Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

ויזואליזציה של Microbiota במעיים שנתות על-ידי הכלאה כולה-הר בחיי עיר

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57758
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להעריך במרחב של חנותם הנוכחות של קיימא microbiota במעיים שנתות תוך שימוש בגישה שונה כולה-הר היברידיזציה.

Abstract

מחלות זיהומיות המועברת על ידי וקטורים arthropod ימשיכו להוות איום משמעותי על בריאות האדם ברחבי העולם. פתוגנים גרימת מחלות אלו, אינם קיימים בבידוד כאשר הם ליישב את הווקטור; במקום זאת, הם כנראה לעסוק אינטראקציות עם מיקרואורגניזמים תושב ב לומן מעיים. Microbiota וקטור הוכח כדי לשחק תפקיד חשוב בפתוגן שידור עבור מספר מחלות נישאות וקטור. בין אם תושב חיידקים בבטן של השניה Ixodes scapularis , הוקטור של מספר פתוגנים האנושי כולל Borrelia burgdorferi, להשפיע על השידור שנתות של פתוגנים לא נקבע. אנחנו דורשים שיטות עבור אפיון ההרכב של חיידקים הקשורים עם הבטן שנתות כדי להקל על הבנה טובה יותר של פוטנציאל אינטראקציות בין זנים בבטן שנתות. שימוש כולה-הר בחיי עיר הכלאה להמחיש תעתיקים RNA הקשורים למין מסוים חיידקי מאפשר האוסף של נתונים איכותיים לגבי שפע והפצה של microbiota בתוך הרקמה ללא פגע. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון שינויים וחשש microbiota הבטן במהלך שנתות האכלה, ניתן להחיל גם לנתח את הביטוי של גנים שנתות. צביעה של כל שנתות אומץ התשואה מידע אודות התפלגות מרחבית ברוטו היעד RNA ברקמה ללא צורך שחזור תלת מימדי, מושפע פחות זיהום סביבתי, אשר לעיתים קרובות מבלבל את מבוסס על רצף שיטות שימוש תכוף ללמוד קהילות מיקרוביאלי מורכבים. בסך הכל, טכניקה זו היא כלי רב ערך שיכול לשמש טוב יותר להבין וקטור-פתוגן-microbiota אינטראקציות ותפקידם העברת מחלות.

Introduction

האדם ובעלי פתוגנים ששודרו על-ידי וקטורים arthropod מצויים ברחבי העולם בחשבון כ- 20% של מחלות זיהומיות ברחבי העולם1, אך יעיל ואני בטוח חיסונים נגד רוב פתוגנים אלה אינן זמינות. הבנתנו תפקידה החשוב של מיקרואורגניזמים commensal, סימביוזה, פתוגניים, המכונה באופן קולקטיבי microbiome2, להתכוונן בעיצוב הבריאות של metazoans כמעט כל3 מתרחבת. עכשיו זה ברור arthropod וקטורים של פתוגנים הנמל גם בטן microbiota microbiota הקשורות וקטור אלה הוכחו השפעה מגוונים פתוגנים בעקיצות וקטור4,5. Microbiome arthropod מורכב eubacteria, ארכאונים, וירוסים, חיידקים האיקריוטים כגון חד-תאיים, נמטודות פטריות6. עם זאת, מוקד מחקר השולט כבר ב eubacteria נובע, בין השאר, את הזמינות של סמן גנים ובסיסי התייחסות לזהות חברי חיידקי ספציפי.

עם דגש על Ixodes scapularis, וקטור שנתות של פתוגנים האנושי מרובים כולל Borrelia burgdorferi7, סוכן סיבתי של מחלת ליים, אופטימיזציה של טכניקה ויזואליזציה מיקרוביאלי היה מכוון שיפור ההבנה שלנו של microbiota בטן שנתות בהקשר של אינטראקציות פתוגן-וקטור. מספר שאלות נותרו להיענות בשדה microbiome שנתות. הוא האתר של המורחבת המפגש הראשון בין השניה את הפתוגן נכנסות בהקשר של פתוגנים המועברים אופקית; לכן, להבין את התפקיד של וקטור microbiota בטן ב להתכוונן פתוגן-וקטור אינטראקציות תחשוף תובנות משמעותיות. קרציות יש מצב ייחודי של עיכול ארוחת דם, עיבוד של ארוחת דם רכיבים לוקח המקום intracellularly8. לומן מעיים לכאורה משמש קיבול להכיל את ארוחת דם כמו ההזנות שנתות, והוא מזין עיכול והטמעה ensue לאורך מספר ימים של האכלה ולהמשיך כסיגנל שלאחר. פתוגנים שרכשה את תקתוק שהאכילה הזן לומן הבטן יחד עם bloodmeal והופך ובכך לומן אתר ראשי של אינטראקציות בין שנתות, הפתוגן, תושב microbiota. כמו עיכול ממשיך דרך כסיגנל שנתות Ixodid משיר, הבטן עובר שינויים מבניים ופונקציונליים9. את ההרכב ואת הארגון המרחבי של חיידקים במעיים סביר גם משתנים בתיאום עם הבטן משתנה הסביבה שבה התרחשה. חשוב, לכן להבין את הארכיטקטורה של תושב חיידקים בבטן שנתות כדי להבין באופן מלא את הגומלין של שנתות הפתוגן, הבטן microbiota.

טכניקות מולקולריות כדי לתאר microbiota מארח-הקשורים באופן שגרתי לנצל אסטרטגיות רצפי מקביל בתפוקה גבוהה10 כדי להגביר את רצף ה-DNA חיידקי מטוסי אף-16 30s ריבוזומלי (rDNA). אלה אסטרטגיות רצפי לעקוף את הצורך להשיג axenic תרביות של חיידקים מסוימים מספקים תיאור מעמיק של כל חברי חיידקי ייצג במדגם. למרות זאת, אסטרטגיות מעין אלו הם מבולבל על ידי חוסר היכולת להבחין בין הסביבה מציג מתושבים bona פיד ה . עוד יותר, כאשר הערכת במדגמים, כגון קרציות, הינם קטני מידות ומכילות ומכאן DNA ספציפיים microbiota נמוך התשואות, הסבירות של הגברה של מזהמים סביבתיים מוגברת11 ותוצאות של פרשנות חד משמעיים של ההרכב microbiome. אפיון פונקציונלי בשיתוף עם הפריט החזותי של חיידקים קיימא ספציפי, לכן, תהיה קריטית כדי להגדיר ולהבחין את microbiome של שנתות חנותם והמרגשים. לעבר המטרה הזו, אנחנו ניצלו את העובדה RNA כולה-הר בחיי עיר הכלאה. טכניקה זו משמשת באופן שגרתי כדי להעריך את ג'ין תבניות ביטוי איברים, העוברים12,13,14 ומאפשר ניתוח semiquantitative של הביטוי על המדגם בכל עניין. זה שונה מסורתי בחיי עיר טכניקות הכלאה אשר לנצל את מקטעי רקמת ולעיתים קרובות דורשים ניתוח מקיף של חומר משרטוטי עם אסיפה חישובית לחזות ביטוי איברים כל15. בעוד כולה-הר מתייחס בדרך כלל אורגניזמים כל12, כאן כולה-הר מתייחס כל אומץ או איברים. יתרונות השימוש כולה-הר RNA בחיי עיר הכלאה הגישה כדי להעריך את הארכיטקטורה של שנתות בטן microbiota הם multifold. הבטן שנתות מורכב 7 זוגות diverticula, כל זוג משתנה גודל16. ההבדלים פונקציונלי, אם בכלל, בין אלה diverticula, אינם מובנים בהקשר של שנתות ביולוגיה, לתקתק אינטראקציות microbiota או פתוגן-שנתות. המניפולציות של המעיים, זה קרע את diverticula בטן תחסיר microbiota נוכח לומן מעיים או אלה הקשורים באופן רופף הבטן ואת התוצאה פירוש מוטעה של לוקליזציה המרחבי של microbiota. התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית RNA בחיי עיר הכלאה יש כבר מנוצל קודם לבחון שנתות בטן תעתיקים17 על-ידי תיקון ופתיחה diverticula בטן בודדים כדי להבטיח בדיקה הכלאה וכדי להתאים לשפה burgdorferi דרב תעתיקים באמצעות חלוקתה פרפין-מוטבע כל קרציות18. שתי גישות אלה דורשים מניפולציות של הרקמות שנתות לפני הכלאה שישפיעו על הארכיטקטורה microbiota בטן.

בדו ח זה, נתאר בפירוט את פרוטוקול לבחון microbiota בטן שנתות קיימא באמצעות כולה-הר בחיי עיר הכלאה (WMISH). השימוש של ה-RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר מאפשר הבנה גלובלית של נוכחות ושפע של הבטן ספציפי חיידקים באזורים שונים של המעיים, עשויה לדרבן תובנות חדשות שנתות ביולוגיה בטן בהקשר של פתוגן קולוניזציה ושידור. עוד יותר, השימוש של הגששים RNA נגד RNA חיידקי ספציפי מאפשר זיהוי של קיימא חיידקים בבטן שנתות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תבניות DNA

  1. להוריד את רצף rRNA מטוסי אף-16 ספציפי על כל סוגים חיידקי NCBI מסד נתונים ועיצוב תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) תואם קדימה ולהפוך תחל זה יגביר את אזורים סוגים (~ 200-250 זוג בסיסים ארוך) כמתואר קודם לכן 19. להתייחס גם קוד פתוח מסדי נתונים סילבה20,21 ו- probeBase22 המשאבים המקוונים, ממוקדות rRNA oligonucleotide הגששים, תחל RNA זונדי כמה סוגים חיידקי עלולה להיות מסחרית אפשרות זו זמינה.
    הערה: חשוב בחר גנים באזורים ספציפיים כדי ספציפי סוגים ולהבטיח כי תחל מעוצב לא להגביר קשורים סוגים חיידקי. זה חיוני כדי לקבל ג'ין/סוגים-ספציפיות בדיקה הכלאה.
  2. להאכיל קרציות במשך 24 שעות ביממה, 48 או 72 h על עכברים, לנתח שנתות אומץ ולהכין RNA ו- cDNA של אומץ שנתות כמו שתואר קודם23. השתמש cDNA תבנית ל- PCR להגביר amplicons סוגים ספציפיים באמצעות של thermocycler. לרוץ על aliquot של ה-PCR-המוצר/אמפליקון על 1.5% agarose ג'ל ולאשר אמפליקון המתאים לגודל הצפוי על ידי החזותיים מתחת לאור אולטרה סגול (UV), באמצעות ג'ל מערכת הדמיה.
  3. לשכפל את אמפליקון ribosomal RNA בקטריאלי מטוסי אף-16 עניין לתוך וקטור TA זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) המכיל RNA פולימראז היזמים מתאים bacteriophage polymerases (SP6, T7 או T3). רצף שיבוטים כדי לאשר את הזהות של אמפליקון. הכיוון של השיבוט ביחס לכל אחד היזמים. על סמך זה, לקבוע המקדם של בחירה כדי ליצור תחושה או antisense RNA רגשים (איור 1).
  4. Linearize 1 מ ג של פלסמיד עם אנזים ההגבלה המתאימה נפח התגובה של עד 30 µLfor 2 h בטמפרטורות המומלץ על ידי היצרן. לבחור אנזימי הגבלה המבוססת על יזם ב'טבלת כדי ליצור את התחושה או בדיקה antisense (איור 1). לאמת לינאריזציה על ידי ויזואליזציה של µL 2 תקציר לתגובה על ג'ל agarose 1%.
  5. לטהר את µL 28 הנותרים של DNA מעוכל בעזרת זמינים מסחרית PCR המוצר עמודת ערכת טיהור ולכמת את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים.
    הערה: כמה הגששים הגיוני עלול לגרום רקע מכתים גבוהה בהרבה מזו החללית antisense המתאימים, אפשרויות אחרות ייתכן שתצטרך להבטיח את הזמנתכם. פקדים שלילי חלופי כוללים פלסמידים קידוד רצפים אינו מיוצג המדגם או בדיקה אחרת המניבה דפוס ייחודי של הכלאה.

2. בניית Digoxygenin-UTP RNA הגששים

  1. מכינים את תערובת נוקלאוטיד על-ידי שילוב µL 7.5 מ"מ UTP, 25 µL של 10 מ מ digoxygenin-UTP, 10 µL כל של 100 מ מ ATP, GTP ו- CTP בשפופרת צנטרפוגה 1.5 mL.
  2. לבצע תמלול במבחנה באמצעות זמינים מסחרית ערכות T7 או Sp6 RNA פולימראז, באמצעות µL 1 של המיקס נוקלאוטיד (שלב 2.1) ו- 0.25 - 1 µg של תבנית ה-DNA. להביא את אמצעי האחסון עד 20 µL עם מים. קפיצי צינור כדי לשלב, דופק ספין. דגירה ב 37 ° C עבור 2.5-3 h.
    הערה: בדיקה הבנייה הוכתרה בהצלחה עם מתעכל פלסמיד ריכוזים המתחילים 7 ng/µL, אבל ריכוזים טיפוסי בטווח לשלב הזה מ- 15-25 ng/µL. התגובה שעתוק גם מודגרות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, אך זה לא להגדיל באופן משמעותי את התשואה RNA.
  3. להוסיף 1 µL של DNase (2,000 יחידות/µL) דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לא יעלה על 10 דקות, או האנזים יכולה להתחיל משפילים RNA.
  4. להוסיף 30 µL של קרח 7.5-8 מ' ליתיום כלוריד ו 30 µL של מים נטולי נוקלאז צוננת, כדי לזרז את הרנ א. קפיצי צינור כדי לערבב. לאפשר משקעים של RNA להמשיך בין לילה ב-20 ° C.
  5. לאסוף RNA על ידי צנטריפוגה-17,000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 1 מ"ל אתנול 75% שזה עתה הוכנו במים pyrocarbonate (DEPC) Diethyl, ולאחר מכן לחזור צנטריפוגה.
  6. להסיר למחוק את תגובת שיקוע, להפוך את הצינורית על מגבת נייר נקי ו אפשר להתייבש במשך 10 דקות Resuspend בגדר במים נטולי נוקלאז. אם בגדר גלויים בקלות, resuspend ב 25 µL. אם בגדר קטנה מאוד או שאינו גלוי, resuspend µL 15-20. לקבל הערכה של RNA ריכוז על-ידי ספקטרופוטומטרים.
    הערה: RNA טיפוסי ריכוזים נע בין 200-500 ng/µL.

3. הדמיה של RNA רגשים על ידי RNA פורמלדהיד בג'ל כדי להעריך RNA טוהר

התראה: פורמלדהיד מהווה סיכון שאיפה; לכן, ליצור את הפתרונות הדרושים לניתוח ג'ל RNA בשכונה fume. אתידיום ברומיד הוא קרצינוגן חשד; . לטפל.

  1. הכנת ג'ל agarose 1% פורמלדהיד כפי שתואר קודם לכן24 . והשליכו את הג'ל בתוך קופסת ג'ל ללא RNases. ברגע מגניב, למלא את הקופסא ג'ל 1 x הפעלת מאגר (1 x MOPS ב- pH 7.0, 5% פורמלדהיד).
  2. הכנת המאגר מדגם (5 µL 400 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד, µL 20 10 x המגבים, פורמלדהיד µL 35 ו- 100 µL formamide). לשלב 2 µL של RNA בדיקה (שלב 2.6) עם µL 8 דוגמת המאגר. דגירה-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. להכין RNA טעינת מאגר על ידי שילוב של גליצרול 50% מ ל, 1 מ ל 10% פורמלדהיד, 40 מ"ג bromophenol כחול, 40 מ"ג קסילן cyanol ו- µL 20 של EDTA 0.5 M (pH 7.5). לאחר השימוש, לאחסן המאגר ב-20 ° C.
  4. להוסיף 3 µL של טעינת מאגר המדגם RNA-3.2 שלב ומערבבים. לשמור על צינורות מדגם על קרח.
  5. לטעון את אמצעי האחסון מדגם כולו מ 3.4 שלב לתוך הג'ל. לטעון aliquot של הסולם RNA חד-גדילי לצד כדי לוודא גודל ה-RNA. הפעל את הג'ל ב- 100 וולט או נמוך עד צבען כחול נודד כ- 75% של הדרך למטה הג'ל. דמיינו את הרנ א תחת אור UV באמצעות מערכת הדמיה ג'ל.
    הערה: בדיקה RNA באיכות טובה אמורה להופיע כלהקה דיסקרטית עם ניידות המתאימים לגודל הצפוי של המכשיר (איור 2, ליין 1). אם המכשיר מופיע ' מאטום לשקוף ', smeary להקה (איור 2ליין 2) זה לא אמור לשמש.

4. לסמן איסוף הבטן של קיבעון

  1. לאסוף נימפות Ixodes scapularis אשר ניזונה על עכברים במשך הזמן מוקדי עניין.
    הערה: לצורך של טכניקה זו, קרציות להזנה 48 או 72 שעות עבודה בצורה הטובה ביותר.
  2. מחלקים הבטן מן השניה MEMFA (טבלה 1) על משטח זכוכית תחת מיקרוסקופ לנתיחה, הימנעות נזק לאיבר ככל האפשר. המקום קרצייה בשקופית מיקרוסקופ נקיים ב- 20-30 µL של MEMFA. בעזרת זוג עקר גבוהה-פחמן פלדה גילוח #11 פרוסה אזור הראש scutum של השניה העוזב את הגוף של השניה. לחץ בעדינות את הגוף כדי לדחוף את הבטן diverticula ואת בלוטות הרוק החוצה הקוטיקולה הגוף. נפרדים בלוטות הרוק, הבטן ולאסוף את האומץ על הלהב גילוח.
  3. לאסוף ביצים לתוך צינור 1.5 mL המכיל 500 µL MEMFA. דגירה הצינור בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין לשעה או למשך הלילה ב 4 º C.
    הערה: בלוטות הרוק שנתות עשוי גם להיות גזור באופן דומה קבוע, צבעונית.
  4. מייבשים את הרקמה ע י שטיפת בעדינות 3 פעמים עם 1 מ"ל אתנול 100% קר כקרח. תן את האומץ כיור בטבעיות לתחתית הצינור בין כל כביסה, כמו צנטריפוגה עלול לגרום נזק הרקמה. לאחסון לטווח ארוך, שומרים את הדגימות 100% אתנול ב-20 ° C.

5. בניית רשת מדגם סלים ו מחזיק סל 24-ובכן

  1. חותכים תחתיות מחוץ 2 mL או 5 מ ל צינורות צנטריפוגה snap-העליון בעזרת סכין גילוח מחוממת עם קצוות יחיד על אזמל.
    התראה: הלהב ייתכן שתצטרך להיות מחוממים מספר פעמים לפני השלמת החתך.
  2. חותכים ריבועים של רשת ניילון מיקרומטר 110 מעט גדול יותר מאשר פתיחת צינור חדש. בונד רשת השינוי לתחתית הצינור על ידי לחיצה על אותם יחד בקלות על גבי צלחת חמה על אש בינונית-נמוכה עד סגירה. ומצננים, להבטיח שלא יהיו מרווחים בין הרשת לבין הצינור ולחיתוך רשת עודף מסביב לקצוות.
  3. חותכים חורים עטיפת צלחת 24-ובכן כך השפה של הסל מדגם ב 5.2 שלב לשבת על החור, לא ליפול דרך, מניב מלכודת איפה שהסוליות של הסלים מדגם יושב עד הסוף הבארות כאשר הם מוכנסים חורים במכסה.
  4. השתמש הזה מחזיק סל מצויד כדי העברת סלים של לוח אחד למשנהו בקלות יחסית על מכלול של פרוטוקול הכלאה בחיי עיר . השתמש שתי צלחות 24-ובכן כך בזמן הדגירה אחד מתרחש, הלוחית השנייה ערוכה בכביסה הבאה.

6. הכלאה בחיי עיר : יום 1 (תזמון: 4-5 שעות)

  1. העברת האומץ תוויות. מדגם סלים, מופרדים על-ידי תנאי נסיוני ומיועד RNA בדיקה.
    הערה: כתם אומץ לפחות 5 לכל תנאי להביא בחשבון וריאציה טבעי בין משכפל.
  2. נתרענן הדגימות בעדינות כדי להימנע מהחדרה בועות אוויר לתוך הרקמה על ידי בהדרגה הגדלת היחס של באגירה פוספט תמיסת מלח עם 0.1% ללא יונית חומרים פעילי שטח (PTw; טבלה 1) כדי אתנול ב- שוטף.
    הערה: להשלים את כל שוטף ב בעל 24-ובכן סל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין אלא אם נכתב אחרת. Aliquot 500-600 µL של פתרונות לשטוף כל טוב של בעל כזה כי האומץ בסל כל לחלוטין טובע. להכין את כל הפתרונות במים שטופלו DEPC כדי למנוע השפלה RNA.
    1. לשטוף את הדגימות עבור 5 דקות 500 µL 100% אתנול.
    2. הכנת µL לפחות 500 לכל סל הדגימה של 75%, 50% ו- 25% אתנול PTw. נוזלים הדגימות על ידי שטיפה עבור 5 דקות בפתרון כל אתנול, לנוע אתנול הריכוז הגבוה ביותר לנמוך.
    3. לשטוף את הדגימות 4 פעמים במשך 5 דקות ב PTw.
  3. Permeabilize את הדגימות עם Proteinase K (10 µg/mL) ב PTw במשך 5 דקות.
  4. להכין את הרקמה הכלאה עם הגששים RNA.
    1. לשטוף את הדגימות פעמיים כמתואר ב- 6.2 ב בעל 24-ובכן סל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין למשך 5 דקות כל במאגר הידרוקסיאתיל 500 µL (0.1 M, pH 7.0-8.0) (טבלה 1) כדי לשמור את הדוגמאות סביבה נטולת אמין.
    2. מתייחסים הדגימות פעמיים עם 500 µL 0.25% אנהידריד אצטי במאגר הידרוקסיאתיל (0.1 M, pH 7.0-8.0) למשך 5 דקות ולאחר מכן לשטוף את הדגימות פעמיים ב PTw למשך 5 דקות.
      הערה: אנהידריד אצטי acetylates אמינים חינם לנטרל מטען חיובי, אשר חיוני כדי למנוע שאינם ספציפיים אלקטרוסטאטיות ולהבטיח איגוד ספציפי של המכשיר ל mRNA.
    3. לתקן את האומץ כעשרים דקות עם 500 paraformaldehyde 4% µL ב PTw ולאחר מכן לשטוף 5 פעמים ב PTw למשך 5 דקות.
    4. Prehybridize על ידי המקננת הדגימות ב 500 µL הכלאה מאגר /in בעל 24-ובכן סל בצלחת טוב 24 (טבלה 1) עבור 1.5-2.5 h ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין באמבט מים חזק. לשמור את המאגר הכלאה המשמש עבור השלב prehybridization לעשות שימוש חוזר בפרוטוקול ביום 2 (שלב 7.1).
    5. הכן פתרונות הכלאה בדיקה על ידי דילול RNA הגששים במאגר הכלאה כדי ריכוז סופי של 1 µg/mL.  דגירה בדגימות עם פתרונות הכלאה בדיקה של בעל 24-ובכן סל ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין בן לילה בתוך אמבט מים חזק (טבלה 2). מכסים את הצלחת נושא בעל סל בנוחות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע אידוי של הפתרון הכלאה.

7. הכלאה בחיי עיר : יום 2 (תזמון: 4.5-5.5 h)

  1. להסיר את הדגימות פתרונות הכלאה של החללית, למקם אותם לתוך המאגר השמור הכלאה של היום הקודם. דגירה ב 60 מעלות צלזיוס עם עצבנות עדין למשך 3 דקות.
    הערה: בדיקה הכלאה פתרונות ניתן לאחסן ב-20 ° C לשימוש חוזר עד 3 פעמים.
  2. להכין 2 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) על-ידי 20 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC (טבלה 1). לשטוף את הדגימות פעמיים במשך 3 דקות עם 2 x האס, אז 3 פעמים במשך 20 דקות עם 2 x SSC ב 60 ° C כדי להסיר כל עקבות של מאגר החללית ואת הכלאה.
  3. להתייחס RNase (20 µg/mL) ו- RNase T1 (10 µg/mL) ב 2 x האס למשך 30 דקות ב 37 ° C כדי להסיר אחת תקועים בדיקה RNA המייצג חינם ללא-hybridized RNA.
  4. תשטוף פעם אחת עם 2 x SSC 10 דקות בטמפרטורת החדר. להכין 0.2 x SSC על-ידי 2 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC, ואז לשטוף פעמיים עם 0.2 x SSC למשך 30 דקות ב 60 ° C כדי להסיר את עודף RNases.
  5. לשטוף פעמיים עם 500 µL חומצה maleic מאגר (MAB; טבלה 1) 10 דקות כל אחד.
  6. דגירה בדגימות עם חסימת פתרון (2%, חסימה ריאגנט ב MAB) 1.5-2 h.
    הערה: הכימית חסימה יכולה להיות קשה להמיס; חימום עדין עזרי התפרקות.
  7. החלף את הפתרון חסימה אלקליין anti-digoxigenin µL 500 מצומדת פוספטאז של נוגדן-1:3,000 לדילול בחסימה פתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך כ 4 שעות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

8. הכלאה בחיי עיר : ביום השלישי (תזמון: 6-אייץ ' ללון)

  1. לשטוף את הדגימות לפחות 5 פעמים במשך 30 דקות כל עם 500 µL MAB כדי להסיר עודפי נוגדנים.
    הערה: שוטף אלה הם גמישים, יורחב כדי h 1-2, או 3-4 שוטף יכול להיות מוחלף על שטיפת לילה אחד ב 4 ° C עם השפעה מזערית על היעילות.
  2. לשטוף פעמיים במשך חמש דקות עם מאגר phosphatase אלקליין, pH 9.5 (AP המאגר; טבלה 1).
  3. מתחילים את תגובת צבע על-ידי החלפת בכביסה האחרונה µL 500 של המצע הדפסות כסף עבור phosphatase אלקליין (טבלה של חומרים). לכסות את הצלחת מדגם ברדיד אלומיניום ולתת ההכתמה להמשיך בטמפרטורת החדר במשך 3 - 5 שעות או לילה ב 4 º C. נטר את התגובה מכתימים מעת לעת על-ידי הצגת הרקמה תחת מיקרוסקופ ויבתר כדי להימנע overstaining.
    הערה: כאשר ההכתמה תושלם, גוון סגול הוא לזיהוי בעין הדגימות ובחן antisense מתחת למיקרוסקופ, אבל הרקמה אסור להיות כהה מאוד. צביעת מתקדם מאוד לאט ב 4 ° C, עשויה להימשך עד 20-24 שעות.
  4. לעצור את תגובת צבע על ידי שטיפה עבור 5 דקות ב- 500 µL MAB ולאחר מכן את הרקמה בן לילה בפתרון של Bouin.
    התראה: להתמודד עם הפתרון של Bouin בשכונה fume; הוא קרצינוגן קורוזיבית.

9. הכלאה בחיי עיר : יום 4 (תיזמון: 3-3.5 שעות)

  1. להכין לפחות 7 מ לכל סל דגימה של 1 x SSC ב-20 המדללת x SSC במים שטופלו DEPC. להסיר את הפתרון של Bouin על ידי נטילת הדגימות 4 עד 6 פעמים עם אתנול 70% 1 x SSC עד הרקמה הוא כבר לא צהוב.
  2. להכין µL 500 לכל דגימה סל של פתרונות אתנול 75%, 50% ו- 25% 1 x SSC. לשטוף את הדגימות עבור 5 דקות בפתרון כל, לנוע ריכוז האתנול הגבוהה לנמוכה כדי להחזיר נוזלים הרקמה. לשטוף פעמיים במשך 5 דקות 1 בתוך כל x SSC.
  3. תקופת דגירה בדגימות בפתרון אקונומיקה (טבלה 1) של 90 דקות על אור ומכשיר בשכונה fume.
    הערה: שלב זה מאפשר כל פיגמנטציה דוגמאות או הגיוון מהפתרון Bouins יוסרו ומגבירה את אות בדיקה עבור פריט חזותי ברור.
  4. לשטוף את הדגימות פעמיים עם 500 µL 1 x SSC במשך 5 דקות.
  5. להעביר את האומץ עם נזק מינימלי על-ידי היפוך הסל מדגם לבאר של צלחת 24-ובכן חדשה, לשטוף עם 70% אתנול דרך תחתית רשת שינוי באמצעות פיפטה של העברה. לאחסן ב-20 ° C, במידת הצורך.
  6. כדי לקבל מבט כולל על הדפוסים מכתימים מספר דוגמאות של מוצג באיור 3, לשמור על האומץ אתנול 70% 24 פלייט-ובכן, תצוגה עם כל מיקרוסקופ שדה בהיר. כדי לבחון את האומץ בודדים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כפי שמוצג באיור 4, איור 5, ו איור 6, הר האומץ ב- 100% גליצרול תחת coverslips. השתמש מרית פלסטיק בעדינות לתפעל את הרקמה עם נזק מינימלי.
    הערה: צמיגות גבוהה של גליצרול מסייע בהגנה על הרקמה מפני נזק על ידי דחיסה ומאפשר המיקום זהיר של diverticula כזה ניתן להציג את הרקמה בצורה אופטימלית-הגדלה גבוהה יותר.
  7. ללכוד תמונות במיקרוסקופ באמצעות תוכנה ללכידת תמונה ספציפית מיקרוסקופ (טבלה של חומרים) ולייצא כמו תמונות Tiff לתמונה כללית תוכנה לעריכת. כדי לכמת את ההבדלים מכתימים היחסי בין טיפולים ניסיוניים, להוריד תוכנת ניתוח תמונה כללית (טבלה של חומרים). פתחו את התמונה בתוך התוכנה ניתוח ולהשתמש את ההוראות בתוך התוכנה כדי למדוד את עוצמת פיקסל ההכתמה ולחישוב היסטוגרמה חלקות להכתים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מדידה, הערכה של איכות הגששים RNA הם קריטיים לפני תחילת ההכתמה. במבחנה שעתוק יעילות מאוד תלוי כמות ואיכות תבנית ה-DNA. אנחנו באופן שגרתי דמיינו את הגששים RNA על ג'ל פורמלדהיד כדי לאמת את הטוהר ואת כמות בדיקה שנוצר על ידי התגובות שעתוק. הגששים אמור להופיע כרצועות בהיר, דיסקרטית (איור 2). מדידות spectrophotometric ריכוז ה-RNA היו מאוד מעידה על איכות המכשיר מתואם היטב עם המראה של הלהקות הג'ל. לפיכך, הצעד ויזואליזציה ג'ל ייתכן יבוצע במידת הצורך לאחר היכרות עם הפרוטוקול שהושגה. בכל מקרה, חשוב לוודא כי הוא מיוצר RNA מספיק באיכות גבוהה, כמו כל השלבים במורד הזרם תלוי היציבות של הגששים.

הכוח של טכניקה זו היא בביצוע תצפיות רחבה על microbiota שנתות, כולל נוכחות או היעדרות של חיידקי מינים, שינויים שפע של חיידקים לאורך זמן כמו ההזנות שנתות, לוקליזציה של מינים בתוך רקמת שלם. וריאציה קצת מכתים כמות והפצה הוא נורמלי בין משכפל ביולוגי, כמו גם בקרב זוגות 7 של diverticula של הפרט אומץ (איור 3), לכן שמומלץ כתם אומץ לפחות חמישה לכל תנאי כדי לקבל מושג על ממוצע צביעת דפוס. ההצלחה הכוללת של הפרוטוקול נאמדת בצורה הטובה ביותר על-ידי השוואת ההכתמה של הדגימות antisense והיגיון עבור כל תנאי. הדגימות הגיוני, פקדים שלילית חשוב עבור סוג זה של ניתוח, צריך להיות מינימלי אין צבע סגול (איור 4). לעומת זאת, דגימות antisense צריך להציג מכתים חזקים עם רקע מינימלי, האינטנסיביות של אשר תיקבע על השפע של התרשימים חיידקי ספציפי להיות ממוקד. התבנית מכתימים בתוך רקמת גם ישתנו בהתבסס על פרמטרים אלה. חשוב, החוש והן דוגמאות antisense חייב להיות שפותחה עבור אותה כמות של זמן כדי להיות מסוגל להשוות ישירות אותם, אז צריך להיות מעובד הדוגמיות הללו במקביל. דורסני התגובה צבע יכול לגרום כמות גבוהה של רקע מכתים, היכן הדגימות הגיוני להתחיל דומים. לאלו antisense (איור 5). הטיפול בפרט צריך להתייחס בשלב זה בפרוטוקול כדי להימנע overstaining, משום שאין שום דרך להפוך את התגובה כשזה יקרה.

זה חיוני כדי לוודא כי כל האומץ מלא טובע בתוך כל ריאגנט במהלך כל שלב; עלייה וריאציית במדגמים שונים יכול להיות בגלל חשיפה לא אחידה ריאגנטים. הסכום של זמן כי הקרציות ניזונים לפני האומץ נאספים יש גם השפעה רבה על התוצאות. קרציות אני קרוב או ניזונים רק 24 שעות היו קשה לעבוד איתו; האומץ היו גם יותר פגום בקלות, אינו מכתים טוב (איור 6) ויש מגבלה של גישה זו בזמן הזה. קרציות בשביל 48-72 h היו הכי קל לעבוד איתו, בשל גודל גדול יותר של אלה אומץ כאשר לעומת אומץ של קרציות מוזן על האומץ ה 24 נקודות זמן מאוחר יותר גם צבעונית יותר 24 h-fed קרציות, כנראה עקב העלאות נטל חיידקי במהלך o שלבים מאוחר יותר f האכלה. הרקמה 72-h לעתים קרובות היה רקע קלה של גוון חום מהדם, אבל ההכתמה סגול היה נראה בבירור מעל הגוון (איור 4). האומץ נצפים ביותר בהגדלה נמוכה (5 X או 10 X) כדי שניתן יהיה להציג את דפוסי מכתימים על פני הרקמה כולה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. הצפייה כולה-הר רקמות בהגדלה גבוהה יותר, כגון עם 63 X שמן אובייקטיבי, מפעיל את הסיכון של פגיעה את רקמת המטרה הקש נגד השקופית, לדחוס את הרקמה בגלל העובי של הדגימות. אם רצוי הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, יש לבחון את פוטנציאל רקמות חלוקתה.

Figure 1
איור 1 . סכמטי של תבנית הכנה לדור בדיקה. לשכפל את אמפליקון rRNA מטוסי אף-16 לתוך שיסחוב שיבוט וקטור שמכיל היזמים T7, Sp6. Linearize הבונה באמצעות אנזימי הגבלה לחתוך על אתרים או b עבור במבחנה תמלול באמצעות יזם T7 או Sp6 כדי ליצור תחושה או antisense הגששים בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . ויזואליזציה של המכשיר RNA על ידי אלקטרופורזה בג'ל. הגששים RNA (~ 700 ng) היו electrophoresed על ג'ל agarose פורמלדהיד, דמיינו תחת אור UV, עם תמונה באמצעות ג'ל מסחרי מערכת הדמיה. נציג באיכות טובה, ליין 1; באיכות ירודה RNA הגישוש, ליין 2.

Figure 3
איור 3 . סקירה נציג כולה-הר בחיי עיר הכלאה של אומץ h-fed 48. אומץ של קרציות מוזן על 48 שעות מוכתם antisense RNA משלים רצף ribosomal RNA 16 שנשמרת מראה מכתים דיפרנציאלית של הבטן diverticula. סרגל קנה מידה מייצג 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 . להחליפן בתמונות מוצלח כל-הר בחיי עיר הכלאה במעיים Ixodes scapularis . אומץ של קרציות האכיל את הסכום המצוין של זמן היו כתמים באמצעות גם הגיוני (בקרה שלילית) או antisense RNA רגשים. הגששים antisense היו משלימים רצף ribosomal RNA שנשמרת 16 (16 אוניברסלי) או רצף הרנ א 16 ספיציפית סוג חיידקים מסוימים (כפי שמצוין). Enterococcus לא נכנע מכתים חזקים ב ה 48 מיקרומטר מייצגים 140 סרגלי קנה מידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . זמן התגובה הדפסות כסף ממושך שמוביל שאינם ספציפיים מכתים. האומץ של קרציות ניזונים במשך 48 שעות היו שנבדק בדיקה RNA הגיוני או של בדיקה antisense משלימים לרצף ה-RNA שנשמרת מטוסי אף-16. הרקמה, נדגרה עם המצע phosphatase אלקליין מוניטור סגול לילה 4 ° C ולאחר מכן בטמפרטורת החדר במשך כ 4 שעות לפני הפסקת התגובה. סולם העמודות מייצגות 140 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 . כולה-הר בחיי עיר הכלאה משתמש אני קרוב או 24 שעות האכיל שנתות אומץ. אומץ מ unfed או 24 h-fed קרציות היו כתמים באמצעות חוש RNA הגששים או antisense רגשים משלימים רצף הרנ א 16 שנשמרת או רצף ספציפי הסוג ריקטסיה. צביעת הדגימות antisense פחות חזקים מהנצפה בנקודות זמן מאוחר יותר, האומץ, הם גם יותר בקלות יתערער. סולם העמודות מייצגות מיקרומטר 60. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שם ריכוז סופי PH הסופי אחסון הערות
MEMFA 0.1 המטליות M - טמפרטורת החדר
2 מ מ EGTA
1 מ מ מגנזיום גופרתי
3.7% פורמלדהיד
PBS-Tween (PTw) 1 x PBS, 0.1% Tween-20 7.0 טמפרטורת החדר
0.1% Tween-20
מאגר הידרוקסיאתיל 1 x PBS 7.0-8.0 טמפרטורת החדר
0.1 הידרוקסיאתיל M
מאגר הכלאה 50% formamide - -20 ° C
5 x SSC
1 מ"ג/מ"ל Torula RNA
הפרין 100 µg/mL
1 x הפתרון של Denhart
0.1% Tween-20
0.1 בחורים %
10 מ מ EDTA
חומצה maleic מאגר (MAB) חומצה maleic 100 מ מ 7.0 טמפרטורת החדר
150 מ מ נתרן כלוריד
מאגר phosphatase אלקליין (AP) 100 מ מ טריס 9.5 -20 ° C
50 מ מ מגנזיום כלוריד
100 מ מ נתרן כלוריד
0.1% Tween-20
5 מ מ levamisol
פתרון אקונומיקה 1% מימן על-חמצני - להכין טרי
formamide 5%
0.5 x SSC

טבלה 1. מתכונים של פתרונות שימוש בפרוטוקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זהו השימוש הראשון טכניקה הכלאה (WMISH) כולה-הר בחיי עיר ללמוד את microbiota של וקטור arthropod של פתוגנים. פרוטוקול שלנו הותאם מאחד המשמשות ללימוד פיתוח בדרוזופילה וב -צפרדע עוברי25,26. RNA הכלאה בחיי עיר כולה-הר נעשה שימוש באופן שגרתי כדי להתאים לשפה ג'ין תעתיקים במרחב, חנותם27 והדמיה של תעתיקים יכול להיעשות על-ידי שדה בהיר או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אימצנו לשעבר לקראת זיהוי של microbiota במעיים שנתות. חשוב לציין כי מנסה לבצע כולה-הר בחיי עיר הכלאה באמצעות קרציות שלם שבו אזור הראש הוסר כדי לאפשר חדירת מקבע ופתרונות הכלאה לא הצליחה. הפרוטוקול המתואר כאן מנצל אומץ גזור, יושמה לחקור את ההשפעות של חלבונים ספציפיים שנתות על מושבת חיידקים פיתול23. מידע המתקבל WMISH משולה אימונוהיסטוכימיה אבל יש את היתרון של לא דורש את הדור של חלבונים, נוגדנים הגן או חלבון עניין. מידע גנומית מספיקה ליצור את ריאגנטים עבור WMISH. גם WMISH וגם דגים (זריחה בהכלאה באתרו) יכול לזהות בביטוי הגן. עם זאת, עקב היותו assay אנזימטי, מבוסס על chromogen, WMISH יש יתרון כי פיתוח צבע ניתן לנטר באופן פעיל, התגובה מותר להמשיך עד האות הרצויה, רגישות מושגת. זה מלא נוטה אוטומציה והוא להרחבה בקלות לתבנית תפוקה גבוהה. בניגוד אימונוהיסטוכימיה ודגים, חלוקתה לא נדרש. החיסרון של WMISH על הדג הוא רק 2 mRNAs שונים או גנים ניתן לטפל במקביל ידרוש הגששים להיקרא עם תחליפי נוקלאוטיד שונים כגון digoxigenin-UTP, fluorescein-UTP28. עם דגים, עד 6 mRNAs שונים שיכולים להיבדק אחת assay29. בעוד שני מבחני דורשים זמן מקביל, העלות של צבעי זריחה נמצאים גבוה מזה של סובסטרטים הדפסות כסף. מבחני דגים גם ידרוש מיקרוסקופ פלורסצנטיות להמחשת תמונה, בעוד WMISH תמונות פריט חזותי ניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ אור כלשהו.

זה קריטי כי הפרוטוקול מלווה מקרוב; עם זאת, ישנם כמה צעדים הדורשים טיפול מסוים. ניתוח פיתול מן השניה ללא פגיעה הרקמה דורש מיומנות כלשהי. זה עשוי להיות זהיר לאסוף קרציות נוספות כדי לתרגל את והניתוחים ולהשיג מיומנות. עקב הטרוגניות של צביעת ב diverticula שונים של אומץ בודדים (איור 3), חשוב לבחון את כל diverticula של כל הבטן להפיק ראיות חותכות השפע חיידקי. חשוב גם לעבד מספר ביצים (לפחות 5) עבור כל תנאי ניסוי על מנת לקבל מידע חד משמעי על נוכחות, התפוצה המרחבית, שפע של חיידקים מסוימים בתוך diverticula שונים. הייצור של הגששים RNA באיכות גבוהה חיוני גם רקמות יעיל מכתים. זה חיוני לאשר גם את הרצף של תבנית בדיקה בוקטור השיבוט כדי להבטיח את antisense, הגיוני הגששים נוצרים בהתאם. תגובת שעתוק פרודוקטיבי במבחנה דורש מספקת תבנית DNA; מינימום של 100 ng עשוי לשמש, אך 0.5 - 1 µg מומלץ לדור בדיקה אופטימלית.

השימוש לדוגמה סלים. ובכן 24 צלחות ב פרוטוקול זה מונע טפלול ישיר של הרקמה על כל צעד ושעל לשטוף, אשר ממזערת נזקים במהלך תהליך צביעת. עם זאת, דגימות עדיין מדי פעם יאבדו או יינזקו; האומץ של קרציות unfed או 24 שעות-fed, בפרט, הינם קשה לראות קל לאבד בעת העברת הסלים מדגם מיכל אחסון לטווח ארוך. יש לקחת טיפול נוספים לטיפול הדוגמיות הללו. בשל מגבלה זו, בעיקר השתמשנו אומץ שנתות h-fed 48 ל-72. הנוכחות של כמויות גדולות של ארוחת דם בבטן בנקודות אלו הזמן-(יותר מ- 72 h) משבשת צביעת והדמיה בשל הרקע לא ספציפית של הדם-הארוחה ומציגה גם מגבלה של טכניקה זו. סביר להניח כי השימוש של הגששים שכותרתו fluorescently יכול לעקוף בעיה זו.

ההיבט החשוב ביותר של ההליך ההגדלה היא ליצור את האיזון בין מכתים חזקים ושידור רקע נמוך. העיתוי של צבע אידיאלי לפיתוח יכול להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי. לכן, מומלץ לבצע את תגובת צבע-פיתוח צבע בטמפרטורת החדר ואת הצג כ 30 דקות. התגובה יכול גם להגדיר להמשיך בין לילה ב 4 ° C כדי להאט את התפתחות הצבע. עם זאת, חשוב מאוד לא לתת תגובה זו להמשיך זמן רב. התגובה מכתימים יכול להיות קשה לפקח על ידי העין, כך יש לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופ לנתיחה. גוון סגול צריך להיות גלוי על דגימות שנבדק עם antisense RNA, ואילו הדגימות ובחן בחוש RNA צריך לשמור על צבע מינימלי. אם הדגימות שנבדק-RNA הגיוני כתם במאור פנים, שלבי פתרון הבעיה יש להתחיל עם הפחתת זמן דגירה עם מוניטור סגול והגברת הזמן חסימה. לפעמים תחושה רגשים יכול לגרום anomalously רקע בהשוואה את הגששים antisense; במקרים אלה, ייתכן אזורים שונים של הגן להיחשב ליצירת RNA הגששים. רצפי DNA אינו מיוצג במדגם נתון עשויים גם להיחשב כתבניות כדי להפיק שליטה שלילי הגששים. לדוגמה, תבנית ה-DNA קידוד אזור חלבון פלואורסצנטי ירוק, לא ייצג את הגנום שנתות או microbiome שלו, יכול להיות מנוצל.

מגבלה אחת של טכניקה זו היא כי הניתוח הוא במידה רבה איכותי; עם זאת, התמונה ניתוח תוכנה (טבלה של חומרים) יכול לשמש כדי למדוד את כמות אותות מכתימים בכל מדגם. יכולת זו תאפשר השוואה כמותית למחצה של השפע של מינים חיידקים שונים בתנאים שונים ניסיוני. אמנם זה פרוטוקול גוזלת זמן זה לוקח 3-4 ימים כדי להשלים, זה לא מייגעת; הפעם תרגולים כל יום הוא רק כ- 3-5 שעות בממוצע. עם זאת, היכולת לעבד דוגמאות רבות במקביל עם השימוש של מדגם סלים, מחזיקי מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה. יתרה מזאת, תהליך זה יכול להיות אוטומטי באמצעות מכשירים זמינים מסחרית (טבלה של חומרים) אם פרוטוקול זה צפוי להיות חיוני ושוטף מרכיב של המעבדה מחקר על-ידי שימוש זמינים מסחרית אוטומציה תואם פלטפורמות (טבלה של חומרים) בכדי להפחית הפעם תרגולים.

הפרוטוקול המתואר עושה שימוש הגששים התווית על-ידי digoxygenin לאפשר הייצור של האות ערכי צבע מוחלטים, כי יכול להיות תמונה באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר. בעוד אנחנו נעזרו המצע הדפסות כסף אחד כדי לזהות hybridized RNA רגשים ספציפיים למטרות בודדים, זה גם אפשרי לזהות מטרות מרובות בו-זמנית על-ידי תיוג רגשים עם תחליפי נוקלאוטיד שונים, כגון digoxigenin-UTP, fluorescein-UTP, הדפסות כסף סובסטרטים30. דגימות רקמה ואז להיות מודגרות ברצף עם אלקליין פוספטאז-מצמידים נוגדנים נגד digoxigenin, fluorescein, עם תגובות שונות הדפסות כסף עבור שני השלבים. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאם שכותרתו fluorescently הגששים, עשוי להקל על הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית31 ומספקות את האפשרות של שימוש הגששים מרובים בצבעים שונים במקביל. טכניקה זו רק במיוחד יכול להעריך כמה מיקרואורגניזמים בבת אחת מדגם אחד. עם זאת, מספר דגימות יכול להיות מוערך במבחני תפוקה גבוהה כדי לטפל המיקרואורגניזמים מרובים יכולים להיות מיוצגים ב- microbiota שנתות.

לבסוף, טכניקה זו אינה מוגבלת לחקירה של אינטראקציות בין קרציות microbiota המשויך שלהם. הגששים משלימים על כל הגן עניין בתוך הגנום שנתות עשוי להיות שנוצר ומשמש לבחון את השפע ואת לוקליזציה של גנים ספציפיים ברקמות שונות. בלוטות הרוק של השניה יכול גם להיות מעובד וניתח באופן דומה אל הבטן. בסך הכל, טכניקה זו יש פוטנציאל רחב עבור הסתגלות ללימודים על הדינמיקה של קהילות חיידקים בתוך וקטורים אחרים המחלה arthropod עניין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ד ר מוסטפא Khokha, אוניברסיטת ייל, למתן את השימוש במשאבים המעבדה שלו. אנו מודים על מר מינג-ג'יאה-וו לסיוע טכני מעולה. EF הוא חוקר HHMI. עבודה זו נתמכה על ידי מתנה ג'ון Monsky ואת קרן המחקרים של מחלת ליים Monsky של ג'ניפר וייס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software National Institutes of Health ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).  Intavis, Biolane HT1.16v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Tags

גנטיקה גיליון 136 arthropod טיק בטן microbiota התעתיק היברידיזציה כולה-הר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., … More

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter