Summary
巨大な繊毛虫ラッパムシは、創傷治癒と再生を研究する優れたシステムです。単一細胞または細胞断片からラッパムシ細胞培養の確立、切断細胞による再生を誘導する、化学的に membranellar バンドと口腔装置、イメージング、およびセルの分析の再生を誘導するための手順を提案します。再生。
Abstract
セルは外部摂動から回復するためのパーツを再生することができる必要があります。単細胞の繊毛虫ラッパムシ創傷治癒研究に優秀なモデル生物とそれに続く細胞の再生です。ラッパムシゲノム RNAi などの現代分子生物学方法と共に最近では、利用可能になった。これらのツールは、分子レベルで単一細胞の再生を検討することが可能。プロトコルの最初のセクションは、単一細胞または細胞の断片、ラッパムシ文化を維持するための一般的なガイドラインに沿ってからの培養細胞確立ラッパムシをカバーしています。ラッパムシを大量に養殖生化学、シーケンシング、および質量分析のような貴重なツールを使用することができます。プロトコルの後続のセクションはカバーラッパムシの再生を誘導するさまざまなアプローチです。ガラス針で細胞を手動で切断には、セルの前にある特定の構造の再生を勉強できます蔗糖あるいは尿素とセルを扱う大細胞部品の再生を勉強することができます。イメージング細胞再生の方法は、ステージングおよび再生のダイナミクスを分析するためのルーブリックと共に提供されます。再生の全体のプロセスは 3 つの段階に分かれています。進行の段階を経て細胞の人口の動態を可視化、再生タイミングで不均一性を発揮します。
Introduction
細胞は、酵素ではなく非常に複雑な機械要素を慎重に適切なサイズにスケールおよび明確に定義された位置に配置がシンプルなバッグではありません。個々 の細胞の形態形成は、細胞・発生生物学の重要なプロセスを表しますが、その分子機構は不明な1,2。いくつかの培養細胞塊に似ている、その単細胞生物に、非常に複雑なのアーキテクチャ、繊毛虫3,4に見られる複雑な皮質パターンに代表される持っていることができます。
おそらく高度な構造セルの最も極端な例は、巨大な heterotrichous の繊毛虫テトラヒメナゾウリムシのの遠縁ラッパムシ、です。ラッパムシ1 mm 長いは、セル全体の長さが実行される微小管リボンの並列スタック主催繊毛の行交互青色色素の以上 100 の縦ストライプで覆われます。セルはトランペット形 (図 1)、membranellar バンドとその前方の端と後部で基板にセルをアタッチ ホールドファスト口腔装置 (OA)。クリア前後極性に加えて、セルは間隔毛様体行徐々 に時計回りの方向に増加するように独特のキラル パターニングも示しています。これは、結果、狭い行が最も幅の広い行およびセル表面のこの地域を満たす不連続に前方構造別セル5、接ぎ木の 2 番目のセットの形成を誘導することができますストライプのコントラストの軌跡として知られ、正式のオーガナイザーと同等となっています。したがって、発生生物学のすべての主要プロセスは、ラッパムシの類似をある: axiation、パターン形成と誘導。胚、ラッパムシは異なる細胞の間、これらのプロセスが運命の違いによって駆動される、彼らは単一のセル内の異なる領域の運命の違いによって駆動される必要があります。ラッパムシの内の領域の違いを定義するものは謎です。
ラッパムシの任意の部分が途中で切れている場合、セルの行方不明の部分は時間の問題で正常な細胞を生成する再生成できます。セルがある場合で、各部分の半分、あるいははるかに小さい部分にカット普通しかし小さい細胞に再編成し、セル部品6、7の間に適切な比例を復元します。小さな断片、1/64th元のセルのサイズが小さいが均整通常細胞として再生して、フル サイズ6にすることができます。ラッパムシは、こうしての通常の組織または個体レベルで適用される手術方法を使用して細胞器官サイズ スケーリングと細胞成長調節機構を研究するユニークな機会を示します。
ラッパムシ手術操作の広い範囲から再生成することができますのプロパティの 1 つは8の全体のゲノムの約 50,000 枚とシングル着生大核 (図 1) が含まれていることです。細胞断片にゾウリムシの少なくとも 1 つのノードが含まれている限り、それは完全に再生成する能力を持ってください。ラッパムシの再生能力の基になる別のプロパティは、その驚異的な創傷治癒能力です。多くの細胞のタイプが9自分の傷の治癒が可能、ラッパムシは物理的な摂動の異常な範囲から回復することができます。以前ラッパムシ10で細胞質流動を可視化する方法とともに、抜本的な摂動からラッパムシ復旧の例は報告されなかった。これらのメソッドによりどのように負傷とそれに続く再生の影響の研究、細胞の物理的な状態。
ラッパムシの巨大なサイズ、異常な再生能力と、それが多細胞の胚 (主催者、axiation、パターニングなど) に見られる発達現象の多くをマニフェスト実際集めて中に多く発達生物学者トーマス ・ ハント ・ モーガンの7を含む最後の世紀の変わり目。50 年代、60 年代の間には、顕微鏡下の方法は、この単一 celled の有機体11の再生・形成過程の驚くべき配列を紹介されて。ただし、ラッパムシ最近開発された分子生物学モデル システムとしてのみ。過去数年、ラッパムシのゲノムは配列された、8を組み立て、餌で RNAi を用いた遺伝子発現を摂動する術が開発した12。
ラッパムシは現代分子生物学のみのモデル生物にした理由の一つは最近成長の長い細胞周期 (3 ~ 5 日) による大規模な文化の難しさがあった。ただし、現代の genomic および proteomic 方法ラッパムシ単細胞のボリュームは単一の分析のために開発された超高感度の方法に頼ることがなく、これらのメソッドは、十分な彼らには使用より少ない材料が必要ラッパムシよりはるかに小さいされているセル。プロトコルのセクション 1 は、単一のラッパムシセルから大規模な文化を確立するための手順を詳しく説明します。セルを切断して得られる細胞片から大規模な文化を確立する同じ方法を使用することができます。セクション 1 は、時間の長い期間にわたって健康ラッパムシ文化を維持するためのガイドラインを提供します。プロトコルのセクション 2 は、ガラス針で細胞を手動で切断することによって細胞の再生を誘導するための方法論を提供します。プロトコルのセクション 3 は特定のセル構造体 (membranellar バンドと口腔装置) の再生を誘導する 2 つの方法に捧げられて: 続いて、これらの構造の脱落につながる蔗糖あるいは尿素とセルを扱う、再生。プロトコルのセクション 4 では、時間の長い期間にわたって個々 の再生細胞のイメージング法を詳しく説明します。セクション 4 は、再生と再生のダイナミクスの解析のヒントの段階の説明で終わります。
Protocol
1.ラッパムシの養殖と単一細胞または細胞断片からラッパムシ文化の確立
- ラッパムシのための食糧として使用されるクラミドモナス文化を準備します。
- (材料表) の商業製造者からクラミドモナス細胞を取得します。
- 生殖不能の技術13を使用して市販のタップ メディアのクラミドモナスの 500 mL の液体培養を確立します。
- 週 2 回タップ メディアでそれを薄めて (約 1 の外径) で飽和に近い濃度でランプの下でクラミドモナス文化を保ちます。
注:クラミドモナス文化は、シェーカーで栽培できます。 - スライド上の文化のドロップを配置し、coverslip でそれを覆う、40 倍の倍率での顕微鏡の下でそれをチェック、クラミドモナス文化が健康かどうかを定期的にチェックします。
注:ラッパムシの餌それが細菌で汚染されている場合、またはクラミドモナス細胞、クラスターに集約されるカルチャを使用しないでください。これらの問題のいずれかが発生した場合は、新しいクラミドモナス文化を開始します。
- (材料表) の商業製造者からラッパムシ青斑核細胞を取得します。
- ラッパムシ細胞は、その自然の生息地から必要な場合は、池や湖、川11から収集します。
- 池や湖、川からラッパムシを収集、水は比較的穏やかな日陰に、明確ないくつかの植生の領域を見つけます。
注:ラッパムシ藻が育つ場所でを見つけることのより高い確率があります。 - 注ぎやすい容器に水の少なくとも 2 リットルを収集します。
- デトリタスと粒子状物質は、容器の底に解決して後は、優しくラッパムシ、大型コンテナーで解決するデトリタスの各コレクションの後、数秒間待ってをチェックするいくつかの小さな容器を入力します。
- 場所でサンプルのコレクションを完了すると、少なくとも 10 m は、新しい場所に移動し、そこのサンプルのコレクションを繰り返します。
注: すべての池、ラッパムシ人口サンプリングする複数の池があります。 - サンプル研究室に返され、個々 のペトリ皿にコンテナーから水を移します。
- 各ペトリ皿 5 倍の倍率で斜めの光で実体顕微鏡下ラッパムシを検索します。市販の殺菌春水 (PSW) の少なくとも 100 μ L を含むガラス スポット プレートのウェルに 1 mL ピペットを使用して個々 のラッパムシセルを転送します。
注: 基板 (図 1) に接続されているとき、ラッパムシ細胞はラッパのような形をしています。スイミングラッパムシセルがセル基板 (ビデオ 1) に接続されているより少ない拡張です。 - PSW 少なくとも 3 でラッパムシを洗う x。よく、ラッパムシ細胞を維持しながら井戸からの水の約 90% を除去することによって洗浄を実行に PSW の 500 μ L を追加することによって続きます。
注:ラッパムシピペット ピペット チップ 10 μ L 以下での使用を処理する前にカット大細胞を通過、生成されるせん断力による細胞の負傷を避けるためにハサミでピペット チップの端から約 0.5 mm 先端 op の小さすぎます。社。
- 池や湖、川からラッパムシを収集、水は比較的穏やかな日陰に、明確ないくつかの植生の領域を見つけます。
- ラッパムシのそれぞれの餌の前に、クラミドモナスを準備します。
- 手順 1.1 のように 1.5 mL 遠心チューブに準備クラミドモナス文化の 1 mL に転送します。3 min に 2,095 × g で遠心分離機します。
- 上澄みを除去し、PSW の中の 1 mL にペレットを再停止されます。3 分削除上澄み 2,095 × g で遠心し、PSW の 500 μ L でペレットを再懸濁します。
注: このように、洗浄、濃縮クラミドモナスが以下の手順で「クラミドモナス覚悟」と呼ばれます。タップ メディアは、ラッパムシ、ラッパムシを給餌は重要な前に従ってクラミドモナスを洗濯に有害です。
- クローンラッパムシ培養が必要な場合は、個々 のラッパムシセルまたはセル フラグメントから文化を開始します。
- ラッパムシ単細胞が PSW でよく育たないので、既存の健康ラッパムシ文化からメディアの 500 μ L の滅菌フィルター エアコン メディアを準備します。
- 調節されたメディアの 500 μ L をスポット ガラスの井戸の 1 つに転送します。
- エアコンのメディアを含むガラス スポット プレートのウェルに 1 つラッパムシを転送します。転送を行うため、できるだけ小さな媒体として使用します。
- すべての 48 h 準備クラミドモナスの各ラッパムシ5 μ L をフィードします。ラッパムシを分割、井戸のセルの数をカウントし、準備クラミドモナス細胞 1 個あたりの 5 μ L を追加します。
- セル (たとえば、明確なプラスチックの箱は、紙タオルで覆われている)、光に敏感であるので、日陰の場所にラッパムシをしてください。
- 新鮮な馴化培地毎の 96 h とよくラッパムシ培地を交換します。
- 1.5.1 のステップのように新鮮な調節されたメディアを準備します。
- 優しく上下に井戸の液体をピペッティングにより井戸の底からデタッチすべてのラッパムシセルを作る。
- 慎重によく使用して井戸に残っているすべてのセルを確かめる 1 mL ピペットから液を吸引します。井戸の中に新鮮な調節されたメディアの 500 μ L を追加します。
- 井戸のセルの数が 20 を超えたら、大規模なコンテナー、広口のガラス瓶などにセルを移動します。
- オートクレーブの広口のガラス瓶に PSW の 20 mL を追加します。
注:ラッパムシのガラスのオートクレーブは慎重に洗浄とすすぎで置き換えることができます。 - 慎重にピペット メディアの井戸の底からすべてのセルをデタッチするのには井戸の中を上下。1 mL のピペット チップを使用してすべてのラッパムシ細胞を収集し、そっとガラス瓶にそれらを転送します。
- オートクレーブの広口のガラス瓶に PSW の 20 mL を追加します。
- ラッパムシ文化、空気へのアクセス権を許可すると瓶の蓋を締めください。
- 約 20 のセル/mL でラッパムシ密度を保つために瓶ごとの 48 h に PSW を追加します。目で細胞密度を推定します。
注: また、瓶の中に文化の 1 mL をピペットの壁から外し、ピペット チップ内のセルの数をカウントするセルを作成するのにバブルの空気に 1 mL ピペットを使用します。 - すべての 48 h フィード覚悟クラミドモナスラッパムシ文化 jar ファイル (手順 1.4 参照)。準備クラミドモナスの 200 μ L で文化を給餌を開始します。文化のボリュームが増えると、1 mL を餌用に準備クラミドモナスの量を徐々 に増やします。
- 文化ボリューム瓶の容量の約 90% に達すると、文化をより大きい容器に転送します。
- 1 mL ピペット ガラスからラッパムシをデタッチすると、jar ファイル内にある文化の上下、ピペットします。
- Jar ファイルの内容全体を 2 カップ ガラス製の容器に注ぐ。
- PSW の残りラッパムシを収集する 2 カップ ガラス容器に約 25 mL の瓶をすすいでください。
- 2 カップ ガラス容器の健全な文化を維持します。
- フィードラッパムシ文化 2 mL 準備クラミドモナス文化の 100 mL あたりのすべての 4-5 日。約 20 のセル/mL でラッパムシ密度を保つためにすべての 4-5 日ガラス容器に PSW を追加します。
注: 450 mL、2 カップ コンテナーを保持している最大のボリュームです。 - 週に一度、ワムシ、真菌、および他の成長のために顕微鏡を切り裂く X 5 の下で文化を検査します。文化の健康を長引かせる、1 mL ピペットを使用して異常形と無色のラッパムシセルとともに汚染微生物を削除します。
- ガラス容器が約 90% と、文化を分割します。
- PSW の 25 mL をガラス容器に追加します。ガラスからラッパムシをデタッチするのには、上下 25 mL ピペット、ピペットを使用します。新しい 2 カップ ガラス容器に文化の約 50% に移動します。
- 両方の文化に PSW の 25 の mL を追加し、プロトコルのこのセクションで説明するように、2 つの文化を維持し続けます。
注:ラッパムシ細胞は高い温度に敏感なので文化が保管されている部屋の温度 25 ° c 以下を維持します。また、文化は、インキュベーターで保つことができます。ラッパムシ養殖のトラブルシューティングの表 1を参照してください。
- フィードラッパムシ文化 2 mL 準備クラミドモナス文化の 100 mL あたりのすべての 4-5 日。約 20 のセル/mL でラッパムシ密度を保つためにすべての 4-5 日ガラス容器に PSW を追加します。
2. 切削ラッパムシ細胞による再生を誘導します。
- 針の引き手を使用してプログラムを次のように使用して毛細管からいくつかの針: 熱 - 735、プル - 100、速度 - 110、時間 - 150、圧力 - 400。
- PSW の 50 mL で 4% セルロース溶液を準備します。
- セルロースの 1 グラムを追加 (粘度: 1500 cP) PSW 50 mL に。
- セルロースの溶解を容易にするために、少なくとも 8 時間のための 4 ° C で孵化させなさい。
- 室温で 4% セルロース溶液を維持します。
- カットを実行した後、細胞の断片を格納するためガラス スポット プレートを準備します。
- フィルターは、メディアから健全な文化、よく必要とするガラス スポットあたり 500 mL を滅菌します。
- それぞれ必要な井戸の滅菌メディアの 500 mL に転送します。
- 2 μ L の液滴の 1 つ健康ラッパムシ(定義されたトランペット形状、鮮やかな青緑色で、ない大きな液胞を持つ) を収集し、coverslip またはスライドの上に置きます。4% メチル セルロース (図 2) の 2 μ L を追加します。ラッパムシ(動画 2) を切断する前に減速ができます。
- 針を壊すようにできるだけ切削表面に平行としてガラス針を保持します。
- 解剖顕微鏡ステレオを使用して、ガラス針の先端を見つけて近く (図 3 a) セルに移動します。(図 3 b、C) の針と接触、ラッパムシ契約を観察します。
注: 困難の後端から前方を分離する方向にセルがある場合は、それを回転させる非常に優しく針の側面と。 - 2 つのセルをカットするガラス針の側で契約ラッパムシを軽くを押して(図 3 D と E、ビデオ 3)。フラグメントの融合を避けるために、それらの間の細胞質の接続がないことを確保する別の 2 つのフラグメントを移動 (図 3 f)。
- 両方のフラグメントは斜光と解剖顕微鏡の下で破片を調べることによって各少なくとも 1 つのゾウリムシ ノードであるかどうかを確認します。
注: は、細胞の生存に不可欠なゾウリムシ ノードが少なくとも 1 つを持っていることです。中またはカット後、セルは青顔料と共にそのペリクル (透明なシェル) を当てることがあります。ほとんどの場合、これは細胞の長期生存率を与えません。 - ステップ 2.3 で作製したガラス スポット プレートのウェルにフラグメントを移動します。
- 切り取ったセルの一部は再生成されませんので、複数セルを切り取る。
- 1 つのセッションで複数のカットを実行すると、それが大きくラッパムシ残渣や、その先端が壊れたでコーティングしたときガラス針を交換してください。また、シリコンのスペーサーの部分の上に優しくそれを拭くことによって針をきれい。
注: 複数セル切断セッションのガラス針を使用できます。 - 湿度チャンバーに細胞断片でガラス スポット プレートをしてください。
- イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生結果の解釈に進みます。
3. Membranellar バンド ・ スクロース ・尿素処理による口腔装置の再生を誘導します。
- ショ糖を用いた Membranellar バンドと口腔装置の除去
- PSW でショ糖の 25% 溶液を準備します。
- スナップ キャップ付き微量遠心チューブに PSW で 25% 蔗糖の 500 μ L を追加します。
- スクロース処理後セルを洗浄の PSW の中の 1 ml の各管内スナップ キャップが 3 マイクロ遠心チューブ用を準備します。
- 1 mL ピペット (図 4矢印 A) を使用して別の遠心管に 1 mL の培地で 30-60ラッパムシ細胞を収集します。
- 200 μ L ピペットを使用して単一の抽選で 125 μ L 最終巻でチューブからすべてのセルを収集します。625 μ 20% ショ糖液 (図 4矢印 B) を取得する (ステップ 3.1.2 の準備) 25% ショ糖の 500 μ L でチューブに転送します。ストップウォッチを起動します。
- この 20% ショ糖液とフリック スピン ラック 1 分の遠心チューブラッパムシを孵化させなさい。
- 1 回の描画でのすべての細胞を収集 (200 μ L 最大能力簡単にコレクションにピペットを調整)。
- ストップウォッチ表示スクロース処理の 2 分までピペット チップで細胞を維持します。
- 3.1.3 (図 4矢印 C) の手順で作製したマイクロ遠心チューブ用のいずれかにラッパムシを取り出します。ラックにチューブをフリック-スピン。
- 2 回以上一度 PSW を含むマイクロ遠心チューブ用の残りの 2 つのそれぞれの準備手順 3.1.3 (図 4D と E の矢印) でセルを洗浄します。
注: 単一のセル コレクション手法は洗浄の間に重要ではありません。 - イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生ダイナミクス (図 4F と G の矢印) の解釈に進みます。
- 尿素を用いた Membranellar バンドと口腔装置の除去
- PSW で 4% 尿素の溶液を準備します。
- スナップ キャップ付き微量遠心チューブに PSW で 4% 尿素の 300 μ L を追加します。
- スナップ キャップ 1 mL PSW の尿素処理後セルを洗浄の各管内を含む 3 マイクロ遠心チューブ用を準備します。
- 1 mL ピペット (図 4矢印 A) を使用して別の遠心管に 1 mL の培地で 30-60ラッパムシ細胞を収集します。
- 1 回の描画で 1 mL ピペットを使用して 300 μ L 最終巻でチューブからすべてのセルを収集します。2% 尿素溶液 (図 4矢印 B) 600 μ L を取得する 4% 尿素 (3.2.2 の手順で準備) の 300 μ L でチューブに転送します。ストップウォッチを起動します。
- この 2% 尿素とフリック スピン ラック 1 分の遠心チューブラッパムシを孵化させなさい。
- 1 回の描画のすべてのセルを収集します。
- ストップウォッチ表示尿素処理の 2 分までピペット チップで細胞を維持します。
- 3.2.3 (図 4矢印 C) の手順で作製したマイクロ遠心チューブ用のいずれかにラッパムシを取り出します。ラックにチューブをフリック-スピン。
- 2 回以上一度 PSW を含むマイクロ遠心チューブ用の残りの 2 つのそれぞれの準備手順 3.2.3 (図 4D と E の矢印) でセルを洗浄します。
注: 単一のセル コレクション手法は洗浄の間に重要ではありません。 - イメージングの詳細についてはプロトコルのセクション 4、ラッパムシ再生ダイナミクス (図 4F と G の矢印) の解釈に進みます。
4. イメージングと細胞の再生を分析
- 正立型顕微鏡を使用すると、ぶら下げ場合個々 のセルの画像再生するドロップレット法。
- スポット ガラスの十分に PSW の 100 μ L を入れてください。
- 文化メディア (彼らは、メディア) の 4 μ L で 1 つラッパムシのセルを分離、ピペット 10 または 20 μ L を使用します。22 × 22 mm2 coverslip (図 5) の真ん中に液滴を入金します。
注: セルを 1) 不健全なかどうか (異常形または重く胞) または 2) まだ membranellar バンドや口腔装置 (化学治療実験) のため、画像を使用しないでください。 - 液滴間の十分なスペースを残しながら以前の液滴中の文化メディアラッパムシの 4 の滴を配置します。
- 滴と coverslip の反転し、優しく PSW が手順 4.1 で追加されたガラス スポットの井戸の上に置きます。
- 注: 井戸の PSW は、(図 5) 液滴の蒸発を最小限になります。
- イメージング手順 4.1.1 - 4.1.4 で残りのセルを準備します。
- 再生細胞を必要な時間分解能を持つ顕微鏡をイメージします。また、解離性の実体顕微鏡を用いた再生を確認します。
注: セル切断または蔗糖あるいは尿素による治療直後に再生が開始されます。ただし、表示される新しい口腔構造は再生の初めの後約 3 h を形成します。
- 各時点の各セルに 3 つの再生の段階の 1 つを割り当てます。これを行うには、各セル (図 4および図 6) 段階を示す代表的な画像を比較します。
- (図 6 a) まだ membranellar のバンドを持っていない細胞にステージ 1 を割り当てます。
- Membranellar バンドとセルにステージ 2 を割り当てます。
注: membranellar バンド (図 4図 6 b) 治療後 3-6 時間が表示されます。このステージの一番最後に、membranellar バンドの後部の端の湾曲率が増加オーラル原基が表示される直前に表示されます。 - 経口原基の細胞にステージ 3 を割り当てます。
注: 口腔の原基は、陥入 membranellar バンド (図 4図 6 と 6 D) の後端で治療後 6-8 時間を表示します。セルは前方端と特徴的なトランペットのセル形状 (図 4,図 6 e) で membranellar バンドを持っている場合、再生は完了します。ラッパムシのほとんどの細胞は、再生の開始以来 8-9 h の内で完全に再生されます。
- 各積み上げボックス プロット (図 7) の形で各時点の再生段階のセルの割合をプロットします。
注意: このタイプのプロットは、細胞の人口の再生のダイナミクスの可視化をできます。
Representative Results
ラッパムシ文化は確実に確立し、個々 のセルまたはプロトコルのセクション 1 を使用してセルのフラグメントから維持されます。ビデオ 1に大きい健全な文化の代表的な例を示します。
再生の時間コースラッパムシステップ 3.1、イメージングとセクション 4 (図 7) で説明する分析方法に記載されている再生を開始するためショ糖治療法を使用して測定しました。このプロットは、任意の特定のステージに到達する細胞の人口によって撮影時間 1 時間広がりがあることを示します。このタイプの解析は、細胞の再生の人口の再生過程における的不均一性の研究をことができます。
(図 4および図 6) ショ糖治療の数十の後これまで観察されている再生タイミングの概要は以下です。ステージ 1 は、ラッパムシセル (この段階はショ糖ウォッシュ アウトした直後に開始)、membranellar 帯なし涙のようです。このステージ 3 6 h. ステージ 2 は membranellar バンド表示 (スクロース処理後 3-6 時間) の成長と続きます。3-4 秀ステージ 3 は経口原基が membranellar バンド (スクロース処理後 6-8 時間) の後部の端に表示され、セルの前の終わりの方の両方の構造を移動するときこの段階続きます。この段階は、1-2 時間続きます。Membranellar バンドと口腔装置細胞の前端に達する、これは再生の完了を示した。セルは、特徴的なラッパムシラッパのような形状を採用しています。セルは、スクロース処理後 8-9 h を完全に再生されたのでした。
図 1。ラッパムシのスナップショット。Membranellar バンドと口腔装置は細胞の前方の端に表示されます。止め金はセルの後部端に。ラッパムシ大核が着生します。よく供給ラッパムシは大抵クラミドモナスを含む緑の食胞。スケール バーは 0.5 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 2。ラッパムシ切断設定します。セル切断、市販解離性ステレオ顕微鏡を用いた細胞を見ながらガラス針を手動で操作することによって実行されます。ティッシュ ペーパーの目的より良いセルを表示する白い背景を提供することです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。ガラス針でラッパムシをカットする方法を示すビデオ 3 のスナップショット。(A) Aラッパムシ針がそれに触れる前にすぐに。(B) Aラッパムシは針とガラス スライド間優しく圧迫。(C) 契約ラッパムシ針の力に反応しています。(D) Aラッパムシ軽く針の側面とセルを押すカットされています。(E) Aラッパムシは今 2 つのカットが、区切られていません。(F) 2 つのラッパムシのフラグメント。スケール バーは 0.25 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4。セクション 3 とプロトコルのセクション 4 のスケマティック可視化。ショ糖や尿素処理や細胞の再生の観察を行うための図解プロトコルです。下部のパネルに示されている時刻は、洗って 1 の先頭から測定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5。正立型顕微鏡を用いた再生のイメージングおよび/または直接観察のためセットアップします。それぞれ 4 μ L の液滴は、coverslip からぶら下がって、再生を受けている 1 つのセルがあります。スポット ガラスの井戸の水は、水滴の蒸発を制限します。このセットアップは、次の並列で複数の細胞を再生できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6。ラッパムシの membranellar バンドと口腔装置再生の各段階でスナップショット。(A) ステージ 1 はティア ドロップのような細胞の形態と membranellar バンドの不在によって特徴付けられます。(B) 第 2 段階は、membranellar バンド、継続的に打つ繊毛ベースの構造の外観が特徴です。パネル B の白い破線が付いている Membranellar バンド - D (C と D) ステージ 3 は経口原基 (矢印でマーク) の出現によって特徴付けられます。経口原基は membranellar バンドの後端で、陥入のように見えます。口腔の原基は、口腔装置になること、セルの前方に向かって移動されます。セルは特性ラッパムシラッパのような形状を採用し、口腔装置 (矢印でマーク) がセルの前方終わりに拡大している (E) 再生が完了します。スケール バーは 0.25 mm ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 7。ボックス プロット表示をスタック スクロース処理後の再生のすべての段階における細胞の割合がどのように変化する時間をかけています。プロットは、再生細胞の人口内の再生段階のタイミングで不均一性を示しています。「登録終了」は、再生完了を示します。セル数: 28。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1。健全なラッパムシ文化の例。一般的に、文化は集中して、文化の分割お勧めします。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2。セルロースと減速しラッパムシ。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
動画 3.切削ラッパムシ。個々 のセルは、セルを介してガラス針を押すことによって顕微鏡を切り裂くステレオの下の複数の部分に手動でカットすることができます。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| 文化の問題 | 可能な治療 | 可能な限り予防 |
| 文化は、ワムシや他の大規模な生物によって圧倒されます。 | 新しい培養皿にできるだけ多くラッパムシを削除します。セルを 3 回洗います。 | 商業製造者から購入する場合でも、メッセージを受信するとき、ラッパムシを徹底的に洗います。 |
| 文化は、真菌や他の小さい有機体によって圧倒されます。 | 角を識別するが、少なくともラッパムシ。その地域で多くラッパムシを削除せず、可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW で追加します。ミックス優しくしかし徹底的 distrubute に侵入した微生物。次の授乳をスキップして、ラッパムシはそれらを食べる。 | 文化を定期的に観察し、新鮮な PSW のメディアを交換することによって小さい汚染物質を削除します。 |
| ラッパムシは互いの上に置くこと。 | 濃度は細胞/ml 未満 20 文化を分割します。 | 多くの文化を分割します。 |
| ラッパムシ細胞交尾します。 | 5 日ではなく 4 日ごとをフィードします。 | |
| 文化は、暗い廃棄物のたくさんを持っています。 | 多くの暗い材料、セルを削除せずに、できるだけ、ラッパムシ廃棄物として削除します。ラッパムシは、暗い材料に添付されている場合、は、廃棄物からラッパムシセル、セルを削除せず廃棄物をメディアを取り外します上下ピペットします。または、それらのラッパムシを削除し、それに応じてフィードより少ない。 | フィードのラッパムシ以下の食品文化の 100 mL あたり 1 mL。 |
| 不健康な探して (胞/肥大化または丸みを帯びた)ラッパムシ。 | ラッパムシ細胞の多くを削除せず可能な限りとして多くのメディアを削除し、新しい PSW を追加します。 | 定期的にメディアを交換します。 |
表 1。ラッパムシを培養するためのトラブルシューティング ガイド。
Discussion
ラッパムシを養殖の課題の数を示します。多数のセルを必要とする実験を実行するまず、ラッパムシ濃度 20 セル/mL を超えると不健康になる文化としてラッパムシ文化の多数を維持するためにであります。第二に、しばしばラッパムシ文化を汚染できる生物はラッパムシより分割し、(一般的な汚染物質はワムシ) 文化を圧倒します。したがって、顕微鏡下で培養を定期的に検査し、汚染物質を除去する必要は。時折、新しい文化は、汚染された文化から手動で救出された細胞の数が少ないから開始する必要があります。これは健康ラッパムシ文化を維持するために必要な時間が増加します。第三に、単一のセルを 400 mL 文化に進出と、ラッパムシ細胞周期は 3-5 日ために、少なくとも 1 ヶ月を必要です。第四に、他のモデルとは異なりと嚢胞フォームに繊毛虫ラッパムシ稀に凍結することはできません。
ラッパムシを養殖の重要な側面は、適切な食品の有機体の選択です。ラッパムシを培養するためのさまざまな方法が説明しました。それらの 1 つは、ラッパムシを供給するバクテリアを培養するスキムミルクを使用するように提案します。このような手法は養殖ラッパムシ; 効果的です。しかし、ゲノム技術のアプリケーションでは、未定義の餌生物からゲノムの読み取りによる混乱を避けるために純粋なサンプルが必要です。現在のプロトコルを使用して、ラッパムシを大量に育てることができる、彼らの食糧、クラミドモナスが配列されているので食品有機体からの遺伝子汚染の存在することができます検出および制御します。未知の理由のため歯石を前にラッパムシを見つけた彼に戻って彼の在庫を補充するために持っていた。現在のプロトコルでは、長年ラッパムシを維持できました。
ラッパムシ再生実験は一般に簡単ですが、留意すべきいくつかの重要な詳細があります。ラッパムシを切断に関してセクション 2 分で半分のセルを習得できます。ラッパムシのより高度な手術の手順をマスターすると、1 週間練習が必要があります。一方、スクロース処理が次に実行されるときの 10-30 s インキュベーション時間を増やす蔗糖あるいは尿素治療 (セクション 3)、イメージングの初めにほとんどの細胞はまだ自分たちの membranellar のバンドがある場合を実行します。それは細胞死になりますので 3 分インキュベーションを超えてスクロース処理の時間を増やさないでください。
ラッパムシの画像再生時間の長い期間にわたって大型細胞をイメージする方法が必要です。セクション 4 で詳細なイメージング法は、正立型顕微鏡でのみ使用できます。倒立顕微鏡が利用できる代わりに、スライドまたは小型チャンバーの coverslip のセルが配置できます。1 つの方法は、蒸発を防ぐために別の coverslip でワセリンとカバーの商工会議所を作成します。1 × 1 cm2のシリコン スペーサーの正方形で希望のサイズの穴を開けると穴を作るで、個々 のセルの商工会議所または、可能 (材料表)、観察にスペーサーを配置すること、商工会議所のセルを置くこと、と別の coverslip の商工会議所をカバーします。ラッパムシは、再生の各段階の特徴を観察する向きが正しいされていない場合、イメージング、携帯契約させるしっかりとプレートをタップします。細胞の再生の段階を識別するために拡張を見る (完全な拡張は約 45 秒)。間違った方向のセルでは、タップを繰り返します。図 1と図 6に示すように画像が撮影されたステレオ ズーム顕微鏡;ただし、詳細すべての実験は、実体顕微鏡を切り裂く X 5 を使用して実行できます。
養殖やラッパムシをイメージング以外の別の挑戦再生、特に段階を識別するために必要な時間の量の追跡であります。再生細胞がはっきりと見える口腔原基の領域と完全に指向の場合、ステージの同定は数秒をかかります。場合によっては、ただし、ラッパムシセルがので識別するより多くの時間を割いて、再生段階の明確な割り当てを防止する方向で。再生細胞が待機するオブザーバーを必要とするステージングの時間精度の減少、すべての再生細胞の定量を遅れる可能性がありますステージとイメージを再作成後にセルに移動に必要な時間のかなりの量新しい向き。したがって、この実験は時間と労力がかかりました。これらの理由から、ラッパムシ細胞を検出し、ビデオ顕微鏡検査データの再生の段階を割り当てるのための自動方法を開発する非常に望ましいでしょう。これらはまたより多くの再現実験に、サンプル サイズ、および人間バイアスの除去で増加します。
高感度の genomic および proteomic 方法の出現は、リーチに単一細胞の研究を入れてし始めています。このような単一細胞解析のラッパムシセルの巨大なサイズ概念実証実験のため、望ましいテストの対象になります。可能にするそのような実験のためラッパムシの養殖が、基本で、ここで説明する方法より高度な単一セル技術の更なる発展に役割を果たすべきので。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH グラント R01 GM113602 (WFM) と NSF 1144247 (AL) によって支持されました。我々 は、有益な議論では、これらのプロトコルのいくつかの初期のバージョンを開発するため、マーク Slabodnick とナタリー カークランドを認めます。原稿の批判的な読み、カリーナ Perlaza とグレイソン ・ ルイスに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
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