Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Summary

Die riesigen Ciliate Stentor Coeruleus, ist ein ausgezeichnetes System zu studieren Regeneration und Wundheilung. Wir stellen Verfahren zur Einrichtung Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, Regenerierung durch Schneiden Zellen induzieren, chemisch induziert die Regeneration von Membranellar Band und mündliche Apparatur, Bildverarbeitung und Analyse der Zelle Regeneration.

Abstract

Zellen müssen in der Lage sein, ihre Teile wieder aus externen Störungen zu regenerieren. Die einzelligen ciliate Stentor Coeruleus ist eine ausgezeichnete Modellorganismus Wundheilung zu studieren und anschließende Zellregeneration. Das Stentor Genom wurde kürzlich, zusammen mit modernen molekularbiologischen Methoden, wie z. B. RNAi. Diese Tools machen es möglich, einzelne Zelle Regeneration auf molekularer Ebene zu untersuchen. Der erste Abschnitt des Protokolls umfasst Aufbau Stentor Zellkulturen aus einzelnen Zellen oder zellfragmente, zusammen mit allgemeinen Leitlinien für die Aufrechterhaltung der Stentor Kulturen. Kultivierung von Stentor in großen Mengen ermöglicht die Verwendung von wertvollen Tools wie Biochemie, Sequenzierung und Massenspektrometrie. Nachfolgende Abschnitten des Protokolls decken verschiedene Ansätze zur Regeneration bei Stentorinduzieren. Zellen mit einer glasnadel manuell schneiden ermöglicht die Regeneration der großen Zelle teilen, zu studieren, während Behandlung von Zellen mit Saccharose oder Harnstoff ermöglicht die Regeneration der spezifischen Strukturen befindet sich am vorderen Ende der Zelle zu studieren. Ein Verfahren zur Bildgebung regenerierende Einzelzellen sowie eine Rubrik für die Inszenierung und Analyse der Dynamik der Regeneration zur Verfügung gestellt. Der gesamte Prozess der Regeneration ist in drei Stufen unterteilt. Durch die Visualisierung der Dynamik der Entwicklung einer Bevölkerung der Zellen durch die Stadien, zeigt sich die Heterogenität in Regeneration Timing.

Introduction

Zellen sind nicht einfache Taschen von Enzymen, sondern eher hochkomplexen Maschinen, deren Komponenten sind sorgfältig auf die richtige Größe skaliert und in klar definierten Positionen angeordnet. Die Morphogenese einzelner Zellen stellt ein Schlüsselprozess in Zell- und Entwicklungsbiologie, aber seine molekulare Mechanismus ist unbekannt^1,2. Während einige kultivierten Zellen Blobs ähneln, können einzellige Organismen extrem Architekturen, veranschaulicht durch die komplexe kortikale Muster gesehen in Ciliaten^3,4erschwert.

Vielleicht ist das extremste Beispiel einer hochstrukturierten Zelle Stentor Coeruleus, eine riesige Heterotrichous ciliate im Zusammenhang mit weitläufig Tetrahymena und Paramecium. Stentor ist 1 mm lang und ist mit mehr als 100 Längsstreifen der blaue Pigment abwechselnd mit Reihen von Zilien organisiert durch parallele Stapel von Mikrotubuli-Bänder, die die Länge der gesamten Zelle ausgeführt. Die Zelle ist (Abbildung 1), Trompetenförmige mit einer Membranellar-Band und eine mündliche Vorrichtung (OA) an seinem vorderen Ende und einem Holdfast, die das Substrat an seinem hinteren Ende die Zelle beimisst. Neben der klaren anterior-posterioren Polarität zeigt die Zelle auch eine unverwechselbare chiralen Musterung so dass Abstand zwischen ciliary Reihen allmählich steigt im Uhrzeigersinn. Dies führt zu einer Diskontinuität, wo die schmalste Zeile die breiteste Zeile und dieser Region von der Zelloberfläche erfüllt, bekannt als der Ort der Streifen Kontrast, kann induzieren die Bildung des zweiten Satzes der vorderen Ende Strukturen, wenn auf eine andere Zelle⁵, gepfropft so dass es formal gleichwertig Spemann Veranstalter. Somit haben alle wesentlichen Prozesse der Entwicklungsbiologie ihre Analoga in Stentor: Axiation, Musterbildung und Induktion. In einem Embryo diese Prozesse werden angetrieben durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Zellen, sondern in Stentor, sie müssen durch Schicksal Unterschiede zwischen verschiedenen Regionen innerhalb einer einzelnen Zelle getrieben werden. Was die Unterschiede zwischen den Regionen innerhalb von Stentor definiert, ist ein Rätsel.

Wenn ein Teil des Stentor abgeschnitten wird, kann das fehlende Stück der Zelle regenerieren, um eine normale Zelle in einer Angelegenheit von Stunden zu liefern. Wenn eine Zelle halbieren oder sogar in viel kleinere Stücke schneiden jedes Stück in eine Normal aussehende, aber kleinere Zelle reorganisiert und stellt richtige Proportionalität zwischen Zelle Teile^6,7. Auch winzige Fragmente, 1/64^th die Größe der ursprünglichen Zelle, sind in der Lage, in eine kleine, aber normal proportionierten Zelle regenerieren und wachsen dann zu voller Größe⁶. Stentor stellt somit eine einzigartige Gelegenheit zu untersuchen die Mechanismen der Organelle Größe skalieren und Zelle wachstumsregulation mit chirurgischen Methoden, die in der Regel auf der Ebene der Gewebe oder ganze Organismen angewendet werden.

Eine der Eigenschaften von Stentor , die es ermöglicht, aus einer breiten Palette von chirurgischen Eingriffen zu regenerieren ist, dass es einen einzigen Kugelgrafit Macronucleus (Abbildung 1) mit ca. 50.000 Kopien des gesamten Genoms⁸enthält. Solange eine Zelle Fragment mindestens ein macronuclear Knoten enthält, hat es die Fähigkeit, vollständig zu regenerieren. Eine weitere Eigenschaft, die zugrunde liegenden StentorRegenerationsfähigkeit ist seine ungeheure Wundheilung Fähigkeit. Obwohl viele Zelltypen, die Heilung ihrer Wunden⁹sind, ist Stentor in der Lage, eine außergewöhnliche Auswahl an physischen Störungen beheben. Ein Beispiel für Stentor Erholung von eine drastische Störung, zusammen mit den Methoden zur Visualisierung von zytoplasmatischen Strömung in Stentor¹⁰ wurden bisher gemeldet. Diese Methoden ermöglichen der Studie wie verletzte und die anschließende Regeneration beeinflussen den körperlichen Zustand des Zytoplasmas.

Stentorenorme Größe, außergewöhnliche Regenerationsfähigkeit und die Tatsache, dass es viele der Entwicklungsbiologie Phänomene gesehen bei mehrzelligen Embryos (z. B. Veranstalter, Axiation und Musterung) manifestiert lockte viele Entwicklungs Biologen während die Wende des letzten Jahrhunderts, darunter Thomas Hunt Morgan⁷. Während der 50er und 60er Jahren gezeigt mikrochirurgische Ansätze eine überraschende Auswahl an regenerativen und morphogenetischen Prozesse in dieser einzelligen Organismus¹¹. Jedoch hat Stentor als Modellsystem Molekularbiologie erst vor kurzem entwickelt worden. In den vergangenen Jahren das Genom des Stentor wurde sequenziert und⁸montiert, und die Methode, die Genexpression RNAi durch die Fütterung mit Radardetektoren war entwickelten¹².

Vor kurzem war einer der Gründe, dass Stentor in ein Modellorganismus für die moderne Molekularbiologie nur entwickelt wurde die Schwierigkeit der wachsenden großen Kulturen aufgrund seiner langen Zellzyklus (3-5 Tage). Moderne genomische und Proteomik Methoden erfordern jedoch weniger Material als früher und das Volumen von einer Einzelzelle Stentor für diese Methoden reicht auch ohne Rückgriff auf Gromer Methoden, die entwickelt wurden, für die Analyse der einzelnen Zellen, die viel kleiner sind als Stentor. Abschnitt 1 des Protokolls beschreibt das Verfahren für den Aufbau einer großen Kultur aus einer einzigen Zelle Stentor . Der gleiche Ansatz lässt sich eine große Kultur aus einer Zelle Fragment erhalten durch Schneiden einer Zelle zu etablieren. Abschnitt 1 enthält auch die Richtlinien für die Aufrechterhaltung der gesunder Stentor Kulturen über lange Zeiträume hinweg. Abschnitt 2 des Protokolls bietet die Methodik zur Induktion Zellregeneration durch Schneiden die Zellen manuell mit einer glasnadel. Abschnitt 3 des Protokolls widmet sich zwei Methoden der Induktion der Regeneration der spezifischen Zellstrukturen (Membranellar Band und Oral Apparate): Behandlung der Zellen mit Saccharose oder Harnstoff führt bis zum Vergießen von diesen Strukturen, gefolgt von ihrer Regeneration. Abschnitt 4 des Protokolls beschreibt eine Methode für die Darstellung der einzelnen regenerierenden Zellen über lange Zeiträume hinweg. 4. Abschnitt endet mit der Beschreibung der Phasen der Regeneration und Tipps für die Analyse der Dynamik der Regeneration.

Protocol

(1) Kultivierung Stentor und Stentor Kulturen aus einzelnen Zellen oder Zellfragmente etablieren

1. Bereiten Sie Chlamydomonas Reinhardtii Kultur als Nahrung für Stentorverwendet werden.
   1. Chlamydomonas Reinhardtii Zellen von einem kommerziellen Anbieter (Table of Materials) erhalten.
   2. Etablieren Sie eine 500 mL-Flüssigkultur von Chlamydomonas Reinhardtii in handelsüblichen Wasserhahn Medien mit steriler Technik¹³.
   3. Halten Sie die Chlamydomonas Kultur unter einer Lampe in einer Konzentration in der Nähe von Sättigung (bei O.D von etwa 1) durch das Verdünnen es mit TAP Medien zweimal in der Woche.
      Hinweis: Die Chlamydomonas Kultur kann auf einem Boston-Shaker angebaut werden.
   4. Regelmäßig überprüfen Sie, ob die Chlamydomonas Kultur gesund ist durch einen Rückgang der Kultur auf einer Folie platzieren, mit einem Deckglas abdecken und Kontrolle unter dem Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.
      Hinweis: Verwenden Sie die Kultur nicht für Stentor zu füttern, wenn es mit Bakterien verunreinigt ist oder Chlamydomonas Zellen in Clustern zusammengefasst sind. Wenn eines dieser Probleme auftritt, starten Sie eine neue Kultur der Chlamydomonas .
2. Erhalten Sie Stentor Coeruleus Zellen von einem kommerziellen Anbieter (Table of Materials).
3. Wenn Stentor Zellen aus ihrem natürlichen Lebensraum benötigt werden, sammeln sie aus einem Teich, See oder Fluss¹¹.
   1. Um Stentor aus einem Teich, See oder Fluss zu sammeln, finden Sie einen Bereich mit Vegetation, wo das Wasser relativ ruhigen, schattigen und klar ist.
      Hinweis: Es gibt eine höhere Wahrscheinlichkeit des Findens Stentor an den Standorten wo Wasserlinse wächst.
   2. Sammeln Sie mindestens 2 L Wasser in einem Behälter, der leicht aus Gießen ist.
   3. Nach Detritus und Feinstaub an der Unterseite des Behälters beglichen sind, füllen Sie sanft ein paar kleinere Behälter, Stentor, warten ein paar Sekunden nach jeder Kollektion für den Detritus sich in den großen Behälter zu prüfen.
   4. Sobald die Entnahme von Proben an einem Ort abgeschlossen ist, gehen an eine neue Position, die mindestens 10 m entfernt ist und die Entnahme von Proben es wiederholen.
      Hinweis: Nicht jeder Teich hat Stentor Einwohner, so dass mehrere Teiche entnommen werden können.
   5. Mit den Proben ins Labor zurück und das Wasser aus den Behältern in einzelnen Petrischalen übertragen.
   6. Suchen Sie in jede Petrischale nach Stentor unter einem Stereomikroskop mit Schräglicht bei 5 X Vergrößerung. Stentor Einzelzellen mit einer 1-mL-Pipette in einen Brunnen aus einer Glasplatte vor Ort mit mindestens 100 µL kommerziell erhältliche pasteurisierte Quellwasser (PSW) zu übertragen.
      Hinweis: Stentor Zellen haben eine trompetenartige Form, wenn sie auf ein Substrat (Abbildung 1) angeschlossen sind. Schwimmen Stentor Zellen sind weniger als die Zellen auf ein Substrat (Video 1) erweiterte.
   7. Waschen von Stentor im PSW mindestens 3 X. Führen Sie Waschungen durch Entfernen von etwa 90 % des Wassers aus dem Brunnen unter Beibehaltung Stentor Zellen im Brunnen, gefolgt durch Zugabe von 500 µL PSW in den Brunnen.
      Hinweis: Vor dem Umgang mit Stentor mit Pipetten mit Pipettenspitzen von 10 µL oder kleiner, schneiden Sie ca. 0,5 mm vom Ende der Pipettenspitze mit einer Schere zu verwunden die Zellen durch Scherkräfte, die generiert werden, während eine große Zelle durchläuft zu klein für ein Tipp-Op tung.
4. Bereiten Sie Chlamydomonas vor jeder Fütterung von Stentor vor.
   1. Übertragen Sie 1 mL der Chlamydomonas Kultur vorbereitet wie in Schritt 1.1 zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. 2.095 x g für 3 min zentrifugieren.
   2. Den überstand zu entfernen und das Pellet in 1 mL der PSW Nukleinsäuretablette. Zentrifugieren bei 2.095 x g für 3 min. Überstands entfernen und das Pellet in 500 µL PSW Aufschwemmen.
      Hinweis: Damit gewaschen und konzentrierte Chlamydomonas wird als "vorbereitet Chlamydomonas"in den folgenden Schritten bezeichnet werden. Tippen Sie auf Medien schadet Stentor, damit waschen Chlamydomonas vor Stentor Fütterung wichtig.
5. Gegebenenfalls eine klonale Stentor -Kultur ist die Kultur aus einer einzelnen Zelle Stentor oder ein Fragment der Zelle beginnen.
   1. Da Stentor Einzelzellen nicht gut im PSW wachsen, bereiten Sie konditionierte Medien durch Filter Sterilisation 500 µL Medien aus einer vorhandenen, gesunden Stentor Kultur vor.
   2. Übertragen Sie 500 µL konditionierten Medien auf einer der Brunnen aus einer Glasplatte vor Ort.
   3. Ein Stentor in den Brunnen der Glasplatte vor Ort mit konditionierten Medien zu übertragen. Verwenden Sie als wenig Mittel wie möglich um die Überweisung zu tätigen.
   4. Füttern Sie jedes Stentor 5 µL bereit Chlamydomonas alle 48 h. Bei Stentor teilen, die Anzahl der Zellen in den Brunnen und 5 µL bereit Chlamydomonas pro Zelle hinzufügen.
   5. Halten Sie Stentor an einem schattigen Ort, da die Zellen (z. B. in durchsichtigen Kunststoff-Boxen mit Küchenpapier bedeckt) lichtempfindlich sind.
   6. Austausch von Stentor Medium im Brunnen mit frischem konditionierten Medium alle 96 h.
      1. Bereiten Sie frische konditionierte Medien wie in Schritt 1.5.1.
      2. Alle Stentor Zellen von der Unterseite des Brunnens zu lösen, indem sanft pipettieren die Flüssigkeit nach oben und unten in den Brunnen zu machen.
      3. Aspirieren Sie sorgfältig die Flüssigkeit aus dem nun mit einer 1-mL-Pipette, sicherstellen, dass alle Zellen in den Brunnen bleiben. Die gut 500 µL frisch konditionierten Medien hinzufügen.
   7. Überschreitet die Anzahl der Zellen in den gut 20, bewegen Sie die Zellen in einen größeren Behälter, z. B. ein breit-Mund Glas.
      1. 20 mL PSW in einem Autoklaven breit-Mund Glas hinzugeben.
         Hinweis: Autoklavieren von Glaswaren für Stentor sind auswechselbar, mit vorsichtig waschen und spülen.
      2. Die Medien pipette vorsichtig rauf und runter in den Brunnen, die Zellen von der Unterseite des Brunnens zu lösen. Sammeln Sie alle Stentor Zellen mit einer 1 mL-Pipette-Spitze und übertragen Sie sanft auf das Glas.
   8. Ziehen Sie nicht den Deckel auf die Gläser mit Stentor Kulturen ausreichend Zugriff auf Luft.
   9. Fügen Sie PSW um Stentor Dichte bei etwa 20 Zellen/mL zu halten das Glas alle 48 h hinzu. Schätzen Sie die Dichte der Zellen mit dem Auge.
      Hinweis: Alternativ können Sie eine 1-mL-Pipette in die Blase Luft in das Glas machen Zellen trennen von den Wänden, Pipette, 1 mL der Kultur, und die Anzahl der Zellen in der Pipettenspitze.
   10. Alle 48 h bereit Feed Chlamydomonas , Stentor Kulturen in Gläsern (siehe Schritt 1.4). Beginnen Sie mit der Fütterung der Kultur mit 200 µL bereit Chlamydomonas. Mit zunehmender Lautstärke der Kultur schrittweise Erhöhung der Menge der vorbereiteten Chlamydomonas für Fütterung bis zu 1 mL verwendet.
   11. Wenn das kulturvolumen erreicht etwa 90 % der Kapazität das Glas, die Kultur in einen größeren Behälter zu übertragen.
       1. Pipette die Kultur in das Glas oben und unten mit einer 1-mL-Pipette, Stentor aus dem Glas zu lösen.
       2. Gießen Sie den gesamten Inhalt des Glases in einem 2-Tassen-Glasbehälter.
       3. Spülen Sie das Glas mit ca. 25 mL PSW in der 2-Tassen Glasbehälter, die restlichen Stentorzu sammeln.
6. Pflegen Sie gesunde Kulturen in 2 Tassen Glasbehältern.
   1. Stentor Kulturen 2 mL der vorbereiteten Chlamydomonas pro 100 mL der Kultur alle 4-5 Tage zu ernähren. Fügen Sie PSW auf den Glascontainer alle 4-5 Tage Stentor Dichte bei etwa 20 Zellen/mL zu halten.
      Hinweis: 450 mL ist die maximale Lautstärke, die ein Container "2 Tassen" enthält.
   2. Inspizieren Sie einmal in der Woche, die Kulturen unter ein 5 X Mikroskop, Rädertierchen, Pilze und andere Wachstum zu sezieren. Um die Gesundheit der Kultur zu verlängern, entfernen Sie kontaminierende Mikroorganismen zusammen mit ungewöhnlich geformten und farblos Stentor Zellen mit einer 1 mL-Pipette.
   3. Bei der Glasbehälter ca. 90 % voll ist, teilen Sie die Kultur.
      1. Fügen Sie 25 mL des PSW auf den Glascontainer. Verwenden Sie eine 25 mL Pipette, Pipette rauf und runter, um Stentor aus dem Glas zu lösen. Etwa 50 % der Kultur Einzug in eine neue 2-Tassen-Glasbehälter.
      2. 25 mL der PSW für beide Kulturen und weiter pflegen die beiden Kulturen, wie beschrieben in diesem Abschnitt des Protokolls.
         Hinweis: Da Stentor Zellen empfindlich auf hohe Temperaturen sind, behalten Sie die Temperatur bei 25 ° C oder niedriger in den Raum, wo die Kulturen gehalten werden. Alternativ können die Kulturen im Brutschrank gehalten werden. Siehe Tabelle 1 für die Problembehandlung von Stentor zu züchten.

(2) Induktion Regeneration durch Schneiden Stentor Zellen

1. Ein Nadel-Abzieher verwenden, um mehrere Nadeln von Kapillaren, die mit dem Programm wie folgt vorzunehmen: Hitze - 735, Pull - 100, - 110, Zeit - Geschwindigkeit 150, Druck - 400.
2. Bereiten Sie eine 4 % Methylcellulose-Lösung in 50 mL PSW.
   1. Fügen Sie 1 g Methylcellulose (Viskosität: 1500 cP), 50 mL von PSW.
   2. Inkubieren Sie bei 4 ° C für mindestens 8 h, die Auflösung der Methylcellulose zu erleichtern.
   3. 4 % Methylcellulose Lösung bei Zimmertemperatur aufbewahren.
3. Bereiten Sie eine Glasplatte vor Ort für die Speicherung der zellfragmente nach der Durchführung der Kürzungen.
   1. Filter zu sterilisieren Medien aus einer gesunden Kultur, 500 mL pro Glasplatte vor Ort erforderlich.
   2. 500 mL sterilisiert Medien aller benötigten Kavitäten zu übertragen.
4. Sammeln Sie eine gesunde Stentor (mit einer definierten Trompetenform, leuchtende blau-grüne Farbe und keine großen Vakuolen) in einem 2 µL Tröpfchen und legen Sie es auf einem Deckglas oder Folie. Fügen Sie 2 µL 4 % Methylcellulose (Abbildung 2). Lassen Sie Stentor vor dem Schneiden (Video 2) verlangsamen.
5. Halten Sie die glasnadel als parallel zur Schnittfläche möglichst zu verhindern, dass die Nadel bricht.
6. Verwenden eine Stereo-Mikroskop sezieren, suchen Sie die Spitze der glasnadel und verschieben sie näher an die Zelle (Abbildung 3A). Beobachten Sie die Stentor Vertrag beim Kontakt mit der Nadel (Abb. 3 b und C).
   Hinweis: Wenn die Zelle in eine Orientierung, die Macht am vordere Ende von das hintere Ende schwer zu trennen ist, drehen Sie ihn sehr vorsichtig mit der Seite der Nadel.
7. Drücken Sie vorsichtig auf die vertraglich vereinbarten Stentor mit der Seite der Glas-Nadel, die Zelle in zwei Schneiden(Abbildung 3D und E, Video 3). Verschieben Sie die beiden Fragmente auseinander, um sicherzustellen, dass keine zytoplasmatischen zwischen ihnen Verbindung, Fragment Fusion zu vermeiden (Abbildung 3F).
8. Überprüfen Sie, ob beide Fragmente mindestens ein macronuclear Knoten haben durch die Fragmente unter dem sezierenden Mikroskop mit Schrägbeleuchtung untersuchen.
   Hinweis: Mindestens ein macronuclear Knoten ist unerlässlich für das Überleben der Zelle. Die Zelle kann ihre Häutchen (transparente Hülle) zusammen mit dem blau-grünen Pigment während oder nach dem Schnitt vergossen. In den meisten Fällen wird dadurch nicht berührt, das langfristige Überleben der Zelle.
9. Verschieben Sie die Fragmente in Brunnen aus einer Glasplatte vor Ort in Schritt 2.3 vorbereitet.
10. Schneiden Sie mehrere Zellen, weil ein Teil der ausgeschnittenen Zellen nicht regeneriert werden.
11. Wenn mehrere Einschnitte in einer Sitzung durchführen, ersetzen Sie die glasnadel, wenn es stark beschichtet wird mit Stentor Rückstände oder wenn die Spitze gebrochen ist. Alternativ, reinigen Sie die Nadel es sanft auf einem Stück Silizium Abstandhalter.
    Hinweis: Glas Nadeln können mehrere Zelle schneiden Sitzungen verwendet werden.
12. Halten Sie die Glasplatte vor Ort mit zellfragmente in eine Feuchte Kammer.
13. Fahren Sie mit Abschnitt 4 des Protokolls Einzelheiten zur Bildgebung und Ergebnisauswertung Stentor Regeneration.

(3) induzieren Regeneration von Membranellar Band und mündliche Apparat von Saccharose oder Harnstoff-Behandlung

1. Membranellar Band und Oral Apparat Entfernung mit Saccharose
   1. Bereiten Sie eine 25 % ige Lösung von Saccharose in PSW.
   2. Fügen Sie 500 µL 25 % Saccharose in PSW zu einem Microcentrifuge Schlauch mit einem Snap-Cap.
   3. Bereiten Sie 3 Mikrozentrifugenröhrchen mit Snap Caps mit 1 mL der PSW in jedem Röhrchen zum Waschen der Zellen nach der Saccharose Behandlung vor.
   4. Sammeln Sie 30-60 Stentor Zellen in 1 mL ihrer Kultur Medien zu einem separaten Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette (Abbildung 4, Pfeil A).
   5. Sammeln Sie alle Zellen aus der Tube in 125 µL Endvolumen mit einer 200 µL Pipette in ein einziges Unentschieden. Übertragen Sie sie auf das Rohr mit 500 µL 25 % Saccharose (vorbereitet in Schritt 3.1.2) um 625 µL 20 % Saccharoselösung (Abbildung 4, Pfeil B) zu erhalten. Starten Sie eine Stoppuhr.
   6. Inkubieren Sie Stentor in diesem 20 % Saccharoselösung und Flick-Spin Microcentrifuge Schlauch im Rack für 1 min.
   7. Sammeln Sie alle Zellen in einem einzigen Remis (passen Sie die Pipette zu 200 µL max. Kapazität für einfacher Sammlung).
   8. Halten Sie die Zellen in der PIPETTENSPITZE, bis die Stoppuhr 2 min von Saccharose Behandlung zeigt.
   9. Werfen Sie Stentor in eines der Mikrozentrifugenröhrchen in Schritt 3.1.3 (Abbildung 4, Pfeil C) vorbereitet. Flick-Spin das Rohr im Rack.
   10. Waschen Sie die Zellen, die zwei Mal, einmal in jedem der beiden verbleibenden Mikrozentrifugenröhrchen mit PSW im Schritt 3.1.3 (Abbildung 4, Pfeile, D und E) vorbereitet.
       Hinweis: Single Draw Zelle Sammlung Technik ist nicht wichtig zwischen den Wäschen.
   11. Fahren Sie mit Abschnitt 4 des Protokolls Einzelheiten zur Bildgebung und Interpretation von Stentor Regeneration Dynamik (Abbildung 4, Pfeile, F und G).
2. Membranellar Band und Oral Apparat Entfernung mit Harnstoff
   1. Bereiten Sie eine Lösung von 4 % Harnstoff im PSW.
   2. Fügen Sie 300 µL 4 % Harnstoff in PSW zu einem Microcentrifuge Schlauch mit einem Snap-Cap.
   3. Bereiten Sie 3 Mikrozentrifugenröhrchen mit Snap Caps, enthält 1 mL der PSW in jedem Röhrchen zum Waschen der Zellen nach Harnstoff-Behandlung.
   4. Sammeln Sie 30-60 Stentor Zellen in 1 mL ihrer Kultur Medien zu einem separaten Microcentrifuge Schlauch mit einer 1-mL-Pipette (Abbildung 4, Pfeil A).
   5. Sammeln Sie alle Zellen aus der Tube in 300 µL Endvolumen mit einer 1-mL-Pipette in ein einziges Unentschieden. Übertragen Sie sie auf das Rohr mit 300 µL 4 % Harnstoff (vorbereitet in Schritt 3.2.2) um 600 µL 2 % Harnstofflösung (Abbildung 4, Pfeil B) zu erhalten. Starten Sie eine Stoppuhr.
   6. Inkubieren Sie Stentor in dieser 2 % Harnstofflösung und Flick-Spin Microcentrifuge Schlauch im Rack für 1 min.
   7. Sammeln Sie alle Zellen in einem einzigen Remis.
   8. Halten Sie die Zellen in der PIPETTENSPITZE, bis die Stoppuhr 2 min von Harnstoff-Behandlung zeigt.
   9. Werfen Sie Stentor in eines der Mikrozentrifugenröhrchen in Schritt 3.2.3 (Abbildung 4, Pfeil C) vorbereitet. Flick-Spin das Rohr im Rack.
   10. Waschen Sie die Zellen, die zwei Mal, einmal in jedem der beiden verbleibenden Mikrozentrifugenröhrchen mit PSW im Schritt 3.2.3 (Abbildung 4, Pfeile, D und E) vorbereitet.
       Hinweis: Single Draw Zelle Sammlung Technik ist nicht wichtig zwischen den Wäschen.
   11. Fahren Sie mit Abschnitt 4 des Protokolls Einzelheiten zur Bildgebung und Interpretation von Stentor Regeneration Dynamik (Abbildung 4, Pfeile, F und G).

4. Bildgebung und Zellregeneration zu analysieren

1. Wenn mit einem aufrechten Mikroskop verwenden die hängenden Tropfen Methode Bild Regeneration einzelner Zellen.
   1. Setzen Sie 100 µL der PSW in einen Brunnen aus einer Glasplatte vor Ort.
   2. 1 Stentor Zelle in 4 µL Nährmedien (die Medien, die sie in sind) zu isolieren, mit 10 oder 20 µL pipette. Hinterlegen Sie die Tropfen in der Mitte ein 22 x 22 mm² Deckglas (Abbildung 5).
      Hinweis: Wenn die Zellen, die 1) fehlerhaft sind (abnorm geformte oder stark vakuolisierten) oder (2) noch Membranellar Bands oder mündliche Apparate (für chemische Behandlung Experimente), verwenden Sie nicht für die Bildgebung.
   3. Arrangieren Sie 4 weitere Tröpfchen von Stentor in den Kultur-Medien rund um die letzten Tropfen, wobei genügend Platz zwischen den Tropfen.
   4. Drehen Sie das Deckglas mit Tröpfchen und legen Sie sie vorsichtig über dem Brunnen der Glasplatte vor Ort die PSW in Schritt 4.1 hinzugefügt wurde.
   5. Hinweis: PSW im Brunnen wird die Verdunstung der Tröpfchen (Abbildung 5) minimieren.
   6. Bereiten Sie die verbleibenden Zellen indem Sie die folgenden Schritte 4.1.1 - 4.1.4 Bildgebung vor.
   7. Bild der regenerierenden Zellen unter dem Mikroskop mit der gewünschten zeitlichen Auflösung. Alternativ die Regeneration mit einem sezierenden Stereo-Mikroskop zu beobachten.
      Hinweis: Regeneration beginnt sofort nach Zelle schneiden oder Behandlung mit Saccharose oder Harnstoff. Sichtbare neuen orale Strukturen bilden jedoch ca. 3 Stunden nach dem Beginn der Regeneration.
2. Für jeden Zeitpunkt Zuweisen eines der drei Stadien der Regeneration der Zellen. Vergleichen Sie dazu, jede Zelle auf die repräsentative Bilder illustrieren die Etappen (Abbildung 4 und Abbildung 6).
   1. Die Zellen, die nicht über eine Membranellar Band noch (Abb. 6A) weisen Sie Stufe 1 zu.
   2. Die Zellen mit einem Membranellar Band Stage 2 zuweisen.
      Hinweis: Eine Membranellar Band erscheint 3 bis 6 h nach der Behandlung (Abb. 4, Abb. 6 b). Am Ende dieser Phase erscheint eine zusätzliche Krümmung des hinteren Endes der Membranellar Band kurz vor einer mündlichen Primordium erscheint.
   3. Die Zellen mit einer mündlichen Primordium Stage 3 zuweisen.
      Hinweis: Eine mündliche Primordium ist eine Einstülpung erscheinen 6-8 h nach der Behandlung am hinteren Ende des Membranellar Bandes (Abb. 4, Abb. 6 und 6 D). Regeneration ist abgeschlossen, wenn die Zellen verfügen über eine Membranellar Band an ihrem vorderen Ende und die charakteristischen Trompetenform Zelle (Abb. 4, Abb. 6E). Die meisten Stentor Zellen sind innerhalb von 8-9 h seit dem Start der Regeneration vollständig regeneriert.
3. Zeichnen Sie den Prozentsatz der Zellen in jeder der Phasen Regeneration für jeden Zeitpunkt in Form von einem gestapelten Boxplot (Abbildung 7).
   Hinweis: Diese Art von Handlung ermöglicht die Visualisierung der Regeneration Dynamik in einer Bevölkerung der Zellen.

Representative Results

Stentor Kulturen wurden zuverlässig eingerichtet und gepflegt von Einzelzellen oder zellfragmente mit Abschnitt 1 des Protokolls. Video 1zeigt ein repräsentatives Beispiel für eine große gesunde Kultur.

Der zeitliche Verlauf der Regeneration wurde in Stentor mit Saccharose-Behandlungsmethode für die Initiierung der Regenerierung gemäß Schritt 3.1, kombiniert mit der Bildgebung und Analysemethode diskutiert in Abschnitt 4 (Abbildung 7) gemessen. Dieses Diagramm zeigt, dass gibt es eine eine-Stunde-langen Ausbreitung in die Zeit von der Bevölkerung der Zellen für eine bestimmte Stufe zu erreichen. Diese Art der Analyse ermöglicht die Untersuchung der zeitlichen Heterogenität in den Regenerationsprozess in einer Population von Zellen zu regenerieren.

Nachfolgend eine Zusammenfassung der Regeneration-Timing, die bisher nach Dutzenden von Saccharose Behandlungen (Abbildung 4 und Abbildung 6) beobachtet wurden. Phase 1 ist, wenn Tränen ohne jede Membranellar Band Stentor Zellen aussehen (diese Etappe beginnt unmittelbar nach der Saccharose Auswaschen). Diese Phase dauert ca. 3-6 h Stufe 2 ist, wenn eine Membranellar Band erscheint und wächst (3-6 h nach der Saccharose-Behandlung). Diese Phase dauert ca. 3-4 h. Phase 3 ist, wenn eine orale Primordium am hinteren Ende des Membranellar Bandes (6-8 h nach der Saccharose-Behandlung erscheint), und beide Strukturen sind am vorderen Ende der Zelle verschoben. Diese Phase dauert ca. 1-2 h. Wenn die Membranellar Band und der mündlichen Apparat am vordere Ende der Zelle erreicht, dies angegeben die Vollendung der Regeneration. Die Zelle hat charakteristische Stentor trompetenartige Form angenommen. Zellen wurden komplett regenerierte 8-9 h Saccharose Nachbehandlung.

Abbildung 1. Snapshot von Stentor. Die Membranellar Band und der mündlichen Apparat sind am vorderen Ende der Zelle angezeigt. Die Holdfast ist am hinteren Ende der Zelle. Stentor Macronucleus ist Kugelgrafit. Eine gut genährte Stentor hat grüne Lebensmittel Vakuolen enthalten meist Chlamydomonas. Maßstabsleiste beträgt 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Stentor schneiden Set-up. Zelle Schneiden erfolgt manuell bearbeiten einer glasnadel beim Betrachten der Zelle mit einem handelsüblichen sezierenden Stereo-Mikroskop. Das Seidenpapier dient den weißen Hintergrund um zu sehen, die Zellen besser angeben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Schnappschüsse von Video 3 darstellen, wie ein Stentor mit einer glasnadel schneiden. (A) A Stentor unmittelbar vor die Nadel, die er berührt. (B) ein Stentor drückte sanft zwischen Nadel und Glas Folie. (C) A beauftragt Stentor als Reaktion auf die Kraft der Nadel. (D) A Stentor durch leichtes Drücken auf die Zelle mit der Seite der Nadel geschnitten. (E) A Stentor jetzt in zwei Teile geschnitten, aber nicht getrennt. (F) zwei Stentor Fragmente. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Schematische Darstellung von Abschnitt 3 und Abschnitt 4 des Protokolls. Dies ist eine illustrierte Protokoll zur Durchführung von Saccharose oder Harnstoff-Behandlung und Beobachtung der Zellregeneration. Die Zeitangabe im unteren Bereich wird von Anfang an die Wäsche 1 gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Das Setup für Bildgebung und/oder direkte Beobachtung der Regeneration mit einem aufrechten Mikroskop. In jeder 4 µL Tropfen von dem Deckglas hängen gibt es eine Zelle Regeneration unterzogen. Wasser in den Brunnen der Glasplatte vor Ort begrenzt Verdunstung der Tröpfchen. Dieses Setup ermöglicht nach der Regeneration von mehreren Zellen parallel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6. Schnappschüsse von Stentor in den einzelnen Phasen der Membranellar Band und die mündliche Apparat Regeneration. (A) Stufe 1 zeichnet sich durch eine Träne-wie Zellform und das Fehlen der Membranellar Band. (B) Stufe 2 zeichnet sich durch die Darstellung der Membranellar Band, ein Zilien-basierte Struktur, die ständig schlägt. Membranellar Bänder sind gekennzeichnet mit weiße gestrichelte Linien in Platten B - D. (C und D) Stufe 3 zeichnet sich durch die Darstellung der mündlichen Primordium (mit einem Pfeil markiert). Mündliche Primordium sieht aus wie eine Einschnürung am hinteren Ende der Membranellar Band. Die mündliche Primordium wird dann in Richtung der vorderen Zelle Aufsteigen zu den mündlichen Apparat. (E) Regeneration ist abgeschlossen, wenn die Zelle das Merkmal Stentor trompetenartige Form angenommen hat, und die mündliche Vorrichtung (mit einem Pfeil markiert) hat am vorderen Ende der Zelle erweitert. Maßstabsleiste ist 0,25 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7. Box-Plot zeigt gestapelt wie Proportionen von Zellen in allen Phasen der Regeneration nach der Saccharose Behandlung über zeitliche Veränderungen. Die Grafik zeigt die Heterogenität des Zeitpunkts der Regeneration Phasen innerhalb einer Population von regenerierenden Zellen. "Reg End" zeigt die Fertigstellung der Regeneration. Die Anzahl der Zellen: 28. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1. Beispiel für eine gesunde Kultur Stentor . In der Regel, wenn eine Kultur das konzentriert ist, teilen der Kulturkreis empfiehlt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 2. Verlangsamt sich Stentor mit Methylcellulose. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Video 3. Schneiden Stentor. Einzelne Zellen können manuell in mehrere Stücke unter einem Stereo Mikroskop durch Drücken einer glasnadel durch die Zelle zu sezieren geschnitten werden. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Problem mit Kultur	Mögliche Abhilfe	Mögliche Prävention
Kultur wird von Rädertierchen oder andere große Organismen überwältigt.	Entfernen Sie so viele Stentor wie möglich in eine neue Kulturschale. Dann waschen Sie die Zellen dreimal.	Waschen Sie Stentor gründlich, wenn sie, zu empfangen, selbst wenn sie von einem kommerziellen Anbieter zu kaufen.
Kultur ist durch Pilz oder andere kleinen Organismen überwältigt.	Identifizieren eine Ecke wo gibt es die am wenigsten Stentor. Entfernen Sie in diesem Bereich, so viel Medien möglichst ohne viele Stentor und fügen Sie neue PSW. Mischen Sie sanft aber gründlich zu Jahrgangsstufe die eindringenden Organismen. Überspringen Sie die nächste Fütterung und Stentor Essen sie.	Die Kultur regelmäßig beobachten und durch den Austausch von Medien für frische PSW kleine Verunreinigungen zu entfernen.
Stentor liegen übereinander.	Teilen Sie die Kultur, so dass die Konzentration weniger als 20 Zellen/mL beträgt.	Immer öfter Kulturen aufgeteilt.
Stentor Zellen sind Paarung.	Alle 4 Tage statt alle 5 Tage zu ernähren.
Kultur hat eine Menge von dunklen Abfallmaterial.	Entfernen Sie so viel des dunklen Materials, Stentor Abfälle wie möglich ohne die Zellen zu entfernen. Wenn das dunkle Material Stentor zugeordnet sind, pipette rauf und runter um die Stentor Zellen aus ihrer Abfälle lösen und entfernen dann das Medium mit dem Abfall ohne die Zellen zu entfernen. Oder entfernen Sie die Stentor und entsprechend füttern weniger.	Feed Stentor 1 mL weniger Nahrung pro 100 mL der Kultur.
Auf der Suche von fehlerhaft (vakuolisierten/aufgebläht oder gerundet) Stentor.	Entfernen Sie so viel Medien wie möglich ohne zu viele Stentor Zellen entfernen und fügen Sie neuer PSW hinzu.	Tauschen Sie die Medien regelmäßig.

Tabelle 1. Handbuch zur Problembehandlung für die Kultivierung von Stentor.

Discussion

Kultivierung von Stentor präsentiert eine Reihe von Herausforderungen. Erstens, um Experimente durchzuführen, die eine große Anzahl von Zellen erfordern, braucht man weiterhin eine große Anzahl von Stentor Kulturen, wie Kulturen werden ungesund, wenn Stentor Konzentration 20 Zellen/mL übersteigt. Zweitens die Organismen, die Stentor Kulturen oft kontaminieren können schneller als Stentor teilen und überwältigen die Kultur (eine gemeinsame Verunreinigung ist Rädertierchen). Daher ist es notwendig, die Kultur unter dem Mikroskop in regelmäßigen Abständen zu überprüfen und die Verunreinigungen zu entfernen. Gelegentlich muss eine neue Kultur von einer kleinen Anzahl von Zellen manuell aus einem kontaminierten Kultur gerettet gestartet werden. Dadurch erhöht sich den Zeitaufwand für gesunde Stentor Kulturen pflegen. Drittens erfordert die Expansion einer einzelnen Zelle in eine 400 mL-Kultur mindestens einen Monat, weil Stentor Zellzyklus 3-5 Tage. Viertens: im Gegensatz zu anderen Modell Ciliaten, Stentor selten eingehen Zyste Form und sie können nicht eingefroren werden.

Ein wichtiger Aspekt der Kultivierung von Stentor ist die Auswahl eines geeigneten Nahrungsmittel Organismus. Verschiedene Methoden zur Kultivierung von Stentor wurden bisher beschrieben. Einer von ihnen schlägt, Magermilch, Kultur Bakterien verwenden, die dann Stentorfüttern. Diese Technik ist wirksam bei der Kultivierung von Stentor; Anwendung der genomischen Techniken erfordert jedoch reine Proben um Verwechslungen aus genomischer liest aus undefinierten Essen Organismen. Über das aktuelle Protokoll, Stentor in Masse angebaut werden können und weil ihre Nahrung, Chlamydomonas, sequenziert wurde, das Vorhandensein von genomischen Kontamination von Lebensmitteln Organismus erkannt und für gesteuert werden kann. Aus unbekannten Gründen musste Zahnstein ergänzen seine Vorräte durch Rücksendung, wo er Stentor vor gefunden. Mit dem aktuellen Protokoll konnten wir Stentor für Jahre zu halten.

Regeneration-Experimente mit Stentor sind im Allgemeinen einfach, aber es gibt ein paar wichtige Details im Auge zu behalten. In Bezug auf Abschnitt 2 Schneiden Stentor Zellen in zwei Hälften in Minuten gemeistert werden können. Mastering erweiterte Mikrochirurgie-Verfahren von Stentor erfordern eine Woche Praxis. Während Durchführung einer Saccharose oder Harnstoff-Behandlung (Abschnitt 3), wenn zu Beginn der Bildgebung die meisten Zellen noch ihre Membranellar Bands haben, erhöhen Inkubationszeit von 10-30 s für als Saccharose Behandlung als nächstes ausgeführt wird. Erhöhen Sie die Zeit der Saccharose Behandlung über 3 min Inkubation nicht, weil es in Zelltod führen wird.

Imaging von Stentor muss Regeneration Methoden große Zellen über lange Zeiträume hinweg. Das bildgebende Verfahren, die in Abschnitt 4 beschriebenen kann nur mit einem aufrechten Mikroskop verwendet werden. Wenn einem inversen Mikroskop stattdessen verfügbar ist, können Zellen auf eine Folie oder ein Deckglas in kleinen Kammern platziert werden. Eine Methode ist die Schaffung eine Kammer aus Vaseline und Abdeckung mit einem anderen deckgläschen um Verdunstung zu verhindern. Alternativ kann eine Kammer für eine einzelne Zelle durch ein Loch mit einem Locher der gewünschten Größe in einem 1 x 1 cm-² Quadratmeter Silizium Spacer gemacht werden (Tabelle der Materialien), Platzierung des Abstandhalters auf einem deckgläschen, indem Zellen in der Kammer , und die Kammer mit einem anderen Deckglas abdecken. Beim abbilden, wenn Stentor nicht in der richtigen Ausrichtung, die charakteristischen Merkmale der einzelnen Phasen der Regeneration zu beobachten sind, tippen Sie auf die Platte fest um den Handy-Vertrag zu machen. Sehen Sie sich die Zelle erweitert werden, um die Phase der Regeneration zu identifizieren (Vollauszug dauert etwa 45 s). Wenn die Zelle immer noch in der falschen Ausrichtung ist, wiederholen Sie das klopfen. Die in Abbildung 1 und Abbildung 6 gezeigten Bilder wurden von einem Stereo-Zoom-Mikroskop aufgenommen; jedoch können alle Experimente, die detailliert mit einer 5 X Stereo-Mikroskop sezieren durchgeführt werden.

Eine weitere Herausforderung neben Kultivierung und imaging- Stentor ist das Tracking der Regeneration, insbesondere die Höhe der Zeit notwendig, um Phasen identifizieren. Wenn die regenerierenden Zellen perfekt ausgerichtet mit der Region der mündlichen Primordium deutlich sichtbar ist, dauert Identifikation der Stufe wenige Sekunden. Manchmal ist jedoch die Stentor -Zelle in eine Orientierung verhindern klare Zuweisung der Regeneration Stufe, damit mehr Zeit nehmen, zu identifizieren. Die erhebliche Menge an Zeit benötigt, um Bühne einzelne regenerierende Zellen, die Quantifizierung aller regenerierenden Zellen verzögern, damit Verringerung der zeitlichen Präzisions Inszenierung und erfordern den Betrachter zu warten und Re-Imaging auf die Zelle danach umgezogen eine neue Ausrichtung. Infolgedessen ist dieses Experiment Zeit- und arbeitsintensiv. Aus diesen Gründen wäre es sehr wünschenswert, automatisierte Methoden zur Erkennung von Stentor Zellen und Phasen der Regeneration im Videomikroskopie Daten zuordnen zu entwickeln. Diese würde auch mehr reproduzierbare Experimente ermöglichen erhöht die Größe der Stichprobe und die Beseitigung der menschlichen Neigung.

Die Entstehung von hochsensiblen Genomik und Proteomik Methoden hat damit begonnen, Studien einzelner Zellen in Reichweite zu stellen. Für solche einzelligen Analysen macht die riesige Größe einer Stentor Zelle es wünschenswert Testperson für Proof-of-Concept-Experimente. Für solche Experimente möglich Kultivierung Stentor ist von grundlegender Bedeutung, und so sollten die hier beschriebenen Methoden eine Rolle in der weiteren Entwicklung von fortgeschrittenen Techniken der einzelligen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stentor coeruleus live culture	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar	Carolina Biological Supply	152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle	Carolina Biological Supply	132458
Methyl cellulose, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Pyrex glass spot plate	Fisher Scientific	13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
2-cup glass container with glass lid	Pyrex	1095600
CultureWell silicone sheet material	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Cover Glass	Fisher finest	12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture	ThermoFisher	A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White	Spectrum	P1037
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Needle puller P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope	Zeiss