Summary
Aquí, presentamos un protocolo evaluar espacial y temporal la presencia de microbiota viable en agallas de señal usando un acercamiento modificado todo montaje de hibridación in situ.
Abstract
Enfermedades infecciosas transmitidas por vectores artrópodos siguen planteando una amenaza significativa para la salud humana en todo el mundo. Los patógenos que causan estas enfermedades, no existen en aislamiento cuando coloniza el vector; por el contrario, probablemente participan en interacciones con microorganismos residentes en el lumen intestinal. La microbiota del vector se ha demostrado que juegan un papel importante en la transmisión de patógenos de varias enfermedades transmitidas por vectores. No se determina si las bacterias residentes en el intestino de la garrapata de scapularis de Ixodes , el vector de varios patógenos humanos, incluyendo el burgdorferi de Borrelia, influyen en la transmisión de la señal de patógenos. Requieren métodos para caracterizar la composición de las bacterias asociadas con el intestino de la garrapata para facilitar una mejor comprensión de las interacciones entre las especies potenciales en el intestino de la garrapata. Con conjunto de montaje en situ hibridación visualizar transcritos de RNA asociadas a especie bacteriana en particular permite la recolección de datos cualitativos con respecto a la abundancia y distribución de la microbiota en el tejido intacto. Esta técnica puede utilizarse para examinar los cambios en el entorno de microbiota intestinal a lo largo de la señal de alimentación y también puede ser aplicada para analizar la expresión de los genes de la garrapata. La coloración de la garrapata entera guts rendimiento información sobre la distribución espacial bruta de destino RNA en el tejido sin necesidad de reconstrucción tridimensional y es menos afectada por contaminación del medio ambiente, que a menudo confunde basada en la secuenciación métodos utilizados con frecuencia para el estudio de comunidades microbianas complejas. En general, esta técnica es una herramienta valiosa que puede utilizarse para mejor entender las interacciones patógeno-vector-microbiota y su papel en la transmisión de la enfermedad.
Introduction
Patógenos humanos y animales transmitidas por artrópodos vectores se encuentran en todo el mundo y representan aproximadamente el 20% de las enfermedades infecciosas a nivel mundial1, pero efectivo y seguras vacunas contra la mayoría de estos patógenos no están disponibles. Está expandiendo nuestra comprensión de la importancia de los microorganismos comensales, simbióticas y patógenas, colectivamente conocidos como el microbioma2, en la modulación y la configuración de la salud de casi todos los metazoos3 . Ahora es evidente que artrópodos vectores de patógenos también albergan la microbiota intestinal y estos microbiota asociado vector han demostrado influir en diversos agentes patógenos transmitidos por el vector4,5. El microbioma artrópodo se compone de eubacteria, archaea, virus y microbios eucariotas como protozoos, nematodos y hongos6. Sin embargo, el enfoque predominante ha sido en eubacterias debido, en parte, la disponibilidad de genes marcadores y bases de datos de referencia para identificar a miembros bacterianos específicos.
Con un enfoque de scapularis de Ixodes, el vector de señal de múltiples patógenos humanos incluyendo Borrelia burgdorferi7, el agente causal de la enfermedad de Lyme, la optimización de una técnica de visualización microbiano apuntaba a mejorar nuestra comprensión de la señal intestinal microbiota en el contexto de las interacciones patógeno vector. Varias preguntas quedan para ser contestadas en el campo de microbioma de la garrapata. El intestino es el sitio del primer encuentro extendido entre la garrapata y el patógeno entrante en el contexto de patógenos transferidos horizontalmente; por lo tanto, entender el papel de la microbiota intestinal de vector en la modulación de las interacciones patógeno vector revelará información significativa. Las garrapatas tienen un modo único de la digestión de la comida de sangre, donde procesamiento de harina de sangre componentes ocurre intracelularmente lugar8. El lumen de intestino aparentemente sirve como recipiente para contener la harina de sangre como los feeds de la garrapata, y asimilación y digestión de nutrientes sobrevienen a lo largo de los días de la alimentación y continúan después de la repleción. Los patógenos adquiridos por la garrapata durante la alimentación entre el lumen intestinal junto con la harina de sangre y así la luz se convierte en un sitio primario de las interacciones entre la microbiota residente, garrapata y patógeno. Medida que avanza la digestión a través de la repleción y garrapatas Ixodid muda, el intestino sufre cambios estructurales y funcionales9. La composición y la organización espacial de las bacterias del intestino también es probable que varíe en concierto con el cambiante entorno de tripa. Por lo tanto, es importante entender la arquitectura de las bacterias residentes en el intestino de la garrapata para comprender la interacción de garrapatas y patógenos microbiota intestinal.
Técnicas moleculares para describir la microbiota asociada a host rutinariamente utilizan estrategias de secuenciación paralela de alto rendimiento10 para amplificar y secuenciar ADN ribosomal bacteriano 16S (ADNr). Estas estrategias de secuenciación eluden la necesidad de obtener cultivos axénicos de bacterias específicas y proporcionar una descripción más detallada de todos los miembros de bacterias en la muestra. Sin embargo, tales estrategias se confunden por la incapacidad de distinguir la contaminación ambiental de los residentes bona fide . Además, al evaluar muestras, tales como las garrapatas, que son pequeñas en tamaño y por lo tanto, contienen ADN de microbiota específica bajo rendimientos, la probabilidad de amplificación de los contaminantes ambientales es mayor11 y en la interpretación ambigua de los resultados composición del microbioma. Caracterización funcional junto con la visualización de bacterias viables concretas, por lo tanto, será fundamental para definir y discernir el microbioma de la señal temporal y espacial. Hacia esta meta, lo aprovechó el conjunto Monte RNA en situ el hibridación. Esta técnica se usa rutinariamente para evaluar patrones de expresión génica en órganos y embriones12,13,14 y permite el análisis semicuantitativo de la expresión sobre toda la muestra de interés. Esto difiere de la tradicional en situ hibridación técnicas que utilizan secciones de tejidos y a menudo requieren un análisis extenso del material seccionado con un ensamblaje computacional para predecir la expresión en todo los órganos15. Mientras que Monte todo generalmente se refiere a todo los organismos12, aquí todo Monte se refiere a todo vísceras u órganos. Las ventajas de utilizar el conjunto de montaje RNA en situ hibridación enfoque para evaluar la arquitectura de la microbiota intestinal de garrapatas son múltiples. El intestino de la garrapata se compone de 7 pares de divertículos, cada par de variables en tamaño16. Las diferencias funcionales, si alguno, entre estos divertículos, no se entienden en el contexto de la biología de la garrapata, garrapata interacciones microbiota o tick-patógeno. Manipulaciones de la tripa que rompen los divertículos de intestino desplazaría la microbiota presente en el lumen del intestino o los asociados libremente con la tripa y resultar en una mala interpretación de la localización espacial de la microbiota. Marcados con fluorescencia RNA en situ el hibridación se ha utilizado anteriormente para examinar marca gut transcripciones17 mediante la fijación y apertura divertículos intestinales individuales para hibridación de la sonda y localizar del burgdorferi del B. transcripciones de secciones parafina-encajadas de garrapatas todo18. Ambos estos métodos requieren manipulaciones de los tejidos de garrapatas antes de hibridación que pueden afectar a la arquitectura de microbiota intestinal.
En este informe, describimos en detalle el protocolo para examinar garrapata viable intestinal microbiota con conjunto de montaje en situ hibridación (WMISH). El uso del montaje en conjunto RNA en situ hibridación permite una comprensión global de la presencia y abundancia de las bacterias del intestino específicos en las diferentes regiones del intestino y puede estimular nuevos conocimientos sobre biología de tripa de garrapatas en el contexto de la colonización de patógenos y la transmisión. Además, el uso de sondas de RNA dirigida contra ARN bacteriano específico permite la detección de bacterias viables en el intestino de la garrapata.
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Protocol
1. elaboración de plantillas de la DNA
- Descargar la secuencia de rRNA 16S específica para cada género bacteriano de la NCBI diseño y base de datos de reacción en cadena polimerasa (PCR) compatible hacia adelante y atrás cartillas que se amplifican regiones específicas de géneros (~ 200-250 pares bajos largo) como se describió anteriormente 19. también consulte el código abierto las bases de datos SILVA20,21 y probeBase22 online recursos para sondas de oligonucleótidos dirigidos a rRNA y cartillas, como sondas de RNA para algunos géneros bacterianos pueden ser comercialmente disponible.
Nota: Es importante seleccionar regiones de genes que son específicos a específicos géneros y asegurar que primers diseñados no amplificar géneros bacterianos relacionados. Esto es fundamental para conseguir la hibridación de géneros/gene-específico sonda. - Alimentación de las garrapatas para 24, 48 o 72 h en ratones, diseccionar tripas de garrapata y elaborar ARN y cDNA de tripas de garrapatas como descrito anterior23. CDNA de uso como plantilla para PCR amplifican amplicones específicos de géneros utilizando un termociclador. Ejecutar una parte alícuota de la polimerización en cadena-producto/productos en gel de agarosa 1.5% y confirmar que el amplicon corresponde al tamaño esperado por visualización bajo luz ultravioleta (UV) utilizando un gel sistema de imagen.
- Clonar el bacteriano 16S ribosomal RNA amplicon de interés en un vector disponible comercialmente de TA (Tabla de materiales) que contienen promotores de la ARN polimerasa adecuados para Polimerasas del bacteriófago (SP6, T7 y T3). La secuencia de los clones para confirmar la identidad de los amplicones y la direccionalidad de la copia con respecto a cada uno de los promotores. En base a esto, determinar el promotor de la opción generar sentido o antisentido RNA puntas de prueba (figura 1).
- Alinear 1 mg del plásmido con una enzima de restricción apropiada en un volumen de reacción de hasta 30 µLfor 2 h en las temperaturas recomendadas por el fabricante. Elegir las enzimas de restricción basadas en el promotor que se utilizarán para generar el sentido o la punta de prueba antisentido (figura 1). Verificar la linearización de visualización de 2 μl de la reacción de digestión en gel de agarosa al 1%.
- Purificar las restantes 28 μl de ADN digerido utilizando un kit de potabilización comercialmente disponible de PCR producto columna y cuantificar la concentración de DNA por el espectrofotómetro.
Nota: Algunas sondas de sentido pueden causar tinción de fondo mucho más alta que la correspondiente sonda antisentida y otras opciones deben ser exploradas. Controles negativos alternativos incluyen plásmidos codifican secuencias no representadas en la muestra u otro sondeo que produce un patrón distintivo de la hibridación.
2. construcción de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
- Preparar la mezcla de nucleótidos mediante la combinación 7.5 μl 100 mm UTP, 25 μl de 10 mM digoxygenin-UTP y 10 μl cada una de 100 mM ATP, GTP y CTP, en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
- Realizar la transcripción en vitro usando kits de polimerasa T7 o Sp6 RNA disponibles comercialmente, utilizando 1 μl de la mezcla de nucleótidos (paso 2.1) y 0.25 - 1 μg de plantilla de ADN. Llevar el volumen hasta 20 μl con agua. Flick el tubo para combinar y pulso spin. Incubar a 37 ° C por 2.5-3 h.
Nota: Construcción de la sonda ha tenido éxito con plásmido digerido concentraciones tan bajas como 7 ng/μl, pero concentraciones típicas en esta gama de paso de 15-25 ng/μl. La reacción de transcripción también se incuba durante la noche a 37 ° C, pero esto no aumentó significativamente la producción de RNA. - Añadir 1 μl de DNasa (2.000 unidades/μL) y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. No exceda 10 minutos, o la enzima puede comenzar a degradar RNA.
- Añadir 30 μl de cloruro de litio de helada de 7,5-8 M y 30 μl de agua libre de nucleasa refrigerada para precipitar el ARN. Flick el tubo para mezclar. Permitir la precipitación de RNA para proceder durante la noche a-20 ° C.
- Recoger el RNA por centrifugación a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar el precipitado una vez con 1 mL de etanol al 75% recién preparada en dietil pirocarbonato (DEPC) agua y repita la centrifugación.
- Retire y descarte el sobrenadante, invertir el tubo sobre una toalla de papel limpia y dejar para secar por 10 minutos Resuspender el precipitado en agua libre de nucleasa. Si el sedimento es fácilmente visible, resuspender en 25 μl. Si la pastilla es muy pequeña o no visible, resuspender en 15-20 μl. obtener una estimación de la concentración de RNA de espectrofotómetro.
Nota: RNA típicas concentraciones entre 200-500 ng/μl.
3. visualización de RNA puntas de prueba por electroforesis del Gel del ARN formaldehído para evaluar la pureza del ARN
PRECAUCIÓN: Formaldehído plantea un peligro de inhalación; por lo tanto, generar las soluciones necesarias para el análisis del gel del ARN en una campana de humos. Bromuro de etidio es un carcinógeno; Manéjela con cuidado.
- Preparar un gel de agarosa 1% formaldehído como descrito previamente24 y echado el gel en una caja de gel libre de RNasas. Una vez fría, llenan el cuadro de gel 1 x buffer (1 x MOPS a pH 7,0, formaldehído al 5%) de ejecución.
- Preparar el tampón de muestra (bromuro de etidio de 400 mg/mL de 5 μl, 20 μl 10 x MOPS, 35 formaldehído μl y 100 μl formamida). 2 μl de sonda de RNA (paso 2.6) se combinan con 8 μl del tampón de muestra. Incubar a 70 ° C durante 10 minutos.
- Preparar Buffer de carga de RNA mediante la combinación de 5 mL 50% de glicerol, formaldehído al de 10% 1 mL, azul de bromofenol 40 mg, 40 mg xileno cyanol y 20 μl de EDTA de 0,5 M (pH 7.5). Después de su uso, almacenar este tampón a-20 ° C.
- Agregar 3 μl de tampón de carga a la muestra de RNA de paso 3.2 y mezclar. Mantener los tubos en hielo.
- Cargar el volumen de toda muestra de paso 3.4 en el gel. Cargar una parte alícuota de escalera de RNA monocatenario junto a verificar tamaño de RNA. Correr el gel a 100 V o baja hasta que el colorante azul migra aproximadamente el 75% de la bajada del gel. Visualizar el RNA bajo luz UV utilizando un sistema de proyección de imagen del gel.
Nota: Una sonda de RNA de buena calidad debe aparecer como una banda discreta con una movilidad corresponde al tamaño esperado de la sonda (figura 2, carril 1). Si la sonda aparece como difusa y graso banda (figura 2carril 2) esto no debe ser utilizado.
4. colección de tripa y la fijación de la señal
- Recoger a ninfas de Ixodes scapularis que han alimentado en ratones para los puntos de tiempo de interés.
Nota: Para los efectos de esta técnica, garrapatas alimentan por 48 o 72 h trabajo mejor. - Disecar el intestino de la garrapata en MEMFA (tabla 1) en un portaobjeto bajo el microscopio de disección, evitando daño al órgano tanto como sea posible. Coloque una marca sobre un portaobjetos limpio en 20-30 μl de MEMFA. Con un par de estéril alto carbono navaja acero #11 rebanada la región central en el escudo de la garrapata dejando el cuerpo de la garrapata. Presione suavemente el cuerpo para empujar la divertículos intestinal y las glándulas salivales a la cutícula del cuerpo. Separe las glándulas salivales y la tripa y sacar las tripas en la hoja de afeitar.
- Recoger vísceras en un tubo de 1,5 mL que contiene 500 μl MEMFA. Incubar el tubo a temperatura ambiente con balanceo suave durante 1 hora o toda la noche a 4 ° C.
Nota: Marque las glándulas salivales también puede ser disecadas y semejantemente fijo y manchadas. - Deshidratar los tejidos lavando suavemente 3 veces con 1 mL helada 100% de etanol. Que las tripas naturalmente se hunden hasta el fondo del tubo entre cada lavado, centrifugación puede dañar el tejido. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras en etanol 100% a-20 ° C.
5. construcción de malla muestra cestas y soporte de la canasta de 24 pocillos
- Cortar los fondos de 2 mL o 5 mL tubos de centrífuga de la encajar a presión-tapa utilizando una hoja de afeitar calentada solo filo de un bisturí.
PRECAUCIÓN: La hoja puede necesitar ser recalentado varias veces antes de que se complete el corte. - Cortar cuadrados de una malla de nylon de 110 μm ligeramente más grande que la nueva apertura del tubo. Adherir la malla en la parte inferior del tubo presionándolos juntos ligeramente en un plato caliente sobre fuego medio-bajo hasta que un buen sello. Deje que se enfríe, asegurar que no quedan huecos entre la malla y el tubo y recortar el exceso de malla alrededor de los bordes.
- Corte agujeros en la tapa de una placa de 24 pocillos tal que el borde de la cesta de la muestra hecho en el paso 5.2 a sentarnos en el agujero y no caer, dando una configuración donde los fondos de las canastas de muestra se sentará en los pozos cuando se colocan en el orificios de la cubierta.
- Utilice este soporte de la canasta equipada para transferir cestas de una placa a otra con relativa facilidad para la totalidad del Protocolo de hibridación en situ . Utilice dos placas de 24 pocillos para que mientras se está produciendo una incubación, la otra placa está preparada para el siguiente lavado.
6. hibridación in Situ : día 1 (tiempo: 4-5 h)
- Valor de transferencia había etiquetado cestas muestra, separados por condición experimental y sonda de RNA la intención.
Nota: La mancha por lo menos 5 agallas por condición para tener en cuenta la variación natural entre repeticiones. - Rehidratar las muestras suavemente para evitar la introducción de burbujas de aire en el tejido aumentando gradualmente la proporción de solución salina con tampón fosfato con 0.1% de tensioactivo no iónico (PTw; Tabla 1) de etanol en los lavados.
Nota: Completar los lavados en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave a menos que se indique lo contrario. Alícuotas de 500-600 μl de soluciones de lavado en cada pozo del titular tal que las tripas en cada cesta estén completamente sumergidas. Preparar todas las soluciones con agua tratada con DEPC para evitar la degradación del RNA.- Lavar las muestras durante 5 minutos en 500 μl 100% de etanol.
- Preparar por lo menos 500 μl por canasta de muestra de 75%, 50% y 25% de etanol en PTw. Rehidratar las muestras de lavado durante 5 minutos en cada solución de etanol, pasando de la concentración de etanol más alto al más bajo.
- Lavar las muestras 4 veces de 5 min en PTw.
- Permeabilizar las muestras con proteinasa K (10 μg/mL) en PTw durante 5 minutos.
- Preparar el tejido para hibridación con las sondas de RNA.
- Lavar las muestras dos veces como se describe en 6.2 en el soporte de la canasta de 24 pocillos a temperatura ambiente con agitación suave durante 5 minutos en 500 μl de tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) (tabla 1) para mantener las muestras en un ambiente libre de Amina.
- Tratar las muestras dos veces con anhídrido acético de 500 μl 0.25% en tampón de trietanolamina (0.1 M, pH 7.0-8.0) durante 5 min, luego lavar las muestras dos veces en PTw por 5 min.
Nota: El anhídrido acético acetylates aminas libres para neutralizar la carga positiva, que es fundamental para prevenir interacciones electrostáticas no específicas y garantizar la unión específica de la sonda al mRNA. - Fijar las agallas por 20 min con paraformaldehido de 4% de 500 μl de PTw, luego lavar 5 veces en PTw durante 5 minutos.
- Prehybridize por incubación de las muestras en 500 μl de hibridación buffer /in el soporte de la canasta de 24 pozos en la placa bien 24 (tabla 1) por 1.5-2.5 h a 60 ° C con agitación suave en un baño. Guardar el buffer de hibridación utilizado por el paso prehybridization para reutilizar en el protocolo del día 2 (paso 7.1).
- Preparar soluciones de hibridación probe diluyendo las sondas de RNA en tampón de hibridación a una concentración final de 1 μg/mL. Incubar las muestras con soluciones de hibridación de sonda en el soporte de la canasta de 24 pocillos a 60 ° C con agitación suave durante la noche en un baño (tabla 2). Cubra la placa con el soporte de la canasta bien con papel de aluminio para evitar la evaporación de la solución de hibridación.
7. hibridación in Situ : día 2 (tiempo: 4.5-5.5 h)
- Sacar las muestras de las soluciones de hibridación de la sonda y en el tampón de hibridación reservada del día anterior. Incubar a 60 ° C con agitación suave durante 3 minutos.
Nota: Soluciones de sonda de hibridación pueden ser almacenadas a-20 ° C para su reutilización hasta 3 veces. - Preparar diluyendo 20 2 x de buffer de citrato de sodio solución salina (SSC) x SSC en agua tratada con DEPC (tabla 1). Lavar las muestras dos veces por 3 minutos con 2 x SSC, luego 3 veces durante 20 min con 2 x SSC a 60 º C para eliminar los restos de la sonda y tampón de hibridación.
- Tratamiento con Rnasa (20 μg/mL) y Rnasa T1 (10 μg/mL) en 2 x SSC durante 30 min a 37 ° C para eliminar solo trenzado sonda RNA representando gratis no-cruzado por hibridación RNA.
- Lave una vez con 2 x SSC durante 10 min a temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por dilución 2 x SSC en el agua tratada con DEPC, luego lavar dos veces con 0,2 x SSC durante 30 min a 60 ° C para eliminar RNasas exceso.
- Lavar dos veces con 500 μl de tampón de ácido maleico (MAB; Tabla 1) de 10 minutos cada uno.
- Incubar las muestras con solución (reactivo de bloqueo 2% en MAB) 1.5-2 h de bloqueo.
Nota: El reactivo de bloqueo puede ser difícil de disolver; calentamiento suave ayuda a la disolución. - Reemplace la solución de bloqueo con anti-digoxigenina alcalina conjugados con fosfatasa 500 μl del anticuerpo a la dilución de 1:3,000 en solución de bloqueo e incubar a temperatura ambiente por cerca de 4 horas o a 4 ° C durante la noche.
8. hibridación in Situ : día 3 (tiempo: 6 h hasta toda la noche)
- Lavar las muestras por lo menos 5 veces de 30 minutos cada uno con 500 μl de MAB para quitar exceso del anticuerpo.
Nota: Estos son flexibles y pueden ampliarse a 1-2 h o 3-4 lavados se pueden sustituir por un lavado durante la noche a 4 ° C con un mínimo efecto sobre la eficacia. - Lavar dos veces durante 5 minutos con buffer de fosfatasa alcalina, pH 9.5 (tampón de AP; Tabla 1).
- Comenzar la reacción de color mediante la sustitución del último lavado con 500 μl de cromógeno sustrato para fosfatasa alcalina (Tabla de materiales). Cubrir la placa de la muestra con papel de aluminio y dejar que la tinción proceder a temperatura ambiente durante 3 - 5 h o durante la noche a 4 ° C. Monitorear periódicamente la reacción de tinción viendo el tejido bajo un microscopio de disección para evitar overstaining.
Nota: Cuando la tinción es completa, un tinte púrpura es detectable por el ojo en las muestras de sondeo antisentido al microscopio, pero el tejido no se debe llegar a ser muy oscuro. La coloración procede muy lentamente a 4 ° C y puede tardar hasta 20-24 h. - Detenga la reacción de color de lavado durante 5 minutos en 500 μl de MAB y fijar el tejido durante la noche en solución de Bouin.
PRECAUCIÓN: Manipule solución de Bouin en una campana de humos; es un carcinógeno corrosivo.
9. hibridación in Situ : día 4 (tiempo: 3-3,5 h)
- Preparar por lo menos 7 mL por canasta de muestra de 1 x SSC por dilución 20 x SSC en el agua tratada con DEPC. Retirar la solución de Bouin lavando las muestras de 4 a 6 veces con etanol al 70% en 1 x SSC hasta que el tejido ya no es de color amarillo.
- Preparar 500 μl por canasta de muestra de soluciones de etanol 75%, 50% y 25% en 1 x SSC. Lavar las muestras durante 5 minutos en cada solución, pasando de más alta concentración de etanol a menor a rehidratar el tejido. Lavar dos veces durante 5 min cada 1 en x SSC.
- Incubar las muestras en la solución de lejía (tabla 1) durante 90 minutos en un lightbox en una campana de humos.
Nota: Este paso permite cualquier pigmentación en las muestras o coloración de Bouins solución para quitarse y mejora la señal de la sonda para una visualización clara. - Lavar las muestras dos veces con 500 μl de 1 x SSC durante 5 minutos.
- Reubicar las tripas con un daño mínimo por inversión de la cesta de la muestra en un pocillo de una placa de 24 pocillos nueva y lave con etanol al 70% a través del fondo de la malla con una pipeta de transferencia. Almacenar a-20 ° C si es necesario.
- Para obtener una visión general de los patrones de tinción de muestras múltiples como se muestra en la figura 3, mantener las tripas en etanol al 70% en la placa de la pozo 24 y la vista con cualquier microscopio de campo brillante. Examinar vísceras individuales bajo un microscopio de campo brillante como se muestra en la figura 4, figura 5, y la figura 6, Monte las tripas en glicerol al 100% bajo el cubreobjetos. Utilice una espátula de plástico para manipular suavemente los tejidos con daño mínimo.
Nota: La alta viscosidad de la glicerina ayuda a proteger el tejido del daño por compresión y permite la colocación cuidadosa de divertículos que el tejido puede verse óptimamente con aumentos más altos. - Captura de imágenes en el microscopio utilizando el software de captura de imagen específica de microscopio (Tabla de materiales) y exportar como una imagen genérica de software de edición de imágenes Tiff. Para cuantificar las diferencias de coloración relativas entre tratamientos experimentales, descargar un software de análisis de imagen genérico (Tabla de materiales). Abre la imagen dentro del software de análisis y siga las instrucciones dentro del software para medir intensidad de píxeles de la tinción y cálculo parcelas histograma de la tinción.
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Representative Results
La medición y valoración de la calidad de las sondas de RNA son esenciales antes de comenzar con la tinción. Eficiencia de transcripción in vitro depende altamente de la cantidad y calidad de la plantilla de la DNA. Habitualmente visualizamos las sondas de RNA en un gel de formaldehído para verificar la pureza y la cantidad de sonda generada por las reacciones de transcripción. Las sondas deben aparecer como bandas luminosas, discretos (figura 2). Medidas espectrofotométricas de la concentración de RNA fueron altamente indicativo de la calidad de la sonda y correlacionado bien con la aparición de las bandas en el gel. Así, el paso de visualización del gel puede omitirse si se desea una vez que se ha logrado la familiaridad con el protocolo. De cualquier manera, es importante asegurarse de que se produce suficiente ARN de alta calidad, como todas las etapas posteriores dependen de la robustez de las sondas.
La fuerza de esta técnica es facilitar observaciones generales sobre la microbiota de garrapatas, incluyendo la presencia o ausencia de especies bacterianas, cambios en la abundancia de bacterias con el tiempo como los feeds de la garrapata y la localización de especies dentro del tejido del todo. Alguna variación en la coloración de la cantidad y la distribución es normal entre réplicas biológicas así como los 7 pares de divertículos de tripas individuales (figura 3), por lo tanto, es mejor por lo menos cinco tripas por condición para tener una idea del promedio de la mancha patrón de tinción. El éxito del protocolo es mejor calibrado mediante la comparación de la tinción de las muestras de sentido y antisentido para cada condición. Las muestras de sentido, importantes controles negativos para este tipo de análisis, deben tener mínimo a ningún color púrpura (figura 4). Por el contrario, las muestras antisentidas deben mostrar coloración robusta con antecedentes mínimos, la intensidad de la que dependerá de la abundancia de las transcripciones bacteriano específicas está dirigido. El patrón de coloración en el tejido también variará en base a estos parámetros. Importante, el sentido y antisentidas muestras deben ser desarrolladas para la misma cantidad de tiempo para poder compararlos directamente, por lo que estas muestras deben procesarse en paralelo. Desarrollo excesivo de la reacción de color puede resultar en una cantidad alta de fondo, tinción, donde las muestras de sentido empiezan a parecerse a la antisense (figura 5). Particular debe tener cuidado en este paso en el protocolo para evitar la overstaining, como no es posible revertir la reacción una vez que se produce.
Es esencial para asegurarse de que todas tripas están sumergidas completamente en cada reactivo durante cada paso; un aumento en la variación a través de las muestras puede ser debido a la exposición desigual a los reactivos. La cantidad de tiempo que las garrapatas se alimentan antes de que las tripas se recogen también tiene un efecto significativo en los resultados. Las garrapatas unfed o sólo alimentadas por 24 h eran difíciles de trabajar las entrañas fueron también más fácilmente dañado y no mancha así (figura 6) y es una limitación de este enfoque en este momento. Las garrapatas alimentadas por 48-72 h eran más fáciles de trabajar, debido al tamaño más grande de estas agallas en comparación con tripas de garrapatas que se alimentan para tripas de 24 h. de puntos de tiempo posteriores también mancharon mejores que 24 h-alimentó las garrapatas, posiblemente debido a aumentos en la carga bacteriana durante la posteriores etapas o f alimentación. El tejido 72 h tenía a menudo un leve fondo de tinte marrón de la sangre, pero la coloración púrpura era claramente visible sobre el tinte (figura 4). Las tripas se ven mejor con poco aumento (5 X o 10 X) para poder ver los patrones de coloración en el tejido entero utilizando un microscopio de campo brillante. Ver montaje de conjunto tejido a mayor aumento, tales como con 63 X objetivo de aceite, corre el riesgo de dañar el tejido como el objetivo contra el portaobjetos y comprimir el tejido por el espesor de las muestras. Si se desea la proyección de imagen de mayor resolución, debe examinarse la posibilidad de seccionamiento de tejidos.
Figura 1 . Esquema de preparación de la plantilla para la generación de la sonda. Clonar los amplicones de 16S rRNA en un TA clonación vector que contiene promotores T7 y Sp6. Alinear la construcción utilizando enzimas de restricción para cortar en sitios a o b en vitro transcripción usando promotor T7 o Sp6 para generar sondas sentido o antisentido respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Visualización de la sonda de RNA por electroforesis en gel de. Sondas de RNA (~ 700 ng) fueron electrophoresed en un gel de agarosa de formaldehído, visualizados bajo luz UV y fotografiada utilizando un gel comercial sistema de imagen. Un representante de buena calidad, carril 1; y la sonda de RNA de mala calidad, lane 2.
Figura 3 . Una visión representativa de todo Monte en situ hibridación de 48 tripas h-alimentó. Entrañas de garrapatas alimentación para 48 h teñido con antisense RNA complementario a una secuencia de ARN ribosomal 16S conservado muestra tinción diferencial de divertículos del intestino. Barra de escala representa 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Imágenes representativas del exitoso conjunto-Monte hibridación en situ en agallas de scapularis de Ixodes . Entrañas de garrapatas alimentadas por la cantidad de tiempo se tiñeron utilizando cualquiera de los dos sentido (control negativo) o sondas antisense RNA. Sondas antisentidas son complementarias a una secuencia conservada 16S de ARN ribosómico (16S Universal) o una secuencia de ARN de 16S específica a un determinado Género bacteriano (como se indica). Enterococo no dió la coloración robusta en 48 h. escala barras representan 140 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . El tiempo de reacción cromogénico prolongado conduce a la tinción inespecífica. Tripas de garrapatas alimentadas durante 48 h fueron sondeados con una sonda de RNA de sentido o una punta de prueba antisentido complementario a una secuencia de RNA 16S conservado. El tejido se incubó con el sustrato de la fosfatasa alcalina BM púrpura durante la noche a 4 ° C y luego a temperatura ambiente durante unas 4 h antes de parar la reacción. Barras de escala representan 140 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Conjunto de montaje en situ hibridación utilizando unfed o tripas de garrapatas 24 h alimentado. Entrañas de unfed o 24 h-alimentó las garrapatas se tiñeron utilizando sondas de RNA de sentido o antisentido sondas complementarias a una secuencia de ARN 16S conservados o una secuencia específica del género Rickettsia. Tinción de las muestras antisentidas es menos robusta que la observada en más puntos del tiempo y las agallas son también más fácilmente dañado. Barras de escala representan 60 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Concentraciones finales | PH final | Notas de almacenamiento de información |
| MEMFA | 0.1 MOPS DE M | - | Temperatura ambiente |
| 2 mM EGTA | |||
| sulfato de magnesio 1 m m | |||
| 3.7% formaldehído | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1 x PBS, 0,1% Tween-20 | 7.0 | Temperatura ambiente |
| 0,1% Tween-20 | |||
| Buffer de trietanolamina | 1 x PBS | 7.0-8.0 | Temperatura ambiente |
| 0.1 trietanolamina M | |||
| Tampón de hibridación | formamida 50% | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| Torula de 1 mg/mL RNA | |||
| heparina de 100 μg/mL | |||
| 1 x solución de Denhart | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 0.1 GRIETAS DEL % | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Ácido Maleic amortiguamiento (MAB) | ácido maleico de 100 mM | 7.0 | Temperatura ambiente |
| cloruro de sodio de 150 mM | |||
| Almacenador intermediario de la fosfatasa alcalina (AP) | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| cloruro de magnesio de 50 mM | |||
| cloruro de sodio 100 mM | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| levamisol 5 mM | |||
| Solución de lejía | peróxido de hidrógeno 1% | - | Preparar fresco |
| 5% formamida | |||
| 0.5 x SSC |
Tabla 1. Recetas de soluciones utilizadas en el protocolo.
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Discussion
Este es el primer uso de una técnica de hibridación (WMISH) conjunto de montaje en situ para el estudio de la microbiota de un artrópodo vector de agentes patógenos. Nuestro protocolo fue adaptado de uno usado para el estudio de desarrollo en Drosophila y en embriones de rana25,26. Conjunto de montaje RNA en situ el hibridación se ha utilizado rutinariamente para localizar espacialmente las transcripciones del gene y temporal27 y visualización de las transcripciones pueden hacerse en campo brillante o por microscopia fluorescente. Hemos adoptado el anterior hacia la detección de la microbiota en agallas de garrapata. Es importante tener en cuenta que los intentos realizar el montaje en conjunto en situ hibridación con garrapatas todo en que la región central fue quitada para permitir la penetración de soluciones de fijador y la hibridación no tuvo éxito. El protocolo descrito aquí utiliza tripas disecadas y se ha implementado para estudiar los efectos de las proteínas señal específica sobre la colonización bacteriana en el intestino medio23. Información obtenida de WMISH es comparable a la inmunohistoquímica, pero tiene la ventaja de no requerir la generación de proteínas y anticuerpos para el gen o la proteína de interés. Información genómica es suficiente para generar los reactivos para WMISH. WMISH y FISH (hibridación fluorescente in situ) puede detectar la expresión de genes. Sin embargo, debido a que es un ensayo enzimático y de cromógeno, WMISH tiene la ventaja que puede vigilarse activamente desarrollo de color y la reacción puede continuar hasta la señal deseada y sensibilidad se logra. Es totalmente susceptible a la automatización y es fácilmente escalable al formato de alto rendimiento. A diferencia de los peces e immunohistochemistry, ningún corte es necesario. La desventaja del WMISH en peces es que sólo 2 mRNAs diferentes genes pueden abordarse simultáneamente y requerirían que las sondas etiquetarse con análogos de nucleótidos diferentes como digoxigenina UTP y fluoresceína-UTP28. Con los pescados, hasta 6 diferentes mRNAs pueden examinarse en un ensayo29. Mientras que ambos ensayos requieren de tiempo comparable, el costo de los colorantes de fluorescencia es mayor que el de sustratos cromogénicos. Ensayos de pescado también requeriría un microscopio de fluorescencia para la visualización de la imagen, mientras que la visualización de la imagen WMISH se puede realizar con cualquier microscopio de luz.
Es crucial que el protocolo es seguido muy de cerca; sin embargo, hay algunos pasos que requieren especial atención. Disección del midgut de la garrapata sin dañar el tejido requiere cierta destreza. Puede ser prudente recoger las señales extras para la práctica de las disecciones y ganar la pericia. Debido a la heterogeneidad de la coloración de los distintos divertículos de tripas individuales (figura 3), es importante examinar todos los divertículos de cada tripa para obtener pruebas concluyentes de la abundancia bacteriana. También es importante procesar varias agallas (mínimo 5) para cada condición experimental para obtener información concluyente sobre la presencia, distribución espacial y abundancia de bacterias específicas en distintos divertículos. Producción de sondas de RNA de alta calidad también es importante la coloración efectiva del tejido. Es crucial confirmar también la secuencia de la plantilla de la sonda en el vector de clonación para antisentido y sondas de sentido se generan adecuadamente. Una reacción productiva en vitro de la transcripción requiere suficiente DNA de la plantilla; un mínimo de 100 ng puede utilizarse, pero 0.5 - 1 μg se recomienda para la generación óptima de la sonda.
El uso de cestas de la muestra y las placas de 24 pocillos en este protocolo evita la manipulación directa de los tejidos en cada paso del lavado, que minimiza el daño durante el proceso de tinción. Sin embargo, las muestras son todavía de vez en cuando perdidas o dañadas; tripas de garrapatas unfed o alimentados 24h, en particular, son difíciles de ver y fácil de perder al transferir de las cestas de la muestra a un recipiente de almacenamiento a largo plazo. Debe tener cuidado adicional durante la manipulación de las muestras. Debido a esta limitación, hemos utilizado principalmente tripas garrapata fed h 48 y 72. La presencia de grandes cantidades de harina de sangre en las entrañas en estos momentos (más de 72 h) interfiere con la tinción y visualización debido a antecedentes no específicos de la harina de sangre y también presenta una limitación de esta técnica. Es probable que el uso de sondas marcadas con fluorescencia podría eludir esta cuestión.
El aspecto más importante del procedimiento de tinción es establecer el equilibrio entre la coloración robusta y la señal de bajo fondo. El tiempo de desarrollo de color ideal puede variar dependiendo de las condiciones experimentales. Por lo tanto, es mejor realizar la reacción de color en el desarrollo de color de temperatura y monitor aproximadamente cada 30 minutos. La reacción puede también configurarse para continuar durante la noche a 4 ° C para retardar el desarrollo del color. Sin embargo, es extremadamente crítica no permitan que esta reacción procede por mucho tiempo. La reacción de tinción puede ser difícil de controlar por el ojo, por lo que las muestras deben examinarse bajo un microscopio de disección. Un tinte púrpura debe ser visible en las muestras probadas con ARN antisentido, mientras que las muestras de sondeo con sentido RNA debe conservar mínimo color. Si las muestras de sondeo de RNA de sentido manchan brillantes, solución de problemas pasos debería comenzar con reducir el tiempo de incubación con BM púrpura y aumentando el tiempo de bloqueo. A veces las puntas de prueba de sentido pueden causar fondo anómalamente alta en comparación con las sondas antisentidas; en estos casos, distintas regiones del gen podrían tener que ser considerado para la generación de sondas de RNA. Secuencias de ADN no representadas en una muestra determinada pueden considerarse también como plantillas para generar sondas de control negativo. Por ejemplo, se puede utilizar una plantilla de DNA codifican una región de la proteína verde fluorescente, no representada en el genoma de la garrapata o la microbioma.
Una limitación de esta técnica es que el análisis es en gran parte cualitativo; sin embargo, software de análisis de imagen (Tabla de materiales) podría ser utilizado para medir la cantidad de coloración de señal en cada muestra. Esto permitiría una comparación semicuantitativa de la abundancia de varias especies bacterianas bajo diferentes condiciones experimentales. Mientras que esto es un protocolo lento que tarda 3-4 días para completar, no es laborioso; cada día práctica tiempo es tan sólo unos 3-5 h en promedio. Sin embargo, la capacidad de procesar muchas muestras en paralelo con el uso de las cestas de la muestra y los titulares permite el análisis de alto rendimiento. Además, este proceso puede automatizarse mediante instrumentos comercialmente disponibles (tabla de materiales) si este protocolo se espera que sea un componente esencial y sistemático del laboratorio de investigación utilizando comercialmente disponible plataformas de automatización compatible (Tabla de materiales) a más reducen el tiempo de práctica.
El protocolo descrito hace uso de sondas marcadas con digoxygenin que permiten la producción de una señal colorimétrica que puede ser reflejada mediante microscopía de campo brillante. Mientras que nosotros hemos utilizado un sustrato cromogénico para la detección de RNA hibridizada sondas específicas de objetivos individuales, también es posible detectar múltiples objetivos simultáneamente por etiquetado de sondas con análogos de nucleótidos diferentes, tales como digoxigenina UTP y fluoresceína-UTP y diferentes sustratos cromogénicos30. Luego se incuban las muestras de tejido secuencialmente con junto de fosfatasa alcalina anticuerpos contra digoxigenina y fluoresceína, con diversas reacciones cromogénicos para los dos pasos. Esta técnica también podría ser adaptada para sondas marcadas con fluorescencia, que pueden facilitar la proyección de imagen de alta resolución utilizando microscopía confocal31 y proporcionar la opción de usar sondas múltiples de diferentes colores en paralelo. Esta técnica puede evaluar sólo específicamente algunos microorganismos a la vez en una muestra. Sin embargo, varias muestras pueden ser evaluadas en los ensayos de alto rendimiento para abordar múltiples microorganismos que pueden representarse en garrapata microbiota.
Por último, esta técnica no se limita a la investigación de las interacciones entre las garrapatas y su microbiota asociada. Sondas complementarias a cualquier gen de interés dentro del genoma de garrapata pueden genera y utiliza para examinar la abundancia y localización de genes específicos en diversos tejidos. Las glándulas salivares de la garrapata también puede procesadas y analizadas de manera similar a la tripa. En general, esta técnica tiene gran potencial de adaptación a los estudios sobre la dinámica de comunidades microbianas dentro de otros vectores artrópodos de interés.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente el Dr. Mustafa Khokha, Universidad de Yale, proporcionando el uso de sus recursos de laboratorio. Agradecemos a Mr. Wu Ming-Jie excelente asistencia técnica. EF es un investigador HHMI. Este trabajo fue financiado por una donación de la John Monsky y Jennifer Weis Monsky fondo de investigación de la enfermedad de Lyme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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