Summary
在这篇文章中, 我们展示了建立的克隆文化的单细胞共轭藻类物种收集从一个自然的现场。
Abstract
必须建立微藻的克隆文化, 用于研究各种主题, 如生理学、遗传学、分类学和微生物学。因此, 建立克隆文化的技术极为重要。本文展示了共轭藻无性系培养的建立。从田间采集水样。随后, 细胞被隔离使用玻璃毛细管吸管, 放置在媒体, 并生长在条件适合生成克隆文化。
Introduction
共轭藻类 (顺序 Zygnematales), 也被称为 conjugatophytes, 占据关键的系统发育地位, 作为最接近的生活亲属的直接祖先的土地植物1,2。在过去的几年里, 建立了藻类的克隆文化, 导致了各种各样的分类学、生理和遗传学研究。微生物的分离技术从一个自然领域有一个长的传统3,4。近年来, 采用流式细胞仪的自动隔离技术也建立了5。最常用的方法, 以获得一个单一的细胞建立克隆文化是单细胞隔离使用玻璃毛细管吸管6。这种传统的方法需要技巧和精确的实验协议。
在本文中, 我们展示了从田间样品中藻类的取样和建立单细胞共轭藻类的克隆文化, 如新月物种, 使用玻璃毛细管吸管。一个含有营养细胞的水样本是从一个田野遗址 (如湖泊、池塘或稻田) 收集的。细胞与水样分离, 使用玻璃毛细管吸管, 然后清洗。细胞是培养在一个试管中含有氮补充培养基 (CA 培养基) 在24摄氏度下, 在一个16小时 light:8-h 黑暗政权。该方法也适用于分离其他微藻生成无性系培养。
Protocol
1. 收集含有藻类的水样
注: 单细胞 conjugatophytes 生长在停滞的淡水地区, 如湖泊、沼泽和稻田。从这些环境之一中收集含藻类的水样, 以产生一种培养菌株。在开始该过程之前需要下列项目: 浮游生物网, 一次性吸管, 和一个瓶子或50毫升管收集水样。
- 在湖泊环境中使用浮游生物网从水中收集藻类。根据用途, 使用适当的网。
注意: 网的上部对水是透水的。被网捕获的藻类集中在浮游生物网的底部容器中。一个粗糙的网格允许小藻类通过。细网容易被堵塞。 - 将水 (约50毫升) 转移到50毫升管或100毫升塑料瓶。把浓缩的水样带到实验室。
- 单细胞 conjugatophytes 也生长在沼泽或稻田。在这些浅水区域, 含有藻类的水样可以直接用吸管取样。然后, 将水 (30-50 毫升) 转移到50毫升管或50毫升塑料瓶。
注: 水仔细取样在土壤表面之上, 以便样品不包含任何土壤。
2. 藻类的确认
注意: 以下项目是必需的: 放大镜或便携显微镜和60毫米的盘子观察。
- 为了确认样品中藻类存在于一次性吸管中, 请使用放大镜直接观察样品。
注意: 使用此方法可以很容易地观察到大约 400-1000 µm 的较大细胞 (例如,新月 ehrenbergii)。 - 在便携式显微镜下确认藻类, 将水样倒入塑料实验盘中。
- 将样品 (约3毫升) 放在60毫米培养皿的上半部分 (盖子) 的内侧, 然后将下半部分放在下部, 其底部朝向盖子的内部, 上面。
注: 此方法使样品不动, 使观察更容易。
- 将样品 (约3毫升) 放在60毫米培养皿的上半部分 (盖子) 的内侧, 然后将下半部分放在下部, 其底部朝向盖子的内部, 上面。
3. 从巴斯德吸管中制备玻璃毛细管吸管隔离
注意: 在开始该过程之前, 需要下列项目: 灭菌的巴斯德吸管, 一架为巴斯德吸管, 手套, 橡胶灯泡, 精神灯, 甲醇为精神灯, 打火机, 镊子, 垃圾桶为玻璃, 和一个干净的房间或层流流动罩 (如有必要)。
- 点燃酒精燃烧器。
- 要生产一个细玻璃毛细管隔离, 确保火焰没有闪烁。锐化火焰, 并在其尖端熔化巴斯德吸管。
- 用镊子在火焰上加热无菌玻璃巴斯德吸管, 用手和笔尖在橡胶灯泡一侧支承。
- 把巴斯德吸管脱下火焰, 伸展它。
- 当玻璃融化时, 迅速从火焰中取出巴斯德吸管, 然后拉。
注: 在本实验中, 巴斯德吸管的扩展为 15-20 厘米. 在拉拔过程中, 要确保吸管脱离火焰。
- 当玻璃融化时, 迅速从火焰中取出巴斯德吸管, 然后拉。
- 将玻璃毛细管吸管的尖端折断到适当的长度。因为鞠躬的部分是最好的, 它是理想的尖端。
注: 在本研究中, 制备了一个 5-10 厘米尖端的玻璃毛细管吸管。- 在熔化后一定要丢弃毛细管, 并确认火焰熄灭。
- 从玻璃毛细管吸管释放出来的气泡表明尖端开口的大小。选择要隔离的单元格的适当大小。大约1毫米气泡是适当的分离新月物种, 与细胞宽度 10-20 µm。
4. 用玻璃毛细管吸管分离单细胞
注: 在启动前需要下列物品: 倒置光镜、手表眼镜、塑料碟和含钙介质的无菌螺纹试管 (表 1) 或条件 ca 中等7。
- 准备一些手表眼镜 (直径22毫米和1毫米深度), 每只含有1毫升的无菌钙培养基。
- 将目标单元格与在该字段中收集的水样样本隔离。
- 将含有靶细胞的水样 (约 30-40 毫升) 倒入塑料盘中。
- 在用倒置的光镜观察塑料碟中的样品时, 用玻璃毛细管吸管提取单细胞。
- 在细胞附近带上玻璃毛细管吸管, 用毛细管作用来促进细胞的吸入。
- 将细胞转移到含有1毫升无菌 CA 培养基的手表玻璃上 (图 1a)。
- 再用新的玻璃毛细管从不育的钙介质中提取细胞并将其转移到含有无菌 ca 介质的第二个手表玻璃上 (图 1b)。
注意: 此过程是重复的, 直到单个单元格被隔离在专版中 (图 1c)。 - 使用新的玻璃毛细管吸管拾取单细胞, 最后将其转移到包含14毫升 ca 介质或条件 ca 介质的试管中 (图 1d)。在16小时 light:8-h 黑暗周期的2周内, 将样品孵化23摄氏度。
注: 细胞增殖的未知因素, 从生长细胞分泌到周围环境中, 包括在条件培养基中以促进细胞分裂4。如果建立克隆文化, 则从培养基4中制备条件 CA 培养基。如果成功, 文化将变成绿色。
Representative Results
在 2016年6月25日, 日本千叶樱花石 (Inba) 的一个取样点 (pH 8.1, 24.7 °c; 35°44′30.2″N 140°12′08.2″E) 采集了50毫升的水样 (Inba1)。水样品被存放在 4-8 °c。第二天收集后,新月的标本从含有营养细胞的水样中分离出来。十五相同形态的营养细胞 (Inba1-1,-2、-3、-4、5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、15、) 与样品分离, 然后使用吸管洗涤法进行清洗。在含有15毫升条件的钙培养基的独立试管中培养出十五株孤立单细胞。经过2周的孵化, 在9试管中观察到细胞增殖 [Inba1-1,-3,-4,-5 (图 2a),-6,-9,-10,-12 (图 2b), 和-13;表 2]。从 Inba1 样本分离株中建立了九种克隆培养物 (图 3)。
图 1: 单细胞分离的流动.(a) 将单一目标藻类细胞从原水样品转移到第一个观察玻璃中的无菌介质。(b、 c)再次将细胞转移到下一个手表玻璃上清洗。该程序应重复, 直到没有其他细胞/污染物比目标的媒介;三手表眼镜显示在图这里作为一个例子。(d) 最后, 将冲洗过的电池转移到适当培养基的试管中进行生长。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 植物细胞的照片新月sp.(a) Inba1-5 和 (b) Inba1-12 显示在这里。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 3: 从 Inba1 样品中建立克隆文化.从底部拍摄了2周培养的试管。星号表示细胞增殖。刻度条 = 2 厘米.请点击这里查看这个数字的大版本.
| 媒体名称 | 参考 | 评论 | |
| 约 | 市村和渡边12 | Ca (NO3)2· 4H2O | 2毫克 |
| 3 | 10毫克 | ||
| NH4NO3 | 5毫克 | ||
| β–Na2glycerophosphate·5H2O | 3毫克 | ||
| MgSO4· 7H2O | 2毫克 | ||
| 维生素 B12 | 0.01 微克 | ||
| 素 | 0.01 微克 | ||
| 盐酸硫胺 | 1微克 | ||
| PIV 金属 | 0.1 毫升 | ||
| Fe (EDTA; 1:1 摩尔) | 0.1 毫升 | ||
| HEPES | 40毫克 | ||
| 加水使100毫升 | |||
| pH 值与氢氧化钠调节为7。2 | |||
| P IV 金属 | Provasoli 和 Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100毫克 |
| FeCl3· 6H2O | 19.6 毫克 | ||
| MnCl2·4H2O | 3.6 毫克 | ||
| ZnCl2* | 1.04 毫克 | ||
| CoCl2· 6H2O | 0.4 毫克 | ||
| Na2MoO4· 2H2O | 0.25 毫克 | ||
| 加水使100毫升 | |||
| Fe (EDTA; 1:1 摩尔) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(如此4)2· 6H2O, | 70.2 毫克 |
| Na2EDTA·2H2O, | 66毫克 | ||
| 加水使100毫升 | |||
| 条件 CA 介质 | 亚伯等7 | 在新鲜的钙培养基中孵化细胞14–20天。用质滤纸过滤培养基, 通过热处理 (121 °c 15 分钟) 对过滤介质进行消毒。 | |
| * 在新兴工业化中, 1.04 毫克 ZnCl2被2.2 毫克 ZnSO4· 7H2O 取代。 | |||
表 1: 本研究使用的媒介配方。
| 水样 | 单元格名称 | 文化后的状态 | 应变名称 |
| Inba1 | -1 | 细胞增殖 | Inba1-1 |
| -2 | 未更改 | ||
| -3 | 细胞增殖 | inba1-3 | |
| -4 | 细胞增殖 | inba1-4 | |
| -5 | 细胞增殖 | inba1-5 | |
| -6 | 细胞增殖 | inba1-6 | |
| -7 | 未更改 | ||
| -8 | 未更改 | ||
| -9 | 细胞增殖 | inba1-9 | |
| -10 | 细胞增殖 | inba1-10 | |
| -11 | 未更改 | ||
| -12 | 细胞增殖 | inba1-12 | |
| -13 | 细胞增殖 | inba1-13 | |
| -14 | 未更改 | ||
| -15 | 未更改 |
表 2: 隔离试验摘要。
Discussion
采用现有的方法, 从水样中分离出的15个细胞 (Inba1) 中, 建立了9株新月无性系培养菌株, 成功率达60%。今后将通过形态学观察和 DNA 分析等方法对物种进行鉴定, 如分子系统发育分析8。
在本方法中, 水样的新鲜度对成功率有重要意义。在野外采集后, 最好尽快将细胞从水样中分离出来。虽然新月物种的细胞 (例如, ehrenbergii, peracerosum-strigosum 护胸复合物) 可以保存在水样品约 7 d, 通过储存在 4-8 摄氏度, 细胞的隔离是可取的在收集的当天或第二天。除去目标细胞以外的任何污染物也很重要, 因此增加洗涤重复次数 (即> 3x) 可以防止土壤和细胞中的微生物对培养物造成污染。
这种技术的一个局限性是, 本协议中使用的培养基 (ca 或条件 ca 培养基) 并不总是适合所有的共轭藻类。在某些情况下, 可能需要考虑使用另一种介质, 以及不同的光和温度条件。此外, 由于很难证明某种文化是否从一个细胞中生长出来, 所以在将细胞转移到试管时, 必须准确地提取出1个细胞。因此, 每次都要用新的玻璃毛细管吸管进行转移。
用这种吸管洗涤法建立克隆文化是一种经典/标准方法, 是用来分离所需细胞进行研究的最可靠的方法。采用本方法建立了多项研究8、9、10、11共轭藻类的无性系培养。没有克隆文化, 很难分析共轭藻类。此外, 近年来,从头开始的整个基因组序列变得容易获得 (例如, 通过使用奴才纳米排序器), 并建立克隆文化将进一步促进新的排序。换言之, 这种方法是今后研究这些藻类的第一步, 以更好地了解它们的生物多样性。
为了建立稳定的文化张力, 必须在协议中准确地执行某些关键步骤。最重要的步骤是制备一个具有最佳孔径的玻璃毛细管吸管, 仅允许单个细胞通过。玻璃毛细管吸管的孔径必须略大于所感兴趣细胞的小轴长度。最佳的玻璃毛细管吸管可以通过毛细管作用吸入单个细胞。然而, 如果孔径的直径太大, 毛细管也将绘制非生物污染材料, 甚至 (a) 其他有机体, 除了目标细胞。
要获得最佳孔径的玻璃毛细管吸管, 必须注意以下几点。首先, 在加热玻璃毛细管时, 火焰的柱必须是狭窄的。其次, 当拔出巴斯德吸管时, 必须从火焰中除去它;否则, 巴斯德吸管的光圈就会崩溃。
本协议中显示的设备和容器是基本的, 可以修改。例如, 通过使用多孔板而不是用一个井观察眼镜, 可以使细胞洗涤更有效率。此外, 集装箱可以替代其他类似的。在最后一步, 通过将单个细胞转移到培养基上, 可以建立克隆培养。
准备一个灭菌容器和工作在一个罩将建立无菌 (无污染) 菌株。为了防止污染, 有必要重复清洗步骤与新鲜整除数超过3x。有时, 细菌也通过添加抗生素15消毒。
该方法侧重于 desmid (Zygnematales) 隔离, 但通过改变玻璃毛细管孔径的大小, 可以将其应用于不同大小的浮游生物的分离。
Acknowledgments
我们感谢 Hisayoshi 野崎 (东京大学)、隆 Nakada (京庆大学)、原田 Marukawa 桥本 (日本女子大学) 和博行 Sekimoto (日本女子大学)。我们要感谢评价员的意见。这项研究得到了日本科学促进协会 (26440223 号和 15H04413) 资助的资助, 并得到了来自新科技发展基金会的赠款, Tsuchikane。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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