Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Visualisering av bakterieflora i Tick tarmar av hela-mount In Situ hybridisering

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57758
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att spatialt och temporalt bedöma förekomst av livskraftiga bakterieflora i tick tarmar med en modifierad hela-mount in situ hybridisering metod.

Abstract

Smittsamma sjukdomar som överförs av leddjur vektorer fortsätter att utgöra ett betydande hot mot människors hälsa i hela världen. De patogener som orsakar dessa sjukdomar, existerar inte isolerat när de kolonisera vektorn; de bedriver snarare sannolikt interaktioner med inhemska mikroorganismer i tarmen lumen. Den vektor bakterieflora har visat sig spela en viktig roll i patogener överföring för flera vektorburna sjukdomar. Om inhemska bakterier i tarmen av fästingen Ixodes scapularis , vektorn av flera mänskliga patogener inklusive Borrelia burgdorferi, påverka fästingen överföring av patogener bestäms inte. Vi kräver metoder för karaktärisering sammansättningen av de bakterier som är associerade med Markera tarmen att underlätta en bättre förståelse av potentiella mellan arterna interaktioner i tick tarmen. Med hela-fäste i situ möjliggör hybridisering att visualisera RNA avskrifter är associerad med viss bakterieart insamling av kvalitativa data om överflödet och distribution av bakterieflora i intakt vävnad. Denna teknik kan användas för att undersöka förändringar i tarmen bakterieflora miljö under loppet av tick utfodring och kan också användas för att analysera tick genuttryck. Färgning av hela fästing tarmar avkastning information om brutto rumslig distribution av målet RNA i vävnaden utan behov av tredimensionell rekonstruktion och påverkas mindre av miljöförorening, som ofta förvirrar den sekvensering-baserade metoder som ofta används för att studera komplexa mikrobiella samhällen. Sammantaget är denna teknik ett värdefullt verktyg som kan användas för att bättre förstå vektor-patogen-bakterieflora interaktioner och deras roll i sjukdomsspridning.

Introduction

Mänskliga och boskap patogener överförs av leddjur vektorer finns över hela världen och står för ca 20% av infektionssjukdomar globalt1, men effektivt och säkert vaccin mot de flesta av dessa patogener är inte tillgängliga. Vår förståelse av den viktiga rollen som kommensaler, symbiotiska och patogena mikroorganismer, gemensamt benämnda mikrobiomet2, modulerande och formar hälsan hos nästan alla metazoans3 växer. Nu är det uppenbart att leddjur vektorer av patogener även hysa tarmfloran och dessa vektor-associerade bakterieflora har visat sig påverka olika vektorburna patogener4,5. Den leddjur mikrobiomet består av eubacteria, arkéer, virus och eukaryota mikrober som protozoer, nematoder och svampar6. Dock har dominera forskningens fokus funnits på eubacteria vederbörlig, delvis, tillgängligheten av markörgener och referensdatabaser att identifiera specifika bakteriell medlemmar.

Med fokus på Ixodes scapularis, tick vektorn av flera mänskliga patogener inklusive Borrelia burgdorferi7, vilka smittämnen av borrelia, optimering av en mikrobiell visualisering teknik syftade att förbättra vår förståelse av tick tarmfloran i samband med vector-patogen interaktioner. Flera frågor återstår för att besvaras i fältet Markera mikrobiomet. Tarmen är platsen för det första utöka mötet mellan fästingen och inkommande patogenet i samband med horisontellt överförda patogener. Därför kommer att förstå rollen som vektor tarmfloran i modulerande vektor-patogen interaktioner avslöja meningsfulla insikter. Fästingar har ett unik läge av blodmjöl matsmältningen, där bearbetning av blodmjöl komponenter tar placera intracellulärt8. Gut lumen till synes fungerar som ett fartyg ska innehålla blodmjöl som tickande feeds, och näringsämnen matsmältning och assimilering uppstå under flera dagar av utfodring och fortsätta efter tillskott. De patogener som fästingen förvärvat under utfodring ange gut lumen tillsammans med blodmjöl och lumen blir således en primär plats av interaktioner bland tickande, patogen och bosatt bakterieflora. Som matsmältningen vinning genom tillskott och Ixodid tick ömsat, genomgår tarmen strukturella och funktionella förändringar9. Sammansättning och den rumsliga organisationen av tarmbakterier är också sannolikt att variera i samförstånd med den föränderliga gut-miljön. Det är därför viktigt att förstå arkitekturen av bosatta Vanliga magbakterier kryssa till fullo förstå samspelet mellan fästing, patogen och tarmfloran.

Molekylära metoder för att beskriva värd-associerade bakterieflora rutinmässigt använda hög genomströmning parallella sekvensering strategier10 för att förstärka och sekvens bakteriell 16S ribosomal DNA (rDNA). Dessa sekvensering strategier kringgå behovet av att få axenic kulturer av särskilda bakterier och ger en fördjupad Beskrivning av alla bakteriella medlemmar representerade i provet. Dock sådana strategier är tvetydiga på grund av oförmågan att skilja miljömässiga föroreningar från bona fide invånare. Ytterligare, när bedömningen av prover, såsom fästingar, som är liten i storlek och därmed innehåller låg bakterieflora-specifika DNA ger, sannolikheten för förstärkning av miljögifter är ökad11 och resulterar i en tvetydig tolkning av mikrobiomet sammansättning. Funktionell karakterisering tillsammans med visualisering av specifika livskraftiga bakterier blir därför avgörande för att definiera och urskilja mikrobiomet av fästingen temporally och rumsligt. Mot detta mål tog vi fördel av hela-mount RNA i situ hybridisering. Denna teknik används rutinmässigt bedöma gen uttrycksmönster i organ och embryon12,13,14 och möjliggör semikvantitativ analys av uttryck över hela provet av intresse. Detta skiljer sig från traditionella i situ hybridisering tekniker som utnyttjar vävnadssnitt och kräver ofta omfattande analys av sektionerad material med en computational församling att förutsäga uttryck i hela organ15. Medan hela-mount hänvisar generellt till hela organismer12, refererar här hela-mount till hela tarmar eller organ. Fördelarna med att använda den hela-mount RNA in situ hybridisering-metoden för att bedöma arkitekturen av tick tarmfloran är mångfacetterat. Markera tarmen består av 7 par av diverticula, varje par varierande i storlek16. Funktionella skillnader, kryssa om någon, bland dessa diverticula, inte förstås i samband med tick biologi, bakterieflora eller tick-patogen interaktioner. Manipulationer av tarmen som brista i tarmen diverticula skulle förskjuta bakterieflora i tarmen lumen eller de löst kopplade tarmen och resultera i felaktig tolkning av den rumsliga lokaliseringen av bakterieflora. Fluorescens-märkt RNA i situ hybridisering har använts tidigare för att undersöka tick gut avskrifter17 genom fastställande och öppna enskilda tarmen diverticula att säkerställa sonden hybridisering och lokalisera B. burgdorferi avskrifter av snittning paraffin-inbäddat hela fästingar18. Båda metoderna kräver manipulationer av tick vävnader före hybridisering som skulle påverka tarmen bakterieflora arkitekturen.

I den här rapporten beskriver vi i detalj i protokollet för att undersöka livskraftig tick tarmfloran med hela-fäste i situ hybridisering (WMISH). Användning av hela-mount RNA i situ hybridisering möjliggör en global förståelse av förekomsten och överflöd av specifika tarmbakterier i olika regioner i tarmen och kan sporra nya insikter i tick gut biologi i samband med patogener kolonisering och överföring. Användning av RNA sonder riktade mot specifika bakteriell RNA kan ytterligare, livskraftiga bakterier i tarmen fästing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av DNA mallar

  1. Hämta 16S rRNA sekvensen specifika till varje bakterie släkten från NCBI databas och design polymeraskedjereaktion (PCR) kompatibel fram och vända primers som kommer att förstärka släkten-specifika regioner (~ 200-250 baspar lång) som tidigare beskrivits 19. se även öppen källkod databaser SILVA20,21 och probeBase22 online resurser för rRNA-riktade oligonukleotiden sonder och grundfärger, som RNA sonder för vissa bakteriella släkten kan vara kommersiellt tillgängliga.
    Obs: Det är viktigt att välja genen regioner som är specifika till specifika släkten och säkerställa att designade primers inte förstärka relaterade bakteriell släkten. Detta är avgörande att få gen/släkten-specifika sonden hybridisering.
  2. Foder fästingar för 24, 48 eller 72 h på möss, dissekera tick tarmar och förbereda RNA och cDNA från fästing inälvor som beskrivs tidigare23. Användning cDNA som mall till PCR förstärka släkten-specifika amplikoner använder en termocykler. Kör en alikvot av PCR-produkten/ospädd på en 1,5% agarosgel och bekräfta att ospädd motsvarar den förväntade storleken av visualisering under ultraviolett (UV) ljus med en gel som tänkbar system.
  3. Klona det bakteriell 16S ribosomalt RNA kopian av intresse i en kommersiellt tillgänglig TA vektor (Tabell för material) som innehåller RNA-polymeras initiativtagare passar bacteriophage polymeraser (SP6, T7 eller T3). Sekvensera klonerna för att bekräfta identiteten för ospädd och riktningen på klon med avseende på var och en av initiativtagarna. Utifrån detta avgöra främjare av val att generera känsla eller antisense-RNA sonder (figur 1).
  4. Linjär 1 mg av Plasmiden med en lämplig restriktionsenzym i en reaktionsvolym av upp till 30 µLfor 2 h vid temperaturer som rekommenderas av tillverkaren. Välj restriktionsenzym baserat på arrangören som kommer att användas för att generera den mening eller antisense sonden (figur 1). Verifiera Linearisering av visualisering av 2 µL av digest reaktion på en 1% agarosgel.
  5. Rena de återstående 28 µL av smält DNA använder en kommersiellt tillgänglig PCR-produkt kolumn rening kit och kvantifiera DNA-koncentration av spektrofotometer.
    Obs: Vissa känsla sonder kan orsaka bakgrundsfärgning mycket högre än motsvarande antisense sonden och andra alternativ kan behöva undersökas. Alternativa negativa kontroller inkluderar plasmider kodning sekvenser som inte representerade i provet eller en annan sond som ger en distinkt mönster av hybridisering.

2. konstruktion av Digoxygenin-UTP RNA sonder

  1. Förbereda den nukleotid-mix genom att kombinera 7,5 µL av 100 mM UTP, 25 µL 10 mM digoxygenin-UTP, och 10 µL varje 100 mM ATP, GTP och CTP i ett 1,5 mL centrifugrör.
  2. Utföra i vitro transkription med kommersiellt tillgängliga T7 eller Sp6 RNA polymeras kits, använder 1 µL nukleotid mixen (steg 2.1) och 0,25 - 1 µg av DNA. Ta volymen upp till 20 µL med vatten. Snärta röret för att kombinera och puls spin. Inkubera vid 37 ° C för 2,5-3 h.
    Obs: Sonden byggandet har varit framgångsrika med smält plasmid koncentrationer så låg som 7 ng/µL, men typiska koncentrationerna på detta steg varierar från 15-25 ng/µL. Transkription reaktionen kan också inkuberas över natten vid 37 ° C, men detta ökar avsevärt inte RNA avkastningen.
  3. Tillsätt 1 µL av DNAS (2 000 enheter/µL) och inkubera vid 37 ° C i 10 min. Överskrid inte 10 min, eller enzymet kan börja förnedrande RNA.
  4. Lägg till 30 µL iskall 7,5-8 M litium klorid och 30 µL kylda nuclease-fritt vatten för att fällningen RNA. Snärta röret att blanda. Tillåta utfällning av RNA att fortsätta över natten vid-20 ° C.
  5. Samla RNA genom centrifugering vid 17 000 x g i 20 min vid 4 ° C. Tvätta pelleten en gång med 1 mL nyberedd 75% etanol i dietyleter pyrocarbonate (DEPC) vatten, sedan upprepa centrifugering.
  6. Ta bort och Kassera supernatanten vänd röret på en ren pappershandduk och låt torka för 10 min. återsuspendera pelleten i nuclease-gratis vatten. Om pelleten är lätt synliga, Återsuspendera i 25 µL. Om pelleten är mycket litet eller inte syns, Återsuspendera i 15-20 µL. få en uppskattning av RNA-koncentrationen av spektrofotometer.
    Obs: Typiska RNA koncentrationer varierar från 200-500 ng/µL.

3. visualisering av RNA sonder med RNA formaldehyd gelelektrofores att bedöma RNA renhet

FÖRSIKTIGHET: Formaldehyd utgör en risk för inandning. Därför generera de lösningar som krävs för RNA gel analys i dragskåp. Etidiumbromid är misstänkt cancerframkallande; hantera med försiktighet.

  1. Förbereda en 1% formaldehyd agarosgel som tidigare beskrivits24 och kasta gelen i en gel box gratis av RNaser. När cool, Fyll gelboxen med 1 x kör buffert (1 x moppar vid pH 7,0, 5% formaldehyd).
  2. Förbereda prov bufferten (5 µL 400 mg/mL etidiumbromid, 20 µL 10 x moppar, 35 µL formaldehyd och 100 µL formamid). Kombinera 2 µL av RNA sonden (steg 2,6) med 8 µL prov buffert. Inkubera vid 70 ° C i 10 min.
  3. Förbereda RNA lastning buffert genom att kombinera 5 mL 50% glycerol, 1 mL 10% formaldehyd, 40 mg bromofenolblått, 40 mg xylen cyanol och 20 µL 0,5 M EDTA (pH 7,5). Efter användning, lagra denna buffert vid-20 ° C.
  4. Tillsätt 3 µL av lastning buffert till RNA-prov från steg 3,2 och blanda. Hålla provrör på is.
  5. Fyll hela provvolymen från steg 3,4 i gelen. Ladda en alikvot av enkelsträngat RNA stege parallellt med att verifiera RNA storlek. Kör gelen vid 100 V eller lägre tills det blå färgämnet migrerar ungefär 75% av vägen ner gelen. Visualisera RNA under UV-ljus med hjälp av en gel imaging system.
    Obs: En god kvalitet RNA sond ska visas som ett diskret band med en rörlighet som motsvarar den förväntade storleken på sonden (figur 2, lane 1). Om sonden visas som en diffus och smetig band (figur 2lane 2) detta inte bör användas.

4. Kryssa Gut insamling och fixering

  1. Samla Ixodes scapularis nymfer som har matats på möss för punkter av intresse.
    Obs: För tillämpningen av denna teknik, fästingar matas för 48 eller 72 h arbete bäst.
  2. Dissekera tarmen från fästingen in i MEMFA (tabell 1) på en glasskiva i dissektion Mikroskop, undvika skador på organ som möjligt. Placera en bock på ett rent objektglas i 20-30 µL av MEMFA. Använda ett par sterila högkolhaltig stål rakblad #11 segment regionen huvud på skölden av fästingen lämnar kroppen av fästingen. Tryck försiktigt på kroppen att driva den tarmen diverticula och spottkörtlar ut kroppen nagelbanden. Separat spottkörtlarna och tarmen och scoop modet på rakbladet.
  3. Samla in modet i ett 1,5 mL rör som innehåller 500 µL MEMFA. Inkubera röret med mild gunga för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
    Obs: Tick spottkörtlar kan också vara dissekeras och likaså fixeras och färgas.
  4. Torkar ut vävnaden genom att tvätta försiktigt 3 gånger med 1 mL iskallt 100% etanol. Låt modet sjunka naturligt till botten av röret mellan varje tvätt, centrifugering kan skada vävnaden. För långsiktig lagring, hålla proverna i 100% etanol vid-20 ° C.

5. byggandet av Mesh prov korgar och 24-väl korg hållare

  1. Skära bottnarna utanför 2 mL eller 5 mL snapin-top centrifugrör med en uppvärmd eneggad rakblad på en skalpell.
    FÖRSIKTIGHET: Bladet kan behöva värmas flera gånger innan snittet är klar.
  2. Skär rutor av en 110 µm nylon mesh något större än nya tube öppningen. Bond maskan till botten av röret genom att trycka dem ihop lätt på en värmeplatta på medellång låg värme tills en bra tätning görs. Låt svalna, kontrollera det inte finns några mellanrum mellan maskorna och röret och trimma överflödigt mesh runt kanterna.
  3. Skär hål i locket 24-well platta så att läppen av provet korgen i steg 5.2 kommer sitta vid hålet och inte faller igenom, vilket ger en set-up där bottnarna i provet korgarna kommer att sitta hela vägen i brunnarna när de placeras i den hål i locket.
  4. Använd denna monterad korg hållare för att överföra korgar från en platta till en annan med relativ lätthet för helheten av protokollet i situ hybridisering. Använda två 24 brunnar så att medan en inkubering sker, den andra plattan är förberedd för nästa tvätt.

6. in Situ hybridisering: dag 1 (Timing: 4-5 h)

  1. Överföring modet att märkt provet korgar, åtskilda av experimentella villkor och avsedda RNA sonden.
    Obs: Fläcken minst 5 tarmar per tillstånd att ta hänsyn till naturliga variationer bland replikat.
  2. Rehydrera proverna försiktigt för att undvika att införa luftbubblor i vävnaden genom att gradvis öka förhållandet mellan fosfatbuffrad saltlösning med 0,1% icke-jonisk tensid (PTw; Tabell 1) till etanol i tvättarna.
    Obs: Slutföra alla tvättar i hållaren 24-väl korg vid rumstemperatur med mild agitation om inget annat anges. Alikvotens 500-600 µL tvätta lösningar i varje brunn av innehavaren av sådan att modet i varje korg är helt nedsänkt. Förbereda alla lösningar med DEPC-behandlad vatten för att förhindra RNA nedbrytning.
    1. Tvätta proverna för 5 min i 500 µL 100% etanol.
    2. Bered minst 500 µL per prov korg med 75%, 50% och 25% etanol i PTw. Rehydrera proverna genom tvättning för 5 min i varje etanol lösning, flyttar från den högsta etanol koncentrationen till de lägsta.
    3. Tvätta proverna 4 gånger för 5 min varje i PTw.
  3. Permeabilize av prov med proteinas K (10 µg/mL) i PTw för 5 min.
  4. Förbereda vävnaden för hybridisering med RNA sonderna.
    1. Tvätta proverna två gånger som beskrivs i punkt 6.2 i hållaren 24-väl korg vid rumstemperatur med mild agitation för 5 min varje i 500 µL trietanolamin buffert (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tabell 1) för att upprätthålla proverna i en amine-fri miljö.
    2. Behandling av prov två gånger med 500 µL 0,25% ättiksyraanhydrid i trietanolamin buffert (0.1 M, pH 7,0-8,0) för 5 min varje, sedan tvätta proverna två gånger i PTw för 5 min varje.
      Obs: Ättiksyraanhydrid acetylates gratis aminer för att neutralisera positiv laddning, som är avgörande för att förhindra icke-specifik elektrostatiska interaktioner och säkerställa specifika bindningen av sonden till mRNA.
    3. Fixa modet i 20 min med 500 µL 4% PARAFORMALDEHYD i PTw, sedan tvätta 5 gånger i PTw för 5 min varje.
    4. Prehybridize av ruvning proverna i 500 µL hybridisering buffert /i 24-väl korg innehavaren i 24 väl plattan (tabell 1) för 1,5-2,5 h vid 60 ° C med mild agitation i skakningar vattenbad. Spara hybridisering bufferten används för prehybridization steg för att återanvända i protokollet dag 2 (steg 7.1).
    5. Förbereda sonden hybridisering lösningar genom att späda ut RNA sonder i hybridisering buffert till en slutlig koncentration på 1 µg/mL.  Inkubera prover med sonden hybridisering lösningar i hållaren 24-väl korg vid 60 ° C med mild agitation övernattning i en skakande vattenbad (tabell 2). Täcka plattan bär korg innehavaren tätt med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning av hybridisering lösningen.

7. in Situ hybridisering: dag 2 (Timing: 4,5-5,5 h)

  1. Ta bort proverna från sonden hybridisering lösningarna och placera dem i reserverade hybridisering bufferten från föregående dag. Inkubera vid 60 ° C med mild agitation för 3 min.
    Obs: Sonden hybridisering lösningar kan förvaras vid-20 ° C för återanvändning upp till 3 gånger.
  2. Förbered 2 x saltlösning-natriumcitrat buffert (SSC) genom att späda 20 x SSC i DEPC-behandlad vatten (tabell 1). Tvätta proverna två gånger för 3 min med 2 x SSC, sedan 3 gånger för 20 min med 2 x SSC vid 60 ° C att avlägsna alla spår av sonden och hybridisering buffert.
  3. Behandla med RNase en (20 µg/mL) och RNase T1 (10 µg/mL) 2 x SSC under 30 minuter vid 37 ° C ta bort enda stranded RNA sond som representerar gratis icke-hybridiserad RNA.
  4. Tvätta en gång med 2 x SSC i 10 min i rumstemperatur. Förbereda 0,2 x SSC genom att späda 2 x SSC i DEPC-behandlad vatten, tvätta sedan två gånger med 0,2 x SSC för 30 min 60 ° c att ta bort överflödig RNaser.
  5. Tvätta två gånger med 500 µL av maleinsyra buffert (MAB; Tabell 1) för 10 min varje.
  6. Inkubera prover med blockering lösning (2% blockerande reagent i MAB) för 1,5-2 h.
    Obs: Den blockerande reagensen kan vara svårt att upplösa; skonsam uppvärmning hjälpmedel upplösningen.
  7. Ersätta den blockerande lösningen med anti-digoxigenin alkalisk fosfatas-konjugerad 500 µL av antikroppen vid en 1:3,000 spädning i blockering lösning och inkubera i rumstemperatur i ca 4 h eller vid 4 ° C över natten.

8. in Situ hybridisering: dag 3 (Timing: 6 h till över natten)

  1. Tvätta proverna minst 5 gånger för 30 min varje med 500 µL MAB ta bort överskjutande antikroppar.
    Obs: Dessa tvättar är flexibla och kan förlängas till 1-2 h, 3-4 tvättar får ersättas eller för en övernattning tvätt vid 4 ° C med minimal inverkan på effekten.
  2. Tvätta två gånger för 5 min med alkaliskt fosfatas buffert, pH 9,5 (AP buffert; (Se tabell 1).
  3. Börja färg reaktionen genom att ersätta den sista tvättningen med 500 µL av den kromogent substraten för alkaliskt fosfatas (Tabell för material). Täck prov plattan med aluminiumfolie och låt färgningen fortsätta i rumstemperatur i 3 - 5 h eller övernattning vid 4 ° C. Periodvis övervaka färgning reaktionen genom att Visa vävnaden under dissekera Mikroskop för att undvika overstaining.
    Obs: När färgningen är komplett, en lila nyans detekteras genom ögat i antisense-probed prover under mikroskopet, men vävnaden bör inte tillåtas att bli mycket mörkt. Färgning fortsätter mycket långsamt vid 4 ° C och kan ta upp till 20-24 h.
  4. Stoppa färg reaktionen genom tvättning för 5 min i 500 µL MAB, sedan fixa vävnaden över natten i Bouins lösning.
    FÖRSIKTIGHET: Hantera den Bouins lösning i ett dragskåp; Det är frätande cancerframkallande.

9. in Situ hybridisering: dag 4 (Timing: 3-3,5 h)

  1. Förbereda minst 7 mL per prov korg av 1 x SSC med att späda 20 x SSC i DEPC-behandlad vatten. Avlägsna den Bouins lösning genom att tvätta av prov 4 till 6 gånger med 70% etanol i 1 x SSC tills vävnaden inte längre gul.
  2. Förbereda 500 µL per prov korg med 75%, 50% och 25% etanol lösningar i 1 x SSC. Tvätta proverna för 5 min i varje lösning, flyttar från högsta etanol koncentrationen till lägsta att rehydrera vävnaden. Tvätta två gånger för 5 min varje i 1 x SSC.
  3. Inkubera proverna i blekmedel lösningen (tabell 1) i 90 min på ett ljusbord i dragskåp.
    Obs: Detta steg tillåter någon pigmentering i prover eller färgning från Bouins lösning tas bort och förbättrar sonden signalen för tydlig visualisering.
  4. Tvätta av prov två gånger med 500 µL av 1 x SSC för 5 min.
  5. Flytta modet med minimal skada genom att invertera urval korgen i en bra ny 24-well platta och tvätta med 70% etanol genom mesh botten med överföring pipett. Förvaras vid-20 ° C om det behövs.
  6. För att få en översikt över de färgning mönster av flera prover som visas i figur 3, behålla modet i 70% etanol i 24 brunn-plattan och Visa med några ljusa fält Mikroskop. Att undersöka enskilda tarmar i ljusa fält Mikroskop som visas i figur 4, figur 5, och figur 6, montera modet i 100% glycerol under coverslips. Använd en plast spatel försiktigt manipulera vävnaden med minimal skada.
    Obs: Den höga viskositeten glycerol hjälper till att skydda vävnaden från att skadas av komprimering och tillåter noggrann placering av diverticula så att vävnaden kan ses optimalt vid högre förstoringar.
  7. Fånga bilder på mikroskopet använder Mikroskop bestämd bild ta till fånga mjukvaran (Tabell av material) och exportera som Tiff-bilder till en allmän bild redigerande mjukvaran. För att kvantifiera de relativa färgning skillnaderna mellan experimentella behandlingar, hämta en allmän bild analys programvara (Tabell för material). Öppna bilden inom analys programvaran och använda instruktionerna i programmet att mäta pixel intensiteten av färgningen och beräkna histogrammet tomter färgningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mätning och uppskattning av kvaliteten på de RNA-sonderna är kritiska innan färgningen. In vitro transkription effektivitet beror på mängden och kvaliteten av mallen DNA. Vi visualiseras rutinmässigt RNA sonderna på en formaldehyd gel att kontrollera renhet och mängden sond som genereras av transkription reaktionerna. Sonderna ska visas som ljusa, diskret band (figur 2). Spektrofotometrisk mätning av RNA-koncentrationen var mycket vägledande av sonden kvalitet och korrelerade väl med utseendemässigt av banden på gelen. Således det gel visualisering steget kan hoppas över om så önskas när förtrogenhet med protokollet har uppnåtts. Hursomhelst, det är viktigt att se till att produceras tillräckligt RNA av hög kvalitet, som alla efterföljande steg är beroende av robustheten av sonderna.

Styrkan i denna teknik är att underlätta bred iakttagelser om den tickande bakterieflora, inklusive närvaro eller frånvaro av bakteriearter, förändringar i överflöd av bakterier med tiden som tickande feeds och lokalisering av arter inom hela vävnaden. Viss variation i färgning beloppet och fördelningen är normal bland biologiska replikat liksom bland de 7 par av diverticula av enskilda tarmar (figur 3), därför är det bäst att färga minst fem tarmar per tillstånd att få en uppfattning av genomsnittet färgningsmönster. Den totala framgången för protokollet är bäst mätas genom att jämföra färgningen av förnuft och antisense proverna för varje villkor. Sense proverna, viktiga negativa kontroller för denna typ av analys, bör ha minimal till ingen lila färg (figur 4). Omvänt, antisense prover ska Visa robust färgning med minimal bakgrund, intensiteten som beror på överflödet av specifik bakteriell avskrifter riktade. Färgning mönstret inom vävnaden varierar också beroende på dessa parametrar. Ännu viktigare, måste det förnuft och antisense prover utvecklas för samma mängd tid för att direkt jämföra dem, så att dessa prover bör behandlas parallellt. Överexploatering av färg reaktionen kan resultera i en hög mängd bakgrund färgning, där känsla proven börjar att likna antisense (figur 5). Särskild omsorg bör tas i detta steg i protokollet att undvika overstaining, eftersom det finns inget sätt att omvända reaktionen när det inträffar.

Det är viktigt att se till att alla tarmar är helt nedsänkt i varje reagens under varje steg; en ökning av variationen över prover kan bero på ojämn exponering för reagenser. Beloppet av tid att fästingarna matas innan modet samlas också har en betydande inverkan på resultaten. Fästingar som utbildningsbordet eller endast matas för 24 h var svåra att arbeta med; modet var också mer lätt skadas och inte fläckar och en begränsning av detta tillvägagångssätt vid denna tid (figur 6). Fästingar som matas för 48-72 h var lättast att arbeta med, på grund av den större storleken av dessa tarmar jämfört med tarmar från fästingar utfodras under 24 h. tarmar från senare tid pekar också målat bättre än 24 h matad fästingar, möjligen på grund av ökningar av bakteriell belastning under de sena stadierna o f utfodring. 72-h vävnaden hade ofta en liten bakgrund av brun färgton från blod, men lila färgningen var klart synliga över färgton (figur 4). Modet är bäst vid låg förstoring (5 X eller 10 X) för att kunna visa färgning mönster över hela vävnaden med ljusa fält Mikroskop. Visa hela-mount vävnaden vid högre förstoring, såsom med en 63 X olja mål, löper risk att skada vävnaden som målet skulle trycka mot bilden och komprimera vävnaden på grund av tjockleken på proverna. Om högre upplösning imaging önskas, bör potentialen för snittning av vävnad undersökas.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk av mallen förberedelse för sonden generation. Klona 16S rRNA ospädd in en TA kloning vektor som innehåller T7 och Sp6 initiativtagare. Linjär den bygga klipper på platser en eller b för in vitro- transkription med T7 eller Sp6 arrangören för att generera känsla eller antisense sonder respektive med restriktionsenzym. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Visualisering av RNA sonden med gelelektrofores. RNA sonder (~ 700 ng) var electrophoresed på en formaldehyd agarosgel, visualiseras under UV-ljus, och avbildas med en kommersiell gel imaging system. En representativ god kvalitet, lane 1; och dålig kvalitet RNA sond, lane 2.

Figure 3
Figur 3 . En representativ översikt av hela-fäste i situ hybridisering av 48 h matad tarmar. Tarmar från fästingar matas för 48 h färgas med antisense RNA kompletterande en bevarade 16S ribosomalt RNA-sekvens visar differentiell färgning av tarmen diverticula. Skalstapeln representerar 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Representativa bilder av framgångsrika hela-fäste i situ hybridisering i Ixodes scapularis tarmar. Tarmar från fästingar matas för den angivna mängden tid var målat använder antingen sense (negativ kontroll) eller antisense RNA sonder. Antisense sonder kompletterade till en bevarade 16S ribosomalt RNA-sekvens (Universal 16S) eller en 16S RNA-sekvens specifika för en viss bakteriesläkte (som anges). Enterococcus inte avkastning robust färgning på 48 h. skala barer representera 140 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Långvarig kromogen reaktionstid leder till icke-specifik färgning. Tarmar från fästingar matas för 48 h var utforskad med en känsla RNA sond eller en antisense sond som komplement till en bevarade 16S RNA-sekvens. Vävnaden var inkuberas med alkaliskt fosfatas substratet BM lila övernattning på 4 ° C och sedan i rumstemperatur i ca 4 h innan du stoppar reaktionen. Skala staplarna representerar 140 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 . Hela-fäste i situ hybridisering använder utbildningsbordet eller 24 h matas tick tarmar. Tarmar från utbildningsbordet eller 24 h-matade fästingar var målat med känsla RNA sonder eller antisense sonder kompletterar en bevarade 16S RNA-sekvens eller en sekvens som är specifika för släktet Rickettsia. Färgning i antisense proverna är mindre robust än observerats vid senare tidpunkter och modet är också mer lätt skadas. Skala staplarna representerar 60 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Namn Slutliga koncentrationer Slutligt pH Lagring anteckningar
MEMFA 0,1 M MOPPAR - Rumstemperatur
2 mM EGTA
1 mM magnesiumsulfat
3,7% formaldehyd
PBS-Tween (PTw) 1 x PBS, 0,1% Tween-20 7.0 Rumstemperatur
0,1% Tween-20
Trietanolamin buffert 1 x PBS 7.0-8.0 Rumstemperatur
0,1 M trietanolamin
Hybridisering buffert 50% formamid - -20 ° C
5 x SSC
1 mg/mL Torula RNA
100 µg/mL heparin
1 x Denharts lösning
0,1% Tween-20
0,1% KÄKAR
10 mM EDTA
Maleinsyra buffert (MAB) 100 mM maleinsyra 7.0 Rumstemperatur
150 mM natriumklorid
Alkaliskt fosfatas (AP)-buffert 100 mM Tris 9,5 -20 ° C
50 mM magnesiumklorid
100 mM natriumklorid
0,1% Tween-20
5 mM levamisol
Blekmedel lösning 1% väteperoxid - Förbereda färska
5% formamid
0,5 x SSC

Tabell 1. Recept av lösningar används i protokollet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta är den första användningen av en hela-fäste i situ hybridisering (WMISH) teknik för att studera bakterieflora av ett leddjur vektor av patogener. Våra protokoll anpassades från en används för att studera utvecklingen i Drosophila och grodan embryon25,26. Hela-mount RNA i situ hybridisering har rutinmässigt används för att lokalisera genen avskrifter rumsligt och tidsmässigt27 och visualisering av utskrifter kan göras genom ljusa fält eller fluorescerande mikroskopi. Vi har antagit tidigare mot upptäckt av bakterieflora i tick tarmar. Det är viktigt att notera som försöker utföra hela-fäste i situ hybridisering med hela fästingar där regionen huvud togs bort så att penetration av fixativ och hybridisering lösningar inte lyckades. Protokollet beskrivs här använder dissekeras tarmar och har genomförts för att studera effekterna av särskilda tick proteiner på bakteriell kolonisation i midgut23. Information från WMISH är jämförbar med immunohistokemi men har fördelen av att inte kräva generering av protein och antikroppar mot genen eller protein av intresse. Genomisk information är tillräcklig för att generera reagenser för WMISH. Både WMISH och FISH (fluorescence in situ hybridisering) kan upptäcka genuttrycket. Men på grund av det är en enzymatisk och kromogen-baserad analys, har WMISH den fördelen att färgutveckling kan övervakas aktivt, och reaktionen är tillåtet att fortsätta tills önskad signal och känslighet uppnås. Det är fullt mottaglig för automation och enkelt skalbar till hög genomströmning format. Till skillnad från fisk och immunohistokemi krävs ingen snittning. Nackdelen med WMISH över fisken är att endast 2 olika mRNA eller gener kan behandlas samtidigt och skulle kräva att sonder märkas med olika nukleotid analoger såsom digoxigenin-UTP och fluorescein-UTP28. Med fisk, kan upp till 6 olika mRNA undersökas i en assay29. Medan båda analyser kräver jämförbar tid, kostnaden för fluorescens färgämnen som är högre än för kromogent substrat. FISH-analyser skulle också kräva fluorescens Mikroskop för bild visualisering, medan WMISH bild visualisering kan utföras med någon ljusmikroskop.

Det är viktigt att protokollet följs noga; men finns det vissa steg som kräver särskild omsorg. Dissektion av midgut från fästingen utan att skada vävnaden kräver viss fingerfärdighet. Kan det vara klokt att samla extra fästingar för att öva dissektionerna och få kunskaper. På grund av heterogenitet färgning i de olika diverticula av enskilda tarmar (figur 3), är det viktigt att undersöka alla diverticula varje Gut att härleda avgörande bevis för bakteriell överflöd. Det är också viktigt att bearbeta flera tarmar (minst 5) för varje experimentella villkor för att erhålla avgörande information på närvaro, rumslig fördelning och överflöd av särskilda bakterier inom olika diverticula. Produktion av högkvalitativa RNA sonder är också kritisk till effektiv vävnad färgning. Det är viktigt att också bekräfta sekvensen av mallen sonden i kloning vektorn att säkerställa att antisense och känsla sonder genereras på lämpligt sätt. En produktiv in vitro- transkription reaktion kräver tillräcklig mall DNA; minst 100 ng kan användas, men 0,5 - 1 µg rekommenderas för optimal sonden generation.

Användning av provet korgar och 24 brunnar i detta protokoll undviker direkt manipulation av vävnad vid varje tvätt steg, vilket minimerar skador under processen färgning. Men proverna fortfarande ibland förloras eller skadas; tarmar från utbildningsbordet eller 24h-matade fästingar, är särskilt svåra att se och lätt att förlora när du överför från provet korgarna till en långsiktig lagring behållare. Extra försiktighet bör iakttas vid hantering av dessa prover. På grund av denna begränsning, har vi främst använt 48 och 72 h matad tick tarmar. Förekomsten av stora mängder blodmjöl i tarmar vid dessa tidpunkter (längre än 72 h) stör färgning och visualisering på grund av icke-specifika bakgrund från blod-måltiden och presenterar också en begränsning av denna teknik. Det är troligt att användning av fluorescently-märkta sonder kan kringgå det här problemet.

Den viktigaste aspekten av färgningsproceduren är att fastställa balansen mellan robust färgning och låg bakgrund signal. Tidpunkten för perfekt färgutveckling kan variera beroende på de experimentella förhållandena. Således är det bäst att utföra färg reaktionen vid rumstemperatur och övervaka färgutveckling ungefär varje 30 min. Reaktionen kan också ställas in att fortsätta över natten vid 4 ° C till långsam färgutveckling. Det är dock ytterst kritisk inte att låta denna reaktion fortsätta länge. Färgning reaktionen kan vara svårt att övervaka av ögat, så proven bör undersökas i Mikroskop för dissektion. En lila nyans ska synas på prover utforskad med antisense-RNA, medan proverna utforskad med känsla RNA bör behålla minimal färg. Om känsla RNA-probed proverna fläcken ljust, bör felsökningssteg börja med att minska inkubationstiden med BM lila och öka den blockerande tid. Ibland kan känsla sonder orsaka onormalt hög bakgrund jämfört med antisense sonderna; i dessa fall kan olika regioner av genen behöva övervägas för att generera RNA sonder. DNA-sekvenser som inte representeras i ett givet prov kan också betraktas som mallar generera negativa kontrollen sonder. Exempelvis kan en DNA mall kodning en region av grönt fluorescerande protein, inte representerade i tick genomet eller dess mikrobiomet, utnyttjas.

En begränsning med denna teknik är att analysen är till stor del kvalitativa; bild analys programvara (Tabell för material) kan dock användas för att mäta mängden färgning signal i varje prov. Detta skulle möjliggöra en semikvantitativ jämförelse av överflödet av olika bakteriearter under olika experimentella förhållanden. Även detta är ett tidskrävande protokoll som tar 3-4 dagar att genomföra, är det inte mödosam; varje dag hands-on tid är endast ca 3-5 h i genomsnitt. Förmågan att bearbeta många prover parallellt med användning av provet korgar och hållare kan dock för hög genomströmning analys. Ytterligare, denna process kan automatiseras med hjälp av kommersiellt tillgängliga instrument (tabell för material) om detta protokoll förväntas vara en nödvändig och rutinmässig komponent i forskningslaboratoriet med hjälp av kommersiellt tillgängliga Automation-kompatibla plattformar (Tabell för material) för att ytterligare minska hands-on tid.

Protokollet beskrivs använder sig av digoxygenin-märkta sonder som tillåter produktion av en kolorimetrisk signal som kan avbildas med ljusa fält mikroskopi. Medan vi har utnyttjat ett kromogent substrat för att upptäcka hybridiserade RNA sonder specifika för enskilda mål, det är också möjligt att upptäcka flera mål samtidigt genom märkning sonder med olika nukleotid analoger, såsom digoxigenin-UTP och fluorescein-UTP och olika kromogent substrat30. Vävnadsproverna kan sedan inkuberas sekventiellt med alkaliskt fosfatas-kopplade antikroppar mot digoxigenin och fluorescein, med olika kromogen reaktioner för de två stegen. Denna teknik kan också anpassas för fluorescently-märkt sonder, som kan underlätta högre upplösning imaging använder konfokalmikroskopi31 och ge möjlighet att använda flera sonder i olika färger samtidigt. Denna teknik kan uttryckligen endast bedöma några mikroorganismer i taget i ett prov. Dock kan flera prover bedömas i hög genomströmning analyser att åtgärda flera mikroorganismer som kan vara representerad i tick bakterieflora.

Slutligen, denna teknik är inte begränsad till utredningen av samspelet mellan fästingar och deras associerade bakterieflora. Sonder komplement till någon gen av intresse inom tick genomet kan genereras och används för att undersöka överflöd och lokalisering av specifika gener i olika vävnader. Spottkörtlarna av fästingen kan också bearbetas och analyseras på samma sätt till tarmen. Sammantaget har denna teknik breda möjligheter för anpassning till studier på dynamiken i mikrobiella samhällen inom andra leddjur smittspridarens sevärdheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Mustafa Khokha, Yale University, för att ge hans laboratorium resursanvändning. Vi är tacksamma att Mr Ming Jie Wu för utmärkt teknisk assistans. EF är en HHMI utredare. Detta arbete stöds av en gåva från John Monsky och Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software National Institutes of Health ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).  Intavis, Biolane HT1.16v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Tags

Genetik fråga 136 leddjur fästing gut bakterieflora avskrift hela-mount in situ hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., … More

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter