Summary
Ciliate ענק, Stentor coeruleus, היא מערכת מצויינת ללמוד התחדשות ואף ריפוי פצעים. אנו מציגים את הליכי הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, גרימת התחדשות על ידי חיתוך תאים, מבחינה כימית גרימת לרגנרציה של להקת membranellar, המנגנון אוראלי, הדמיה, וניתוח של תא התחדשות.
Abstract
התאים צריכים להיות מסוגלים לחדש את החלקים שלהם להתאושש לפליטת חיצוניים. Ciliate חד־תאיות Stentor coeruleus הוא אורגניזם מודל מצויין ללמוד ריפוי הפצע התחדשות התאים הבאים. הגנום Stentor הפכו לזמינות לאחרונה, יחד עם שיטות בביולוגיה מולקולרית מודרניים, כגון RNAi. כלים אלה מאפשרים ללמוד תא בודד התחדשות ברמה המולקולרית. המקטע הראשון של הפרוטוקול מכסה הקמת Stentor תרביות תאים תאים בודדים או שברי תאים, ביחד עם הנחיות כלליות לשמירה על תרבויות Stentor . Culturing Stentor בכמויות גדולות מאפשרת שימוש בכלים יקר כמו ביוכימיה, רצף ספקטרומטר מסה. המקטעים הבאים של הפרוטוקול לכסות גישות שונות כדי גרימת התחדשות ב- Stentor. חיתוך באופן ידני תאים עם מחט זכוכית מאפשרת ללמוד לרגנרציה של חלקי תאים גדולים, כאשר מתייחסים תאים עם סוכרוז או אוריאה מאפשר ללמוד לרגנרציה של מבנים ספציפיים ממוקם בקצה הקדמי של התא. שיטת הדמיה תאים בודדים ההתחדשות מסופק, יחד עם טבלת עזר להערכת הישגים היערכות וניתוח את הדינמיקה של התחדשות. התהליך כולו של התחדשות מחולק בשלושה שלבים. דמיין את הדינמיקה של ההתקדמות של אוכלוסיה של תאים דרך השלבים, הוא הפגין את הטרוגניות בתזמון התחדשות.
Introduction
התאים אינם תיקים פשוטים של אנזימים, אבל מאוד מורכבת למדי מכונות שהרכיבים בקפידה לשינוי הגודל הנכון, לארגן תפקידים מוגדרים היטב. מורפוגנזה של תאים בודדים מייצג תהליך מפתח התא וביולוגיה התפתחותית, אך המנגנון המולקולרי שלה לא ידוע1,2. בעוד כמה תאים בתרבית דומות כתמים, אורגניזמים חד־תאיות יכול מאוד סיבכו ארכיטקטורות, ומעוררות את דפוסי בקליפת המוח מורכבת ראיתי3,ciliates4.
אולי הדוגמה הקיצונית ביותר של תא מאוד מובנית הוא Stentor coeruleus, heterotrichous ענק ciliate קשור Tetrahymena ו- סנדלית. Stentor הוא באורך של 1 מ מ, והוא מכוסה עם יותר מ-100 פסים אורכיים של פיגמנט כחול לסירוגין עם שורות של cilia מאורגנים בערימות מקבילים של סרטים microtubule להפעיל את משך כל התא. התא הוא חצוצרה בצורת (איור 1), עם תזמורת membranellar מכשירים דרך הפה (OA) לסיומה הקדמי, ואת holdfast שמתחבר התא המצע בקצה האחורי שלו. בנוסף הקוטביות ברור הקדמי, האחורי, התא גם מראה המתבנת כיראלי, ייחודי כך ריווח בין שורות ciliary בהדרגה גדל עם כיוון השעון. התוצאה רציפות שם השורה הצר פוגש את השורה הרחב ביותר, ואת אזור זה של פני השטח של התא, המכונה מיקומה של פס ניגודיות, יכולים לגרום להיווצרות הסט השני של מבנים הקצה הקדמי כאשר הושתל אל תא אחר5, . עושה את זה באופן רשמי המקביל לסדרן של Spemann. לפיכך, כל תהליכי מפתח ביולוגיה התפתחותית יש תחליפי שלהם ב- Stentor: axiation, תבניות ו אינדוקציה. העובר, תהליכים אלה מונעים על ידי הגורל ההבדלים בין תאים שונים, אבל ב- Stentor, הם חייבים להיות מונע על ידי הגורל הבדלים בין אזורים שונים בתוך תא בודד. מה שמגדיר את ההבדלים בין האזורים בתוך Stentor היא בגדר תעלומה.
אם חלק כלשהו של Stentor נחתך, החתיכה החסרה של התא יכול להתחדש להניב תאים נורמליים תוך מספר שעות. אם תא לחתוך לחצי, או אפילו לחלקים קטנים הרבה יותר, כל קטע מארגנת מחדש ויהיו לתוך תא שנראה נורמלי אבל קטנים יותר ומשחזרת את המידתיות נכונה בין תא חלקים6,7. אפילו שברירי, 1/64th לגודל התא המקורי, מסוגלים להתחדש בתוך תא קטן, אך בדרך כלל פרופורציות ולאחר מכן לגדול בגודל מלא6. Stentor ובכך מציגה הזדמנות ייחודית ללמוד את המנגנונים של אברון גודל שינוי גודל של תאים צמיחה תקנה בשיטות כירורגיות המוחלות בדרך כלל ברמה של רקמות או אורגניזם שלם.
אחד המאפיינים של Stentor ומאפשרת לו להתחדש מתוך מגוון רחב של ניתוחים כירורגיים הוא שהוא מכיל macronucleus nodulated יחיד (איור 1) עם בערך 50,000 עותקים של כל הגנים8. כל עוד קטע התא מכילה צומת macronuclear אחד לפחות, הוא בעל יכולת להתחדש באופן מלא. מאפיין נוסף המשמש כבסיס יכולת התחדשות של Stentor, היא יכולתה ריפוי פצע עצום. סוגי תאים רבים אמנם מסוגל ריפוי הפצעים שלהם9, Stentor הוא מסוגל להתאושש במגוון יוצא דופן של לפליטת הפיזי. דוגמה Stentor ההתאוששות מן ההפרעות דרסטית, יחד עם השיטות להמחשת זרימה cytoplasmic Stentor10 דווחו בעבר. שיטות אלה מאפשרות לימוד משפיעים על התחדשות איך ופצעו ובעקבות המצב הפיסי של הציטופלסמה.
גודל עצום של stentor, יכולת התחדשות יוצאת דופן, והעובדה כי זה בא לידי ביטוי, תופעות התפתחותיות אצל העוברים multicellular (כגון המארגנים, axiation והמתבנת) רבות נמשך ביולוגים התפתחותיים רבים במהלך הפנייה של המאה הקודמת, לרבות תומאס הנט מורגן7. במהלך החמישים והשישים, גישות המיקרוכירורגית הדגים מערך מדהים של תהליכים morphogenetic ולעירור החד-תאי הזה11. עם זאת, Stentor פותחה כמערכת מודל בביולוגיה מולקולרית רק לאחרונה. במהלך השנים האחרונות, הגנום של Stentor היה וסודרו והתכנסו8, ואת השיטה perturb ביטוי גנים באמצעות RNAi מאכילים היה מפותח12.
אחת הסיבות Stentor פותחה לתוך אורגניזם מודל הביולוגיה המולקולרית המודרנית רק לאחרונה היה הקושי של גידול גדול התרבויות בגלל מחזור התא ארוכה שלה (3 עד 5 ימים). עם זאת, שיטות מודרניות גנומית פרוטיאומיה מבנית לדרוש פחות חומר מאשר הם נהגו, הנפח של תא בודד Stentor היא מספקת שיטות אלה, אפילו בלי להזדקק העדינה שיטות שפותחו עבור הניתוח של יחיד תאים קטנים בהרבה Stentor. בסעיף 1 של הפרוטוקול מפרט את ההליך עבור יצירת תרבות גדול מתא Stentor בודד. אותה גישה יכול לשמש כדי ליצור תרבות גדול מרסיס תא שהושג על ידי חיתוך תא. בסעיף 1 מספק גם ההנחיות לשמירה על תרבויות Stentor בריאים לאורך פרקי זמן ארוכים. סעיף 2 של הפרוטוקול מספקת את המתודולוגיה להשראת התחדשות התאים על ידי גזירה את התאים באופן ידני עם מחט זכוכית. סעיף 3 של הפרוטוקול מוקדש שתי שיטות של גרימת לרגנרציה של תא מסוים מבנים (membranellar band ואוראלי-המנגנון): טיפול תאי עם סוכרוז או אוריאה שמוביל שפיכת של מבנים אלה, ואחריו שלהם התחדשות. סעיף 4 של הפרוטוקול פירוט שיטת ההדמיה של תאים בודדים ההתחדשות במשך פרקי זמן ארוכים. סעיף 4 מסתיים התיאור של השלבים של התחדשות וטיפים על הניתוח של התחדשות דינמיקה.
Protocol
1. culturing Stentor ומיסוד של תאים בודדים או שברי תאים תרבויות Stentor
- להכין Chlamydomonas reinhardtii תרבות כדי לשמש מזון Stentor.
- להשיג Chlamydomonas reinhardtii תאים מן הספק מסחרי (טבלה של חומרים).
- ליצור תרבית נוזלית 500 מ"ל של Chlamydomonas reinhardtii בתקשורת ברז זמינים מסחרית באמצעות סטרילי טכניקה13.
- לשמור על התרבות Chlamydomonas תחת מנורה-ריכוז ליד רוויה (-יתר כ 1) על ידי לדלל אותה עם ברז מדיה פעמיים בשבוע.
הערה: ניתן לגדל את התרבות Chlamydomonas על מטרף. - לבדוק בקביעות אם התרבות Chlamydomonas בריא על ידי הצבת טיפת תרבות בשקופית, מכסה את זה עם coverslip בודק. את זה תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 40.
הערה: אין להשתמש התרבות Stentor האכלה אם מזוהם בחיידקים או אם Chlamydomonas תאים נצברות לתוך אשכולות. אם אחת מהבעיות הללו מתרחשת, להתחיל תרבות Chlamydomonas חדשה.
- להשיג Stentor coeruleus תאים מן הספק מסחרי (טבלה של חומרים).
- אם תאים Stentor נדרשים מן הגידול הטבעי שלהם, לאסוף אותם בריכה, אגם או נהר11.
- איסוף Stentor אגם, אגם או נהר, למצוא שטח עם צמחייה קצת איפה המים רגועים יחסית, מוצל, וברור.
הערה: יש הסתברות גבוהה יותר של מציאת Stentor במיקומים שבו גדל duckweed. - לאסוף לפחות 2 ל' מים במיכל זה ביציקתו מ.
- לאחר דטריטי וחומר חלקיקי התיישבו בתחתית המיכל, בעדינות למלא כמה מכולות קטנות יותר לבחון עבור Stentor, מחכה כמה שניות אחרי כל אוסף עבור הפסולת להתיישב בתוך המיכל גדול.
- עם סיום איסוף דגימות במיקום, להעביר למיקום חדש כי הוא לפחות 10 מ' משם וחזור על האוסף של דוגמאות שם.
הערה: לא כל בריכה יש אוכלוסיה Stentor , כך מספר בריכות ייתכן שיהיה עליך ניתן לטעום. - אחזור עם הדגימות למעבדה, להעביר את המים המכולות פטרי בודדים.
- בכל צלחת פטרי, לחפש Stentor תחת stereomicroscope עם אור המלוכסן בהגדלה X 5. העברת תאים Stentor בודדים באמצעות פיפטה של 1 מ"ל לבאר של צלחת זכוכית ספוט המכיל לפחות 100 µL של מי מעיין מפוסטר זמינים מסחרית (PSW).
הערה: Stentor תאים בעלי צורה דמויית חצוצרה כאשר הן צמודות ל מצע (איור 1). תאים Stentor שחייה הם מורחבים פחות מאשר התאים מחובר מצע (Video 1). - לשטוף Stentor ב PSW לפחות 3 x. לבצע את שוטף על-ידי הסרת כ- 90% של המים מן הבאר תוך שמירה על Stentor תאים בתוך הבאר, ולאחר מכן על-ידי הוספת µL 500 של PSW לתוך הבאר.
הערה: לפני טיפול Stentor באמצעות פיפטות עם טיפים פיפטה של 10 µL או קטנים יותר, לחתוך כ 0.5 מ מ לבטל הקצה של הקצה פיפטה עם מספריים כדי להימנע ופצעו את התאים עקב כוחות גזירה הנוצרות כפי תא גדול זורם דרך קטן מדי של מבצע עצה הה.
- איסוף Stentor אגם, אגם או נהר, למצוא שטח עם צמחייה קצת איפה המים רגועים יחסית, מוצל, וברור.
- להכין Chlamydomonas לפני כל הנקה של Stentor.
- העברת 1 מ"ל של תרבות Chlamydomonas מוכן כמו שלב 1.1 לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. צנטריפוגה ב g x 2,095 למשך 3 דקות.
- הסר את תגובת שיקוע, resuspended בגדר ב 1 מ"ל של PSW. צנטריפוגה ב g x 2,095 במשך 3 דקות להסיר תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 500 µL של PSW.
הערה: לפיכך, שטף, מרוכז Chlamydomonas יטופלו כמו "מוכנה Chlamydomonas"בשלבים הבאים. ברז מדיה הוא מזיק Stentor, ובכך שטיפה Chlamydomonas לפני האכלה Stentor חשובה.
- אם יש צורך תרבות Stentor המשובטים, להתחיל את התרבות תא Stentor יחיד או רסיס תא.
- מאז תאים בודדים Stentor לא צומחים גם PSW, להכין ממוזגים מדיה על-ידי מסנן לחיטוי µL 500 של מדיה מתרבות Stentor הקיימים, בריא.
- להעביר באחת הבארות של צלחת זכוכית ספוט µL 500 של מדיה ממוזגים.
- העברה אחת Stentor לתוך הבאר של לוח הזכוכית ספוט המכיל מדיה ממוזגים. להשתמש בינוני קטן ככל האפשר לבצע את ההעברה.
- להאכיל כל µL Stentor 5 של מוכן Chlamydomonas כל 48 שעות. כאשר לחלק Stentor , לספור את מספר התאים היטב ולהוסיף 5 µL של מוכן Chlamydomonas בכל תא.
- שמור Stentor במקום מוצל מאז התאים רגישות לאור (לדוגמה, בקופסאות פלסטיק שקוף מכוסה מגבות נייר).
- חילופי Stentor בינוני בבאר בינונית טרייה ממוזגים בכל h 96.
- להכין טרי ממוזגים מדיה כמו שלב 1.5.1.
- להפוך את כל התאים Stentor ניתוק מתחתית הבאר מאת pipetting בעדינות את הנוזל למעלה ולמטה בתוך הבאר.
- בזהירות וארוקן את הנוזל. ובכן באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, מוודא שכל התאים נשארים בתוך הבאר. להוסיף 500 µL של התקשורת ממוזגים טריים הבאר.
- כאשר מספר התאים בתוך הבאר עולה 20, להעביר את התאים מיכל גדול יותר, לדוגמה, צנצנת זכוכית. הפה רחב.
- הוסף 20 מ ל PSW לתוך צנצנת זכוכית רחב-הפה בלוק.
הערה: Autoclaving של כלי זכוכית עבור Stentor יכול להיות מוחלף עם שטיפה ושטיפה. - בזהירות pipette התקשורת למעלה ולמטה בתוך הבאר כדי לנתק כל התאים מתחתית הבאר. לאסוף את כל התאים Stentor באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל, בעדינות להעביר אותם צנצנת הזכוכית.
- הוסף 20 מ ל PSW לתוך צנצנת זכוכית רחב-הפה בלוק.
- אין לחזק את המכסים על הצנצנות עם תרבויות Stentor , כדי לאפשר גישה מספיק אוויר.
- להוסיף PSW הצנצנת כל 48 שעות כדי לשמור על צפיפות Stentor תאים למ"ל כ-20. מעריכים את הצפיפות של תאים לפי העין.
הערה: לחלופין, להשתמש פיפטה 1 מ"ל ל בועות אוויר לתוך הצנצנת כדי ליצור תאים ניתוק מהקירות, פיפטה למעלה 1 מ"ל של התרבות, וספור את מספר התאים בקצה פיפטה. - כל 48 שעות, הזנה מוכן Chlamydomonas לתרבויות Stentor בצנצנות (ראה צעד 1.4). להתחיל עם האכלה התרבות עם 200 µL של מוכן Chlamydomonas. כפי מגביר עוצמת הקול של התרבות, בהדרגה להגדיל את כמות מוכן Chlamydomonas המשמש לאכילה עד 1 מ"ל.
- אמצעי האחסון תרבות מגיעה כ-90% מהקיבולת של הצנצנת, העברת התרבות במיכל גדול יותר.
- Pipette התרבות בתוך הצנצנת, למעלה ולמטה, עם פיפטה 1 מ"ל להתנתק Stentor מהזכוכית.
- שופכים את כל התוכן של הצנצנת לתוך מיכל 2-כוס זכוכית.
- יש לשטוף את הצנצנת עם 25 מ ל PSW לתוך המיכל 2-כוס זכוכית כדי לאסוף את שאר Stentor.
- לשמור על תרבויות בריא במיכלים 2-כוס זכוכית.
- להאכיל Stentor תרבויות מ 2 ל מוכן Chlamydomonas לכל 100 מ של תרבות כל 4-5 ימים. להוסיף PSW מיכל הזכוכית כל 4-5 ימים כדי לשמור על צפיפות Stentor תאים למ"ל כ-20.
הערה: 450 מ ל הוא האחסון המרבי שמחזיק מיכל 2-כוס. - פעם בשבוע, לבדוק את התרבויות תחת 5 X לנתח מיקרוסקופ rotifers, פטריה של צמיחה אחרים. על מנת להאריך את הבריאות של התרבות, להסיר מיקרואורגניזמים מזהמים יחד עם תאים Stentor באופן חריג בצורת וחסר צבע באמצעות פיפטה של 1 מ"ל.
- כאשר מיכל הזכוכית מלא כ- 90%, לפצל את התרבות.
- להוסיף 25 מ ל PSW מיכל הזכוכית. השתמש 25 מ ל פיפטה על פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק Stentor מהזכוכית. מהלך כ-50% של התרבות לתוך מיכל 2-כוס זכוכית חדשה.
- להוסיף 25 מ ל PSW שתי תרבויות והמשך שמירה על שתי התרבויות כמתואר בסעיף זה של הפרוטוקול.
הערה: מאז Stentor תאים רגישים בטמפרטורה גבוהה, לשמור על הטמפרטורה 25 ° c או נמוכה בחדר שבו נשמרים התרבויות. לחלופין, ניתן לשמור את התרבויות בתוך אינקובטור. עיין טבלה 1 לפתרון של Stentor culturing.
- להאכיל Stentor תרבויות מ 2 ל מוכן Chlamydomonas לכל 100 מ של תרבות כל 4-5 ימים. להוסיף PSW מיכל הזכוכית כל 4-5 ימים כדי לשמור על צפיפות Stentor תאים למ"ל כ-20.
2. גרימת התחדשות על ידי תאים Stentor חיתוך
- השתמש של פולר מחט כדי לבצע מספר מחטים של צינורות קפילר באמצעות התוכנית כדלקמן: חום - 735, משיכה - 100, מהירות - זמן 110, - 150, הלחץ - 400.
- להכין פתרון methylcellulose 4% ב- 50 מ של PSW.
- להוסיף 1 גר' methylcellulose (צמיגות: 1500 cP) 50 מ של PSW.
- דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות לפחות להקל על פירוק methylcellulose.
- לשמור על 4% methylcellulose פתרון בטמפרטורת החדר.
- להכין צלחת ספוט זכוכית לאחסון שברי תאים לאחר ביצוע את החתכים.
- מסנן לחטא מדיה מתרבות בריא, 500 מ"ל לכל לוח ספוט הזכוכית, ובכן צריך.
- העברת 500 מ"ל של מדיה סטיריליים בכל אחד מן הבארות הדרושים.
- לאסוף אחת בריאה Stentor (בעל צורה מוגדרת חצוצרה, צבעים כחול-ירוק חיים, אין וקואלות גדול) 2 µL droplet ומניחים אותו על coverslip או שקופיות. להוסיף 2 µL של 4% methylcellulose (איור 2). תן Stentor להאט לפני החיתוך זה (סרטון 2).
- . תחזיקי את המחט זכוכית כמו המקביל למשטח חיתוך ככל האפשר למנוע שבירת מחט
- באמצעות מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ, אתר קצה המחט זכוכית ולהעביר אותה קרוב יותר אל התא (איור 3 א). לבחון את החוזה Stentor לאחר יצירת קשר עם המחט (איור 3B ו- C).
הערה: אם התא נמצא כיוון שגורם הפרדת בקצה הקדמי מהקצה האחורי קשה, לסובב אותו בעדינות עם הצד של המחט. - לחץ בעדינות על מכווצים את Stentor עם הצד של המחט זכוכית לחתוך את התא לשניים(איור 3D ו- E, וידאו 3). להעביר את שני קטעים בנפרד להבטיח כי אין שום קשר cytoplasmic ביניהם, כדי למנוע שבר פיוז'ן (איור 3F).
- בדוק אם שני קטעים יש אחת לפחות צומת macronuclear כל על ידי בחינת השברים תחת מיקרוסקופ ויבתר עם תאורה עקיפה.
הערה: לאחר צומת macronuclear אחת לפחות חיונית להישרדות התא. התא עשוי לשפוך שלה קרומית (מעטפת שקופה) יחד עם הפיגמנט כחול-ירוק במהלך או אחרי החתך. ברוב המקרים, הדבר לא ישפיע על הכדאיות לטווח הארוך של התא. - להזיז את שברי לתוך בארות של צלחת זכוכית ספוט המבושלות 2.3 שלב.
- חותכים תאים מרובים בגלל שבריר של תאים שנגזרו לא תיווצר מחדש.
- אם ביצוע חתכים מרובים בהפעלה אחת, להחליף את המחט זכוכית כאשר זה הופך בכבדות מצופה Stentor שאריות או כאשר את קצהו שבור. לחלופין, לנקות את המחט שתמחקי אותו בעדינות על פיסת סיליקון מרווח.
הערה: זכוכית מחטים יכול לשמש עבור הפעלות מרובות של חיתוך התא. - לשמור על לוח הזכוכית ספוט עם שברי תאים בתוך תא לחות.
- המשך סעיף 4 של הפרוטוקול לפרטים על הדמיה ופרשנות של תוצאות התחדשות Stentor .
3. גרימת התחדשות של להקת Membranellar, מכשיר דרך הפה על ידי סוכרוז או אוריאה טיפול
- Membranellar הלהקה אוראלי מכשיר להסרת באמצעות סוכרוז
- להכין פתרון 25% של סוכרוז ב PSW.
- להוסיף 500 µL של 25% סוכרוז PSW לרכבת התחתית microcentrifuge עם כובע הצמד.
- להכין 3 צינורות microcentrifuge עם הצמד כמוסות עם 1 מ"ל של PSW בצינור כל שטיפת התאים לאחר הטיפול סוכרוז.
- איסוף תאים Stentor 30-60 1 מ"ל של מדיה התרבות שלהם לתוך צינור microcentrifuge נפרד באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (איור 4, חץ א).
- לאסוף את כל התאים מהצינור ב 125 µL הסופי האחסון באמצעות פיפטה µL 200 תיקו אחת. להעביר אותם ברכבת התחתית עם 500 µL של 25% סוכרוז (להכין בשלב 3.1.2) כדי לקבל µL 625 של 20% סוכרוז פתרון (איור 4, חץ B). הפעל סטופר.
- דגירה Stentor ב- 20% סוכרוז פתרון זה ו פליק-ספין הצינור microcentrifuge בארון במשך 1 דקה.
- לאסוף את כל התאים בתיקו אחת (להתאים את פיפטה 200 µL קיבולת מקסימלית עבור אוסף קל יותר).
- שמור את התאים בקצה פיפטה עד העצר מציגה 2 דקות של טיפול סוכרוז.
- הוצאה Stentor באחד הצינורות microcentrifuge מוכן בשלב 3.1.3 (איור 4, חץ C). פליק-ספין הצינור בארון.
- לשטוף את התאים שניים יותר פעמים, פעם אחת בכל אחד מן השניים הנותרים צינורות microcentrifuge המכיל PSW מוכן בשלב 3.1.3 (איור 4, חצים D ו- E).
הערה: צייר יחיד תא אוסף טכניקה אינה חשובה בין שוטף. - המשך סעיף 4 של הפרוטוקול לפרטים על הדמיה ופרשנות של דינמיקה התחדשות Stentor (איור 4, חצים F ו- G).
- Membranellar הלהקה אוראלי מכשיר להסרת באמצעות אוריאה
- להכין פתרון של 4% אוריאה ב- PSW.
- הוספת µL 300 של 4% אוריאה PSW אל צינור microcentrifuge עם כובע הצמד.
- להכין 3 צינורות microcentrifuge עם snap כמוסות המכילות 1 מ"ל של PSW כל צינור לניקוי התאים לאחר הטיפול אוריאה.
- איסוף תאים Stentor 30-60 1 מ"ל של מדיה התרבות שלהם לתוך צינור microcentrifuge נפרד באמצעות פיפטה של 1 מ"ל (איור 4, חץ א).
- לאסוף את כל התאים מהצינור ב- 300 µL הסופי האחסון באמצעות פיפטה של 1 מ"ל בתיקו אחת. להעביר אותם ברכבת התחתית עם 300 µL של 4% אוריאה (להכין בשלב 3.2.2) כדי לקבל 600 µL של 2% שתנן פתרון (איור 4, חץ B). הפעל סטופר.
- דגירה Stentor ב 2% שתנן פתרון זה ו פליק-ספין הצינור microcentrifuge בארון במשך 1 דקה.
- לאסוף את כל התאים בתיקו אחת.
- שמור את התאים בקצה פיפטה עד העצר מציגה 2 דקות של טיפול אוריאה.
- הוצאה Stentor באחד הצינורות microcentrifuge מוכן בשלב 3.2.3 (איור 4, חץ C). פליק-ספין הצינור בארון.
- לשטוף את התאים שניים יותר פעמים, פעם אחת בכל אחד מן השניים הנותרים צינורות microcentrifuge המכיל PSW מוכן בשלב 3.2.3 (איור 4, חצים D ו- E).
הערה: צייר יחיד תא אוסף טכניקה אינה חשובה בין שוטף. - המשך סעיף 4 של הפרוטוקול לפרטים על הדמיה ופרשנות של דינמיקה התחדשות Stentor (איור 4, חצים F ו- G).
4. הדמיה וניתוח התחדשות התאים
- אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף, משתמש התליה droplet שיטה לחידוש תמונה של תאים בודדים.
- לשים 100 µL של PSW טוב של צלחת זכוכית ספוט.
- לבודד תא Stentor 1 ב- 4 µL של תרבות התקשורת (מדיה הם נמצאים), שימוש של 10 או 20 µL פיפטה. להפקיד את ה-droplet באמצע 22 x 22 מ מ2 coverslip (איור 5).
הערה: אם התאים כי הם 1) לא בריא (באופן חריג בצורת או בכבדות vacuolated) או 2) עדיין יש להקות membranellar או מנגנוני אוראלי (לניסויים טיפול כימי), אל תשתמש עבור הדמיה. - לארגן 4 עוד טיפות Stentor בתקשורת התרבות סביב ה-droplet הקודם, תוך השארת מקום בין טיפות.
- להפוך את coverslip עם טיפות, בעדינות למקמו מעל הבאר של לוח הזכוכית ספוט שאליו התווספה PSW ל- 4.1 שלב.
- הערה: PSW בבאר יצמצם האידוי של טיפות (איור 5).
- להכין את התאים הנותרים הדמיה על-ידי ביצוע השלבים 4.1.1 - 4.1.4.
- תמונה התאים ההתחדשות תחת מיקרוסקופ עם הרזולוציה הזמן הרצויים. לחלופין, לבחון את התחדשות באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ויבתר.
הערה: התחדשות יתחיל מיד לאחר חיתוך התא או טיפול עם סוכרוז או אוריאה. עם זאת, נראה לעין מבנים חדשים אוראלי יהוו כ-3 שעות לאחר תחילת התחדשות.
- עבור כל נקודת זמן, להקצות לאחד שלושת השלבים התחדשות לכל התאים. כדי לעשות זאת, להשוות בין כל תא להחליפן בתמונות הממחישות את השלבים (איור 4 , איור 6).
- להקצות בשלב א' התאים אין להקה membranellar עדיין (איור 6A).
- להקצות שלב 2 תאים עם להקת membranellar.
הערה: להקת membranellar מופיעה 3-6 שעות לאחר הטיפול (איור 4, איור 6B). בסוף שלב זה, עקמומיות נוספים של הקצה האחורי של הלהקה membranellar יופיע רק לפני הופעת ראשית דרך הפה. - להקצות בשלב 3 התאים עם ראשית דרך הפה.
הערה: ראשית אוראלי היא invagination המופיעים 6-8 שעות לאחר הטיפול בקצה האחורי של הלהקה membranellar (איור 4, איור 6C ו ד 6). ההתחדשות הושלמה כאשר התאים יש להקה membranellar הקצה הקדמי שלהם ואת הצורה תא חצוצרה אופיינית (איור 4, איור 6E). רוב התאים Stentor נוצרות באופן מלא בתוך 8-9 שעות מאז תחילת התחדשות.
- להתוות את אחוז תאים בכל אחד מן השלבים התחדשות עבור כל נקודת זמן בצורה של מגרש בתיבת עמודות מוערמות (איור 7).
הערה: סוג זה של העלילה מאפשר את הפריט החזותי של התחדשות דינמיקה בקרב אוכלוסיה של תאים.
Representative Results
Stentor תרבויות אמינה שהוקמו והותאמו מתוחזק תאים בודדים או שברי תאים באמצעות בסעיף 1 של הפרוטוקול. דוגמה מייצגת של תרבות בריא גדול מוצג 1 וידאו.
הקורס זמן של התחדשות נמדדה ב Stentor באמצעות שיטת טיפול סוכרוז לאתחול של התחדשות המתוארים שלב 3.1, בשילוב עם הדמיה ושיטת ניתוח שנדונו בסעיף 4 (איור 7). מגרש זה מציין כי כפולה אחת באורך שעה מהזמן נלקח על ידי אוכלוסיית תאים כדי להגיע בכל שלב מסוים. סוג זה של ניתוח מאפשר חקר הטרוגניות טמפורלית בתהליך התחדשות אוכלוסיה של התחדשות תאים.
לפניכם סיכום של תזמון התחדשות זה נצפתה עד כה לאחר עשרות טיפולים סוכרוז (איור 4 , איור 6). שלב ראשון הוא כאשר התאים Stentor נראים כמו דמעות בלי שום להקה membranellar (בשלב זה מתחיל מיד לאחר שטיפה סוכרוז). שלב זה נמשך 3-6 ח' שלב 2 הוא כאשר מופיעה להקה membranellar גדל (3-6 שעות לאחר הטיפול סוכרוז). שלב זה נמשך 3-4 ח' בשלב 3 הוא כאשר ראשית דרך הפה מופיע בקצה האחורי של הלהקה membranellar (6-8 שעות לאחר הטיפול סוכרוז), שני מבנים מועברים לקראת סוף התא הקדמי. שלב זה נמשך 1-2 h. הלהקה membranellar והן את המנגנון אוראלי הגיע לקצה הקדמי של התא, זה הצביעו על השלמתו של התחדשות. התא אימצה צורה אופיינית בחצוצרה Stentor . התאים היו לגמרי מחדש 8-9 שעות לאחר הטיפול סוכרוז.
איור 1. תמונת מצב של Stentor. הלהקה membranellar את המנגנון אוראלי מוצגים בקצה הקדמי של התא. Holdfast נמצאת בקצה האחורי של התא. Stentor macronucleus הוא nodulated. מוזן היטב Stentor יש ירוק וקואלות מזון המכיל בעיקר Chlamydomonas. סולם בר הוא 0.5 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. הגדרת חיתוך stentor . תא חיתוך מתבצע על ידי באופן ידני מניפולציה מחט זכוכית בזמן שאני מסתכל על התא באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ויבתר זמינים מסחרית. מטרת העיתון רקמות היא לספק הרקע הלבן כדי לראות את התאים יותר טוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. תמונות של 3 וידאו המדגימה כיצד לחתוך את Stentor עם מחט זכוכית- (א) א Stentor מיד לפני זה נוגע המחט. (B) A Stentor סחוט בעדינות בין שקופית מחט וזכוכית. (ג) א מתכווץ Stentor מגיב בכוח המחט. (ד) A Stentor שהוא נחתך על ידי בעדינות לחיצה על התא עם הצד של המחט. (E) A Stentor עכשיו לחתוך לשניים אבל לא מופרדים. (F) שני קטעים Stentor . סולם בר הוא 0.25 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. ויזואליזציה סכמטי של סעיף 3, סעיף 4 של הפרוטוקול. זהו פרוטוקול מאויר לביצוע סוכרוז או אוריאה טיפול והתבוננות של התחדשות התאים. הזמן שצוין בחלונית התחתונה נמדד מתחילת לשטוף את 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. הגדרת להשגחה הדמיה ו/או ישיר של התחדשות עם מיקרוסקופ זקוף. רביב כל-µL 4 תלוי coverslip, יש תא אחד בתהליך התחדשות. מים הבארות של לוח הזכוכית ספוט מגביל אידוי טיפות. התקנה זו מאפשרת בעקבות ההתחדשות של תאים מרובים במקביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. תמונות של Stentor בכל שלב ושלב של הלהקה membranellar והתחדשות המנגנון אוראלי. (א) שלב ראשון מאופיין על-ידי צורה דמוית דמעה תא ואת העדר הלהקה membranellar. (B) שלב 2 מתאפיינת במראה של הלהקה membranellar, מבנה מבוסס-cilia שמרביץ ללא הרף. להקות Membranellar מסומנים באמצעות קווים מקווקווים לבן פאנלים B - ד (C ו- D) שלב 3 מתאפיינת במראה של ראשית דרך הפה (מסומן בחץ). ראשית דרך הפה נראה כמו invagination בקצה האחורי של הלהקה membranellar. ראשית דרך הפה ואז לעלות כלפי החלק הפנימי של התא להפוך המנגנון אוראלי. התחדשות (E) הושלמה כאשר התא אימצה האופיינית Stentor חצוצרה צורה, המנגנון אוראלי (מסומן בחץ) הרחיב בקצה הקדמי של התא. סולם בר הוא 0.25 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7. מוערמים תיבת מגרש מראה איך הפרופורציות של תאים בכל שלבי חידוש לאחר טיפול סוכרוז את השינויים לאורך זמן. העלילה מציגה הטרוגניות בתזמון של התחדשות שלבים בתוך אוכלוסייה של תאים ההתחדשות. "רג סיום" מצביע על השלמתו של התחדשות. מספר התאים: 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1. דוגמה של תרבות Stentor בריא. באופן כללי, אם תרבות זה מרוכז, פיצול התרבות מומלץ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 2. מאט Stentor עם methylcellulose. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
וידאו 3. חיתוך Stentor. תאים בודדים ניתן לחתוך באופן ידני לחלקים מרובים תחת מערכת סטריאו לנתח מיקרוסקופ על ידי לחיצה על מחט זכוכית דרך התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
| בעיה עם תרבות | פתרון אפשרי | מניעה אפשרי |
| תרבות היא מוצפת rotifers או אורגניזמים גדולים אחרים. | להסיר כמה שיותר Stentor ככל האפשר לתוך תבשיל תרבות חדשה. לאחר מכן לשטוף את התאים שלוש פעמים. | לשטוף ביסודיות Stentor בעת קבלת אותם, אפילו בעת רכישת אותם מן הספק מסחרי. |
| תרבות היא מוצפת פטריה או אורגניזמים קטנים אחרים. | לזהות לפינה שם יש לפחות Stentor. באזור הזה, להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר רבים Stentor ולהוסיף ב PSW חדש. מערבבים בעדינות אך ביסודיות כדי distrubute אורגניזמים הפולשים. דלג על ההזנה הבא, Stentor יאכלו אותם. | לבחון את התרבות באופן קבוע ולהסיר לכלוך קטן על ידי החלפת מדיה עבור PSW טריים. |
| Stentor שוכבים אחד על השני. | לפצל את התרבות הריכוז הוא תאים למ"ל פחות מ-20. | פיצול תרבויות לעתים קרובות יותר. |
| Stentor תאים ההזדווגות. | להאכיל מדי 4 ימים במקום כל 5 ימים. | |
| תרבות יש הרבה חומר פסולת כהה. | הסר כל כך הרבה של החומר האפל, Stentor פסולת ככל האפשר מבלי להסיר את התאים. אם Stentor מחוברים לחומר האפל, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר את התאים Stentor מפסולת שלהם ולאחר מכן להסיר את התקשורת עם הפסולת מבלי להסיר את התאים. או, להסיר את Stentor ולהאכיל בהתאם פחות. | הזנה Stentor 1 מ"ל פחות מזון לכל 100 מ של תרבות. |
| למראה בריא (vacuolated/נפוח או מעוגל) Stentor. | להסיר כמה שיותר מדיה ככל האפשר מבלי להסיר תאים Stentor רבים ולהוסיף PSW חדש. | חילופי המדיה באופן קבוע. |
טבלה 1. מדריך לפתרון בעיות עבור culturing Stentor.
Discussion
Culturing Stentor מציג מספר אתגרים. ראשית, כדי לבצע ניסויים הדורשים מספר גדול של תאים, אחד צריך לשמור על מספר רב של תרבויות Stentor , כמו תרבויות להיות לא בריא כאשר ריכוז Stentor עולה 20 תאים למ"ל. שנית, המיקרואורגניזמים יכול לזהם Stentor תרבויות קרובות לחלק מהר יותר Stentor , להציף את התרבות (מזהם נפוץ הוא rotifers). לפיכך, יש צורך לבחון את התרבות תחת מיקרוסקופ מעת לעת ולהסיר את המזהמים. לעיתים, תרבות חדשה צריכה להיות החל ממספר קטן של תאים ניצלה באופן ידני מתרבות מזוהמים. פעולה זו מגדילה את הזמן הנדרש כדי לשמור על תרבויות Stentor בריאים. שלישית, הרחבת תא בודד לתוך תרבות 400 מ ל דורש לפחות חודש אחד, כי מחזור התא Stentor הוא 3-5 ימים. רביעית, בניגוד מודל אחר ciliates, Stentor לעיתים רחוקות ללכת לתוך ציסטה טופס, הם לא יכולים להיות קפוא.
היבט חשוב של culturing Stentor הוא הבחירה של אורגניזם מזון המתאים. שיטות שונות עבור culturing Stentor שתוארו קודם לכן. אחד מהם מציע להשתמש חלב רזה התרבות חיידקים אשר מאכילים Stentor. כזה טכניקה יעילה culturing Stentor; עם זאת, יישום של טכניקות גנומית דורש דוגמאות טהור כדי למנוע בלבול הנובע קריאות גנומית של אורגניזמים מזון לא מוגדר. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, ניתן לגדל Stentor במסה, כי את האוכל שלהם, Chlamydomonas, יש כבר וסודרו, הנוכחות של זיהום גנומית של האורגניזם המזון ועוזרת מבוקר על. מסיבות לא ידועות, טרטר נאלץ לחדש את המלאי שלו על-ידי החזרת עד היכן הוא מצא Stentor לפני. עם הפרוטוקול הנוכחי, הצלחנו לשמור על Stentor במשך שנים.
התחדשות ניסויים עם Stentor הם בדרך כלל פשוטה, אבל יש כמה פרטים קריטיים שכדאי לזכור. לגבי סעיף 2, חיתוך Stentor תאים לחצי יכול להיות מומחה תוך דקות. מאסטרינג כירורגיים מתקדמים יותר של Stentor עשויים לדרוש שבוע של תרגול. בזמן ביצוע טיפול סוכרוז או אוריאה (סעיף 3), אם בתחילת הדמיה רוב התאים עדיין יש להקות membranellar שלהם, להגביר את זמן הדגירה על ידי 10-30 s עבור מתי סוכרוז הטיפול מבוצע הבא. לא להאריך את זמן הטיפול סוכרוז מעבר 3 דקות הדגירה מכיוון שהתוצאה תהיה מוות של תאים.
הדמיה של Stentor התחדשות דורש שיטות לתאים גדולים התמונה לאורך פרקי זמן ארוכים. שיטת הדמיה מפורטת בסעיף 4 יכול לשמש רק עם מיקרוסקופ זקוף. אם במיקרוסקופ הפוכה זמין במקום, ואז התאים ניתן להניח בשקופית או coverslip בתאי קטן. שיטה אחת היא ליצור תא מחוץ וזלין ולכסות עם coverslip אחר כדי למנוע אידוי. לחלופין, תא עבור תא בודד יכול להתבצע על ידי עושה חור עם אגרופים חור בגודל הרצוי 1 x 1 ס מ2 מרובע של סיליקון מרווח (טבלה של חומרים), הצבת את מרווח coverslip, שם תאים בבית הבליעה , מכסה את התא עם coverslip אחרת. כאשר הדמיה, אם Stentor אינם לכיוון הנכון כדי לבחון את התכונות האופייניות של כל שלב של התחדשות, הקש על לוח בחוזקה כדי להפוך את החוזה תא. לצפות את התא להרחיב כדי לזהות את השלב של התחדשות (למיתוח לוקח בערך 45 s). אם התא נמצא עדיין הכיוון הלא נכון, חזור הנקישות. הדימויים המוצגים באיור 1 , איור 6 צולמו על ידי מיקרוסקופ זום סטריאו; עם זאת, כל הניסויים מפורט ניתן לבצע באמצעות 5 X לנתח סטריאו מיקרוסקופ.
אתגר נוסף מלבד culturing והדמיה Stentor הוא המעקב של התחדשות, במיוחד את כמות הזמן הדרוש כדי לזהות בשלבים. אם התא ההתחדשות מכוון בצורה מושלמת עם האזור של ראשית הפה נראה בבירור, זיהוי של הבמה לוקח כמה שניות. לפעמים, אולם, התא Stentor היא בכיוון מניעת הקצאה ברורות של שלב התחדשות, ובכך לקחת יותר זמן כדי לזהות. משך הזמן הנדרש כדי שלב ההתחדשות תאים בודדים עשוי לעכב את כימות של כל התאים ההתחדשות, ובכך להקטין את הדיוק הטמפורלי של היערכות ודרישה המתבונן לחכות, להתקין מחדש התא אחריו עברה משמעותית כיוון חדש. כתוצאה מכך, הניסוי הזה הוא גם זמן וגם עבודה אינטנסיבית. מסיבות אלו, רצוי מאוד לפתח בשיטות אוטומטיות עבור Stentor התאים ולהתאושש הקצאת בשלבים של התחדשות בנתוני מיקרוסקופ וידאו. אלה יאפשרו גם לניסויים לשחזור יותר, מגדילה גודל המדגם, הסרת הטיה אנושית.
הופעתה של שיטות רגישה מאוד גנומית פרוטיאומיה מבנית החלה להכניס יד מחקרים של תאים בודדים. עבור ניתוחים תא בודד כזה, בגודל ענק של תא Stentor הופך נושא הבדיקה רצוי עבור ניסויים הוכחה הרעיון. לניסויים כזה בלתי אפשרי, culturing Stentor הוא מהותי, אז בשיטות המתוארות כאן צריך לשחק תפקיד להמשך פיתוח של טכניקות מתקדמות יותר מתא בודד.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק-NIH R01 GM113602 (WFM) ואת ה-NSF 1144247 (אי אל). אנו להכיר מארק Slabodnick, נטלי קירקלנד לפיתוח הגירסאות הראשונית של כמה מהפרוטוקולים האלה, לדיונים אינפורמטיבי. אנו מודים קארינה Perlaza ולואיס גריסון על קריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
- Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular "vitalism". Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
- Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
- Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
- Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
- Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
- Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
- Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).
- Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).
- Harris, E. The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).
