Summary
I denne artikel viser vi oprettelsen af klonede kulturer af encellede de tråddannende alge arter indsamlet fra en naturlig felt site.
Abstract
Det er afgørende at etablere klonede kulturer af mikroalger til brug i undersøgelser af forskellige emner, såsom fysiologi, genetik, taksonomi og Mikrobiologi. Det er således meget vigtigt at udvikle teknikker til at skabe klonede kulturer. I denne artikel viser vi oprettelsen af klonede kulturer af en conjugating alge. Vandprøver er indsamlet fra feltet. Efterfølgende er celler isoleret ved hjælp af et glas kapillær pipette, placeret i medierne, og dyrkes under betingelser, der er egnet til at generere en klonal kultur.
Introduction
De tråddannende alger (i rækkefølgen Zygnematales), har også kendt som conjugatophytes, en Fylogenetisk nøgleposition som den nærmeste levende slægtninge af de umiddelbare forfædre af jord planter1,2. Etablerede klonede kulturer af alger har ført til en bred vifte af taksonomiske, fysiologiske og genetiske undersøgelser i de seneste år. Isolation teknikker af mikroorganismer fra en naturlig felt har en lang tradition3,4. I de seneste år etableret automatiseret isolation teknikker, der anvender flowcytometri har også været5. Den mest almindelige metode til opnåelse af en enkelt celle til etablering af en klonal kultur er encellede isolation ved hjælp af et glas kapillær pipette6. Denne traditionelle metode kræver dygtighed og en præcis forsøgsplan.
I denne artikel vise vi prøveudtagning af alger fra feltprøver og etablering af klonede kulturer af encellede de tråddannende alger, som Closterium arterne, ved hjælp af et glas kapillær pipette. En vandprøve, der indeholder vegetative celler er indsamlet fra et felt (f.eks., en sø, Dam eller rismark). Cellerne er isoleret fra vandprøven, ved hjælp af et glas kapillær pipette og derefter vasket. Cellerne er kulturperler i et reagensglas, som indeholder kvælstof-suppleret medium (CA medium) på 24 ° C under en 16-h lys: 8-h mørke regime. Denne metode er også velegnet til isolering af andre mikroalger til at generere klonede kulturer.
Protocol
1. indsamling af en vandprøve, der indeholder alger
Bemærk: Encellede conjugatophytes vokse i stillestående ferskvand områder, såsom søer, moser og rismarker. En alger-holdige vand stikprøven indsamles fra en af disse miljøer til at producere en kultur stamme. Følgende elementer er nødvendige for før du starter processen: en netto plankton, en engangs pipette, og en flaske eller en 50 mL tube til indsamling vandprøver.
- Brug en plankton net i søen omgivelser for at indsamle alger fra vandet. Bruge et passende net, afhængigt af formålet.
Bemærk: Den øverste del af nettet er gennemtrængelig for vand. Algerne fanget af nettet er koncentreret i den nederste beholder af plankton net. En grove mesh giver små alger at passere igennem. En finmasket får tilstoppet nemt. - Overføre vand (ca. 50 mL) til en 50 mL tube eller en 100 mL plastflaske. Bringe den koncentrerede vandprøven til laboratoriet.
- Encellede conjugatophytes også vokse i marsken eller rismarkerne. I disse lavvandede områder, kan vandprøve indeholdende alger udtages direkte med en pipette. Derefter, overføre vand (30-50 mL) til 50 mL tube eller en 50 mL plastflaske.
Bemærk: Vandet er forsigtigt stikprøven over jordoverfladen, således at prøven ikke indeholder nogen jord.
2. bekræftelse af alger
Bemærk: Følgende er påkrævet: en lup eller bærbare mikroskop og en 60 mm parabol for observation.
- For at bekræfte tilstedeværelsen af alger i prøven, mens det er i den disponible pipette, skal du bruge en lup til at observere prøven direkte.
Bemærk: Større celler på omkring 400-1.000 µm i længde (f.eks. Closterium ehrenbergii) kan nemt blive observeret ved hjælp af denne metode. - For at bekræfte alger under den bærbare mikroskop, hæld vandprøve i en plastik laboratoriet parabol.
- Lagt prøve (ca. 3 mL) på den indre del af den øvre halvdel (låget) af 60 mm petriskål, derefter placere den nederste halvdel, med dens nederste del vender ud mod den indre del af låget på toppen.
Bemærk: Denne metode holder prøven ved flytning og gør observation lettere.
- Lagt prøve (ca. 3 mL) på den indre del af den øvre halvdel (låget) af 60 mm petriskål, derefter placere den nederste halvdel, med dens nederste del vender ud mod den indre del af låget på toppen.
3. forberedelse af et glas kapillær Pipette fra Pasteur Pipette til isolering
Bemærk: Før du starter processen, følgende er nødvendig: steriliseret Pasteur pipetter, en rack for Pasteur pipetter, handsker, en gummi pære, en ånd lampe, methanol til ånd lampe, en lighter, pincet, en skraldespand for glas, og et rent værelse eller laminar flow hood (hvis nødvendigt).
- Antænde en alkohol brænder.
- For at producere fine glas kapillær pipette til isolering, Kontroller, at flammen ikke flimmer. Skærpe flammen og smelte Pasteur pipette på sin spids.
- Varme et sterilt glas Pasteur pipette på flammen, understøttes på siden af gummi pære i hånden og i spidsen side ved hjælp af pincet.
- Tage Pasteur pipette slukke flammen og strække den.
- Når glasset smeltning, hurtigt fjerne Pasteur pipette fra flammen og derefter trække.
Bemærk: I dette eksperiment, Pasteur pipette blev udvidet af 15-20 cm. gør sikker på at afpipetteres er off flammen under den trække.
- Når glasset smeltning, hurtigt fjerne Pasteur pipette fra flammen og derefter trække.
- Bryde spidsen af glas kapillær pipette til den rette længde. Fordi det bukkende er den fineste, er det ideelt til spidsen.
Bemærk: I denne undersøgelse, et glas kapillær pipette med en spids på 5-10 cm blev udarbejdet.- Sørg for at kassere kapillar efter smelter det, og bekræfte, at flammen er slukkede.
- Boblerne frigivet fra glas kapillær pipette angiver størrelsen på spidsen åbning. Vælg den rigtige størrelse for cellen at være isoleret. Ca. 1 mm bobler er korrekt til isolation af Closterium arter, med cellebredder på 10-20 µm.
4. enkelt-celle Isolation med glas kapillær Pipette
Bemærk: Følgende elementer er nødvendig før du starter: en inverteret lysmikroskop, watch briller, en plastik skål og sterile gevind reagensglas indeholdende CA medium (tabel 1) eller aircondition CA medium7.
- Forbered et par ur briller (22 mm i diameter og 1 mm i dybden), hver indeholdende 1 mL sterilt CA medium.
- Isolere en målcelle fra vand stikprøven indsamles i feltet.
- Hæld vand stikprøven (omkring 30-40 mL) der indeholder target-cellerne i en plastik skål.
- Mens observere afhente prøven i plast fadet under en inverteret lysmikroskop enkelt celler ved hjælp af glas kapillær pipette.
- Bringe glas kapillær pipette nær cellen for at lette aspiration af cellen af kapillaritet.
- Overføre cellerne i et ur glas indeholdende 1 mL sterilt CA medium (figur 1a).
- Afhente de celler igen ved hjælp af en ny glas kapillær pipette fra det sterile CA medium og overføre det til en anden urglas, der indeholder sterilt CA medium (figur 1b).
Bemærk: Denne proces gentages indtil en enkelt celle er isoleret i stedet plade (figur 1 c). - Afhente den enkelt celle ved hjælp af en ny glas kapillær pipette, og endelig overføre det til et reagensglas, som indeholder 14 mL CA medium eller konditioneret CA medium (fig. 1 d). Inkuber stikprøve på 23 ° C under en 16-h lys: 8-h mørke cyklus for 2 uger.
Bemærk: De ukendte faktorer for celledelingen, som udskilles fra voksende celler i det omgivende miljø, er inkluderet i konditioneret mellemlang og lette celledeling4. Hvis en klonal kultur er etableret, forberede de aircondition CA medium fra næringssubstratet4. Kultur bliver grøn, hvis succes.
Representative Results
En vandprøve (Inba1) i 50 mL blev indsamlet fra et indsamlingspunkt i søen Kaj-numa (pH 8.1, 24.7 ° C, 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) på Sakura-shi, Chiba, Japan, på 25 juni 2016. Vand stikprøven blev gemt på 4-8 ° C. Den næste dag efter samlingen, et eksemplar af Closterium sp. blev isoleret fra vand stikprøven vegetative celler. Femten vegetative celler af identiske morfologi (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, og -15) blev isoleret fra prøven og derefter vaskes ved hjælp af pipetten vask metode. Femten isolerede enkelte celler blev kulturperler i uafhængige reagensglas indeholder 15 mL af konditioneret CA medium. Efter 2 uger til inkubation, celleproliferation blev observeret i 9 reagensglas [Inba1-1, -3, -4, -5 (figur 2a), -6, -9, -10, -12 (figur 2b) og -13; Tabel 2]. Ni klonede kulturer blev etableret fra Inba1 prøve isolater (figur 3).
Figur 1 : Strømmen af encellede isolation. (en) overførsel enkelt alge målcellen fra den oprindelige vandprøven til den sterile medium i den første urglas. (b, c) Overføre cellen igen til den næste urglas at vaske. Denne procedure bør gentages, indtil der er ingen andre celler/forureninger end målet på mellemlang; tre watch briller er vist i diagram her som eksempel. (d) Endelig, overføre den vaskede celle til et reagensglas af det rette mellemsigtede til vækst. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Fotografier af vegetative celler af Closterium Sp. (en) Inba1-5) og (b) Inba1-12 er vist her. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Oprettelse af en klonal kultur fra prøven, Inba1. Reagensglassene kulturperler i 2 uger blev fotograferet fra bunden. En asterisk angiver celledelingen. Skalalinjen = 2 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navnet på medierne | Reference | Kommentarer | |
| CA | Ichimura og Watanabe12 | Ca (3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH43 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamin B12 | 0,01 μg | ||
| Biotin | 0,01 μg | ||
| Thiamin HCl | 1 μg | ||
| PIV metaller | 0,1 mL | ||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Tilsæt vand for at gøre 100 mL | |||
| pH justeres med NaOH til 7.2 | |||
| P IV metaller | Provasoli og Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| Frihedsbevægelse2· 4H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Tilsæt vand for at gøre 100 mL | |||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(så4)2·6H2O, | 70.2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Tilsæt vand for at gøre 100 mL | |||
| Aircondition CA medium | Abe et al.7 | Inkuber celler i frisk CA medium for 14-20 dage. Indsamle den kulturperler medium ved filtrering ved hjælp af groft filtrerpapir og sterilisere den filtrerede medium ved autoklavering (121 ° C i 15 min). | |
| * I fantastiske erstattes 1,04 mg ZnCl2 af 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabel 1: Formuleringer af de medier, der anvendes i denne undersøgelse.
| Vandprøven | Navnet på celle | Status efter kultur | Stamme-navn |
| Inba1 | -1 | Celler tilvækst | Inba1-1 |
| -2 | Ikke ændret | ||
| -3 | Celler tilvækst | inba1-3 | |
| -4 | Celler tilvækst | inba1-4 | |
| -5 | Celler tilvækst | inba1-5 | |
| -6 | Celler tilvækst | inba1-6 | |
| -7 | Ikke ændret | ||
| -8 | Ikke ændret | ||
| -9 | Celler tilvækst | inba1-9 | |
| -10 | Celler tilvækst | inba1-10 | |
| -11 | Ikke ændret | ||
| -12 | Celler tilvækst | inba1-12 | |
| -13 | Celler tilvækst | inba1-13 | |
| -14 | Ikke ændret | ||
| -15 | Ikke ændret |
Tabel 2: De isolation trial Resumé.
Discussion
Med den nuværende metode, blev 9 klonede kultur stammer af Closterium sp. etableret fra 15 celler isoleret fra vandprøve (Inba1), der repræsenterer en 60% succesrate. Identifikation af arter vil blive gennemført i fremtiden af morfologiske observation samt DNA analyser, som Molekylær Fylogenetisk analyse8.
I den aktuelle metode er friskhed i eksemplet vand vigtigt at succesraten. Det er bedre at isolere celler fra vandprøver hurtigst muligt efter feltsamlingen. Selv om cellerne i Closterium arterne (f.eks., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale komplekse) kan opretholdes i vandprøve for omkring 7 d ved at gemme det på 4-8 ° C, er isolering af cellerne ønskeligt dag i samlingen eller næste dag. Det er også vigtigt at fjerne alle forurenende stoffer end target-cellerne, så stiger antallet af vask gentagelser (dvs., > 3 x) kan forhindre en forurening af kulturer af mikroorganismer i jorden og celler.
En begrænsning af denne teknik er, at den medier anvendt i denne protokol (CA eller konditioneret CA medium) ikke er altid hensigtsmæssigt for alle conjugating alger. I nogle tilfælde kan det være nødvendigt at overveje at bruge et andet medium, samt forskellige lys og temperaturforhold. Også, som det er vanskeligt at bevise, om en kultur er vokset fra en enkelt celle, det er nødvendigt at præcist at afhente kun 1 celle, når du overfører celler til et reagensglas. Derfor, det indskydende bør gøres med en ny glas kapillær pipette hver gang.
Oprettelse af en klonal kultur med denne pipette vask metode er en klassisk/standard metode og er den mest pålidelige metode til at bruge til at isolere de ønskede celler for en undersøgelse. Klonede kulturer de tråddannende alger bruges i mange studier8,9,10,11 blev etableret ved hjælp af den nuværende metode. Det er vanskeligt at analysere de tråddannende alger uden en klonal kultur. Desuden, i de seneste år, de novo samlede genom sekvenser blev let at få (f.eks.ved hjælp af MinION nanopore sequencer), og om oprettelse af klonede kulturer vil yderligere lette de novo sekventering. Med andre ord, er denne metode det første skridt i fremtiden studium af disse alger til bedre at forstå deres biodiversitet.
For at etablere en stabil kultur stamme, er det nødvendigt at foretage visse kritiske trin præcist i protokollen. Det vigtigste skridt er udarbejdelse af et glas kapillær pipette med en optimal blænde til at tillade passage af en enkelt celle kun. Blænde af glas kapillær pipette skal være lidt mere end mindre akse længden af cellen af interesse. Optimal glas kapillær pipette kan Aspirér en enkelt celle ved kapillaritet. Men hvis diameteren af blænden er for stor, kapillar vil også trække i ikke-levende forurenende materialer eller endda (en) andre eller mikroorganismerne, ud over målcellen.
For at få et glas kapillær pipette med en optimal blænde, er følgende punkter vigtige at bemærke. Første skal søjle af ild være smalle når varme glas kapillær pipette. Næste, når du trækker Pasteur pipette, det har at blive fjernet fra flammen; ellers, blænde af Pasteur pipette vil kollapse.
Udstyr og beholdere, der er vist i denne protokol er grundlæggende og kan ændres. For eksempel ved hjælp af multi godt plader i stedet for watch briller med et brønd, kan celle vask gøres mere effektiv. Derudover kan andre lignende dem erstattes containerne. Ved at overføre en enkelt celle til næringssubstratet på det sidste trin, kan en klonal kultur etableres.
Forberede en steriliseret container og arbejder i en hætte vil etablere axenic (urørt) stammer. For at forhindre forurening, er det nødvendigt at gentage trinnet vask med friske delprøver mere end 3 x. Sommetider er bakterier også steriliseres ved at tilføje antibiotika15.
Denne metode fokuseret på desmid (Zygnematales) isolation, men ved at ændre størrelsen af glas kapillær pipette blænde, kan det anvendes til isolering af forskellige størrelser plankton.
Acknowledgments
Vi takker Hisayoshi Nozaki (University of Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Womens Universitet) og Hiroyuki Sekimoto (Japan Womens Universitet). Vi vil gerne takke korrekturlæsere for deres kommentarer. Denne undersøgelse blev støttet af en licensbetaling for videnskabelig forskning (No. 26440223 og 15H 04413) fra Japan-samfund til fremme af videnskab, Japan, og af et tilskud fra den nye teknologi Development Foundation til Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
