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Developmental Biology

Stentor में उत्थान के अध्ययन के लिए तरीके

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California San Francisco

Summary

विशाल ciliate, Stentor coeruleus, पुनर्जनन और घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली है । हम एकल कोशिकाओं या सेल टुकड़े से Stentor सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रक्रियाओं वर्तमान, कोशिकाओं को काटने के द्वारा पुनर्जनन उत्प्रेरण, रासायनिक membranellar बैंड और मौखिक तंत्र, इमेजिंग, और सेल के विश्लेषण के पुनर्जनन उत्प्रेरण पुनर्जनन.

Abstract

कक्षों को बाह्य perturbations से पुनर्प्राप्त करने के लिए उनके भागों को पुनर्जीवित करने में सक्षम होना चाहिए । कोशिकीय ciliate Stentor coeruleus एक उत्कृष्ट मॉडल जीव को घाव भरने और बाद में सेल पुनर्जनन अध्ययन है । Stentor जीनोम हाल ही में उपलब्ध हो गया, साथ आधुनिक आणविक जीवविज्ञान विधियों, जैसे RNAi के रूप में । ये उपकरण आणविक स्तर पर एकल कोशिका उत्थान के अध्ययन को संभव बनाते हैं. प्रोटोकॉल का पहला भाग एकल कोशिकाओं या कोशिका अंशों से Stentor कोशिका संस्कृतियों की स्थापना को कवर करता है, साथ ही Stentor संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए सामांय दिशानिर्देशों के साथ । संवर्धन Stentor बड़ी मात्रा में जैव रसायन, अनुक्रमण, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे मूल्यवान उपकरणों के उपयोग के लिए अनुमति देता है । प्रोटोकॉल के बाद के वर्गों Stentorमें उत्प्रेरण उत्थान के लिए अलग दृष्टिकोण को कवर किया । मैंयुअल रूप से एक गिलास सुई के साथ कोशिकाओं को काटने की अनुमति देता है बड़े सेल भागों के उत्थान का अध्ययन, जबकि या तो सुक्रोज या यूरिया के साथ कोशिकाओं के इलाज के विशिष्ट कोशिका के पूर्वकाल अंत में स्थित संरचनाओं के उत्थान का अध्ययन करने की अनुमति देता है । इमेजिंग के लिए एक विधि व्यक्तिगत reचूकने कोशिकाओं प्रदान की जाती है, मचान और पुनर्जनन की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक शीर्ष के साथ । उत्थान की पूरी प्रक्रिया को तीन चरणों में बांटा गया है । चरणों के माध्यम से कोशिकाओं की जनसंख्या की प्रगति की गतिशीलता visualizing द्वारा, पुनर्जनन समय में विविधता का प्रदर्शन किया है ।

Introduction

कोशिकाओं एंजाइमों के सरल बैग नहीं हैं, बल्कि अत्यधिक जटिल मशीनों जिसका घटकों को ध्यान से सही आकार के लिए स्केल और अच्छी तरह से परिभाषित पदों में व्यवस्था कर रहे हैं । व्यक्तिगत कोशिकाओं के morphogenesis कोशिका और विकास जीवविज्ञान में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन अपने आणविक तंत्र अज्ञात है1,2. जबकि कुछ प्रसंस्कृत कोशिकाओं blobs सदृश, कोशिकीय जीवों अत्यंत जटिल आर्किटेक्चर हो सकता है, जटिल cortical ciliates3,4में देखा पैटर्न द्वारा उदाहरण ।

शायद एक उच्च संरचित कोशिका का सबसे चरम उदाहरण Stentor coeruleus, एक विशाल heterotrichous ciliate दूर से Tetrahymena और Paramecium से संबंधित है । Stentor 1 मिमी लंबी है और नीले रंग की अनुदैर्ध्य धारियों से अधिक के साथ कवर किया जाता है cilia की पंक्तियों microtubule रिबन के समानांतर ढेर द्वारा आयोजित की है कि पूरे सेल की लंबाई चलाने के साथ बारी । सेल तुरही के आकार का है (1 चित्रा), एक membranellar बैंड और उसके पूर्वकाल अंत में एक मौखिक तंत्र (OA) के साथ, और एक holdfast है कि इसके पीछे अंत में सब्सट्रेट करने के लिए सेल देता है । स्पष्ट पूर्वकाल-पीछे ध्रुवता के अलावा, कोशिका भी एक विशिष्ट चिराल पैटर्न से पता चलता है, इस तरह की है कि सिलिअरी पंक्तियों के बीच रिक्ति के एक दक्षिणावर्त दिशा में धीरे-धीरे बढ़ जाती है । एक विच्छेदन में यह परिणाम जहां संकीर्ण पंक्ति व्यापक पंक्ति मिलता है, और सेल सतह के इस क्षेत्र, धारी इसके विपरीत के लोकस के रूप में जाना जाता है, पूर्वकाल अंत संरचनाओं के दूसरे सेट के गठन जब एक और5सेल पर भ्रष्टाचारी पैदा कर सकते हैं, इसे औपचारिक रूप से Spemann के आयोजक के समकक्ष बनाना । इस प्रकार, विकास जीव विज्ञान के सभी प्रमुख प्रक्रियाओं Stentorमें उनके अनुरूप है: axiation, पैटर्न गठन, और प्रेरण । एक भ्रूण में, इन प्रक्रियाओं विभिंन कोशिकाओं के बीच भाग्य मतभेदों से प्रेरित हैं, लेकिन Stentorमें, वे एक ही कक्ष के भीतर विभिंन क्षेत्रों के बीच भाग्य मतभेदों से प्रेरित होना चाहिए । क्या Stentor के भीतर क्षेत्रों के बीच मतभेदों को परिभाषित करता है एक रहस्य है ।

यदि Stentor का कोई भाग कट जाता है, तो कक्ष का गुम टुकड़ा घंटों के मामले में एक सामांय कोशिका को उत्पंन करने के लिए पुनर्जीवित कर सकता है । यदि एक सेल छमाही में कटौती, या भी बहुत छोटे टुकड़ों में है, प्रत्येक टुकड़ा एक सामांय दिखने लेकिन छोटे सेल में पुनर्गठित और सेल6,7भागों के बीच उचित समानता पुनर्स्थापित करता है । यहां तक कि छोटे टुकड़े, 1/64वें मूल कोशिका के आकार, एक छोटे लेकिन आम तौर पर आनुपातिक सेल में पुनर्जंम करने में सक्षम हैं, और फिर पूर्ण आकार6करने के लिए विकसित । Stentor इस प्रकार एक अनूठा organelle आकार स्केलिंग और कोशिका विकास विनियमन शल्य चिकित्सा पद्धतियों है कि आम तौर पर ऊतकों या पूरे जीवों के स्तर पर लागू कर रहे है का उपयोग कर के तंत्र का अध्ययन करने का अवसर प्रस्तुत करता है ।

Stentor के गुणों में से एक है कि यह शल्य आपरेशनों की एक विस्तृत श्रृंखला से पुनर्जीवित करने की अनुमति देता है कि यह एक एकल nodulated macronucleus (चित्रा 1) के बारे में पूरे जीनोम8के ५०,००० प्रतियां के साथ शामिल है । जब तक किसी कक्ष अंश में कम से एक macronuclear नोड होता है, तब तक पूरी तरह से पुन: जनरेट करने की क्षमता होती है । एक अंय गुण अंतर्निहित है Stentorपुनर्जनन क्षमता अपने विलक्षण घाव भरने की क्षमता है । हालांकि कई सेल प्रकार उनके घाव9चिकित्सा करने में सक्षम हैं, Stentor शारीरिक perturbations की एक असाधारण रेंज से उबरने में सक्षम है । एक कठोर गड़बड़ी से Stentor वसूली का एक उदाहरण है, साथ में Stentor10 में cytoplasmic प्रवाह visualizing के लिए तरीकों के साथ पहले ही सूचित किया गया । इन विधियों के अध्ययन की अनुमति कैसे घायल और बाद में पुनर्जनन कोशिका द्रव्य की शारीरिक स्थिति को प्रभावित करते हैं ।

है Stentorविशाल आकार, असाधारण पुनर्जनन क्षमता, और तथ्य यह है कि यह विकासात्मक कोशिकीय भ्रूण में देखा घटना के कई प्रकट (जैसे आयोजकों, axiation के रूप में, और पैटर्न) के दौरान कई विकास जीव आकर्षित थॉमस हंट मॉर्गन7सहित पिछली सदी की बारी है । के दौरान 50 है और 60, microsurgical दृष्टिकोण इस एकल कोशिका वाले जीव11में अपक्षयी और morphogenetic प्रक्रियाओं की एक चौंकाने वाली सरणी का प्रदर्शन किया । हालांकि, Stentor एक आणविक जीवविज्ञान मॉडल प्रणाली के रूप में ही हाल ही में विकसित किया गया है । पिछले कई वर्षों के दौरान, Stentor के जीनोम अनुक्रम और8इकट्ठा किया गया था, और perturb जीन अभिव्यक्ति को खिला द्वारा RNAi का उपयोग करने के लिए विधि12विकसित किया गया था ।

कारणों में से एक है कि Stentor आधुनिक आणविक जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल जीव में विकसित किया गया था ही हाल ही में अपनी लंबी कोशिका चक्र (3 से 5 दिन) के कारण बड़ी संस्कृतियों के बढ़ने की कठिनाई थी । हालांकि, आधुनिक जीनोमिक और proteomic तरीकों के लिए इस्तेमाल की तुलना में कम सामग्री की आवश्यकता होती है, और एक एकल Stentor कोशिका की मात्रा इन विधियों के लिए पर्याप्त है, यहां तक कि एकल के विश्लेषण के लिए विकसित किए गए ultrasensitive विधियों का सहारा लिए बिना वे कक्ष जो Stentorसे बहुत छोटे हैं । किसी एकल Stentor कक्ष से कोई बड़ी संस्कृति स्थापित करने के लिए प्रोटोकॉल विवरण की खंड 1 प्रक्रिया । एक ही दृष्टिकोण एक कोशिका काटने से प्राप्त एक कोशिका टुकड़ा से एक बड़ी संस्कृति स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अनुभाग 1 भी समय की लंबी अवधि में स्वस्थ Stentor संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है । प्रोटोकॉल की धारा 2 एक गिलास सुई के साथ मैंयुअल रूप से कोशिकाओं को काटने के द्वारा सेल पुनर्जनन उत्प्रेरण के लिए पद्धति प्रदान करता है । प्रोटोकॉल की धारा 3 विशिष्ट कोशिका संरचनाओं के उत्थान उत्प्रेरण के दो तरीकों को समर्पित है (membranellar बैंड और मौखिक तंत्र): या तो सुक्रोज या यूरिया के साथ कोशिकाओं के इलाज इन संरचनाओं के छप्पर की ओर जाता है, उनके द्वारा पीछा पुनर्जनन. प्रोटोकॉल के खंड 4 समय की लंबी अवधि के लिए व्यक्तिगत पुनः जनरेट कर रहा है कोशिकाओं के इमेजिंग के लिए एक विधि विवरण । अनुभाग 4 पुनर्जनन और पुनर्जनन गतिशीलता के विश्लेषण पर सुझावों के चरणों के विवरण के साथ समाप्त होता है ।

Protocol

1. संवर्धन Stentor और एकल कोशिकाओं या सेल टुकड़े से Stentor संस्कृतियों की स्थापना

  1. Stentorके लिए भोजन के रूप में इस्तेमाल की जाने Chlamydomonas reinhardtii संस्कृति तैयार करें ।
    1. एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (सामग्री की तालिका) से Chlamydomonas reinhardtii कोशिकाओं को प्राप्त करें ।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नल मीडिया में Chlamydomonas reinhardtii के ५०० मिलीलीटर तरल संस्कृति की स्थापना बाँझ तकनीक13का उपयोग कर ।
    3. संतृप्ति के पास एक एकाग्रता में एक चिराग के तहत Chlamydomonas संस्कृति रखें (के बारे में 1 के ओडी पर) यह नल मीडिया के साथ कमजोर द्वारा सप्ताह में दो बार ।
      नोट: Chlamydomonas संस्कृति एक शेखर पर उगाया जा सकता है ।
    4. नियमित रूप से जांच करें कि Chlamydomonas संस्कृति एक स्लाइड पर संस्कृति की एक बूंद रखकर स्वस्थ है, यह एक coverslip के साथ कवर, और यह 40X आवर्धन पर एक खुर्दबीन के नीचे की जांच ।
      नोट: Stentor खिलाने के लिए संस्कृति का उपयोग न करें यदि यह बैक्टीरिया से दूषित है या यदि Chlamydomonas कोशिकाओं समूहों में एकत्रित कर रहे हैं । यदि या तो इन समस्याओं का होता है, एक नया Chlamydomonas कल्चर प्रारंभ करें ।
  2. एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता (सामग्री की तालिका) से Stentor coeruleus कोशिकाओं को प्राप्त करें ।
  3. यदि Stentor कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक निवास स्थान से की जरूरत है, उंहें एक तालाब, झील, या11नदी से इकट्ठा ।
    1. एक तालाब, झील, या नदी से Stentor इकट्ठा करने के लिए, कुछ वनस्पति जहां पानी अपेक्षाकृत शांत, छायादार है, और स्पष्ट है के साथ एक क्षेत्र लगता है ।
      नोट: जहां duckweed बढ़ता है स्थानों पर Stentor खोजने की एक उच्च संभावना है ।
    2. एक कंटेनर है कि आसानी से डालना है में पानी की कम से 2 एल ले लीजिए ।
    3. कतरे के बाद और बात कण कंटेनर के नीचे करने के लिए बस गया है, धीरे से कुछ छोटे कंटेनरों को भरने के लिए Stentorके लिए जांच, कतरे के लिए एक संग्रह के बाद कुछ सेकंड के लिए इंतजार कर बड़े कंटेनर में बसा ।
    4. एक बार नमूनों का संग्रह एक स्थान पर पूरा हो गया है, एक नए स्थान पर ले जाएं जो कि कम से कम 10 मीटर दूर हो और वहां नमूनों के संग्रह को दोहराएं ।
      नोट: नहीं हर तालाब एक Stentor आबादी है, तो कई तालाबों का नमूना होना पड़ सकता है ।
    5. प्रयोगशाला में नमूनों के साथ लौटें और कंटेनरों से पानी को व्यक्तिगत पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित करें ।
    6. प्रत्येक पेट्री डिश में, 5x आवर्धन पर टेढ़ा प्रकाश के साथ एक stereomicroscope के तहत Stentor के लिए खोज । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध pasteurized स्प्रिंग वॉटर (PSW) के कम से १०० µ l युक्त एक गिलास हाजिर प्लेट की एक अच्छी तरह से एक में एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर व्यक्तिगत Stentor कोशिकाओं स्थानांतरण ।
      नोट: Stentor कोशिकाओं को एक तुरही की तरह आकार है जब वे एक सब्सट्रेट (चित्रा 1) से जुड़े रहे हैं । तैराकी Stentor कोशिकाओं को एक सब्सट्रेट (वीडियो 1) से जुड़ी कोशिकाओं की तुलना में कम बढ़ा रहे हैं.
    7. PSW में Stentor को धो लें । Stentor कोशिकाओं को अच्छी तरह से रखते हुए अच्छी तरह से पानी के बारे में ९०% से निकाल कर बहाकर प्रदर्शन, PSW के ५०० µ एल जोड़कर अच्छी तरह से पीछा किया ।
      नोट: 10 µ एल या छोटे के पिपेट सुझावों के साथ पिपेट का उपयोग Stentor हैंडलिंग से पहले, कैंची के साथ पिपेट टिप के अंत से ०.५ mm के बारे में कटौती के लिए कतरनी बलों है कि एक बड़े सेल के रूप में उत्पंन कर रहे है के कारण कोशिकाओं को घायल से बचने के एक टिप सेशन के बहुत छोटे के माध्यम से प्रवाह ening ।
  4. Stentorके प्रत्येक खिलाने से पहले Chlamydomonas तैयार करें ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में चरण १.१ में के रूप में तैयार Chlamydomonas संस्कृति के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । 3 मिनट के लिए २,०९५ x g पर केंद्रापसारक ।
    2. supernatant निकालें और PSW के 1 मिलीलीटर में गोली reसस्पैंड । 3 मिनट के लिए २,०९५ x g पर केंद्रापसारक. supernatant निकालें और PSW के ५०० µ एल में गोली reसस्पेंड ।
      नोट: इस प्रकार, धोया और केंद्रित Chlamydomonas निंनलिखित चरणों में "तैयार Chlamydomonas" के रूप में भेजा जाएगा । ठोकर मीडिया Stentorके लिए हानिकारक है, इस प्रकार Stentor खिलाने से पहले Chlamydomonas धोने महत्वपूर्ण है ।
  5. यदि एक क्लोनल Stentor संस्कृति की जरूरत है, एक व्यक्ति Stentor सेल या एक सेल टुकड़ा से संस्कृति शुरू करते हैं ।
    1. के बाद से एक Stentor कोशिकाओं PSW में अच्छी तरह से विकसित नहीं है, एक मौजूदा, स्वस्थ Stentor संस्कृति से मीडिया के ५०० µ एल बंध्याकरण फिल्टर द्वारा वातानुकूलित मीडिया तैयार करते हैं ।
    2. एक ग्लास स्पॉट प्लेट के कुओं में से एक के लिए वातानुकूलित मीडिया के ५०० µ एल स्थानांतरण ।
    3. वातानुकूलित मीडिया युक्त ग्लास स्पॉट प्लेट के कुआं में एक Stentor स्थानांतरण । हस्तांतरण करने के लिए संभव के रूप में छोटे माध्यम के रूप में उपयोग करें ।
    4. तैयार Chlamydomonas के प्रत्येक Stentor 5 µ l को फीड कर हर ४८ एच. जब Stentor डिवाइड करें, अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या गिनती और सेल प्रति तैयार Chlamydomonas के 5 µ एल जोड़ें ।
    5. एक छायांकित स्थान में Stentor रखें के बाद से कोशिकाओं को प्रकाश के प्रति संवेदनशील है (उदाहरण के लिए, स्पष्ट प्लास्टिक बक्से में कागज तौलिए के साथ कवर) ।
    6. ताजा वातानुकूलित माध्यम के साथ अच्छी तरह से में विनिमय Stentor माध्यम हर ९६ एच ।
      1. चरण 1.5.1 के रूप में नए वातानुकूलित मीडिया तैयार करें ।
      2. सभी Stentor कोशिकाओं को अच्छी तरह से धीरे से नीचे तरल pipetting और अच्छी तरह से नीचे से अलग करें ।
      3. ध्यान से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर अच्छी तरह से तरल महाप्राण, सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को अच्छी तरह से में रहते हैं । अच्छी तरह से करने के लिए ताजा वातानुकूलित मीडिया के ५०० µ एल जोड़ें ।
    7. जब well में कक्षों की संख्या 20 से अधिक है, तो कक्षों को बड़े कंटेनर में ले जाएं, उदाहरण के लिए, एक चौड़े मुंह वाले ग्लास जार ।
      1. एक autoclaved चौड़ा मुंह ग्लास जार में PSW के 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
        नोट: Stentor के लिए कांच के बना के Autoclaving सावधान धोने और कुल्ला के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता ।
      2. ध्यान से पिपेट मीडिया को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे अच्छी तरह से सभी कोशिकाओं के नीचे से अलग करने के लिए । एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग कर सभी Stentor कोशिकाओं को इकट्ठा करने और धीरे कांच जार करने के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
    8. Stentor संस्कृतियों के साथ जार पर ढक्कन कस नहीं है, हवा के लिए पर्याप्त पहुंच की अनुमति है ।
    9. के बारे में 20 कोशिकाओं पर Stentor घनत्व रखने के लिए हर ४८ ज जार में PSW जोड़ें/ आँख से कोशिकाओं के घनत्व का अनुमान.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए जार में बुलबुला हवा कोशिकाओं दीवारों से अलग करने के लिए, संस्कृति के 1 मिलीलीटर पिपेट, और पिपेट टिप में कोशिकाओं की संख्या गिनती ।
    10. हर ४८ एच, जार में Stentor संस्कृतियों के लिए तैयार Chlamydomonas फ़ीड (१.४ कदम देखें) । तैयार Chlamydomonasके २०० µ l के साथ संस्कृति को खिलाने के साथ प्रारंभ करें । के रूप में संस्कृति की मात्रा बढ़ जाती है, धीरे-1 मिलीलीटर तक खिलाने के लिए इस्तेमाल किया तैयार Chlamydomonas की मात्रा में वृद्धि ।
    11. जब संस्कृति मात्रा जार की क्षमता के बारे में ९०% तक पहुंचता है, एक बड़ा कंटेनर के लिए संस्कृति हस्तांतरण ।
      1. पिपेट जार के अंदर संस्कृति, ऊपर और नीचे, एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ गिलास से Stentor अलग करने के लिए ।
      2. एक 2 कप गिलास कंटेनर में जार की पूरी सामग्री डालो ।
      3. शेष Stentorइकट्ठा करने के लिए 2 कप गिलास कंटेनर में PSW के बारे में 25 मिलीलीटर के साथ जार कुल्ला ।
  6. 2 कप गिलास कंटेनरों में स्वस्थ संस्कृतियों बनाए रखें ।
    1. फ़ीड Stentor संस्कृति के १०० मिलीलीटर प्रति तैयार Chlamydomonas के 2 मिलीलीटर हर 4-5 दिन । लगभग 20 कोशिकाओं में Stentor घनत्व रखने के लिए हर 4-5 दिनों में ग्लास कंटेनर के लिए PSW जोड़ें/
      नोट: ४५० मिलीलीटर अधिकतम मात्रा एक 2-कप कंटेनर रखती है ।
    2. एक बार एक सप्ताह, rotifers, कवक के लिए एक 5x विदारक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण, और अंय विकास । संस्कृति के स्वास्थ्य को लंबा करने के लिए, एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग असामान्य रूप से आकार और बेरंग Stentor कोशिकाओं के साथ दूषित सूक्ष्मजीवों को हटा दें ।
    3. जब ग्लास कंटेनर के बारे में ९०% भरा है, संस्कृति को विभाजित ।
      1. ग्लास कंटेनर के लिए PSW के 25 मिलीलीटर जोड़ें । एक 25 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए पिपेट ऊपर और नीचे कांच से Stentor अलग करने के लिए । एक नया 2 कप ग्लास कंटेनर में संस्कृति के बारे में ५०% हटो ।
      2. दोनों संस्कृतियों के लिए PSW के 25 मिलीलीटर जोड़ें और दो संस्कृतियों के रूप में प्रोटोकॉल के इस खंड में वर्णित बनाए रखने जारी है ।
        नोट: के बाद से Stentor कोशिकाओं को उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील हैं, तापमान को बनाए रखने के 25 डिग्री सेल्सियस या कम कमरे में जहां संस्कृतियों रखा जाता है । वैकल्पिक रूप से, संस्कृतियों एक मशीन में रखा जा सकता है । Stentor संवर्धन की समस्या निवारण के लिए तालिका 1 देखें ।

2. Stentor कोशिकाओं को काटने के द्वारा पुनर्जनन उत्प्रेरण

  1. इस प्रकार इस कार्यक्रम का उपयोग केशिका ट्यूबों से कई सुइयों बनाने के लिए एक सुई खींचने का उपयोग करें: गर्मी-७३५, पुल-१००, वेग-११०, समय-१५०, दबाव-४०० ।
  2. PSW के ५० मिलीलीटर में 4% methylcellulose समाधान तैयार करें ।
    1. methylcellulose (चिपचिपापन: १५०० सीपी) के 1 जी PSW के ५० मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. methylcellulose के विघटन को सुगम बनाने के लिए कम से 8 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    3. कमरे के तापमान पर 4% methylcellulose समाधान रखें ।
  3. कटौती प्रदर्शन के बाद सेल टुकड़े भंडारण के लिए एक ग्लास स्पॉट प्लेट तैयार करते हैं ।
    1. फ़िल्टर एक स्वस्थ संस्कृति से मीडिया निष्फल, गिलास हाजिर प्लेट अच्छी तरह से जरूरत प्रति ५०० मिलीलीटर ।
    2. प्रत्येक कुओं में निष्फल मीडिया की ५०० मिलीलीटर की जरूरत स्थानांतरण ।
  4. एक स्वस्थ Stentor लीजिए (एक परिभाषित तुरही आकार, जीवंत नीला-हरा रंग, और कोई बड़ा रिक्तिकाएं) एक 2 µ एल छोटी बूंद में और यह एक coverslip या स्लाइड पर जगह है । 4% methylcellulose (figure 2) के 2 µ l को जोड़ें । चलो Stentor इसे काटने से पहले धीमा (वीडियो 2) ।
  5. सुई तोड़ने को रोकने के लिए संभव के रूप में काटने की सतह के समानांतर के रूप में कांच सुई पकड़ो ।
  6. एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग, कांच सुई की नोक का पता लगाने और यह (3 ए आंकड़ा) सेल के करीब ले जाते हैं । सुई के साथ संपर्क पर Stentor अनुबंध का निरीक्षण (चित्र बी और सी) ।
    नोट: यदि कोशिका एक अभिविंयास है कि पीछे के अंत मुश्किल से पूर्वकाल अंत अलग बनाता है में है, यह सुई के पक्ष के साथ बहुत धीरे घुमाएं ।
  7. धीरे से कांच की सुई के साइड के साथ कांट्रैक्ट Stentor पर प्रेस करने के लिए दो में सेल कट (फिगर 3d और ई, वीडियो 3). टुकड़े फ्यूजन (चित्रा 3F)से बचने के लिए, उन दोनों के बीच कोई cytoplasmic कनेक्शन है कि यह सुनिश्चित करने के अलावा दो टुकड़े ले जाएँ.
  8. दोनों टुकड़ों एक टेढ़ा रोशनी के साथ एक विदारक खुर्दबीन के नीचे टुकड़े का परीक्षण करके प्रत्येक macronuclear नोड है कि क्या जांच करें ।
    नोट: सेल के अस्तित्व के लिए कम से एक macronuclear नोड होना आवश्यक है । सेल अपने पतली झिल्ली (पारदर्शी खोल) के साथ नीले-हरे रंग के दौरान या कटौती के बाद के साथ शेड हो सकता है । अधिकांश मामलों में, यह सेल की दीर्घकालिक व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करेगा ।
  9. कदम २.३ में तैयार एक गिलास हाजिर प्लेट के कुओं में टुकड़े ले जाएँ.
  10. कट कोशिकाओं के एक अंश पुनर्जीवित नहीं होगा क्योंकि एक से अधिक कोशिकाओं में कटौती ।
  11. यदि एक सत्र में कई कटौती प्रदर्शन, कांच सुई की जगह जब यह भारी Stentor अवशेषों के साथ लेपित हो जाता है या जब इसकी नोक टूट गया है । वैकल्पिक रूप से, यह सिलिकॉन स्पेसर के एक टुकड़े पर धीरे से पोंछते द्वारा सुई साफ ।
    नोट: ग्लास सुई कई सेल काटने सत्र के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  12. एक आर्द्र कक्ष में सेल के टुकड़ों के साथ ग्लास स्पॉट प्लेट रखें ।
  13. इमेजिंग और Stentor पुनर्जनन परिणामों की व्याख्या पर विवरण के लिए प्रोटोकॉल की धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।

3. सुक्रोज या यूरिया उपचार द्वारा Membranellar बैंड और मौखिक तंत्र के उत्थान उत्प्रेरण

  1. Membranellar बैंड और मौखिक तंत्र हटाने सुक्रोज का उपयोग
    1. PSW में सुक्रोज का एक 25% समाधान तैयार करें ।
    2. एक स्नैप कैप के साथ एक microcentrifuge ट्यूब के लिए PSW में 25% सुक्रोज के ५०० µ एल जोड़ें ।
    3. सुक्रोज उपचार के बाद कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में PSW के 1 मिलीलीटर के साथ स्नैप टोपियां के साथ 3 microcentrifuge ट्यूबों तैयार करें ।
    4. एक अलग microcentrifuge ट्यूब में अपनी संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में 30-60 Stentor कोशिकाओं को इकट्ठा एक 1 मिलीलीटर पिपेट (4 चित्रा, एक तीर) का उपयोग कर ।
    5. १२५ µ एल अंतिम मात्रा में ट्यूब से सभी कोशिकाओं को एक ही ड्रा में एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर लीजिए. उंहें ५०० µ एल के साथ ट्यूब के लिए स्थानांतरण 25% सुक्रोज (3.1.2 चरण में तैयार) के ६२५ µ एल प्राप्त करने के लिए 20% सुक्रोज समाधान (चित्रा 4, एरो बी) । स्टॉपवॉच प्रारंभ करें ।
    6. इस 20% सुक्रोज समाधान और झटका में Stentor मशीन-1 मिनट के लिए रैक में microcentrifuge ट्यूब स्पिन ।
    7. एक ही ड्रा में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा (आसान संग्रह के लिए २०० µ एल अधिकतम क्षमता के लिए पिपेट को समायोजित) ।
    8. पिपेट टिप में कोशिकाओं रखें जब तक स्टॉपवॉच सुक्रोज उपचार के 2 मिनट से पता चलता है ।
    9. microcentrifuge ट्यूबों में से एक में Stentor बेदखल कदम 3.1.3 (चित्रा 4, तीर सी) । झटका-रैक में ट्यूब स्पिन ।
    10. दो और बार कोशिकाओं को धो दो, शेष microcentrifuge PSW जिसमें कदम 3.1.3 (चित्रा 4, तीर डी और ई) में तैयार ट्यूबों में से प्रत्येक में एक बार ।
      नोट: एकल ड्रा सेल संग्रह तकनीक धोने के बीच में महत्वपूर्ण नहीं है.
    11. इमेजिंग और Stentor पुनर्जनन गतिशीलता (चित्रा 4, तीर एफ और जी) की व्याख्या पर विवरण के लिए प्रोटोकॉल की धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।
  2. Membranellar बैंड और मौखिक तंत्र हटाने यूरिया का उपयोग
    1. PSW में 4% यूरिया का घोल तैयार करें ।
    2. एक तस्वीर टोपी के साथ एक microcentrifuge ट्यूब के लिए PSW में 4% यूरिया के ३०० µ एल जोड़ें ।
    3. 3 microcentrifuge ट्यूबों को स्नैप कैप्स के साथ तैयार करें जिसमें यूरिया उपचार के बाद कोशिकाओं को धोने के लिए प्रत्येक ट्यूब में 1 मिलीलीटर PSW ।
    4. एक अलग microcentrifuge ट्यूब में अपनी संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में 30-60 Stentor कोशिकाओं को इकट्ठा एक 1 मिलीलीटर पिपेट (4 चित्रा, एक तीर) का उपयोग कर ।
    5. ३०० µ एल अंतिम मात्रा में ट्यूब से सभी कोशिकाओं को इकट्ठा एक एकल ड्रा में एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर । 2% यूरिया समाधान (4 चित्रा, तीर ख) के ६०० µ एल प्राप्त करने के लिए 4% यूरिया (चरण 3.2.2 में तैयार) के ३०० µ एल के साथ ट्यूब करने के लिए उन्हें हस्तांतरण । स्टॉपवॉच प्रारंभ करें ।
    6. इस 2% यूरिया समाधान और झटका में Stentor मशीन-1 मिनट के लिए रैक में microcentrifuge ट्यूब स्पिन ।
    7. एक ही ड्रा में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    8. पिपेट टिप में कोशिकाओं रखें जब तक स्टॉपवॉच यूरिया उपचार के 2 मिनट से पता चलता है ।
    9. कदम 3.2.3 में तैयार microcentrifuge ट्यूबों में से एक में Stentor बाहर निकालें (चित्रा 4, तीर सी) । झटका-रैक में ट्यूब स्पिन ।
    10. दो बार कोशिकाओं को धोने, दो शेष microcentrifuge PSW युक्त चरण 3.2.3 में तैयार ट्यूबों (चित्रा 4, तीर डी और ई) में से प्रत्येक में एक बार ।
      नोट: एकल ड्रा सेल संग्रह तकनीक धोने के बीच में महत्वपूर्ण नहीं है.
    11. इमेजिंग और Stentor पुनर्जनन गतिशीलता (चित्रा 4, तीर एफ और जी) की व्याख्या पर विवरण के लिए प्रोटोकॉल की धारा 4 के लिए आगे बढ़ें ।

4. इमेजिंग और विश्लेषण सेल पुनर्जनन

  1. अगर एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, फांसी छोटी बूंद विधि व्यक्तिगत कोशिकाओं के उत्थान छवि के लिए उपयोग करें ।
    1. एक अच्छी तरह से एक ग्लास स्पॉट प्लेट के PSW में १०० µ एल रखो ।
    2. संस्कृति मीडिया (मीडिया कि वे में हैं) के 4 µ एल में 1 Stentor सेल अलग, एक 10 या 20 µ l पिपेट का उपयोग कर. एक 22 x 22 मिमी2 coverslip (चित्रा 5) के बीच में छोटी बूंद जमा ।
      नोट: यदि कोशिकाओं है कि 1) अस्वस्थ (असामांय रूप से आकार या भारी vacuolated) या 2) अभी भी membranellar बैंड या मौखिक तंत्र (रासायनिक उपचार प्रयोगों के लिए), इमेजिंग के लिए उपयोग नहीं करते हैं ।
    3. पिछले छोटी बूंद के आसपास संस्कृति मीडिया में Stentor की 4 और बूंदों की व्यवस्था है, जबकि बूंदों के बीच पर्याप्त स्थान छोड़ रहा है ।
    4. बूंदों के साथ coverslip पलटना और धीरे यह ग्लास स्पॉट प्लेट जो PSW चरण ४.१ में जोड़ा गया था की अच्छी तरह से अधिक जगह है ।
    5. नोट: PSW में अच्छी तरह से बूंदों के वाष्पीकरण (चित्रा 5) को कम करेगा ।
    6. इमेजिंग के लिए बचे हुए सेल का पालन करके तैयार करें कदम शुू-4.1.4 ।
    7. छवि वांछित समय संकल्प के साथ एक खुर्दबीन के नीचे reचूकने कोशिकाओं । वैकल्पिक रूप से, एक विदारक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पुनर्जनन का निरीक्षण ।
      नोट: पुनर्जनन सेल काटने या सुक्रोज या यूरिया के साथ इलाज के तुरंत बाद शुरू हो जाएगा । हालांकि, दिखाई नए मौखिक संरचनाओं के बारे में 3 ज उत्थान की शुरुआत के बाद फार्म जाएगा ।
  2. प्रत्येक समय बिंदु के लिए, प्रत्येक कक्षों के लिए तीन पुनर्जनन चरणों में से एक असाइन करें । ऐसा करने के लिए, प्रत्येक कक्ष की प्रतिनिधि छवियों के लिए चरणों (4 चित्रा और चित्रा 6) illustrating की तुलना करें ।
    1. उन कक्षों को चरण 1 असाइन करें जिनमें अभी तक कोई membranellar बैंड नहीं है (चित्र 6A) ।
    2. membranellar बैंड के साथ कक्षों को चरण 2 असाइन करें ।
      नोट: एक membranellar बैंड (चित्रा 4, चित्रा घमण्ड) उपचार के बाद 3-6 ज प्रकट होता है । इस चरण के अंत में, membranellar बैंड के पीछे के अंत के एक अतिरिक्त वक्रता बस एक मौखिक primordium प्रकट होता है पहले दिखाई देगा ।
    3. एक मौखिक primordium के साथ कोशिकाओं को चरण 3 निरुपित ।
      नोट: एक मौखिक primordium membranellar बैंड (चित्रा 4, चित्रा 6C और 6D) के पीछे के अंत में उपचार के बाद एक invagination दिखने 6-8 ज है । पुनर्जनन जब कोशिकाओं उनके पूर्वकाल अंत में एक membranellar बैंड और विशेषता तुरही सेल आकार (4 चित्रा, चित्रा 6E) पूरा हो गया है । अधिकांश Stentor कोशिकाओं को पूरी तरह से पुनर्जंम के शुरू के बाद से 8-9 घंटे के भीतर पुनर्जीवित कर रहे हैं ।
  3. प्रत्येक समय बिंदु के लिए एक स्टैक्ड बॉक्स प्लॉट (चित्र 7) के रूप में प्रत्येक उत्थान चरणों में कक्षों का प्रतिशत प्लॉट करें ।
    नोट: इस प्रकार की साजिश कक्षों की जनसंख्या में पुनर्जनन गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता है ।

Representative Results

Stentor संस्कृतियों मज़बूती से स्थापित किया गया है और व्यक्तिगत कोशिकाओं या सेल टुकड़े प्रोटोकॉल के खंड 1 का उपयोग करने से बनाए रखा । एक बड़ी स्वस्थ संस्कृति का एक प्रतिनिधि उदाहरण 1 वीडियोमें दिखाया गया है ।

पुनर्जनन के समय पाठ्यक्रम Stentor चरण ३.१ में उल्लिखित पुनर्जनन, इमेजिंग और विश्लेषण खंड 4 (चित्रा 7) में चर्चा की विधि के साथ संयुक्त के लिए सुक्रोज उपचार विधि का उपयोग कर मापा गया था । इस भूखंड से यह संकेत मिलता है कि किसी भी विशेष मुकाम तक पहुंचने के लिए कक्षों की आबादी द्वारा उठाए गए समय में एक-एक घंटे का लंबा प्रसार होता है । विश्लेषण के इस प्रकार के उत्थान की प्रक्रिया में लौकिक विविधता के अध्ययन के एक जनसंख्या में reचूकने कोशिकाओं की अनुमति देता है ।

निंनलिखित पुनर्जनन समय है कि इस प्रकार अब तक सुक्रोज उपचार के दर्जनों के बाद देखा गया है का सार है (चित्रा 4 और चित्रा 6) । स्टेज 1 है जब Stentor कोशिकाओं teardrops की तरह किसी भी membranellar बैंड के बिना देखो (यह चरण सुक्रोज वॉशआउट के तुरंत बाद शुरू होता है) । यह स्तर 3-6 घंटे के लिए रहता है चरण 2 है जब एक membranellar बैंड प्रकट होता है और बढ़ता है (3-6 सुक्रोज उपचार के बाद एच) । यह चरण 3-4 घंटे के लिए रहता है 3 चरण है जब एक मौखिक primordium membranellar बैंड के पीछे अंत में प्रकट होता है (6-8 सुक्रोज उपचार के बाद एच), और दोनों संरचनाओं कोशिका के पूर्वकाल अंत की ओर ले जाया जाता है । यह चरण 1-2 ज के लिए रहता है । जब दोनों membranellar बैंड और मौखिक तंत्र कक्ष के पूर्वकाल अंत तक पहुंच, यह पुनर्जनन के पूरा होने का संकेत दिया । कोशिका विशेषता Stentor तुरही की तरह आकार को अपनाया गया है । सुक्रोज उपचार के बाद कोशिकाओं को पूरी तरह से पुनर्जीवित 8-9 ज थे ।

Figure 1
चित्र 1. Stentorका स्नैपशॉट । membranellar बैंड और मौखिक तंत्र कोशिका के पूर्वकाल अंत में दिखाए जाते हैं । holdfast कक्ष के पीछे अंत में है । Stentor macronucleus nodulated है । एक अच्छी तरह से खिलाया Stentor हरी खाद्य ज्यादातर Chlamydomonasयुक्त रिक्तिकाएं है । स्केल बार ०.५ mm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Stentor काटना सेट अप । सेल काटने मैन्युअल रूप से एक गिलास सुई जोड़ तोड़ द्वारा किया जाता है, जबकि एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध विदारक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल को देख. टिशू पेपर का उद्देश्य सफेद पृष्ठभूमि प्रदान करने के लिए कोशिकाओं को बेहतर देख रहा है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. 3 वीडियो के स्नैपशॉट कैसे एक गिलास सुई के साथ एक Stentor काटने के लिए illustrating । (क) सुई को छूने से तुरंत पहले एक Stentor . (ख) एक Stentor धीरे एक सुई और गिलास स्लाइड के बीच निचोड़ा । (ग) एक कांट्रैक्ट Stentor सुई के बल पर प्रतिक्रिया. (घ) एक Stentor सुई के पक्ष के साथ धीरे से सेल पर दबाकर काटा जा रहा है । (ङ) एक Stentor अब दो में कटौती लेकिन अलग नहीं. (च) दो Stentor अंश । स्केल बार ०.२५ mm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. 3 खंड और प्रोटोकॉल की धारा 4 के योजनाबद्ध दृश्य । यह सुक्रोज या यूरिया उपचार और सेल पुनर्जनन के अवलोकन के प्रदर्शन के लिए एक सचित्र प्रोटोकॉल है । नीचे पैनल में संकेत दिया समय धो 1 की शुरुआत से मापा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5. इमेजिंग और/या एक ईमानदार खुर्दबीन के साथ पुनर्जनन के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए सेटअप । प्रत्येक 4 µ एल छोटी बूंद में coverslip से लटका, वहां एक पुनर्जनन दौर से गुजर सेल है । कांच की जगह प्लेट के कुंए में पानी, बूंदों का वाष्पीकरण सीमा । इस सेटअप समानांतर में एकाधिक कक्षों के उत्थान के बाद की अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. membranellar बैंड और मौखिक तंत्र पुनर्जनन के प्रत्येक चरण में Stentor के स्नैपशॉट । (एक) चरण 1 एक अश्रु की तरह कोशिका आकार और membranellar बैंड के अभाव की विशेषता है । (ख) स्टेज 2 membranellar बैंड, एक cilia आधारित संरचना है कि लगातार धड़कता है की उपस्थिति की विशेषता है । Membranellar बैंड पैनलों बी डी में सफेद डैश्ड लाइनों के साथ चिह्नित कर रहे है (सी और डी) चरण 3 मौखिक primordium की उपस्थिति की विशेषता है (एक तीर से चिह्नित) । मौखिक primordium membranellar बैंड के पीछे के अंत में एक invagination की तरह लग रहा है । ओरल primordium तो ओरल उपकरण बनने के लिए कोशिका के पूर्वकाल की ओर बढ़ जाएगा. (ङ) उत्थान पूरा हो गया है जब सेल विशेषता Stentor तुरही की तरह आकार को अपनाया है, और मौखिक तंत्र (एक तीर से चिह्नित) कक्ष के पूर्वकाल अंत में चौड़ा है । स्केल बार ०.२५ mm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7. स्टैक किए गए बॉक्स प्लॉट समय के साथ सुक्रोज उपचार परिवर्तन के बाद पुनर्जनन के सभी चरणों में कक्षों का अनुपात कैसे दिखा रहा है । भूखंड पुनः बनाना कोशिकाओं की आबादी के भीतर पुनर्जनन चरणों के समय में विविधता से पता चलता है । "Reg. end" उत्थान के पूरा होने को इंगित करता है । कक्षों की संख्या: 28 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
वीडियो 1. एक स्वस्थ Stentor संस्कृति का उदाहरण । आम तौर पर, अगर एक संस्कृति है यह ध्यान केंद्रित, बंटवारे संस्कृति की सिफारिश की है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
वीडियो 2. methylcellulose के साथ Stentor धीमा । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 3
वीडियो 3. नवनवीन Stentor. व्यक्तिगत कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से सेल के माध्यम से एक गिलास सुई दबाकर एक स्टीरियो विदारक माइक्रोस्कोप के तहत कई टुकड़ों में कटौती की जा सकती है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

संस्कृति के साथ समस्या संभव उपाय संभावित रोकथाम
संस्कृति rotifers या अन्य बड़े जीवों से अभिभूत है । एक नई संस्कृति पकवान में संभव के रूप में कई Stentor निकालें । फिर तीन बार कोशिकाओं को धो लें । Stentor अच्छी तरह से धो जब उंहें प्राप्त करने, यहां तक कि जब उंहें एक वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता से खरीदते हैं ।
संस्कृति कवक या अन्य छोटे जीवों से अभिभूत है । ऐसे कोने की पहचान करें जहां कम से Stentor हों । उस क्षेत्र में, कई Stentor को हटाने और नए PSW में जोड़ने के बिना जितना संभव हो उतना मीडिया निकालें । धीरे लेकिन के माध्यम से मिश्रण करने के लिए हमलावर जीवों distrubute । छोड़ अगले खिला और Stentor उंहें खा जाएगा । संस्कृति का नियमित रूप से निरीक्षण करें और ताजा PSW के लिए मीडिया का आदान-प्रदान करके छोटे-बड़े दूषित पदार्थों को निकालें ।
Stentor एक-दूसरे के ऊपर बिछाने लगे हैं । संस्कृति को इतना विभाजित करें कि एकाग्रता 20 से कम कोशिकाओं/ संस्कृतियों अधिक बार विभाजित ।
Stentor कोशिकाओं में सहवास होता है. हर 5 दिन के बजाय हर 4 दिन में फीड कर दें ।
संस्कृति अंधेरे अपशिष्ट पदार्थ का एक बहुत कुछ है । अंधेरे सामग्री के रूप में ज्यादा, Stentor अपशिष्ट, कोशिकाओं को हटाने के बिना संभव के रूप में निकालें । यदि Stentor अंधेरे सामग्री से जुड़े होते हैं, पिपेट ऊपर और नीचे अपने कचरे से Stentor कोशिकाओं को रिहा करने के लिए और फिर कोशिकाओं को हटाने के बिना कचरे के साथ मीडिया को हटा दें । या, उन Stentor को हटा दें और तदनुसार कम फ़ीड । फ़ीड Stentor 1 मिलीलीटर संस्कृति के १०० मिलीलीटर प्रति कम भोजन ।
अस्वस्थ दिखने वाला (vacuolated/फूला या गोल) Stentor. कई Stentor कोशिकाओं को हटाने और नए PSW जोड़ने के बिना जितना संभव हो उतना मीडिया निकालें । मीडिया नियमित रूप से आदान-प्रदान ।

तालिका 1. संवर्धन Stentorके लिए मार्गदर्शिका समस्या निवारण ।

Discussion

संवर्धन Stentor चुनौतियों का एक नंबर प्रस्तुत करता है । सबसे पहले, प्रयोगों है कि कोशिकाओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता होती है प्रदर्शन करने के लिए, एक Stentor संस्कृतियों की एक बड़ी संख्या को बनाए रखने की जरूरत है, के रूप में संस्कृतियों जब Stentor एकाग्रता 20 कोशिकाओं से अधिक है अस्वस्थ हो/ दूसरा, जीवों कि Stentor संस्कृतियों दूषित अक्सर Stentor से तेजी से विभाजित कर सकते है और संस्कृति (एक आम contaminant rotifers है डूब) । इस प्रकार, यह एक खुर्दबीन के नीचे संस्कृति का निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है समय पर और दूषित पदार्थों को दूर । कभी-कभार, एक नई संस्कृति को कोशिकाओं की एक छोटी संख्या से शुरू करने की जरूरत है एक दूषित संस्कृति से मैंयुअल रूप से बचाया । यह स्वस्थ Stentor संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक समय बढ़ाता है । तीसरा, एक ४०० मिलीलीटर संस्कृति में एक एकल कोशिका का विस्तार कम एक महीने की आवश्यकता है क्योंकि Stentor सेल चक्र 3-5 दिन है । चौथा, अंय मॉडल ciliates के विपरीत, Stentor शायद ही कभी पुटी के रूप में जाना है और वे जमे हुए नहीं किया जा सकता है ।

संवर्धन Stentor का एक महत्वपूर्ण पहलू एक उपयुक्त खाद्य जीव का चयन है । संवर्धन Stentor के लिए विभिंन तरीकों पहले से वर्णित थे । उनमें से एक संस्कृति बैक्टीरिया जो फिर Stentorफ़ीड के लिए स्किम दूध का उपयोग करने का सुझाव । ऐसी तकनीक संवर्धन Stentorमें कारगर है; हालांकि, जीनोमिक तकनीक के आवेदन के लिए शुद्ध नमूनों की आवश्यकता है जीनोमिक से उत्पंन भ्रम से बचने के लिए अपरिभाषित खाद्य जीवों से पढ़ता है । वर्तमान प्रोटोकॉल का प्रयोग, Stentor बड़े पैमाने पर किया जा सकता है और, क्योंकि उनके भोजन, Chlamydomonas, अनुक्रम किया गया है, खाद्य जीव से जीनोमिक संदूषण की उपस्थिति का पता लगाया जा सकता है और के लिए नियंत्रित । अज्ञात कारणों से टैटार को लौटते हुए अपने स्टॉक्स की भरपाई करनी थी, जहां से उसने पहले Stentor पाया । वर्तमान प्रोटोकॉल के साथ, हम साल के लिए Stentor रखने के लिए सक्षम किया गया है ।

Stentor के साथ पुनर्जनन प्रयोग आम तौर पर सीधा कर रहे हैं, लेकिन कुछ महत्वपूर्ण विवरण को ध्यान में रखना हैं । खंड 2 के संबंध में, छमाही में Stentor कोशिकाओं को काटने मिनट में महारत हासिल किया जा सकता है । Stentor के अधिक उंनत microsurgery प्रक्रियाओं माहिर अभ्यास के एक सप्ताह की आवश्यकता हो सकती है । जबकि एक सुक्रोज या यूरिया उपचार प्रदर्शन (धारा 3), इमेजिंग की शुरुआत में सबसे कोशिकाओं अभी भी अपने membranellar बैंड है, जब सुक्रोज उपचार अगले प्रदर्शन किया है के लिए 10-30 एस द्वारा गर्मी समय वृद्धि हुई है । 3 मिनट की मशीन से परे सुक्रोज उपचार के समय में वृद्धि नहीं है क्योंकि यह कोशिका मृत्यु में परिणाम होगा ।

Stentor पुनर्जनन के इमेजिंग समय की लंबी अवधि के लिए छवि बड़ी कोशिकाओं के लिए तरीकों की आवश्यकता है । इमेजिंग खंड 4 में विस्तृत विधि केवल एक ईमानदार खुर्दबीन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि एक औंधा माइक्रोस्कोप के बजाय उपलब्ध है, तो कोशिकाओं को एक स्लाइड पर रखा जा सकता है या छोटे कक्षों में coverslip. एक विधि पेट्रोलियम जेली के बाहर एक चैंबर बनाने के लिए और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक और coverslip के साथ कवर करने के लिए है । वैकल्पिक रूप से, एक कक्ष के लिए एक कक्ष में वांछित आकार के एक छेद पंच के साथ एक छेद बनाने के द्वारा बनाया जा सकता है 1 एक्स 1 सेमी2 सिलिकॉन स्पेसर के वर्ग (सामग्री की तालिका), एक coverslip पर स्पेसिंग रखने, कक्ष में कोशिकाओं डाल , और एक और coverslip के साथ चैंबर को कवर । जब इमेजिंग, यदि Stentor सही अभिविंयास में नहीं है के लिए पुनर्जनन के प्रत्येक चरण के विशिष्ट सुविधाओं का निरीक्षण, थाली मजबूती से नल सेल अनुबंध करने के लिए । देखो सेल उत्थान के चरण की पहचान करने के लिए विस्तार (पूर्ण विस्तार के बारे में ४५ s लेता है) । सेल गलत अभिविन्यास में अभी भी है, तो दोहन दोहराएँ. चित्र 1 में दिखाया गया है और चित्रा 6 एक स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप द्वारा लिया गया; हालांकि, सभी प्रयोगों विस्तृत एक 5x विदारक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है ।

संवर्धन और इमेजिंग Stentor के अलावा एक और चुनौती पुनर्जनन की ट्रैकिंग है, विशेष रूप से चरणों की पहचान करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा । यदि पुनर्सृजन कोशिका पूरी तरह से मौखिक primordium स्पष्ट रूप से दिखाई के क्षेत्र के साथ उंमुख है, मंच की पहचान कुछ सेकंड लेता है । कई बार, तथापि, Stentor सेल एक अभिविंयास में है पुनर्जनन चरण के स्पष्ट काम को रोकने, इस प्रकार अधिक समय लेने के लिए पहचान । समय की महत्वपूर्ण राशि के लिए व्यक्तिगत पुनर्सृजन कोशिकाओं के सभी reचूकने कोशिकाओं के ठहराव देरी हो सकती है, इस प्रकार मचान के लौकिक परिशुद्धता कम और पर्यवेक्षक की आवश्यकता के लिए प्रतीक्षा करें और फिर से छवि सेल के बाद यह स्थानांतरित कर दिया है एक नया अभिविंयास । फलस्वरूप, यह प्रयोग समय और श्रम दोनों ही गहन है. इन कारणों के लिए, यह Stentor कोशिकाओं का पता लगाने और वीडियो माइक्रोस्कोपी डेटा में पुनर्जनन के चरणों निर्दिष्ट करने के लिए स्वचालित तरीके विकसित करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा । ये भी अधिक reproducible प्रयोगों के लिए अनुमति होगी, नमूना आकार में वृद्धि, और मानव पूर्वाग्रह को हटाने.

अत्यधिक संवेदनशील जीनोमिक और proteomic तरीकों के उद्भव के लिए एकल कोशिकाओं के अध्ययन तक पहुंचने में डाल शुरू कर दिया है । ऐसे एकल सेल विश्लेषण के लिए, एक Stentor सेल के विशाल आकार यह सबूत के अवधारणा प्रयोगों के लिए एक वांछनीय परीक्षण विषय बनाता है । ऐसे प्रयोगों के लिए संभव हो, संवर्धन Stentor मौलिक है, और इसलिए यहां वर्णित तरीकों और अधिक उंनत एकल सेल तकनीक के विकास में एक भूमिका निभानी चाहिए ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को NIH ग्रांट R01 GM113602 (WFM) और NSF ११४४२४७ (AL) ने सपोर्ट किया था । हम इन प्रोटोकॉल में से कुछ के प्रारंभिक संस्करणों के विकास के लिए और जानकारीपूर्ण विचार विमर्श के लिए मार्क Slabodnick और नेटली Kirkland स्वीकार करते हैं । हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए करीना Perlaza और Greyson लुईस धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stentor coeruleus live culture Carolina Biological Supply 131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar Carolina Biological Supply 152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle Carolina Biological Supply 132458
Methyl cellulose, 1500 cP Millipore Sigma M0387
Pyrex glass spot plate Fisher Scientific 13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL Carolina Biological Supply 715740
2-cup glass container with glass lid Pyrex 1095600
CultureWell silicone sheet material Grace Bio Labs 664475
Kimwipes Kimberly Clark 34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube Denville C2170
Cover Glass Fisher finest 12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture ThermoFisher A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm Grace Bio Labs 664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White Spectrum P1037
Borosilicate glass capillary tubes.
OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.		 Sutter Instrument B120-90-10
Needle puller P-87 Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope Zeiss

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १३६ Stentor coeruleus ciliates प्रोटिस्टा membranellar बैंड मौखिक तंत्र पुनर्जनन एकल सेल परख
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Lin, A., Makushok, T., Diaz, U.,… More

Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the Study of Regeneration in Stentor. J. Vis. Exp. (136), e57759, doi:10.3791/57759 (2018).

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