met verschillende nucleotide-analogen, zoals heksenkruid-UTP en fluoresceïne-UTP en verschillende chromogenic substraten30. De weefselmonsters kunnen dan sequentieel worden geïncubeerd met alkalische-fosfatase-coupled antilichamen tegen heksenkruid en fluoresceïne, met verschillende chromogenic reacties voor de twee stappen. Deze techniek kan ook worden aangepast voor fluorescently-geëtiketteerden sondes, die kunnen vergemakkelijken van hogere resolutie geschikt zijn met behulp van de confocal microscopie31 en bieden de mogelijkheid van het gebruik van meerdere sondes van verschillende kleuren in parallel. Deze techniek kan alleen specifiek een paar micro-organismen in één keer in één monster beoordelen. Echter, verschillende monsters kunnen worden beoordeeld in high-throughput assays inspelen op meerdere micro-organismen die kunnen worden vertegenwoordigd in de teek microbiota.
Ten slotte, deze techniek is niet beperkt tot het onderzoek van de interacties tussen teken en hun bijbehorende microbiota. Sondes ter aanvulling van een gen van belang in het genoom van de teek kunnen worden gegenereerd en gebruikt de overvloed en lokalisatie van specifieke genen in verschillende weefsels te onderzoeken. De speekselklieren van de teek kan ook worden verwerkt en geanalyseerd op dezelfde manier naar de darm. Globaal, heeft deze techniek breed potentieel voor aanpassing aan de studies over de dynamiek van microbiële gemeenschappen binnen andere geleedpotigen ziekte vectoren van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
Wij danken oprecht Dr. Mustafa Khokha, Yale University, voor het verstrekken van het gebruik van de hulpbronnen van zijn laboratorium. Wij zijn dankbaar aan Mr. Ming-Jie Wu voor uitstekende technische bijstand. EF is een HHMI onderzoeker. Dit werk werd gesteund door een gift van de John Monsky en Jennifer Weis Monsky ziekte van Lyme onderzoeksfonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
