Metoder til undersøgelse af regenerering i Stentor

Summary

Den gigantiske randhårede, Stentor coeruleus, er et fremragende system til at studere regenerering og sårheling. Vi præsenterer procedurer for oprettelse af Stentor cellekulturer fra enkelt celler eller celle fragmenter, inducerende regenerering af skæring celler, kemisk inducerende regenerering af membranellar band og oral apparater, billedbehandling og analyse af celle regenerering.

Abstract

Cellerne behøver for at kunne regenerere deres dele til at inddrive fra eksterne forstyrrelser. Den encellede randhårede Stentor coeruleus er en fremragende model organisme at studere sårheling og efterfølgende celle regenerering. Stentor genom blev tilgængelig for nylig, sammen med moderne molekylærbiologiske metoder, såsom RNAi. Disse værktøjer gør det muligt at studere enkelt celle regenerering på molekylært niveau. Den første del af protokollen omfatter etablering af Stentor cellekulturer fra enkelt celler eller celle fragmenter, sammen med generelle retningslinjer for at opretholde Stentor kulturer. Dyrkning Stentor i store mængder giver mulighed for brug af værdifulde værktøjer som biokemi, sekventering og massespektrometri. Efterfølgende afsnit af protokollen dække forskellige tilgange til at inducere regenerering i Stentor. Manuelt skære celler med en glas nål giver mulighed for at studere regenerering af store celle dele, mens behandling af celler med enten saccharose eller urea giver mulighed for at studere regenerering af specifikke strukturer placeret i den forreste ende af cellen. En metode til billedbehandling individuelle regenererende celler tilbydes sammen med en rubrik for iscenesættelse og analysere dynamikken i regenerering. Hele processen med regenerering er opdelt i tre faser. Ved at visualisere dynamikken i progression af en population af celler gennem faser, godtgøres heterogenitet i regenerering timing.

Introduction

Celler er ikke simpel poser af enzymer, men temmelig meget komplekse maskiner hvis komponenterne er omhyggeligt skaleret til den korrekte størrelse og arrangeret i veldefinerede stillinger. Morfogenese af individuelle celler repræsenterer en vigtig proces i celle og udviklingsmæssige biologi, men dens molekylære mekanisme er ukendt^1,2. Mens nogle kulturperler celler ligner klatter, kan encellede organismer have ekstremt kompliceret arkitekturer, eksemplificeret ved de komplekse kortikale mønstre set i infusionsdyr^3,4.

Måske er det mest ekstreme eksempel på en meget struktureret celle Stentor coeruleus, en kæmpe heterotrichous randhårede fjernt beslægtede Tetrahymena og Paramecium. Stentor er 1 mm lange og er dækket med mere end 100 langsgående striber i blå pigment skiftevis med rækker af cilier arrangeret af parallelle stakke af mikrotubulus bånd, der kører længden af hele cellen. Cellen er trompet-formet (figur 1), med et membranellar band og en oral apparater (OA) på sin forreste ende, og en holdfast, der tillægger substrat i den bageste ende af cellen. Ud over klare anterior-posterior polaritet viser cellen også en karakteristisk chiral mønstre, således at afstanden mellem ciliaere rækker gradvist øges i urets retning. Dette resulterer i en diskontinuitet, hvor den smalleste række møder den bredeste række, og denne region af cellens overflade, kendt som hjemsted for stribe kontrast, kan inducere dannelse af det andet sæt af forreste ende strukturer når podet på en anden celle⁵, gør det formelt svarende til Spemann's Organizer. Alle centrale processer af udviklingsmæssige biologi har således deres analoger i Stentor: axiation, mønster dannelse og induktion. I et embryon, disse processer er drevet af skæbne forskelle mellem forskellige celler, men i Stentor, de skal være drevet af skæbne forskelle mellem forskellige regioner inden for en enkelt celle. Hvad definerer forskellene mellem regionerne inden for Stentor er et mysterium.

Hvis nogen del af Stentor er afskåret, kan den manglende brik i cellen regenerere for at give en normal celle i løbet af få timer. Hvis en celle er skåret i halve, eller selv i meget små stykker, hvert stykke reorganiserer i en normal udseende, men mindre celle og gendanner korrekt proportionalitet mellem celle dele^6,7. Selv små fragmenter, 1/64^th størrelsen af den oprindelige celle, er i stand til at regenerere i en lille, men normalt velproportioneret celle, og derefter vokse til fuld størrelse⁶. Stentor præsenterer således en enestående mulighed for at studere mekanismerne af organelle størrelse skalering og celle vækst forordning ved hjælp af kirurgiske metoder, der anvendes som regel på niveauet af væv eller hele organismer.

En af egenskaberne for Stentor der gør det muligt at regenerere fra en lang række kirurgiske indgreb er, at det indeholder en enkelt nodulated macronucleus (figur 1) med ca. 50.000 eksemplarer af hele genom⁸. Så længe en celle fragment indeholder mindst én macronuclear node, har det evnen til at regenerere fuldt ud. En anden ejendom underliggende Stentorregeneration evne er uhyre sårheling evne. Selv om mange celletyper er i stand til at healing deres sår⁹, er Stentor stand til at inddrive fra en usædvanlig række fysiske forstyrrelser. Et eksempel på Stentor inddrivelse fra en drastisk undertrykkelse af netbårne, sammen med metoder til at visualisere cytoplasmatisk flow i Stentor¹⁰ blev tidligere rapporteret. Disse metoder giver mulighed for undersøgelse af hvordan såret og efterfølgende regenerering påvirker den fysiske tilstand af cytoplasma.

Stentorenorme størrelse, ekstraordinære regeneration evne, og det faktum, at det manifesterer sig mange af de udviklingsmæssige fænomener set i flercellede embryoner (som arrangører, axiation og mønstre) tiltrak mange udviklingsmæssige biologer under Drej af det sidste århundrede, herunder Thomas Hunt Morgan⁷. I løbet af 50 's og 60 's viste microsurgical metoder en overraskende vifte af regenerativ og morfogenetiske processer i denne encellet organisme¹¹. Men, Stentor er blevet udviklet som en molekylær biologi modelsystem for nylig. I løbet af de sidste mange år, Stentor genom blev sekventeret og samlet⁸, og metoden til at forurolige genekspression ved hjælp af RNAi af fodring var udviklede¹².

En af grundene til at Stentor blev udviklet i en model organisme for moderne Molekylærbiologi kun for nylig var vanskeligheden ved voksende store kulturer på grund af sin lange celle cyklus (3 til 5 dage). Men moderne genomisk og proteom metoder kræver mindre materiale end de plejede, og omfanget af en enkelt Stentor celle er tilstrækkelig til disse metoder, selv uden at ty til ultrasensitive metoder, der er blevet udviklet til analyse af single celler, der er meget mindre end Stentor. § 1 i protokollen detaljer proceduren for etablering af en stor kultur fra et enkelt Stentor celle. Den samme tilgang kan bruges til at etablere en stor kultur fra en celle fragment opnået ved at skære en celle. Afdeling 1 giver også retningslinjerne for at opretholde sunde Stentor kulturer over lange perioder. Afsnit 2 i protokollen giver metoden for at fremkalde celle regenerering ved at skære cellerne manuelt med et glas nål. Afsnit 3 i protokollen er dedikeret til to metoder af inducerende regenerering af specifikke cellestrukturer (membranellar band og oral apparater): behandling af celler med enten saccharose eller urea fører til afgivelse af disse strukturer, efterfulgt af deres regenerering. Afsnit 4 i protokollen beskriver en metode til billeddannelse af enkelte regenererende celler over lange perioder. Afsnit 4 ender med beskrivelse af faser af regenerering og tips om analyse af regenerering dynamics.

Protocol

1. dyrkning Stentor og etablere Stentor kulturer fra enkelt celler eller celle fragmenter

1. Forberede Chlamydomonas reinhardtii kultur til at blive brugt som mad til Stentor.
   1. Få Chlamydomonas reinhardtii celler fra en kommerciel leverandør (Tabel af materialer).
   2. Etablere en 500 mL flydende kultur af Chlamydomonas reinhardtii i kommercielt tilgængelige TAP medier ved hjælp af steril teknik¹³.
   3. Holde Chlamydomonas kulturen under en lampe på en koncentration i nærheden af mætning (på OD på omkring 1) ved at fortynde det med TAP medier to gange om ugen.
      Bemærk: Chlamydomonas kulturen kan dyrkes på en shaker.
   4. Regelmæssigt kontrollere, om Chlamydomonas kulturen er sundt ved at placere en dråbe af kultur på et dias, dækker det med en coverslip og tjekke det under et mikroskop på 40 X forstørrelse.
      Bemærk: Brug ikke kulturen til Stentor fodring hvis det er forurenet med bakterier eller hvis Chlamydomonas celler er samlet i klynger. Hvis nogen af disse problemer opstår, starte en ny Chlamydomonas kultur.
2. Få Stentor coeruleus celler fra en kommerciel leverandør (Tabel af materialer).
3. Eventuelt Stentor celler fra deres naturlige habitat, indsamle dem fra en dam, sø eller flod¹¹.
   1. For at indsamle Stentor fra en dam, finde sø eller flod, et område med nogle vegetation, hvor vandet er relativt rolig, skyggefuld og klart.
      Bemærk: Der er en højere sandsynlighed for at finde Stentor på steder hvor andemad vokser.
   2. Indsamle mindst 2 L vand i en beholder, der er let at hælde fra.
   3. Efter efterladenskaber og partikler har fast til bunden af beholderen, forsigtigt fylde et par mindre beholdere til at undersøge for Stentor, venter et par sekunder efter hver samling for detritus at bosætte sig i de store containere.
   4. Når indsamlingen af prøver er afsluttet på en placering, flytte til en ny placering, der er mindst 10 m væk og gentage indsamling af prøver der.
      Bemærk: Ikke alle Dam har en Stentor befolkning, så flere damme kan ikke udtages.
   5. Vende tilbage med prøverne til laboratoriet og overføre vand fra containere til individuelle petriskåle.
   6. I hver petriskål, søge efter Stentor under et stereomikroskop med skrålys på 5 X forstørrelse. Overføre enkelte Stentor celler ved hjælp af 1 mL pipette til et godt af en plet glasplade, der indeholder mindst 100 µL af kommercielt tilgængelige pasteuriseret kildevand (PSW).
      Bemærk: Stentor celler har en trompet-lignende form, når de er knyttet til et substrat (figur 1). Svømning Stentor celler er mindre udvidede end de celler, der er knyttet til et substrat (Video 1).
   7. Vask Stentor i PSW mindst 3 x. Udføre vasker ved at fjerne omkring 90% af vandet fra godt samtidig holde Stentor celler i brønden, efterfulgt af tilføje 500 µL af PSW i brønden.
      Bemærk: Før håndtering Stentor brug af pipetter med pipette tips af 10 µL eller mindre, skåret omkring 0,5 mm ud i slutningen af pipette tip med saks til at undgå sårede celler på grund af shear kræfter, der er genereret som en stor celle løber gennem alt for lille for et tip op delsen.
4. Forberede Chlamydomonas før hver fodring af Stentor.
   1. Der overføres 1 mL af Chlamydomonas kultur parat som trin 1.1 ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør. Der centrifugeres ved 2,095 x g i 3 min.
   2. Fjern supernatanten og genopslemmes pellet i 1 mL PSW. Der centrifugeres ved 2,095 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 500 µL af PSW.
      Bemærk: Således, vasket og koncentreret Chlamydomonas vil blive henvist til som "forberedt Chlamydomonas"i følgende trin. TAP medierne er skadelig for Stentor, således vask Chlamydomonas før fodring Stentor er vigtig.
5. Hvis en klonal Stentor kultur er nødvendig, starte kulturen fra en enkelt Stentor celle eller en celle fragment.
   1. Da enkelt Stentor celler ikke vokser godt i PSW, forberede konditioneret medier af filter sterilisering 500 µL af medier fra en eksisterende, sund Stentor kultur.
   2. Overføre 500 µL af konditioneret medier til en af brøndene af en spot glasplade.
   3. Overføre én Stentor i brønden af den spot glasplade, der indeholder konditioneret medier. Bruge som lille medium som muligt til at foretage overførslen.
   4. Feed hver Stentor 5 µL af rede Chlamydomonas hver 48 timer. Når Stentor kløft, tælle antallet af celler i godt og tilsæt 5 µL af rede Chlamydomonas pr. celle.
   5. Holde Stentor i et skyggefuldt sted, da cellerne er følsomme over for lys (for eksempel i klar plast kasser dækket med papirservietter).
   6. Udveksle Stentor medium i godt med frisk konditioneret medium hver 96 timer.
      1. Forberede frisk konditioneret medier som i trin 1.5.1.
      2. Gøre alle Stentor celler løsnes fra bunden af brønden af forsigtigt pipettering væsken op og ned i brønden.
      3. Omhyggeligt Aspirér væsken fra de godt bruge en 1 mL pipette, og sørg for alle celler forbliver i brønden. Tilføje 500 µL af frisk konditioneret medier til brønden.
   7. Når antallet af celler i brønden overstiger 20, flytte cellerne til en større container, for eksempel, en bred mund glaskrukke.
      1. Der tilsættes 20 mL af PSW i en autoklaveres bred mund glaskrukke.
         Bemærk: Autoklavering af glasvarer til Stentor kan erstattes med forsigtig vask og skylning.
      2. Omhyggeligt afpipetteres medierne op og ned i brønden at løsrive alle celler fra bunden af brønden. Indsamle alle Stentor celler ved hjælp af en 1 mL pipette tip og forsigtigt overføre dem til en glaskrukke.
   8. Spænd ikke låg på krukker med Stentor kulturer, at give tilstrækkelig adgang til luft.
   9. Tilføje PSW til jar hver 48 timer for at holde Stentor tæthed på omkring 20 celler/mL. Anslå tætheden af celler ved øjet.
      Bemærk: Brug alternativt 1 mL pipette til boble luft i krukken for at gøre celler løsnes fra væggene, pipetteres op 1 mL af kulturen, og tæller antallet af celler i pipette tip.
   10. Hver 48 h, foder forberedt Chlamydomonas til Stentor kulturer i krukker (Se trin 1.4). Start med fodring kultur med 200 µL af rede Chlamydomonas. Efterhånden som mængden af kulturen, gradvist øge mængden af rede Chlamydomonas anvendes til fodring af op til 1 mL.
   11. Når kultur volumen når omkring 90% af krukkens kapacitet, overføre kulturen til en større beholder.
       1. Der afpipetteres kultur indeni krukken, op og ned med 1 mL pipette at løsrive Stentor fra glasset.
       2. Hæld hele indholdet af krukken i en 2-kop glasbeholder.
       3. Skyl krukke med ca. 25 mL PSW i 2-kops glasbeholder til at indsamle de resterende Stentor.
6. Opretholde sunde kulturer i glasbeholdere med 2-cup.
   1. Feed Stentor kulturer 2 mL af rede Chlamydomonas pr. 100 mL af kultur hver 4-5 dage. Tilføje PSW til glasindsatsen hver 4-5 dage for at holde Stentor tæthed på omkring 20 celler/mL.
      Bemærk: 450 mL er den maksimale lydstyrke, en 2-kop container holder.
   2. En gang om ugen, inspicere kulturer under en 5 X dissekere mikroskop for hjuldyr, svamp og andre vækst. For at forlænge sundhed af kultur, fjerne kontaminerende mikroorganismer sammen med unormalt formede og farveløs Stentor celler ved hjælp af 1 mL pipette.
   3. Når glasindsatsen er omkring 90% fuld, splitte kulturen.
      1. Tilsættes 25 mL PSW til glasindsatsen. Bruge en 25 mL pipette til pipetteres op og ned for at løsrive Stentor fra glasset. Flytte omkring 50% af kulturen ind i en ny 2-kop glasbeholder.
      2. Tilsættes 25 mL PSW til begge kulturer og fortsat opretholde de to kulturer, som beskrevet i dette afsnit af protokollen.
         Bemærk: Da Stentor celler er følsomme over for høj temperatur, holde temperaturen ved 25 ° C eller lavere i rummet hvor kulturer holdes. Alternativt, kulturer kan holdes i en inkubator. Se tabel 1 for fejlfinding af Stentor dyrkning.

2. inducerende regenerering af skæring Stentor celler

1. Brug en nål aftrækker for at gøre flere nåle fra kapillarrør ved hjælp af programmet som følger: varme - 735, pull - 100, velocity - 110, tid - 150, pres - 400.
2. Forberede en 4% methylcellulose løsning i 50 mL af PSW.
   1. Tilføje 1 g af methylcellulose (viskositet: 1500 cP) til 50 mL af PSW.
   2. Inkuber ved 4 ° C i mindst 8 h at lette opløsningen af methylcellulose.
   3. Holde 4% methylcellulose løsning ved stuetemperatur.
3. Forberede en spot glasplade til opbevaring celle fragmenter efter udførelse af nedskæringerne.
   1. Filter sterilisere medier fra en sund kultur, 500 mL pr. spot glasplade godt behov.
   2. Overføre 500 mL steriliseret medier i hver af brøndene behov.
4. Indsamle en sund Stentor (med en defineret trompet figur, pulserende blå-grøn farve og ingen store vacuoles) i en 2 µL droplet og placere den på en coverslip eller dias. Tilføj 2 µL af 4% methylcellulose (figur 2). Lad Stentor langsom ned før skære det (Video 2).
5. Hold glasset nålen som parallelt med skærefladen som muligt for at forhindre, at bryde nålen.
6. Ved hjælp af en stereo dissekere mikroskop, finde spidsen af glas nålen og flytte det tættere til celle (figur 3A). Iagttage kontraktens Stentor ved kontakt med nål (figur 3B og C).
   Bemærk: Hvis cellen er i en retning, der gør adskiller den forreste ende fra den bageste ende vanskeligt, rotere det meget forsigtigt med siden af nålen.
7. Tryk forsigtigt på den aftalte Stentor med siden af glasset nål til at skære cellen i to(figur 3D og E, Video 3). Flytte de to fragmenter fra hinanden, at sikre, at der er ingen cytoplasmatisk forbindelse mellem dem, for at undgå fragment fusion (figur 3F).
8. Kontrollere, om begge fragmenter har mindst én macronuclear node hver ved at undersøge fragmenter under et dissekere mikroskop med skrå belysning.
   Bemærk: At have mindst én macronuclear node er afgørende for celle overlevelse. Cellen kan kaste sin halvgennemsigtigt (gennemsigtig shell) sammen med den blå-grøn pigment under eller efter snittet. I de fleste tilfælde vil dette ikke påvirke den langsigtede levedygtighed af cellen.
9. Flytte fragmenter i wells af en spot glasplade forberedt i trin 2.3.
10. Klippe flere celler, fordi en brøkdel af de overskårne celler ikke vil regenerere.
11. Hvis udfører flere nedskæringer i én session, skal du erstatte glas nålen, når det bliver stærkt belagt med Stentor restkoncentrationer, eller når dens spids er brudt. Alternativt rense nålen ved at tørre den forsigtigt på et stykke silicium spacer.
    Bemærk: Glas nåle kan bruges til flere celle skæring sessioner.
12. Holde den spot glasplade med celle fragmenter i et fugtigt kammer.
13. Gå til afsnit 4 i protokollen for detaljer om billedbehandling og fortolkning af Stentor regenerering resultater.

3. inducerende regenerering af Membranellar Band og Oral apparater af saccharose eller Urea behandling

1. Membranellar band og oral apparater fjernelse ved hjælp af saccharose
   1. Forberede en 25% opløsning af saccharose i PSW.
   2. Tilføje 500 µL af 25% saccharose i PSW til et microcentrifuge rør med en snap hætten.
   3. Forbered 3 microcentrifuge rør med snap caps med 1 mL PSW i hver tube til at vaske cellerne efter saccharose behandling.
   4. Saml 30-60 Stentor celler i 1 mL af deres kultur medier ind i en separat microcentrifuge rør med 1 mL pipette (figur 4, pil A).
   5. Indsamle alle cellerne fra røret i 125 µL endelige rumfang ved hjælp af en 200 µL pipetteres i et enkelt draw. Overfør dem til rør med 500 µL af 25% saccharose (udarbejdet i trin 3.1.2) for at opnå 625 µL af 20% rørsukkeropløsning (figur 4, pil B). Start et stopur.
   6. Inkuber Stentor i denne 20% rørsukkeropløsning og flick-spin microcentrifuge røret i rack for 1 min.
   7. Indsamle alle cellerne i et enkelt draw (justere pipette til 200 µL max kapacitet for lettere samling).
   8. Holde cellerne i pipette spidsen indtil stopuret viser 2 min af saccharose behandling.
   9. Skubbe Stentor i en af de microcentrifuge rør forberedt i trin 3.1.3 (figur 4, pil C). Flick-spin tube i rack.
   10. Vaske cellerne to gange, én gang i hver af de to resterende microcentrifuge rør indeholdende PSW forberedt taktfast 3.1.3 (figur 4, pile D og E).
       Bemærk: Single draw celle samling teknik er ikke vigtigt i mellem vasker.
   11. Gå til afsnit 4 i protokollen for detaljer om billedbehandling og fortolkning af Stentor regenerering dynamics (figur 4, pile F og G).
2. Membranellar band og oral apparater fjernelse ved hjælp af urinstof
   1. Der fremstilles en opløsning af 4% urea i PSW.
   2. Tilføje 300 µL af 4% urea i PSW til et microcentrifuge rør med en snap hætten.
   3. Forbered 3 microcentrifuge rør med snap caps indeholdende 1 mL PSW i hver tube til at vaske cellerne efter urinstof behandling.
   4. Saml 30-60 Stentor celler i 1 mL af deres kultur medier ind i en separat microcentrifuge rør med 1 mL pipette (figur 4, pil A).
   5. Indsamle alle cellerne fra røret i 300 µL endelige rumfang ved hjælp af 1 mL pipette enkelt uafgjort. Overfør dem til rør med 300 µL af 4% urea (udarbejdet i trin 3.2.2) for at få 600 µL af 2% urea løsning (figur 4, pil B). Start et stopur.
   6. Inkuber Stentor i denne 2% urea løsning og flick-spin microcentrifuge røret i rack for 1 min.
   7. Indsamle alle cellerne i et enkelt draw.
   8. Holde cellerne i pipette spidsen indtil stopuret viser 2 min af urinstof behandling.
   9. Skubbe Stentor i en af de microcentrifuge rør forberedt i trin 3.2.3 (figur 4, pil C). Flick-spin tube i rack.
   10. Vaske cellerne to gange, én gang i hver af de to resterende microcentrifuge rør indeholdende PSW forberedt taktfast 3.2.3 (figur 4, pile D og E).
       Bemærk: Single draw celle samling teknik er ikke vigtigt i mellem vasker.
   11. Gå til afsnit 4 i protokollen for detaljer om billedbehandling og fortolkning af Stentor regenerering dynamics (figur 4, pile F og G).

4. imaging og analysere celle regenerering

1. Hvis du bruger en opretstående mikroskop, bruge hængende droplet metode til billede regenerering af individuelle celler.
   1. Sætte 100 µL af PSW i et godt af en plet glasplade.
   2. Isolere 1 Stentor celle i 4 µL af kultur medier (de medier, som de befinder sig i), ved hjælp af en 10 eller 20 µL afpipetteres. Deponere droplet midt i en 22 x 22 mm² coverslip (figur 5).
      Bemærk: Hvis cellerne, der 1) usunde (unormalt formede eller stærkt vacuolated) eller 2) stadig har membranellar bands eller oral apparater (for kemisk behandling eksperimenter), må ikke anvendes til billedbehandling.
   3. Arrangere 4 flere dråber af Stentor i dyrkningsmedier omkring de foregående dråbe, samtidigt med at indlevering nok plads mellem dråber.
   4. Vend coverslip med dråber og Anbring det forsigtigt over godt af den spot glasplade som PSW blev tilføjet i trin 4.1.
   5. Bemærk: PSW i brønden vil minimere fordampning af dråber (figur 5).
   6. Forberede de resterende celler til billeddannelse ved at følge trin 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Image regenererende cellerne under et mikroskop med den ønskede tidsopløsning. Alternativt, observere regenerering ved hjælp af en dissekere stereo mikroskop.
      Bemærk: Regeneration vil begynde umiddelbart efter celle skæring eller behandling med saccharose eller urea. Dog vil synlige nye mundtlige strukturer være ca 3 h efter begyndelsen af regenerering.
2. Hvert tidspunkt, knytte en af de tre regenerering faser til hver af cellerne. For at gøre dette, skal du sammenligne hver celle til de repræsentative billeder illustrerer stadier (figur 4 og figur 6).
   1. Tildele fase 1 til de celler, der ikke har et membranellar band endnu (figur 6A).
   2. Tildel celler med et membranellar band fase 2.
      Bemærk: Et membranellar band vises 3-6 h efter behandling (figur 4, fig. 6B). I slutningen af dette stadium vises en ekstra krumning af den bageste ende af membranellar band lige før en mundtlig primordium vises.
   3. Tildel celler med en mundtlig primordium fase 3.
      Bemærk: En mundtlig primordium er en invagination optræder 6-8 h efter behandling i den bageste ende af membranellar band (figur 4, figur 6 c og 6 D). Regeneration er afsluttet når cellerne har et membranellar band ved deres forreste ende og den karakteristiske trompet celle figur (figur 4, figur 6E). De fleste Stentor celler er fuldt regenereres inden for 8-9 h siden starten af regenerering.
3. Afbilde procentdelen af celler i hver af regenerering faser for hvert tidspunkt i form af en stablet box plot (figur 7).
   Bemærk: Denne type af plot tillader visualisering af regenerering dynamik i en population af celler.

Representative Results

Stentor kulturer har været pålideligt oprettes og vedligeholdes fra individuelle celler eller celle fragmenter ved hjælp af § 1 i protokollen. Et repræsentativt eksempel på en stor sund kultur er vist i Video 1.

Tidsforløb for regeneration blev målt i Stentor ved hjælp af metoden saccharose behandling for at indlede regenerering skitseret i trin 3.1, kombineret med billedbehandling og analysemetode, der er omtalt i afsnit 4 (figur 7). Dette plot angiver, at der er en ene-time-lange spredning i den tid af befolkningen i celler at nå noget bestemt tidspunkt. Denne type analyse giver mulighed for undersøgelse af tidsmæssige heterogenitet i regenereringsprocessen i en population af regenerere celler.

Følgende er et resumé af regenerering timing, der er blevet observeret hidtil efter snesevis af saccharose behandlinger (figur 4 og figur 6). Fase 1 er når Stentor celler ligne teardrops uden nogen membranellar band (denne fase begynder umiddelbart efter saccharose udvaskning). Denne fase varer for 3-6 h. fase 2 er, når et membranellar band vises og vokser (3-6 h efter saccharose behandling). Denne fase varer for 3-4 h. fase 3 er når en mundtlig primordium vises på den bageste ende af membranellar band (6-8 h efter saccharose behandling), og begge strukturer er flyttet mod den forreste ende af cellen. Denne fase varer 1-2 h. Når både membranellar bandet og den mundtlige apparater nåede den forreste ende af cellen, tydede dette færdiggørelsen af regenerering. Cellen har vedtaget karakteristiske Stentor trompet-lignende form. Celler var helt genskabt 8-9 h efter saccharose behandling.

Figur 1. Øjebliksbillede af Stentor. Membranellar band og den mundtlige apparater er vist i den forreste ende af cellen. Holdfast er på den bageste ende af cellen. Stentor macronucleus er nodulated. En velnærede Stentor har grøn mad vacuoles indeholder for det meste Chlamydomonas. Skalalinjen er 0,5 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Stentor skæring set-up. Celle skæring udføres ved manuelt at manipulere et glas nål mens du kigger på cellen ved hjælp af en kommercielt tilgængelig dissekere stereo mikroskop. Formålet med silkepapir er at give den hvide baggrund for at se de celler bedre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3. Snapshots af Video 3 illustrerer, hvordan man klippe en Stentor med et glas nål. (A) A Stentor umiddelbart før nålen rører det. (B) en Stentor presses forsigtigt mellem en nål og glas dias. (C) indgået Stentor reagerer på kraften af nålen. (D) A Stentor skæres ved forsigtigt at trykke på cellen med siden af nålen. (E) A Stentor nu skåret i to men adskilt ikke. (F) to Stentor fragmenter. Skalalinjen er 0,25 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4. Skematisk visualisering af del 3 og del 4 i denne protokol. Dette er en illustreret protokol til udførelse af saccharose eller urea behandling og observation af celle regenerering. Den tid, der er angivet i bundpanelet er målt fra begyndelsen af vask 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5. Installationsprogrammet til billedbehandling og/eller direkte observation af regenerering med en opretstående mikroskop. I hver 4 µL droplet hængende fra coverslip, er der én celle under regenerering. Vand i brøndene af spot glasplade begrænser fordampning af dråberne. Denne konfiguration giver mulighed for efter regenerering af flere celler sideløbende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Snapshots af Stentor i hver fase af membranellar band og oral apparater regenerering. (A) fase 1 er karakteriseret ved en teardrop-lignende celle figur og fraværet af membranellar band. (B) fase 2 er kendetegnet ved forekomsten af membranellar band, en cilia-baserede struktur, der slår kontinuerligt. Membranellar bands er markeret med hvide stiplede linjer i paneler B - D. (C og D) fase 3 er kendetegnet ved forekomsten af mundtlige primordium (markeret med en pil). Mundtlige primordium ligner en invagination på den bageste ende af membranellar band. Den mundtlige primordium vil derefter gå op mod den forreste af cellen til at blive den mundtlige apparater. (E) regenerering er afsluttet når cellen har vedtaget karakteristiske Stentor trompet-lignende form, og den mundtlige apparater (markeret med en pil) har udvidet på den forreste ende af cellen. Skalalinjen er 0,25 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7. Stablet box plot viser hvordan proportioner af celler i alle faser af regenerering efter saccharose behandling ændrer sig over tiden. Plottet viser heterogenitet i timingen af regenerering faser i en befolkning på regenererende celler. "Reg. ende" angiver afslutningen af regenerering. Antallet af celler: 28. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1. Eksempel på en sund Stentor kultur. Generelt, hvis en kultur er det koncentreret, opdele kultur anbefales. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 2. Bremse Stentor med methylcellulose. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Video 3. Skæring Stentor. Individuelle celler kan manuelt skåret i flere stykker under en stereo dissekere mikroskop ved at trykke på en glas nål gennem cellen. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Problemet med kultur	Mulig afhjælpning	Mulig forebyggelse
Kultur er overvældet af hjuldyr eller andre store organismer.	Fjern så mange Stentor som muligt ind i en ny kultur parabol. Derefter cellerne vaskes tre gange.	Vask Stentor grundigt, når du modtager dem, selv når de køber dem fra en kommerciel leverandør.
Kultur er overvældet af svamp eller andre små organismer.	Identificere et hjørne hvor der er mindst Stentor. I dette område, fjerne så mange medier som muligt uden at fjerne mange Stentor og tilføje i nye PSW. Bland forsigtigt, men grundigt at distrubute de invaderende organismer. Springe til næste fodring og Stentor vil spise dem.	Observere kultur regelmæssigt og fjerne små forurenende stoffer ved at udveksle medier for friske PSW.
Stentor lægger oven på hinanden.	Opdele kulturen, så koncentrationen er mindre end 20 celler/mL.	Split kulturer oftere.
Stentor celler parring.	Feed hver 4 dage i stedet for hver 5 dage.
Kultur har en masse mørke affaldsmateriale.	Fjern så meget af det mørke materiale, Stentor affald som muligt uden at fjerne celler. Hvis Stentor er knyttet til det mørke materiale, pipetteres op og ned for at frigive Stentor celler fra deres affald og derefter fjerne medier med affaldet uden at fjerne celler. Eller fjerne disse Stentor og feed tilsvarende mindre.	Feed Stentor 1 mL mindre mad pr. 100 mL af kultur.
Usunde udseende (vacuolated/oppustet eller afrundede) Stentor.	Fjern så mange medier som muligt uden at fjerne mange Stentor celler og tilføje nye PSW.	Udveksle medierne regelmæssigt.

Tabel 1. Fejlfindingsvejledning til dyrkning Stentor.

Discussion

Dyrkning Stentor præsenterer en række udfordringer. Først, for at udføre eksperimenter, der kræver store mængder af celler, er man nødt til at opretholde et stort antal Stentor kulturer, som kulturer blive usund når Stentor koncentration overstiger 20 celler/mL. For det andet de organismer, der kan forurene Stentor kulturer ofte opdele hurtigere end Stentor og overvælde kultur (en fælles forurenende er hjuldyr). Det er således nødvendigt at inspicere kultur under et mikroskop med jævne mellemrum og fjerne de forurenende stoffer. Lejlighedsvis, skal en ny kultur startes fra et lille antal celler reddet manuelt fra en forurenet kultur. Dette øger den tid, der kræves for at opretholde sunde Stentor kulturer. Tredje, ekspanderende en enkelt celle til et 400 mL kultur kræver mindst en måned, fordi Stentor cellecyklus er 3-5 dage. Fjerde, i modsætning til andre model infusionsdyr, Stentor sjældent gå ind cyste form og de kan ikke fryses.

Et vigtigt aspekt af dyrkning Stentor er udvælgelsen af en passende mad organisme. Forskellige metoder til dyrkning Stentor var tidligere beskrevet. En af dem foreslår for at bruge skummetmælk til kultur bakterier, som derefter fodre Stentor. En sådan teknik er effektiv i dyrkning Stentor; anvendelse af genomisk teknikker kræver dog ren prøver at undgå forvirring som følge af genomisk læsninger fra udefineret mad organismer. Ved hjælp af den aktuelle protokol Stentor kan dyrkes i massen og, fordi deres mad, Chlamydomonas, er blevet sekventeret, tilstedeværelsen af genomisk forurening fra mad organisme kan registreres og kontrolleres. Af ukendte årsager havde tandsten at genopbygge hans aktier ved at vende tilbage til hvor han fandt Stentor før. Med den nuværende protokol har vi kunnet holde Stentor i år.

Regenerering eksperimenter med Stentor er generelt ligetil, men der er et par vigtige oplysninger at huske. Med hensyn til afsnit 2, skære Stentor celler i halvdelen kan håndteres i minutter. Mastering mere avancerede mikrokirurgi procedurer af Stentor kan kræve en uge i praksis. Mens udfører en saccharose eller urea behandling (afsnit 3), hvis i begyndelsen af imaging de fleste celler stadig har deres membranellar bands, øge inkubationstiden af 10-30 s for Hvornår saccharose behandling udføres næste. Øge ikke tidspunktet for saccharose behandling udover 3 min inkubation, fordi det vil resultere i celledød.

Imaging af Stentor kræver regenerering metoder til image store celler over lange perioder. Billedbehandling metode beskrevet i afsnit 4 kan kun bruges med en opretstående mikroskop. Hvis en inverteret mikroskop er tilgængelige i stedet, kan så cellerne placeres på et dias eller coverslip i små kamre. Én metode er at oprette en afdeling af vaseline og dække med en anden coverslip at forhindre fordampning. Alternativt, et kammer for en særskilt celle kan gøres ved at gøre et hul med en hulning i den ønskede størrelse i en 1 x 1 cm² firkantede af silicium spacer (Table of Materials), placere spacer på en coverslip, at sætte celler i salen , og som dækker kammer med en anden coverslip. Når imaging, hvis Stentor ikke er i den korrekte orientering til at observere de karakteristiske træk ved hver fase af regenerering, tryk pladen fast for at gøre den celle kontrakt. Se cellen udvide til at identificere stadiet af regenerering (fuld udvidelse tager ca 45 s). Hvis cellen ikke er stadig i den forkerte retning, skal du gentage aflytning. Billeder vist i figur 1 og figur 6 er taget af en stereo zoom mikroskop; men alle eksperimenter detaljerede kan udføres ved hjælp af et 5 X dissekere stereo-mikroskop.

En anden udfordring udover dyrkning og imaging Stentor er sporing af regenerering, specifikt mængden af tid, der kræves til at identificere faser. Hvis cellen regenererende er perfekt orienteret med regionen i den mundtlige primordium klart synlige, tager identifikation af fase et par sekunder. Nogle gange, men er Stentor celle i en orientering forhindre klar tildeling af regenerering fase, således at tage mere tid til at identificere. Den betydelig mængde af tid, der kræves til fase individuelle regenererende celler kan forsinke kvantificering af alle regenererende celler, derfor faldende de tidsmæssige præcision iscenesættelse og kræver observatør til at vente og re-billed cellen efter den er flyttet til en ny orientering. Dette eksperiment er derfor både tid og arbejdskraft intensiv. Af disse grunde ville det være ønskeligt at udvikle automatiserede metoder til at opdage Stentor celler og tildele stadier af regenerering i video mikroskopi data. Disse vil også give mulighed for mere reproducerbare eksperimenter, øger i prøvestørrelse, og fjernelse af menneskelige bias.

Fremkomsten af meget følsomme genomisk og proteom metoder er begyndt at sætte undersøgelser af enkelt celler i reach. For sådanne én celle analyser gør den gigantiske størrelse af en Stentor celle det et ønskeligt testpersonen til proof of concept eksperimenter. For sådanne forsøg skal være muligt, dyrkning Stentor er grundlæggende, og så de metoder, der beskrives her bør spille en rolle i yderligere udvikling af mere avancerede teknikker, én celle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stentor coeruleus live culture	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar	Carolina Biological Supply	152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle	Carolina Biological Supply	132458
Methyl cellulose, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Pyrex glass spot plate	Fisher Scientific	13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
2-cup glass container with glass lid	Pyrex	1095600
CultureWell silicone sheet material	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Cover Glass	Fisher finest	12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture	ThermoFisher	A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White	Spectrum	P1037
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Needle puller P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope	Zeiss