Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um das Vorhandensein von lebensfähigen Mikrobiota in Tick Eingeweide mit einem modifizierten vollständig-hängen in-situ Hybridisierung Ansatz räumlich und zeitlich zu bewerten.
Abstract
Infektionskrankheiten, die durch Arthropoden Vektoren übertragen weiterhin eine erhebliche Bedrohung für die menschliche Gesundheit weltweit dar. Die Erreger dieser Krankheiten verursachen existieren nicht isoliert, wenn sie den Vektor kolonisieren; vielmehr führen sie wahrscheinlich Interaktionen mit ansässigen Mikroorganismen im Darm Lumen. Die Vektor-Mikrobiota nachgewiesen wurde, eine wichtige Rolle bei der Übertragung der Erreger für mehrere vektorübertragene Krankheiten. Ob ansässige Bakterien im Darm der Zecke Ixodes Scapularis , der Vektor der mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi, einschließlich Tick Übertragung von Krankheitserregern beeinflussen werden nicht bestimmt. Wir benötigen Methoden zur Charakterisierung der Zusammensetzung der Bakterien ermöglichen ein besseres Verständnis der Interspezies Wechselwirkungen im Darm Tick Tick Darm zugeordnet. Mit vollständig-hängen in Situ kann Hybridisierung, RNA-Transkripte, die verbunden sind mit bestimmten Bakterienarten zu visualisieren für die Sammlung qualitativer Daten in Bezug auf die Häufigkeit und Verteilung der Mikrobiota in intaktem Gewebe. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen im Darm Microbiota Milieu im Laufe der Zecke, die Fütterung zu überprüfen und kann auch angewendet werden, um die Expression von Genen Tick zu analysieren. Färbung des ganzen Tick Eingeweide Ausbeute Informationen über die grobe räumliche Verteilung der Ziel-RNA im Gewebe ohne die Notwendigkeit für dreidimensionale Rekonstruktion und weniger Umweltverschmutzung, die häufig die Sequenzierung-basierte verwirrt betroffen ist Methoden, die häufig verwendet, um komplexe mikrobielle Gemeinschaften zu studieren. Insgesamt ist diese Technik ein wertvolles Instrument, das besser genutzt werden kann Vektor-Erreger-Mikrobiota Interaktionen und ihre Rolle bei der Übertragung von Krankheiten zu verstehen.
Introduction
Mensch und Vieh Krankheitserreger übertragen durch Arthropoden Vektoren finden sich weltweit und entfallen etwa 20 % von Infektionskrankheiten weltweit1, aber effektiv und sichere Impfstoffe gegen die meisten dieser Erreger sind nicht verfügbar. Unser Verständnis für die Bedeutung von Kommensalen, symbiotische und pathogenen Mikroorganismen, zusammen bekannt als Mikrobiom2, Modulation und Formen die Gesundheit fast aller Metazoen3 erweitert. Es ist nun offensichtlich, dass Arthropoden Überträger von Krankheitserregern auch Darm Microbiota Hafen und dieser Vektor-assoziierten Mikrobiota haben gezeigt, dass verschiedene Vektoren übertragene Krankheitserreger4,5beeinflussen. Die Arthropoden Microbiome besteht aus Eubakterien, Archaeen und Viren eukaryotic Mikroben wie Protozoen, Nematoden und Pilze6. Aber wurde die vorherrschende Forschungsschwerpunkt Eubakterien zurückzuführen, zum Teil, um die Verfügbarkeit von Markergenen und Referenzdatenbanken, bestimmte bakterielle Mitglieder zu identifizieren.
Mit einem Fokus auf Ixodes Scapularis, die Zecke Vektor mehrere humanpathogene Erreger Borrelia Burgdorferi7, einschließlich der Erreger der Lyme-Borreliose, die Optimierung der mikrobiellen Visualisierungstechnik zielte ein besseres Verständnis der Zecke Darm Microbiota im Zusammenhang mit Vektor-Pathogen Interaktionen. Einige Fragen bleiben, um im Feld Tick Microbiome beantwortet werden. Der Darm ist die Website der erste längere Begegnung zwischen der Zecke und der eingehenden Erreger im Zusammenhang mit horizontal übertragenen Krankheitserreger; Daher wird das Verständnis der Rolle der Vektor Darm Microbiota Modulation Vektor-Pathogen Interaktionen aussagekräftige Erkenntnisse offenbaren. Zecken haben eine einzigartige Art der Blutmahlzeit Verdauung, wo Platz Verarbeitung der Blutmahlzeit Komponenten erfolgt intrazellulär8. Die Darm-Lumen scheinbar dient als Gefäß für die Blutmahlzeit der Zecke Feeds enthalten, und Nährstoff Verdauung und Assimilation ergeben in den Tagen der Fütterung und weiter nach Übersättigung. Die Krankheitserreger erworben von der Zecke während der Fütterung geben Sie das Darm Lumen zusammen mit dem Blutsaugen und somit das Lumen eines primären Standorts von Interaktionen zwischen den Tick, Erreger und resident Mikrobiota. Im weiteren Verlauf Verdauung durch die Kalorienzahl und Ixodid Häckchen Häutung erfährt der Darm strukturelle und funktionelle Veränderungen9. Die Zusammensetzung und die räumliche Organisation der Darmbakterien dürfte auch im Konzert mit den wechselnden Darm-Milieu zu variieren. Deshalb ist es wichtig, die Architektur der ansässigen Bakterien im Darm zu verstehen, das Zusammenspiel von Tick, Erreger und Darm Microbiota Tick zu verstehen.
Molekulare Techniken, um Host-assoziierten Mikrobiota routinemäßig beschreiben nutzen parallel Hochdurchsatz-Sequenzierung Strategien10 zu verstärken und zu sequenzieren bakterielle 16 s ribosomalen DNA (rDNA). Diese Abfolge Strategien umgehen axenic Kulturen von bestimmten Bakterien zu erhalten und bieten eine ausführliche Beschreibung aller bakteriellen Mitglieder in der Stichprobe vertreten werden müssen. Dennoch sind solche Strategien durch die Unfähigkeit, ökologische Verunreinigungen von Bona Fide Bewohner unterscheiden verwechselt. Weiter, bei der Beurteilung von Proben, wie Zecken, die sind klein und daher enthalten geringe Mikrobiota-spezifische DNA ergibt, die Wahrscheinlichkeit der Verstärkung von Umweltschadstoffen erhöhte11 und führt die zweideutige Interpretation des Microbiome Zusammensetzung. Funktionelle Charakterisierung in Verbindung mit der Visualisierung von bestimmten lebensfähige Bakterien, daher werden kritisch zu definieren und zu erkennen das Mikrobiom der Zecke, zeitlich und räumlich. Auf dieses Ziel nutzten wir die gesamte-Mount RNA in Situ Hybridisierung. Diese Technik wird routinemäßig verwendet, um gen Expressionsmuster in Organen und Embryonen12,13,14 beurteilen und ermöglicht semiquantitative Analyse des Ausdrucks über die gesamte Stichprobe von Interesse. Dies unterscheidet sich von traditionellen in Situ Hybridisierung Techniken die Gewebeschnitte nutzen und erfordern häufig umfangreiche Analyse des geschnittenen Materials mit einer rechnerischen Versammlung Ausdruck in ganze Organe15vorherzusagen. Während vollständig-hängen in der Regel auf ganze Organismen12bezieht, bezieht sich hier ganze-Mount auf ganze Eingeweide und Organe. Die Vorteile der Verwendung von ganz-Mount RNA in Situ Hybridisierung Ansatz um zu beurteilen, die Architektur der Zecke Darm Microbiota sind vielfältig. Die Zecke Darm besteht aus 7 Paar Divertikel, jedes Paar unterschiedlicher Größe16. Die funktionalen Unterschiede, wenn jemand unter dieser Divertikel nicht im Zusammenhang mit der Zecke Biologie verstanden werden kreuzen Mikrobiota oder Tick-Pathogen Interaktionen. Manipulationen des Darms, die den Darm Divertikel platzen würde Mikrobiota in das Lumen des Darms oder die lose mit den Darm und führen zu Fehlinterpretationen der räumliche Lokalisation der Mikrobiota verdrängen. Fluoreszenz-markierte RNA in Situ Hybridisierung wurde früher verwendet worden, um Tick Darm Transkripte17 untersuchen durch Fixierung und öffnen einzelne Darm Divertikel Sonde Hybridisierung zu gewährleisten und B. Burgdorferi zu lokalisieren Abschriften von Paraffin-eingebetteten ganze Zecken18-Schnitt. Beide Ansätze erfordern Manipulationen der Zecke Gewebe vor der Hybridisierung, die die Darm Microbiota Architektur beeinflussen würden.
In diesem Bericht beschreiben wir ausführlich das Protokoll um tragfähige Tick Darm Microbiota mit vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH) zu untersuchen. Die Verwendung von ganzen-Mount RNA in Situ Hybridisierung ermöglicht ein globales Verständnis der Gegenwart und Fülle von bestimmten Darmbakterien in den verschiedenen Regionen des Darms und kann neue Einblicke in die Zecke Darm Biologie im Rahmen des Erregers Kolonisation Sporn und Getriebe. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von RNA-Sonden, die gegen bestimmte bakterielle RNA Erkennung von lebensfähigen Bakterien im Darm von Zecken.
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Protocol
1. Vorbereitung der DNA-Templates
- Die 16 s rRNA Sequenz spezifische auf jede bakterielle Gattungen von NCBI Datenbank und Design Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kompatibel vorwärts herunterladen und reverse Primer, die Gattungen-spezifische Regionen (~ 200-250-Basenpaare lang) verstärken werden, wie oben beschrieben 19. Siehe auch die open-Source-Datenbanken SILVA20,21 und ProbeBase22 Online-Ressourcen für rRNA-gezielte Oligonukleotid Sonden und Grundierungen, RNA-Sonden für einige bakterielle Gattungen kommerziell sein mag zur Verfügung.
Hinweis: Es ist wichtig, wählen Genregionen, die nur für bestimmte Gattungen sind und dafür sorgen, dass gestaltete Primer nicht verwandte bakterielle Gattungen verstärken. Dies ist entscheidend für gen/Gattungen-spezifischen Sonde Hybridisierung zu erhalten. - Ernähren Sie Zecken sich für 24, 48 oder 72 h an Mäusen, Tick Mut zu sezieren und RNA und cDNA von Tick Mut wie beschrieben früheren23vorzubereiten. Verwendung cDNA als Vorlage zur PCR verstärken Gattungen-spezifischen Amplifikate mit einem Thermocycler. Führen Sie eine Aliquote des PCR-Produkt/Amplifikate auf einem 1,5 % Agarose-Gel und bestätigen Sie, dass der erwarteten Größe der Amplifikate durch Visualisierung unter ultraviolettem (UV) Licht mit einem Gel imaging-System entspricht.
- Klonen Sie die bakterielle 16 s ribosomalen RNA Amplifikate von Interesse in einen handelsüblichen TA Vektor (Table of Materials), die RNA-Polymerase Promotoren geeignet für Bakteriophage Polymerasen (SP6, T7 oder T3) enthalten. Die Klone zur Bestätigung der Identität der Amplifikate und die Richtwirkung des Klons in Bezug auf jeden der Promotoren-Sequenz. Bestimmen Sie auf dieser Basis, dass der Veranstalter der Wahl um Sinn oder antisense-RNA zu generieren (Abb. 1) Sonden.
- Linearisieren Sie 1 mg des Plasmids mit einem entsprechenden Beschränkung Enzym in einem Reaktionsvolumen von bis zu 30 µLfor 2 h bei Temperaturen, die vom Hersteller empfohlenen. Wählen Sie Restriktionsenzyme anhand der Projektträger, der verwendet wird, um den Sinn oder antisense-Sonde (Abbildung 1) zu erzeugen. Überprüfen Sie die Linearisierung durch Visualisierung von 2 µL Digest Reaktion auf einem 1 % Agarose-Gel.
- Die restlichen 28 µL verdaute DNA mit Hilfe eines handelsüblichen PCR Produkt Spalte Reinigung-Kits zu reinigen und Quantifizierung der DNA-Konzentration von Spektralphotometer.
Hinweis: Einige Sinn-Sonden möglicherweise Hintergrundfärbung viel höher als die entsprechende Antisense-Sonde und andere Optionen können erforscht werden müssen. Alternative Negativkontrollen enthalten Plasmide Codierung Sequenzen in der Probe oder einer anderen Sonde, die ergibt sich ein charakteristisches Muster der Hybridisierung nicht vertreten.
2. Konstruktion des Digoxygenin-UTP-RNA-Sonden
- Bereiten Sie die Nukleotid-Mischung durch die Kombination von 7,5 µL 100 mm UTP, 25 µL 10 mM Digoxygenin-UTP und 10 µL pro 100 mM ATP, GTP und CTP in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
- Führen Sie in Vitro Transkription mit handelsüblichen T7 oder Sp6 RNA-Polymerase-Kits, mit 1 µL Nukleotid-Mix (Schritt 2.1) und 0,25 - 1 µg DNA-Vorlage. Das Volumen bis zu 20 µL mit Wasser zu bringen. Streichen Sie das Rohr zu kombinieren und Impuls-Spin. Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h.
Hinweis: Sonde Bau war erfolgreich mit verdaute Plasmid Konzentrationen so niedrig wie 7 ng/µL, aber typische Konzentrationen an diesem Schritt reichen von 15-25 ng/µL. Die Transkription Reaktion kann auch über Nacht bei 37 ° C inkubiert werden, aber dies erhöht sich nicht deutlich die RNA-Ausbeute. - Fügen Sie 1 µL DNase (2.000 Einheiten/µL) und bei 37 ° C für 10 min inkubieren. 10 min nicht überschreiten, oder das Enzym kann beginnen, erniedrigende RNA.
- Fügen Sie 30 µL eiskalte 7,5-8 M Lithiumchlorid und 30 µL Nuklease-freie Kaltwasser, überstürzen sich die RNA. Streichen Sie das Rohr zu mischen. Lassen Sie Ausfällung von RNA über Nacht bei-20 ° c gehen
- Sammeln Sie RNA durch Zentrifugation bei 17.000 x g für 20 min bei 4 ° C. Waschen Sie das Pellet einmal mit 1 mL frisch zubereitete 75 % Ethanol in Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Wasser zu, dann wiederholen Sie Zentrifugation.
- Entfernen den überstand verwerfen, Invertieren Sie das Rohr auf einem sauberen Papiertuch und trocknen lassen für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in Nuklease-freies Wasser. Wenn die Pellets leicht sichtbar ist, in 25 µL aufzuwirbeln. Wenn das Pellet sehr klein oder nicht sichtbar ist, Aufschwemmen in 15-20 µL. erhalten eine Schätzung der RNA-Konzentration durch Spektralphotometer.
Hinweis: Typische RNA-Konzentrationen reichen von 200-500 ng/µL.
(3) Visualisierung der RNA-Sonden durch RNA Formaldehyd Gelelektrophorese RNA Reinheit bewerten
Achtung: Formaldehyd birgt die Gefahr eines Einatmen; Daher generiert die Lösungen für RNA Gelanalyse unter einem Abzug. Interkalation bromid ist karzinogenverdächtig; mit Vorsicht handhaben.
- Bereiten Sie eine 1 % Formaldehyd-Agarose-Gel, wie zuvor24 beschrieben und warf das Gel in einer Gel-Box frei von RNases. Nach dem Abkühlen, füllen Sie die Gel-Box mit 1 x Puffer (1 X MOPS bei pH 7,0, 5 % Formaldehyd) laufen.
- Bereiten Sie den Probenpuffer (5 µL 400 mg/mL Interkalation Bromid, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL Formaldehyd und 100 µL Formamid). Kombinieren Sie 2 µL RNA-Sonde (Schritt 2.6) mit 8 µL Probenpuffer. Bei 70 ° C für 10 min inkubieren.
- Bereiten Sie RNA laden Puffer durch die Kombination von 5 mL 50 % Glyzerin, 1 mL 10 % Formaldehyd 40 mg Bromophenol blue, 40 mg Xylol Cyanol und 20 µL 0,5 M EDTA (pH 7,5). Nach dem Gebrauch speichern dieser Puffer bei-20 ° C.
- 3 µL Puffer laden die RNS-Probe aus Schritt 3.2 hinzufügen und mischen. Halten Sie Probenröhrchen auf Eis.
- Laden Sie das gesamte Probenvolumen aus Schritt 3.4 in das Gel. Laden Sie eine Aliquote einsträngige RNA Leiter neben um RNA Größe zu überprüfen. Führen Sie das Gel bei 100 V oder senken Sie, bis der blaue Farbstoff ca. 75 % der Weg nach unten das Gel wandert. Visualisierung der RNS unter UV-Licht mit einem Gel-imaging-System.
Hinweis: Eine gute Qualität-RNA-Sonde sollte als diskrete Band mit einer Mobilität, die entsprechend der erwarteten Größe der Sonde (Abbildung 2, Spur 1) angezeigt. Wenn die Sonde als diffus und schmierig Band (Abbildung 2Lane 2) erscheint, dies sollte nicht verwendet werden.
4. kreuzen Sie Darm Sammlung und Fixierung
- Sammeln Sie Ixodes Scapularis Nymphen, die genährt haben bei Mäusen nach der Zeit Points of Interest.
Hinweis: Für die Zwecke dieser Technik gefüttert Zecken am besten für 48 oder 72 h Arbeit. - Zerlegen Sie den Darm von der Zecke in MEMFA (Tabelle 1) auf einen Glasobjektträger Mikroskop Dissektion, Vermeidung von Schäden an der Orgel so weit wie möglich. Setzen Sie ein Häkchen auf einen sauberen Objektträger in 20-30 µL des MEMFA. Mit ein paar sterile High-Carbon Stahl Klinge #11 Stück des Kopfes am Scutum der Zecke aus dem Körper der Zecke. Drücken Sie sanft den Körper, um den Darm Divertikel und Speicheldrüsen, die Körper Nagelhaut schieben. Die Speicheldrüsen und den Darm zu trennen und Schaufel den Mut auf der Rasierklinge.
- Sammeln Sie Mut in einem 1,5 mL Röhrchen mit 500 µL MEMFA. Inkubieren Sie das Rohr bei Raumtemperatur mit sanftes Schaukeln für 1 Stunde oder über Nacht bei 4 ° C.
Hinweis: Speicheldrüsen der Zecke kann auch seziert und ebenso fixiert und gefärbt. - Entwässern Sie das Gewebe durch Waschen sanft 3 Mal mit 1 mL eiskaltes 100 % Ethanol. Lassen Sie den Mut, die natürlich auf den Grund des Rohres zwischen jedem Waschgang sinken, Zentrifugation das Gewebe beschädigen. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Proben in 100 % igem Ethanol bei-20 ° C.
5. Bau von Mesh Probe Körbe und 24 Wohlen Korbträger
- Schneiden Sie die Böden von 2 mL oder 5 mL Snap-Top Zentrifuge Röhren mit einer beheizten einschneidig Rasierklinge auf ein Skalpell.
Achtung: Die Klinge möglicherweise müssen Sie mehrmals aufgewärmt werden, bevor der Schnitt abgeschlossen ist. - Schneiden Sie Quadrate von 110 µm-Nylon-Mesh etwas größer als die neue Röhre Öffnung. Binden Sie das Netz auf den Boden des Rohres durch zusammendrücken sie leicht auf einer heißen Platte auf mittlerer Hitze bis eine gute Abdichtung vorgenommen wird. Lassen Sie abkühlen, sicherzustellen Sie, dass keine Lücken zwischen dem Netz und den Schlauch, und schneiden Sie überschüssiges Gewebe an den Rändern.
- Löcher in den Deckel von einer 24-Well-Platte geschnitten, so dass die Lippe der Probe Korb gemacht im Schritt 5.2 am Loch sitzen und nicht durchfallen, nachgeben ein Setup, wo werden die Böden der Körbe Probe ganz in den Vertiefungen sitzen, wenn sie in platziert werden, die Löcher in der Abdeckung.
- Verwenden Sie diese angepassten korbträger Körbe mit relativer Leichtigkeit für die Gesamtheit der in Situ Hybridisierung Protokoll von einer Platte auf einen anderen übertragen. Verwenden Sie zwei 24-Well-Platten, so dass während einer Inkubation stattfindet, die andere Platte für die nächste Wäsche bereit ist.
6. in Situ Hybridisierung: Tag 1 (Timing: 4-5 Std.)
- Transfer-Mut, beschriftet Probe Körbe, getrennt durch versuchsbedingung und RNA-Sonde bestimmt.
Hinweis: Flecken von mindestens 5 Mut pro Zustand, um natürliche Unterschiede zwischen den Wiederholungen zu berücksichtigen. - Rehydrieren Sie die Proben vorsichtig, um zu vermeiden, Einführung von Luftblasen in das Gewebe durch die schrittweise Erhöhung des Verhältnisses von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % nichtionische Tenside (PTw; Tabelle 1) zu Ethanol in den Waschungen.
Hinweis: Schließe alle wäscht in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation, sofern nicht anders angegeben. Aliquoten 500-600 µL Waschlösungen in jede Vertiefung des Inhabers so, dass die Eingeweide in jedem Korb vollständig eingetaucht sind. Bereiten Sie alle Lösungen mit DEPC-behandeltem Wasser, RNA-Abbau zu verhindern.- Gewaschen Sie die Proben für 5 min in 500 µL 100 % igem Ethanol werden.
- Bereiten Sie mindestens 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol in PTw. rehydrieren die Proben durch Waschen für 5 min in jeder Umzug von der höchsten ethanolkonzentration auf den niedrigsten Ethanol-Lösung.
- Waschen Sie die Proben 4 mal 5 min in PTw.
- Permeabilize der Proben mit Proteinase K (10 µg/mL) in 5 min PTw.
- Bereiten Sie das Gewebe für die Hybridisierung mit der RNA-Sonden.
- Waschen Sie die Proben zweimal wie in 6.2 in 24 Wohlen korbträger bei Raumtemperatur mit sanften Agitation für 5 min in 500 µL Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) (Tabelle 1) weiterhin die Proben in einem Amin-freie Umgebung beschrieben.
- Behandeln Sie die Proben zweimal mit 500 µL 0.25 % Essigsäureanhydrid in Triethanolamin Puffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) für 5 min, dann waschen Sie die Proben zweimal in PTw für 5 min.
Hinweis: Die Essigsäureanhydrid acetylates freie Amine um positive Ladung, der ist entscheidend für verhindern elektrostatische Wechselwirkungen unspezifische und spezifische Bindung der Sonde zu mRNA zu neutralisieren. - Befestigen Sie den Mut für 20 min mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PTw, dann waschen Sie 5 Mal für 5 min in PTw.
- Prehybridize durch Inkubation der Proben in 500 µL Hybridisierung Puffer /in 24 Wohlen korbträger in der 24-well-Platte (Tabelle 1) 1,5-2,5 Stunden bei 60 ° C mit sanften Agitation im Wasserbad schütteln. Speichern des Hybridisierung Puffers verwendet für den prehybridization Schritt zur Wiederverwendung in der Tag-2-Protokoll (Schritt 7.1).
- Bereiten Sie Sonde Hybridisierung Lösungen durch RNA-Sonden in Hybridisierung Puffer, eine Endkonzentration von 1 µg/mL zu verdünnen. Inkubieren Sie Proben mit Sonde Hybridisierung Lösungen in der 24-Well korbträger bei 60 ° C mit sanften Agitation über Nacht in einem schütteln Wasserbad (Tabelle 2). Die Abdeckplatte tragen die korbträger behaglich mit Alufolie um Verdunstung der Hybridisierung Lösung zu verhindern.
7. in Situ Hybridisierung: Tag 2 (Timing: 4,5-5,5 h)
- Entfernen Sie die Proben aus der Sonde Hybridisierung Lösungen und legen Sie sie in den reservierten Hybridisierung Puffer vom Vortag. Bei 60 ° C mit sanften Agitation für 3 min inkubieren.
Hinweis: Sonde Hybridisierung Lösungen können bei-20 ° C zur Wiederverwendung bis zu 3 Mal gespeichert werden. - Bereiten Sie 2 x Kochsalzlösung-Natrium-Citrat-Puffer (SSC) durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser (Tabelle 1). Waschen Sie die Proben zweimal für 3 min mit 2 x SSC, dann 3 Mal für 20 min mit 2 X SSC bei 60 ° C, alle Spuren von Sonde und Hybridisierung Puffer zu entfernen.
- Behandeln mit RNase ein (20 µg/mL) und RNase T1 (10 µg/mL) 2 x SSC für 30 min bei 37 ° C zu entfernen, einzelne gestrandet vertritt freie RNA-Sonde hybridisiert RNA.
- Waschen, einmal mit 2 X SSC für 10 min bei Raumtemperatur. Bereiten Sie 0,2 X SSC durch Verdünnung 2 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser, dann waschen Sie zweimal mit 0,2 X SSC für 30 min bei 60 ° C, überschüssige RNases zu entfernen.
- Waschen Sie zweimal mit 500 µL Puffer Maleic Acid (MAB; Tabelle 1) für 10 Minuten.
- Inkubieren Sie Proben mit blockiert Lösung (2 % blocking Reagenz in MAB) für 1,5-2 h.
Hinweis: Das blockierende Reagenz kann schwierig zu lösen sein; sanfte Erwärmung hilft Auflösung. - Ersetzen Sie die blockierende Lösung mit Anti-Digoxigenin alkalische Phosphatase konjugiert 500 µL Antikörper bei einem 1:3,000 Verdünnung in blocking-Lösung und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur für ca. 4 h oder bei 4 ° C.
8. in Situ Hybridisierung: Tag3 (Timing: 6 h, Übernachtung)
- Waschen Sie die Proben mindestens 5 mal 30 min mit 500 µL MAB, überschüssige Antikörper zu entfernen.
Hinweis: Diese Waschungen sind flexibel und können verlängert werden, um 1-2 h, oder 3-4 Wäschen können für eine Übernachtung zu waschen bei 4 ° C mit minimalen Auswirkungen auf die Wirksamkeit ersetzt werden. - Waschen Sie zweimal für 5 min mit alkalischer Phosphatase-Puffer, pH 9,5 (AP-Puffer; ( Tabelle 1).
- Beginnen Sie die Farbreaktion, indem der letzten Wäsche mit 500 µL des chromogenen Substrates für alkalische Phosphatase (Table of Materials). Decken Sie Probenteller mit Alufolie ab und gehen lassen Sie, die Färbung bei Raumtemperatur für 3 - 5 h oder über Nacht bei 4 ° c gehen Sie Überwachen Sie die Färbung Reaktion in regelmäßigen Abständen durch Anzeigen des Gewebes unter dem sezierenden Mikroskop um overstaining zu vermeiden.
Hinweis: Wenn die Färbung abgeschlossen ist, ein lila Farbton ist von Auge in der Antisense-sondiert Proben unter dem Mikroskop erkannt, aber das Gewebe darf nicht zu sehr dunkel geworden. Färbung kann geht sehr langsam bei 4 ° C und bis zu 20-24 Uhr. - Die Farbreaktion durch Waschen für 5 min in 500 µL MAB stoppen, dann das Gewebe über Nacht in Bouins Lösung zu beheben.
Achtung: Behandeln Sie die Bouins Lösung in einer Dampfhaube; Es ist eine ätzende Karzinogen.
9. in Situ Hybridisierung: Tag 4 (Timing: 3-3,5 h)
- Bereiten Sie mindestens 7 mL pro Probe Korb 1 X SSC durch Verdünnung 20 X SSC in DEPC-behandeltem Wasser. Entfernen Sie die Bouins Lösung durch Waschen der Proben 4 bis 6 Mal mit 70 % Ethanol in 1 X SSC bis das Gewebe nicht mehr gelb ist.
- Bereiten Sie 500 µL pro Probe Korb von 75 %, 50 % und 25 % Ethanol Lösungen in 1 X SSC. Waschen Sie die Proben 5 min in jeder Lösung Verschieben von höchsten ethanolkonzentration auf niedrigsten das Gewebe zu rehydrieren. Waschen zweimal für 5 min jeweils in 1 X SSC.
- 90 min auf einem Leuchtkasten in einer Dampfhaube Proben in das Bleichmittel-Lösung (Tabelle 1) inkubieren.
Hinweis: Dieser Schritt erlaubt Pigmentierung in den Proben oder Färbung von Bouins Lösung entfernt werden und erhöht die Sonde Signal für die übersichtliche Visualisierung. - Waschen Sie die Proben zweimal mit 500 µL 1 X SSC für 5 Minuten.
- Die Eingeweide mit minimalen Schäden durch Umdrehen des Probe-Korbes in einen Brunnen einen neuen 24-Well-Platte zu verlagern und Waschen mit 70 % Ethanol durch den Netz-Boden mit einer transferpipette. Aufbewahren Sie bei-20 ° C, bei Bedarf.
- Um eine Übersicht über die Färbung Muster von mehreren Proben, wie in Abbildung 3, pflegen Sie die Eingeweide in 70 % igem Ethanol in der 24-Well-Platte und Sicht mit jedem Hellfeld Mikroskop. Zu einzelnen Mut unter dem Hellfeld Mikroskop zu untersuchen, wie in Abbildung 4, Abbildung 5gezeigt, und Abbildung 6, montieren Sie die Eingeweide in 100 % Glycerin unter Deckgläsern. Mit einem Spatel aus Kunststoff, um sanft das Gewebe mit minimalen Schäden zu manipulieren.
Hinweis: Die hohe Viskosität des Glycerins schützt das Gewebe vor Schäden durch Kompression und ermöglicht die sorgfältige Positionierung der Divertikel so, dass das Gewebe optimal bei höheren Vergrößerungen angezeigt werden kann. - Aufnahmen auf dem Mikroskop mit Mikroskop bestimmtes Image Capture-Software (Table of Materials) und als TIFF-Bilder zu einem generischen Bildbearbeitungs-Software exportieren. Zur Quantifizierung der relativen Färbung Unterschiede zwischen experimentelle Behandlungen herunterladen Sie eine generische Bildanalyse-Software (Table of Materials). Öffnen Sie das Bild in der Analysesoftware und verwenden Sie die Anweisungen in der Software zur Messung Pixel Intensität der Färbung und Histogramm Grundstücke der Färbung zu berechnen.
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Representative Results
Die Messung und Einschätzung der Qualität der RNA-Sonden sind kritische vor Beginn der Färbung. In-vitro- Transkription Effizienz hängt in hohem Maße auf die Menge und Qualität der DNA-Vorlage. Wir visualisieren routinemäßig die RNA-Sonden auf einem Formaldehyd-Gel zur Überprüfung der Reinheit und Menge der Sonde durch die Transkription Reaktionen erzeugt. Die Sonden erscheint als helles, diskrete Banden (Abbildung 2). Photometrische Messungen der RNA-Konzentration waren höchst bezeichnend für Sonde Qualität und korreliert gut mit dem Erscheinungsbild der Bands auf dem Gel. So kann die Gel Visualisierung Schritt übersprungen werden, falls gewünscht, wenn Vertrautheit mit dem Protokoll erreicht hat. In jedem Fall ist es wichtig sicherzustellen, dass ausreichend RNA von hoher Qualität produziert wird, wie die Robustheit der Sonden alle nachgelagerten Schritte abhängen.
Die Stärke dieser Technik ist bei der Erleichterung der breiter Beobachtungen über die Zecke Mikrobiota, einschließlich Vorhandensein oder Fehlen von Bakterienarten, Veränderungen in der Fülle von Bakterien im Laufe der Zeit als die Zecke Feeds und Lokalisierung von Arten innerhalb des gesamten Gewebes. Einige Unterschiede in der Färbung, Menge und Verteilung ist normal bei biologischen Wiederholungen sowie bei der 7 Paar Divertikel der einzelnen Mut (Abbildung 3), daher ist es am besten, mindestens fünf Eingeweide pro Zustand bekommen Sie eine Ahnung des Durchschnitts zu beflecken Färbung Muster. Der Gesamterfolg des Protokolls ist am besten durch einen Vergleich der Färbung der Sense und Antisense Proben für jede Bedingung gemessen. Sinn Proben, wichtige Negativkontrollen für diese Art von Analyse, müssen minimale bis keine lila Farbe (Abbildung 4). Im Gegensatz dazu sollte antisense Proben anzeigen robuste Färbung mit minimaler Hintergrund, dessen, der Intensität hängt von der Fülle der spezifischen bakteriellen Abschriften angestrebt. Die Färbung Muster innerhalb des Gewebes wird auch auf diese Parameter variieren. Wichtig ist, müssen die Sense und antisense Proben entwickelt werden für die gleiche Menge an Zeit um vergleichen zu können direkt, so dass diese Proben parallel verarbeitet werden soll. Überentwicklung der Farbreaktion kann dazu führen, dass ein hohes Maß an Hintergrund Färbung, wo die Sinne Proben beginnen, Antisense (Abbildung 5) ähneln. Insbesondere in dieser Phase das Protokoll achten um zu vermeiden, overstaining, da gibt es keine Möglichkeit, die Reaktion umkehren, wenn es auftritt.
Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass alle Mut in jedes Reagens in jeder Phase vollständig untergetaucht sind; eine Erhöhung in der Variante über Proben möglicherweise aufgrund der ungleichen Exposition gegenüber Reagenzien. Die Menge der Zeit, dass die Zecken gefüttert werden, bevor den Mut gesammelt werden hat auch erhebliche Auswirkungen auf die Ergebnisse. Zecken, die häufi oder nur für 24 h gefüttert wurden waren schwierig, mit zu arbeiten; die Eingeweide wurden auch mehr leicht beschädigt und keine Flecken (Abbildung 6) und ist eine Einschränkung dieses Ansatzes zu diesem Zeitpunkt. Zecken gefüttert für 48-72 h wurden am einfachsten zu arbeiten, aufgrund der Größe dieser Mut Mut von Zecken gefüttert für 24 h. Mumm aus späteren Zeitpunkten gegenüber gebeizt auch besser als 24 h gefütterten Zecken, möglicherweise aufgrund von bakteriellen Belastung während der späteren Stadien o f zu füttern. Die 72-h-Gewebe hatte oft einen leichten Hintergrund von brauner Färbung von Blut, aber die lila Färbung war deutlich sichtbar über die Tönung (Abbildung 4). Die Eingeweide sind am besten bei kleiner Vergrößerung (5 X oder 10 X), um die Färbung Muster über das gesamte Gewebe mit einem Hellfeld Mikroskop sehen können angesehen. Anzeigen vollständig-hängen Gewebe bei höherer Vergrößerung, wie z. B. mit einem 63 X Öl Ziel, läuft Gefahr, das Gewebe zu beschädigen, wie das Ziel würde gegen die Folie drücken und das Gewebe aufgrund der Dicke der Proben zu komprimieren. Wenn höhere Auflösung Bildbearbeitung gewünscht wird, sollte das Potenzial für Gewebe schneiden untersucht werden.
Abbildung 1 . Schaltplan der Vorlage Vorbereitung für Sonde Generation. Klonen Sie die 16 s rRNA Amplifikate in eine TA klonen Vektor mit T7 und Sp6 Promotoren. Linearisieren der Konstrukt mit Restriktionsenzymen geschnitten an Websites ein oder b für in-vitro- Transkription mit T7 oder Sp6 Projektträger um Sinn oder Antisense Sonden bzw. zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Visualisierung der RNA-Sonde durch Gelelektrophorese. RNA-Sonden (~ 700 ng) wurden electrophoresed auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel unter UV-Licht sichtbar gemacht und mit einem kommerziellen Gel imaging-System abgebildet. Eine repräsentative, gute Qualität, Gasse 1; und qualitativ schlechte RNA-Sonde, Lane 2.
Abbildung 3 . Einen repräsentativen Überblick der gesamten-Mount in Situ Hybridisierung von 48 h gefütterten Mut. Eingeweide von Zecken gefüttert für 48 h gebeizt mit Antisense RNA komplementär zu einer konservierten 16 s ribosomalen RNA-Sequenz zeigt unterschiedliche Färbung der Darm Divertikel. Maßstabsleiste stellt 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Repräsentative Bilder des erfolgreichen ganzen-Mount in Situ Hybridisierung in Ixodes Scapularis Mut. Eingeweide von Zecken, die für den angegebenen Zeitraum gefüttert waren voller Flecken, entweder Menschenverstand (Negativkontrolle) oder Antisense RNA-Sonden. Antisense-Sonden wurden ergänzend zu einer erhaltenen 16 s ribosomalen RNA Sequenz (Universal 16 s) oder eine 16 s RNA-Sequenz spezifisch für eine bestimmte bakterielle Gattung (wie angegeben). Enterococcus nicht Ausbeute robuste Färbung um 48 h Skala Bars stellen 140 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Verlängerte chromogenen Reaktionszeit führt zu unspezifische Färbung. Eingeweide aus Zecken für 48 h gefüttert wurden mit einer Sinn-RNA-Sonde oder eine Ergänzung zu einer erhaltenen 16 s RNA-Sequenz antisense Sonde geprüft. Das Gewebe wurde mit dem Substrat alkalische Phosphatase BM lila über Nacht bei 4 ° C und dann bei Raumtemperatur für ca. 4 h inkubiert, bevor Abstoppen der Reaktion. Maßstabsleisten vertreten 140 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 . Vollständig-hängen in Situ Hybridisierung mit häufi oder 24 h gefüttert Tick Mut. Eingeweide von ungespeist oder 24 h gefütterten Zecken waren voller Flecken, mit Sinn RNA-Sonden oder Antisense-Sonden komplementär zu einer erhaltenen 16 s RNA-Sequenz oder eine Sequenz, die spezifisch für die Gattung Rickettsia. Färbung in der antisense Proben ist weniger robust als zu späteren Zeitpunkten beobachtet und die Eingeweide sind ebenfalls mehr leicht beschädigt. Maßstabsleisten darstellen 60 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Endkonzentrationen | Endgültige pH-Wert | Lagerung-Notizen |
| MEMFA | 0,1 M MOPS | - | Raumtemperatur |
| 2 mM EGTA | |||
| 1 mM Magnesium-Sulfat | |||
| 3,7 % Formaldehyd | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1 X PBS, 0,1 % Tween-20 | 7.0 | Raumtemperatur |
| 0,1 % Tween-20 | |||
| Triethanolamin Puffer | 1 X PBS | 7.0-8.0 | Raumtemperatur |
| 0,1 M Triethanolamin | |||
| Hybridisierung Puffer | 50 % Formamid | - | -20 ° C |
| 5 X SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| 100 µg/mL heparin | |||
| 1 x Denhart Lösung | |||
| 0,1 % Tween-20 | |||
| 0,1 % CHAPS | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Maleic Acid Puffer (MAB) | 100 mM Maleic acid | 7.0 | Raumtemperatur |
| Natrium-Chlorid-150 mM | |||
| Alkalische Phosphatase (AP) Puffer | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| 50 mM Magnesiumchlorid | |||
| Natrium-Chlorid-100 mM | |||
| 0,1 % Tween-20 | |||
| 5 mM levamisol | |||
| Bleichmittel-Lösung | 1 % Wasserstoffperoxid | - | Frisch zubereiten |
| 5 % Formamid | |||
| 0,5 X SSC |
Tabelle 1. Rezepte von Lösungen, die in das Protokoll verwendet.
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Discussion
Dies ist die erste Verwendung einer vollständig-hängen in Situ Hybridisierung (WMISH)-Technik, die Mikrobiota ein Arthropoden Vektor von Krankheitserregern zu studieren. Unser Protokoll wurde von einem zur Entwicklung von Drosophila und Frosch-Embryonen25,26Untersuchung angepasst. Vollständig-hängen RNA in Situ Hybridisierung wurde routinemäßig verwendet, um gen Transkripte räumlich zu lokalisieren und zeitlich27 und Visualisierung von Abschriften können erfolgen durch Hellfeld oder Fluoreszenz-Mikroskopie. Wir haben das ehemalige zur Erkennung von Mikrobiota in Tick Mut angenommen. Es ist wichtig zu beachten, dass die versucht wird, führen Sie vollständig-hängen in Situ Hybridisierung mit ganzen Zecken in denen Kopfbereich entfernt wurde, um zuzulassen, dass Eindringen von Fixativ und Hybridisierung Lösungen nicht erfolgreich war. Das hier beschriebene Protokoll nutzt seziert Mut und wurde implementiert, um die Auswirkungen von bestimmten Zecken-Proteine auf bakterielle Besiedlung in den Mitteldarm23zu studieren. Informationen, die von WMISH ist vergleichbar mit Immunohistochemistry aber hat den Vorteil, dass die Entstehung von Proteinen und Antikörpern gegen das Gen oder Protein des Interesses. Genomische Informationen ist ausreichend, um die Reagenzien für WMISH zu generieren. WMISH und FISH (Fluoreszenz in Situ Hybridisierung) erkennt die Genexpression. Jedoch da es sich um eine enzymatische und Chromogen-based Assays, hat WMISH den Vorteil, dass Farbentwicklung aktiv überwacht werden kann, und die Reaktion erlaubt ist, fahren bis zum Nutzsignal und Empfindlichkeit ist dann erreicht. Es ist voll zugänglich für Automatisierung und ist leicht skalierbar, Hochdurchsatz-Format. Im Gegensatz zu Fisch und Immunohistochemistry ist kein Schnitt erforderlich. Der Nachteil der WMISH über Fische ist, dass nur 2 verschiedene mRNAs oder Gene gleichzeitig angesprochen werden können und würde voraussetzen, dass die Sonden mit verschiedenen Nukleotid-Analoga z. B. Digoxigenin-UTP und Fluorescein-UTP28beschriftet werden. Mit Fisch kann bis zu 6 verschiedene mRNAs in einem Test29untersucht werden. Während beide Assays vergleichbar Zeit erfordern, die Kosten für die Fluoreszenz-Farbstoffen sind höher als die des chromogenen Substraten. Fisch-Assays müssten auch ein Fluoreszenzmikroskop für Bild Visualisierung, während WMISH Bild Visualisierung mit jedem Lichtmikroskop durchgeführt werden kann.
Es ist wichtig, dass das Protokoll dicht gefolgt ist; Allerdings gibt es einige Schritte, die eine besonderen Sorgfalt erfordern. Dissektion der Mitteldarm von der Zecke ohne Beschädigung des Gewebes erfordert einige Geschicklichkeit. Es kann ratsam sein, zusätzliche Ticks um üben die Sezierungen und gewinnen Kenntnisse zu sammeln. Aufgrund der Heterogenität der Färbung in den verschiedenen Divertikel der einzelnen Mut (Abbildung 3) ist es wichtig zu prüfen, die Divertikel jeder Darm schlüssige Beweise für bakterielle Fülle ableiten. Es ist auch wichtig, mehrere Mut (mindestens 5) für jede experimentelle Bedingung zu verarbeiten, um aussagekräftige Informationen über die Präsenz, die räumliche Verteilung und die Fülle von bestimmten Bakterien in verschiedenen Divertikel. Produktion von qualitativ hochwertigen RNA-Sonden ist auch entscheidend für die effektive Gewebe Färbung. Es ist entscheidend, auch die Reihenfolge der Sonde Vorlage im klonen Vektor um sicherzustellen, dass Antisense bestätigen und Sinn Sonden werden entsprechend generiert. Eine produktive in Vitro Transkription Reaktion erfordert ausreichende Vorlage DNA; ein Minimum von 100 ng verwendet werden, aber 0,5 - 1 µg empfiehlt für optimale Sonde Generation.
Die Verwendung der Probe Körbe und 24-Well-Platten in diesem Protokoll vermeidet direkte Manipulation des Gewebes bei jedem Waschschritt, die Schäden bei der Färbung minimiert. Proben sind jedoch noch gelegentlich verloren oder beschädigt; Eingeweide aus ungespeist oder 24h gefütterten Zecken, insbesondere sind schwer zu erkennen und leicht zu verlieren bei der Übertragung von Probe-Körbe zu einem langfristigen Vorratsbehälter. Zusätzliche Vorsicht geboten beim Umgang mit diesen Proben. Aufgrund dieser Einschränkung haben wir vor allem 48 und 72 h gefütterten Tick Eingeweide verwendet. Das Vorhandensein von großen Mengen der Blutmahlzeit in den Eingeweiden zu diesen Zeitpunkten (länger als 72 h) stört die Färbung und Visualisierung aufgrund unspezifischer Hintergrund aus der Blutmahlzeit und stellt auch eine Einschränkung dieser Technik. Es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung von eindringmittel-markierten Sonden könnte dieses Problem umgehen.
Der wichtigste Aspekt der Färbeverfahren ist, das Gleichgewicht zwischen robusten Färbung und geringen Hintergrundsignal zu etablieren. Das Timing der ideale Farbentwicklung variieren je nach den experimentellen Bedingungen. Daher empfiehlt es sich, die Farbreaktion bei Raumtemperatur und Monitor Farbentwicklung ungefähr alle 30 Minuten durchführen. Die Reaktion kann auch eingerichtet werden, über Nacht bei 4 ° C zu Farbentwicklung langsam vorgehen. Es ist jedoch äußerst kritisch, nicht diese Reaktion für lange gehen zu lassen. Die Färbung Reaktion kann schwierig sein, mit dem Auge, zu überwachen, so dass die Proben unter dem Mikroskop Dissektion untersucht werden sollte. Eine violette Färbung soll auf Proben mit antisense-RNA, sondiert, während die Proben sondiert mit Sinn, dass RNA minimal Farbe behalten sollte sichtbar sein. Wenn die Sinne RNA sondiert Proben bunt färben, sollten Schritte zur Problembehandlung beginnen mit die Inkubationszeit mit BM lila reduzieren und erhöhen die Sperrzeit. Manchmal können Sinn Sonden anomal hohen Hintergrund im Vergleich zu der antisense Sonden verursachen; in diesen Fällen möglicherweise unterschiedliche Regionen des Gens zur Erzeugung von RNA-Sonden betrachtet werden. DNA-Sequenzen in einer Probe nicht vertreten können auch als Vorlagen als Negativkontrolle Sonden zu generieren. Beispielsweise kann eine DNA Schablone Kodierung einer Region das grün fluoreszierende Protein, nicht in das Tick-Genom oder seine Microbiome vertreten genutzt werden.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass die Analyse weitgehend qualitativen; jedoch konnte Bildanalyse-Software (Table of Materials) verwendet werden, um die Färbung Signal in jeder Probe zu messen. Dies würde einen semi-quantitativen Vergleich der Fülle der verschiedenen Bakterienarten unter verschiedenen experimentellen Bedingungen ermöglichen. Dies ist zwar eine aufwändige Protokoll, die 3-4 Tage in Anspruch nimmt, ist es nicht mühsam; jeden Tag Hands-on-Zeit ist im Durchschnitt nur ca. 3-5 h. Können jedoch die Möglichkeit, viele Proben parallel mit dem Einsatz von der Probe Körbe und Inhaber Prozess für Hochdurchsatz-Analyse. Darüber hinaus kann dieser Prozess automatisiert werden, mit im Handel erhältlichen Instrumenten (Tabelle der Materialien) wenn dieses Protokolls ein wesentlicher und Routine Bestandteil des Research Laboratory voraussichtlich wird unter Verwendung im Handel erhältlich sein Automatisierung-kompatiblen Plattformen (Table of Materials), um weitere verkürzen praktische.
Das beschriebene Protokoll nutzt Digoxygenin-markierten Sonden, die die Produktion eines farbmetrischen Signals ermöglichen das Hellfeld Mikroskopieren abgebildet werden können. Während wir, einem chromogenen Substrat genutzt haben um hybridisierten RNA-Sonden spezifisch für einzelne Ziele zu erkennen, es ist auch möglich, mehrere Ziele gleichzeitig zu erkennen, indem Sie beschriften Sonden mit verschiedenen Nukleotid-Analoga, wie z. B. Digoxigenin-UTP und Fluorescein-UTP und verschiedenen chromogenen Substraten30. Die Gewebeproben können dann nacheinander mit alkalischen Phosphatase-gekoppelten Antikörper gegen Digoxigenin und Fluorescein, mit unterschiedlichen chromogenen Reaktionen für die beiden Schritte inkubiert werden. Diese Technik könnte auch fluoreszent-markierten Sonden angepasst höherer Auflösung Bildgebung mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie31 erleichtern und bieten Ihnen die Möglichkeit mit mehreren Sonden in verschiedenen Farben parallel. Diese Technik kann nur speziell einige Mikroorganismen auf einmal in einer Probe beurteilen. Allerdings können mehrere Proben beurteilt werden im Hochdurchsatz-Assays an mehreren Mikroorganismen, die in Tick Mikrobiota dargestellt werden kann.
Zu guter Letzt ist diese Technik nicht beschränkt sich auf die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Zecken und ihre damit verbundenen Mikrobiota. Sonden ergänzen jedes Gen des Interesses innerhalb des Tick-Genoms werden erzeugt und zu prüfen, die Fülle und die Lokalisierung von spezifischen Genen in verschiedenen Geweben verwendet. Die Speicheldrüsen der Zecke können auch verarbeitet und gleichermaßen zum Darm analysiert werden. Insgesamt hat diese Technik Potenzial zur Anpassung an den Studien über die Dynamik mikrobieller Gemeinschaften in anderen Arthropoden Krankheitsüberträger von Interesse.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Mustafa Khokha, Yale University, für die Bereitstellung von seinem Labor Ressourceneinsatz. Wir sind dankbar, Herr Wu Ming Jie für ausgezeichnete technische Unterstützung. EF ist ein HHMI Investigator. Diese Arbeit wurde durch ein Geschenk von John Monsky und Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
