Metoder för studier av förnyelse i Stentor

Summary

Den gigantiska flimmerdjuret, Stentor coeruleus, är ett utmärkt system att studera regeneration och sårläkning. Vi presenterar förfaranden för inrättande av Stentor cellkulturer från enstaka celler eller cellen fragment, förmå regenerering av skärande celler, kemiskt inducerande regenerering av membranellar band och oral apparatur, bildbehandling och analys av cell förnyelse.

Abstract

Celler behöver för att kunna regenerera deras delar att återhämta sig från yttre störningar. De encelliga ciliate Stentor coeruleus är en utmärkt modellorganism att studera sårläkning och efterföljande cellförnyelsen. Stentor genomet blev tillgängliga nyligen, tillsammans med moderna molekylärbiologiska metoder, såsom RNAi. Dessa verktyg gör det möjligt att studera single-cell förnyelse på molekylär nivå. Den första delen av protokollet omfattar upprättande av Stentor cellkulturer från enstaka celler eller cellen fragment, tillsammans med allmänna riktlinjer för att upprätthålla Stentor kulturer. Odling Stentor i stora mängder möjliggör användning av värdefulla verktyg som biokemi, sekvensering och masspektrometri. Senare avsnitt av protokollet omfatta olika metoder för att förmå förnyelse i Stentor. Manuellt klippa celler med en glas-nål kan studera regenerering av stora cell delar, medan behandling av celler med antingen sackaros eller urea kan studera regenerering av särskilda strukturer ligger i den främre delen av cellen. En metod för imaging enskilda regenererande celler som, tillsammans med en rubrik för mellanlagring och analysera dynamiken i regenerering. Hela processen av förnyelse är uppdelad i tre etapper. Genom att visualisera dynamiken i utvecklingen av en population av celler genom stadierna, demonstreras heterogenitet i regenerering timing.

Introduction

Celler är inte enkla väskor av enzymer, men ganska mycket komplexa maskiner vars komponenter är noggrant skalas till rätt storlek och arrangerade väl definierade positioner. Morfogenes av enskilda celler representerar en viktig process i cellen och utvecklingsbiologi, men dess molekylära mekanismen är okänd^1,2. Medan vissa odlade celler liknar blobbar, kan encelliga organismer ha extremt komplicerat arkitekturer, exemplifieras av de komplexa kortikala mönster ses i ciliater^3,4.

Kanske är det mest extrema exemplet på en mycket strukturerad cell Stentor coeruleus, en jätte heterotrichous ciliate avlägset besläktade Tetrahymena och Paramecium. Stentor är 1 mm lång och är täckt med mer än 100 längsgående ränder i blått pigment omväxlande med rader av cilier anordnas av parallella travar av mikrotubuli band som kör längden på hela cellen. Cellen är trumpet-formad (figur 1), med ett membranellar band och en oral apparatur (OA) på dess främre änden och en holdfast som fäster cellen till substratet i dess bakre ände. Förutom tydliga anterior-posterior polaritet visar cellen också en distinkt kirala mallning, sådan att avståndet mellan ciliär rader gradvis ökar i medurs riktning. Detta resulterar i en diskontinuitet där den smalaste raden möter den bredaste raden, och denna region av cellytan, kallas locus av stripe kontrast, kan inducera bildandet av den andra uppsättningen av framändan strukturer när ympade på en annan cell⁵, gör det formellt motsvarar Spemanns arrangör. Alla viktiga processer i utvecklingsbiologi har alltså deras analoger i Stentor: axiation, mönster bildandet och induktion. I ett embryo, dessa processer drivs av öde skillnader mellan olika celler, men i Stentor, de måste drivas av öde skillnader mellan olika regioner inom en enda cell. Vad definierar skillnaderna mellan regionerna inom Stentor är ett mysterium.

Om någon del av Stentor är avskuren, kan den saknade pusselbiten i cellen regenerera för att ge en normal cell i några timmar. Om en cell är skära i hälften, eller ens i mycket mindre bitar, varje bit omorganiserar i en normal proffsiga men mindre cell och återställer korrekt proportionalitet mellan cell delar^6,7. Även små fragment, 1/64^{: e} storleken på den ursprungliga cellen, kan regenerera i en liten men normalt tilltagna cell, och sedan växer till full storlek⁶. Stentor presenterar således en unik möjlighet att studera mekanismerna bakom organell storlek skalning och cell tillväxt förordning med kirurgiska metoder som tillämpas normalt på nivån av vävnader eller hela organismer.

En av egenskaperna för Stentor som gör det möjligt att återskapa från en rad kirurgiska ingrepp är att det innehåller en enda knölig macronucleus (figur 1) med cirka 50.000 exemplar av hela genomet⁸. Så länge en cell fragment innehåller minst en macronuclear nod, har den förmågan att regenerera fullt. En annan egenskap underliggande Stentorregeneration förmåga är dess enorma sårläkning förmåga. Även om många celltyper är kapabla att läka deras sår⁹, är Stentor kunna återhämta sig från en extra rad fysiska störningar. Ett exempel på Stentor återhämtning från en drastisk störning, tillsammans med metoderna för att visualisera cytoplasmiska flöde i Stentor¹⁰ rapporterades tidigare. Dessa metoder kan studiet av hur skadade och senare regenerering påverkar det fysiska tillståndet av cytoplasman.

STENTORSenorma storlek, extraordinära regeneration förmåga, och det faktum att det yttrar sig många av de utvecklingsmässiga fenomen som ses i flercelliga embryon (som arrangörer, axiation och mallning) lockade många utvecklande biologer under vänden av förra århundradet, inklusive Thomas Hunt Morgan⁷. Under 50- och 60-talet visade mikrokirurgiska metoder en häpnadsväckande rad regenerativ och morphogenetic processer i denna Singel-celledorganism¹¹. Dock har Stentor utvecklats som molekylärbiologi modellsystem först nyligen. Under de senaste åren, genomet hos Stentor sekvenserades och monterade⁸, och metoden att stör genuttryck med hjälp av RNAi vid utfodringen var utvecklade¹².

En av anledningarna till att Stentor utvecklades till en modellorganism för modern molekylärbiologi endast nyligen var svårigheten att odla stora kulturer på grund av dess långa cellcykeln (3 till 5 dagar). Men kräver moderna genomisk och proteomiska metoder mindre material än de brukade, och volymen av en Stentor cell räcker för dessa metoder, även utan att tillgripa ultrasensitive metoder som utvecklats för analys av enstaka celler som är mycket mindre än Stentor. Avsnitt 1 i protokollet beskriver förfarandet för att inrätta en stor kultur från en Stentor cell. Samma tillvägagångssätt kan användas för att etablera en stor kultur från en cell fragment erhålls genom att skära en cell. Avsnitt 1 ger också riktlinjer för att upprätthålla friska Stentor kulturer över långa tidsperioder. Avsnitt 2 av protokollet tillhandahåller metoden för att inducera cellförnyelsen genom att skära cellerna manuellt med en glas-nål. Avsnitt 3 i protokollet är tillägnad två metoder för att förmå regenerering av specifika cellstrukturer (membranellar band och oral apparatur): behandling av cellerna med antingen sackaros eller urea leder till avgivande av dessa strukturer, följt av deras förnyelse. Avsnitt 4 i protokollet specificerar en metod för bildtagning av enskilda regenererande celler över långa tidsperioder. Avsnitt 4 avslutas med en beskrivning av stadierna av regeneration och tips om analysen av regenerering dynamics.

Protocol

1. odla Stentor och etablera Stentor kulturer från enstaka celler eller cellen fragment

1. Förbereda Chlamydomonas reinhardtii kultur att användas som mat för Stentor.
   1. Erhålla Chlamydomonas reinhardtii celler från en kommersiell leverantör (Tabell för material).
   2. Upprätta en 500 mL flytande kultur av Chlamydomonas reinhardtii i kommersiellt tillgängliga tryck media med steril teknik¹³.
   3. Håll Chlamydomonas kulturen under en lampa vid en koncentration nära mättnad (på OD på cirka 1) genom att späda den med tryck media två gånger i veckan.
      Obs: Chlamydomonas kulturen kan odlas på en shaker.
   4. Kontrollera regelbundet om Chlamydomonas kulturen är friska genom att placera en droppe av kultur på en bild, täcka den med ett täckglas och kontrollera om det under ett Mikroskop med 40 X förstoring.
      Obs: Använd inte kulturen Stentor foder om det är förorenat med bakterier eller om Chlamydomonas celler samlas i kluster. Om något av dessa problem inträffar, starta en ny Chlamydomonas kultur.
2. Erhålla Stentor coeruleus celler från en kommersiell leverantör (Tabell för material).
3. Om Stentor celler behövs från deras naturliga miljö, samla in dem från en damm, sjö eller flod¹¹.
   1. Samla in Stentor från en damm, hittar sjö eller älv, ett område med några vegetation där vattnet är relativt lugn, skumma och tydlig.
      Obs: Finns det en högre sannolikhet för att hitta Stentor på platser där andmat växer.
   2. Samla minst 2 L vatten i en behållare som är lätt att hälla ur.
   3. Efter detritus och partiklar har fast till botten av behållaren, Fyll försiktigt några mindre behållare att undersöka för Stentor, väntar några sekunder efter varje samling för detritus att bosätta sig i den stora behållaren.
   4. När provtagning är klar på en plats, flytta till en ny plats som är minst 10 m bort och upprepa provtagning det.
      Obs: Inte varje damm har en Stentor befolkning, så flera dammar kan behöva provtas.
   5. Återgå med prover till labbet och överför vattnet från behållare till enskilda petriskålar.
   6. I varje petriskål, söka Stentor under ett stereomikroskop med snedbelysning på 5 X förstoring. Överföra enskilda Stentor celler med 1 mL pipett i en brunn i en spot glasplatta som innehåller minst 100 µL av kommersiellt tillgängliga pastöriserad källvatten (PSW).
      Obs: Stentor celler har en trumpet-liknande form när de är knutna till ett substrat (figur 1). Simning Stentor celler är mindre längre än de celler som är knutna till ett substrat (Video 1).
   7. Tvätta Stentor i PSW minst 3 x. Utföra tvättarna genom att ta bort ca 90% av vattnet från brunnen samtidigt hålla Stentor celler i brunnen, följt av att lägga till 500 µL av PSW i brunnen.
      Obs: Innan du hanterar Stentor använda pipetter med pipettspetsar 10 µL eller mindre, skär ca 0,5 mm stänga i slutet av pipettspetsen med sax för att undvika skadade celler på grund av skeva styrkor som genereras när en stor cell flyter genom för litet av en tip-op skapas eller förstärks.
4. Förbereda Chlamydomonas innan varje utfodring av Stentor.
   1. Över 1 mL Chlamydomonas kultur tillagad som steg 1.1 i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Centrifugera vid 2,095 x g i 3 min.
   2. Avlägsna supernatanten och resuspended pelleten i 1 mL av PSW. Centrifugera vid 2,095 x g i 3 min. ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 µL av PSW.
      Obs: Således tvättas och koncentrerad Chlamydomonas kommer att betecknas som ”beredd Chlamydomonas” i följande steg. Tryck på media är till nackdel för Stentor, alltså tvätta Chlamydomonas innan utfodring Stentor är viktigt.
5. Om en klonal Stentor kultur behövs, starta kulturen från en enskild Stentor cell eller en cell fragment.
   1. Eftersom enstaka Stentor celler inte växer bra i PSW, Förbered betingad av filter sterilisering 500 µL av media från en befintlig, friska Stentor kultur.
   2. Överföra 500 µL av konditionerat media till en av brunnarna i en spot glasplatta.
   3. Över en Stentor till brunnen av spot glasskivan som innehåller betingade media. Använd som liten medium som möjligt för att göra överföringen.
   4. Foder varje Stentor 5 µL av beredda Chlamydomonas varje 48 h. När Stentor klyftan, räkna antalet celler i väl och tillsätt 5 µL beredda Chlamydomonas per cell.
   5. Hålla Stentor på en skuggig plats eftersom cellerna är känsliga för ljus (till exempel i klar plast lådor täckt med hushållspapper).
   6. Utbyta Stentor medium i brunnen med fräscha luftkonditionerade medium varje 96 h.
      1. Förbereda färska luftkonditionerade medier som i steg 1.5.1.
      2. Gör alla Stentor celler lossna från botten av brunnen av försiktigt pipettering vätskan upp och ner i brunnen.
      3. Aspirera försiktigt vätskan från den väl med 1 mL pipett, se till att alla celler kvar i brunnen. Tillsätt 500 µL av fräscha luftkonditionerade medier till brunnen.
   7. När antalet celler i väl överstiger 20, flytta celler till en större behållare, till exempel en bred mun glasburk.
      1. Tillsätt 20 mL PSW in en Ånghärdad bred mun glasburk.
         Obs: Autoklavering av glasvaror för Stentor kan ersättas med noggrann tvättning och sköljning.
      2. Noggrant Pipettera media upp och ner i brunnen för att lossa alla celler från botten av brunnen. Samla alla Stentor celler som använder en 1 mL pipettspetsen och försiktigt överföra dem till glasburken.
   8. Dra inte åt locken på burkarna med Stentor kulturer, att ge tillräcklig tillgång till luft.
   9. Lägga till PSW burken varje 48 h för att hålla Stentor densitet på cirka 20 celler/mL. Beräkna densiteten av celler genom ögat.
      Obs: Alternativt använda en 1 mL pipett till bubbla luft i burken för att göra celler lossna från väggarna, pipett upp 1 mL av kulturen, och räkna antalet celler i pipettspetsen.
   10. Varje 48 h, foder beredd Chlamydomonas att Stentor kulturer i burkar (se steg 1.4). Börja med utfodring kulturen med 200 µL beredda Chlamydomonas. Eftersom volymen av kultur ökar gradvis öka mängden beredda Chlamydomonas används för matning till 1 mL.
   11. När volymen kultur når ungefär 90% av burkens kapacitet, överföra kulturen till en större behållare.
       1. Pipettera kulturen inuti burken, upp och ner, med en 1 mL pipett att lösgöra Stentor från glaset.
       2. Häll hela innehållet i burken i en 2-kopp glasbehållare.
       3. Skölj burken med ca 25 mL PSW i glasbehållaren 2-kopp för att samla in de återstående Stentor.
6. Upprätthålla friska kulturer i 2-kopp glasbehållare.
   1. Foder Stentor kulturer 2 mL beredd Chlamydomonas per 100 mL kultur var 4-5 dagar. Lägga till PSW i glasbehållaren för varje 4-5 dagar för att hålla Stentor densitet på cirka 20 celler/mL.
      Obs: 450 mL är den maximala volymen som en 2-kopp behållare rymmer.
   2. En gång i veckan, inspektera kulturer under en 5 X dissekera Mikroskop för rotifers, svamp och andra tillväxt. Ta bort kontaminerande mikroorganismer tillsammans med onormalt formade och färglös Stentor celler med 1 mL pipett för att förlänga hälsa kultur.
   3. När glasbehållaren är ca 90% full, split kulturen.
      1. Tillsätt 25 mL PSW till glasbehållaren för. Använd en 25 mL pipett till pipetten upp och ner för att lösgöra Stentor från glaset. Flytta omkring 50% av kultur i en ny 2-kopp glasbehållare.
      2. Tillsätt 25 mL PSW till båda kulturerna och fortsätta att upprätthålla de två kulturerna som beskrivs i detta avsnitt av protokollet.
         Obs: Eftersom Stentor celler är känsliga för höga temperaturer, hålla temperaturen vid 25 ° C eller lägre i rummet där kulturer hålls. Alternativt, kulturer kan hållas i en inkubator. Se tabell 1 för felsökning av Stentor odling.

2. inducerande regenerering av skärande Stentor celler

1. Använd en nål avdragare för att göra flera nålar från kapillärrör med hjälp av programmet enligt följande: värme - 735, pull - 100, velocity - 110, tid - 150, tryck - 400.
2. Bered en 4% metylcellulosa i 50 mL PSW.
   1. Tillsätt 1 g metylcellulosa (viskositet: 1500 cP) till 50 mL PSW.
   2. Inkubera vid 4 ° C under minst 8 h för att underlätta upplösningen av metylcellulosa.
   3. Hålla 4% metylcellulosa lösning vid rumstemperatur.
3. Förbereda en glasplatta plats för att lagra cellen fragment efter nedskärningar.
   1. Filter sterilisera media från en hälsosam kultur, 500 mL per spot glasplatta som väl behövs.
   2. Överföra 500 mL steriliserat media i alla de brunnar som behövs.
4. Samla en hälsosam Stentor (med en definierad trumpet form, pulserande blå-grön färg och inga stora vakuoler) i en 2 µL droppe och placera den på ett täckglas eller bild. Tillsätt 2 µL av 4% metylcellulosa (figur 2). Låt Stentor bromsa innan du skär det (Video 2).
5. Håll glaset nålen som parallell till skärytan som möjligt för att förhindra att bryta nålen.
6. Använda en stereo dissekera Mikroskop, lokalisera den glas nålspetsen och flytta den närmare till cellen (figur 3A). Observera Stentor kontraktet vid kontakt med nålen (figur 3B och C).
   Obs: Om cellen finns i en riktning som gör att separera den främre änden från den bakre änden svårt, rotera den mycket varsamt med sidan av nålen.
7. Tryck försiktigt på den kontrakterade Stentor med sidan av glas nålen att skära i cellen i två (figur 3D och E, Video 3). Flytta två fragment apart säkerställer att det finns ingen cytoplasmiska anslutning mellan dem, för att undvika fragment fusion (figur 3F).
8. Kontrollera om båda fragment har minst en macronuclear nod varje genom att undersöka fragment i dissekera Mikroskop med sned belysning.
   Obs: Ha minst en macronuclear nod är nödvändigt för cellöverlevnad. Cellen kan sprida dess membran (transparent skal) tillsammans med blå-gröna pigment under eller efter snittet. I de flesta fall kommer detta inte att påverka den långsiktiga livskraften hos cellen.
9. Flytta fragment i brunnar i en spot glasplatta som förberett i steg 2,3.
10. Skär flera celler eftersom en bråkdel av skurna cellerna inte kommer regenererar.
11. Om utför flera nedskärningar i en session, ersätta glas nålen när det blir tungt belagda med Stentor rester eller när dess spets är bruten. Alternativt, ren nålen genom att torka försiktigt på en bit av kisel spacer.
    Obs: Glas nålar kan användas för flera cell kapning sessioner.
12. Hålla glas spot plattan med cellen fragment i en fuktkammare.
13. Fortsätt till avsnitt 4 i protokollet för information om imaging och resultattolkning Stentor regenerering.

3. inducerande regenerering av Membranellar Band och Oral apparatur av sackaros eller Urea behandling

1. Membranellar band och oral apparatur borttagning med hjälp av sackaros
   1. Bered en 25% sackaros i PSW.
   2. Tillsätt 500 µL 25% sackaros i PSW i en mikrocentrifug rör med en snap cap.
   3. Förbered 3 mikrocentrifugrör med snap-lock med 1 mL PSW i varje rör för att tvätta cellerna efter sackaros behandling.
   4. Samla in 30-60 Stentor celler i 1 mL av deras kultur media i ett separat mikrocentrifug rör med 1 mL pipett (figur 4, pil A).
   5. Samla alla celler från röret i 125 µL slutlig volym med 200 µL pipett i en enda dragning. Överföra dem till röret med 500 µL 25% sackaros (bereddes i steg 3.1.2) för att erhålla 625 µL 20% sackaroslösning (figur 4, pil B). Starta ett stoppur.
   6. Inkubera Stentor i denna 20% sackaroslösning och flick-spin mikrocentrifug röret i racket för 1 min.
   7. Samla alla celler i en enda dragning (justera pipetten till 200 µL max kapacitet för enklare samling).
   8. Hålla cellerna i pipettspetsen tills tidtagaruret visar 2 min av sackaros behandling.
   9. Mata ut Stentor i en av de mikrocentrifugrör som bereddes i steg 3.1.3 (figur 4, pil C). Flick-spin röret i racket.
   10. Tvätta cellerna två gånger, en gång i varje av de två återstående mikrocentrifugrör innehållande PSW bereddes i steg 3.1.3 (figur 4, pilar D och E).
       Obs: Enda dragning cell samling teknik är inte viktigt mellan tvättarna.
   11. Fortsätt till avsnitt 4 i protokollet för information om imaging och tolkning av Stentor regenerering dynamics (figur 4, pilar F och G).
2. Membranellar band och oral apparatur borttagning med hjälp av urea
   1. Bered en lösning av 4% urea i PSW.
   2. Tillsätt 300 µL 4% urea i PSW i en mikrocentrifug rör med en snap cap.
   3. Förbered 3 mikrocentrifugrör med snap-lock innehållande 1 mL PSW i varje rör för att tvätta cellerna efter urea behandling.
   4. Samla in 30-60 Stentor celler i 1 mL av deras kultur media i ett separat mikrocentrifug rör med 1 mL pipett (figur 4, pil A).
   5. Samla alla celler från röret i 300 µL slutlig volym med 1 mL pipett i en enda dragning. Överföra dem till röret med 300 µL av 4% urea (bereddes i steg 3.2.2) för att få 600 µL 2% urealösning (figur 4, pil B). Starta ett stoppur.
   6. Inkubera Stentor i denna 2% urealösning och flick-spin mikrocentrifug röret i racket för 1 min.
   7. Samla alla celler i en enda dragning.
   8. Hålla cellerna i pipettspetsen tills tidtagaruret visar 2 min av urea behandling.
   9. Mata ut Stentor i en av de mikrocentrifugrör som bereddes i steg 3.2.3 (figur 4, pil C). Flick-spin röret i racket.
   10. Tvätta cellerna två gånger, en gång i varje av de två återstående mikrocentrifugrör innehållande PSW bereddes i steg 3.2.3 (figur 4, pilar D och E).
       Obs: Enda dragning cell samling teknik är inte viktigt mellan tvättarna.
   11. Fortsätt till avsnitt 4 i protokollet för information om imaging och tolkning av Stentor regenerering dynamics (figur 4, pilar F och G).

4. imaging och analysera cellförnyelsen

1. Om använder en upprätt Mikroskop, använder hängande droppe metod att bilden regenerering av enskilda celler.
   1. Sätta 100 µL av PSW i en brunn av en spot glasplatta.
   2. Isolera 1 Stentor cell i 4 µL kultur media (media som de är i), med en 10 eller 20 µL Pipettera. Deponera droplet-programmet mitt i ett 22 x 22 mm² täckglas (figur 5).
      Obs: Om cellerna som är 1) ohälsosamma (onormalt formade eller tungt vakuoliserade) eller 2) fortfarande har membranellar band eller muntliga apparaturar (för kemisk behandling experiment), Använd inte för avbildning.
   3. Ordna 4 fler droppar av Stentor i kultur media runt tidigare droplet-programmet, samtidigt som den lämnar tillräckligt utrymme mellan dropparna.
   4. Invertera täckglaset med droppar och försiktigt placera den över brunnen av spot glasskivan som PSW lades till i steg 4.1.
   5. Obs: PSW i brunnen kommer att minimera avdunstningen av droppar (figur 5).
   6. Förbereda de återstående cellerna för avbildning genom att följa steg 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Bild de regenererande cellerna i Mikroskop med önskad tidsupplösning. Alternativt, iaktta regenerering med dissekera stereo Mikroskop.
      Obs: Förnyelse börjar omedelbart efter cell kapning eller behandling med sackaros eller urea. Men kommer att synliga nya orala strukturer utgöra ca 3 h efter början av förnyelse.
2. För varje tidpunkt, tilldela en av tre regenerationen arrangerar varje cellerna. Gör detta genom att jämföra varje cell till de representativa bilder som illustrerar arrangerar (figur 4 och figur 6).
   1. Tilldela de celler som inte har ett membranellar band ännu (figur 6A) steg 1.
   2. Etapp 2 tilldela cellerna med ett membranellar band.
      Obs: Ett membranellar band visas 3-6 h efter behandling (figur 4, figur 6B). I slutet av detta skede visas en ytterligare krökning av den bakre änden av membranellar bandet precis innan en oral primordium visas.
   3. Tilldela cellerna med en muntlig primordium etapp 3.
      Obs: En muntlig primordium är en invagination visas 6-8 h efter behandling i bakre slutet av bandet membranellar (figur 4, figur 6 c och 6 D). Förnyelse är klar när cellerna har ett membranellar band på sin främre änden och formen karakteristiska trumpet cellen (figur 4, figur 6E). De flesta Stentor celler omgenereras fullt inom 8-9 h sedan början av förnyelse.
3. Rita procentandelen av celler i varje regenerering steg för varje tidpunkt i form av en staplad lådagram (figur 7).
   Obs: Denna typ av tomt tillåter visualisering av regenerering dynamics i en population av celler.

Representative Results

Stentor kulturer har varit tillförlitligt fastställs och upprätthålls från enskilda celler eller cellen fragment med avsnitt 1 i protokollet. Ett representativt exempel på en stor sund kultur visas i Video 1.

Tidsförloppet för regenerering mättes i Stentor använder sackaros behandlingsmetoden för att initiera regenerering som beskrivs i steg 3.1, kombinerat med bildbehandling och analysmetod som diskuteras i avsnitt 4 (figur 7). Denna handling visar att det finns en en-timme-långa spridning i den tid som befolkningen i celler att nå något särskilt Stadium. Denna typ av analys kan studiet av temporal heterogenitet i regenereringsprocessen i en population av regenererande celler.

Följande är en sammanfattning av regenerering timing som har observerats hittills efter dussintals sackaros behandlingar (figur 4 och figur 6). Etapp 1 är när Stentor celler ser ut som teardrops utan någon membranellar band (detta skede börjar omedelbart efter sackaros washout). Detta stadium varar för 3-6 h. etapp 2 är när ett membranellar band visas och växer (3-6 h efter sackaros behandling). Detta stadium varar för 3-4 h. etapp 3 är när en oral primordium visas på den bakre änden av membranellar bandet (6-8 h efter sackaros behandling) och båda strukturer flyttas mot främre slutet av cellen. Detta stadium varar i 1-2 h. När både membranellar bandet och muntliga apparaten nått främre slutet av cellen, anges detta slutförandet av regenerering. Cellen har antagit karakteristiska Stentor trumpet-liknande form. Cellerna var helt regenererad 8-9 h efter sackaros behandling.

Figur 1. Ögonblicksbild av Stentor. Membranellar bandet och muntliga apparaten visas på den främre änden av cellen. Holdfast är bakre slutet av cellen. Stentor macronucleus är knölig. En välnärda Stentor har grön mat vakuoler som innehåller mestadels Chlamydomonas. Skalstapeln är 0,5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2. Stentor skärande set-up. Cell styckningen utförs genom att manuellt ändra en glas nål medan du tittar på cellen med kommersiellt tillgängliga dissekera stereo Mikroskop. Syftet med mjukpapper är att ge den vita bakgrunden för att se cellerna som är bättre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Ögonblicksbilder av Video 3 illustrerar hur man skär en Stentor med glas nål. (A) A Stentor omedelbart innan kanylen når det. (B) en Stentor klämde försiktigt mellan en nål och glas bild. (C) A kontrakterade Stentor reagerar på styrkan av nålen. (D) A Stentor skärs av försiktigt trycka på cellen med sidan av nålen. (E) A Stentor nu skär i två men separeras inte. (F) två Stentor fragment. Skalstapeln är 0,25 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 4. Schematiska visualisering av avsnitt 3 och avsnitt 4 i protokollet. Detta är en illustrerad protokoll för att utföra sackaros eller urea behandling och observation av cellförnyelsen. Den tid som anges i den nedre panelen mäts från början av tvätten 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Inställningen för imaging eller direkt observation av regenerering med ett upprätt Mikroskop. I varje 4 µL droplet hängande från täckglaset, finns en cell som genomgår regenerering. Vatten i brunnarna av spot glasplattan begränsar avdunstningen av droppar. Denna inställning tillåter efter regenerering av flera celler samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6. Ögonblicksbilder av Stentor i varje skede av membranellar bandet och oral apparatur regenerering. (A) steg 1 kännetecknas av en teardrop-liknande cell form och avsaknad av membranellar bandet. (B) etapp 2 kännetecknas av uppkomsten av membranellar bandet, en cilier-baserad struktur som slår kontinuerligt. Membranellar band är markerade med vita streckade linjer i paneler B - D. (C och D) etapp 3 kännetecknas av uppkomsten av muntliga primordium (markerad med en pil). Muntliga primordium ser ut som en invagination bakre slutet av bandet membranellar. Den muntliga primordium kommer sedan flytta upp mot den främre av cellen att bli oralt apparaten. (E) regenerering är klar när cellen har antagit karakteristiskt Stentor trumpet-liknande form, och den muntliga apparater (markerad med en pil) har ökat på den främre änden av cellen. Skalstapeln är 0,25 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 7. Staplade box plot visar hur andelen celler i alla stadier av regeneration efter sackaros behandling ändras över tiden. Handlingen visar heterogenitet i tidpunkten för regenerering stadier inom en befolkning av regenererande celler. ”Reg. end” indikerar slutförandet av regenerering. Antal celler: 28. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Video 1. Exempel på en hälsosam Stentor kultur. Generellt om en kultur är detta koncentrerade, rekommenderas dela kultur. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 2. Sakta ner Stentor med metylcellulosa. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Video 3. Styckning Stentor. Enskilda celler kan skäras manuellt i flera stycken under en stereo dissekera mikroskopet genom att trycka på en glas nål genom cellen. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Problem med kultur	Möjliga botemedel	Möjliga förebyggande
Kultur är överväldigad av rotifers eller andra stora organismer.	Ta bort så många Stentor som möjligt in i en ny kultur maträtt. Tvätta sedan cellerna tre gånger.	Tvätta Stentor noga när du tar emot dem, även när du köper dem från en kommersiell leverantör.
Kultur är överväldigad av svamp eller andra små organismer.	Identifiera ett hörn där det finns minst Stentor. I området, ta bort så mycket material som möjligt utan att ta bort många Stentor och Lägg i nya PSW. Blanda försiktigt men grundligt till distrubute de invaderande organismerna. Hoppa över nästa utfodring och den Stentor äter dem.	Observera kulturen regelbundet och ta bort små föroreningar genom att utbyta media för färska PSW.
Stentor lägger ovanpå varandra.	Dela upp kulturen så att koncentrationen är mindre än 20 celler/mL.	Dela kulturer oftare.
Stentor celler är parning.	Foder var 4 dagar i stället för varje 5 dagar.
Kultur har en hel del mörka avfall.	Avlägsna så mycket av det mörka materialet, Stentor avfall, som möjligt utan att ta bort celler. Om Stentor bifogas till mörka materialet, Pipettera upp och ner för att släppa Stentor cellerna från deras avfall och sedan ta bort media med avfallet utan att ta bort celler. Eller, ta bort dessa Stentor och foder med detta mindre.	Foder Stentor 1 mL mindre mat per 100 mL av kulturen.
Ohälsosamma proffsiga (vakuoliserade/uppsvälld eller rundade) Stentor.	Ta bort så mycket material som möjligt utan att ta bort många Stentor celler och lägga till nya PSW.	Utbyta media regelbundet.

Tabell 1. Felsökningsguide för odling Stentor.

Discussion

Odling Stentor presenterar ett antal utmaningar. Först, för att utföra experiment som kräver stort antal celler, man behöver underhålla ett stort antal Stentor kulturer, som kulturer bli ohälsosam när Stentor koncentration överstiger 20 celler/mL. Andra organismer som kan förorena Stentor kulturer ofta dela upp snabbare än Stentor och överväldiga den kulturen (en gemensam förorening är rotifers). Det är således nödvändigt att inspektera kulturen under ett Mikroskop regelbundet och ta bort föroreningarna. Ibland behöver en ny kultur startas från ett litet antal celler som räddade manuellt från en kontaminerad kultur. Detta ökar den tid som krävs för att upprätthålla friska Stentor kulturer. För det tredje, expanderar en enskild cell i en 400 mL-kultur kräver minst en månad eftersom Stentor cellcykeln är 3-5 dagar. För det fjärde, till skillnad från andra modell ciliater, Stentor sällan gå in cystorna och de kan inte frysas.

En viktig aspekt av odlingsskålar Stentor är valet av en lämplig mat organism. Olika metoder för att odla Stentor beskrevs tidigare. En av dem föreslår för att använda skumma mjölk till kultur bakterier som sedan mata Stentor. Sådan teknik är effektiv i odling Stentor; tillämpningen av genomiska tekniker kräver dock ren prover till undvika förvirring som följd av genomisk läsningar av odefinierad mat organismer. Använder det nuvarande protokollet, Stentor kan odlas i massa och eftersom deras mat, Chlamydomonas, har varit sekvenserade, förekomsten av genomisk kontaminering från mat organismen kan upptäckas och kontrolleras för. Av okänd anledning hade tandsten att fylla hans bestånden genom att återvända till där han fann Stentor innan. Med det nuvarande protokollet, har vi kunnat hålla Stentor i år.

Regenerering experiment med Stentor är vanligtvis enkelt, men det finns några viktiga detaljer att komma ihåg. När det gäller avsnitt 2, skära Stentor celler i hälften kan bemästras i minuter. Behärska mer avancerade microsurgery förfaranden av Stentor kan kräva en vecka av praxis. Medan utföra en sackaros eller urea behandling (avsnitt 3), om början av imaging de allra flesta fortfarande har sin membranellar band, öka inkubationstid av 10-30 s för när sackaros behandlingen utförs nästa. Öka inte tiden för sackaros behandling utöver 3 minuters inkubation eftersom det kommer leda till celldöd.

Avbildning av Stentor kräver regenerering metoder för att bilden stora celler över långa tidsperioder. Den bildgivande metod som beskrivs i avsnitt 4 kan endast användas med ett upprätt Mikroskop. Om ett inverterat Mikroskop finns istället, kan då celler placeras på en bild eller ett täckglas i små avdelningar. En metod är att skapa en kammare av vaselin och täck med en annan täckglas att förhindra avdunstning. Alternativt, en kammare för enskilda celler kan göras genom att göra ett hål med ett hålslag av önskad storlek i en 1 x 1 cm² kvadrat av kisel spacer (tabell för material), utsläppande distansringen på ett täckglas, sätta celler i kammaren , och som omfattar kammaren med en annan täckglas. När imaging, om Stentor inte är i rätt riktning att Observera de karakteristiska dragen i varje skede av förnyelse, knacka plattan ordentligt för att göra cell kontraktet. Titta på cellen utvidga för att identifiera etappen av regenerering (helutdrag tar ca 45 s). Om cellen är fortfarande i fel riktning, upprepa avlyssning. Bilderna som visas i figur 1 och figur 6 togs av en stereo zoom Mikroskop; Alla experiment detaljerad kan dock utföras med en 5 X dissekera stereo Mikroskop.

En annan utmaning Förutom odling och imaging Stentor är spårning av förnyelse, specifikt mängden tid som behövs för att identifiera stadier. Om cellen regenererande är helt orienterad med regionen i den muntliga primordium klart synliga, tar identifiering av scenen ett par sekunder. Ibland är dock Stentor cellen i en orientering som hindrar tydliga uppdrag av regenerationen arrangerar, således tar mer tid att identifiera. Den betydande mängden tid som krävs för att scenen enskilda regenererande celler kan fördröja kvantifiering av alla regenererande celler, vilket minskar tidsmässiga precision mellanstationer och kräva att observatören att vänta och re-bild cellen efter det har flyttat till en ny inriktning. Detta experiment är följaktligen både tids- och arbetskrävande. Av dessa skäl vore det önskvärt att utveckla automatiserade metoder för att upptäcka Stentor celler och tilldela stadier av regeneration i video mikroskopi data. Dessa skulle också möjliggöra fler reproducerbara experiment, ökar i urvalets storlek och avlägsnande av mänsklig partiskhet.

Uppkomsten av mycket känsliga genomisk och proteomiska metoder har börjat sätta studier av enstaka celler i reach. För sådan enskild cell analyser gör en Stentor cell jätte storlek det en önskvärd testperson för proof-of-concept experiment. För sådana experiment att vara möjligt att odla Stentor är grundläggande, och så de metoder som beskrivs här bör spela en roll i ytterligare utveckling av mer avancerade encelliga tekniker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stentor coeruleus live culture	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar	Carolina Biological Supply	152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle	Carolina Biological Supply	132458
Methyl cellulose, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Pyrex glass spot plate	Fisher Scientific	13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
2-cup glass container with glass lid	Pyrex	1095600
CultureWell silicone sheet material	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Cover Glass	Fisher finest	12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture	ThermoFisher	A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White	Spectrum	P1037
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Needle puller P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope	Zeiss