Summary
In dit artikel tonen we de oprichting van klonen culturen soorten eencellige conjugating algen verzameld uit een natuurlijke veld site.
Abstract
Het is essentieel om klonen culturen van microalgen voor gebruik in studies van verschillende onderwerpen, zoals fysiologie, de genetica, taxonomie en microbiologie. Het is dus uiterst belangrijk om technieken om klonen culturen te ontwikkelen. In dit artikel tonen we de oprichting van klonen culturen van een conjugating alga. Watermonsters worden bijeengezocht uit het veld. Vervolgens zijn cellen geïsoleerd met behulp van een glazen capillaire Pipet, geplaatst in de media, en onder voorwaarden geschikt voor het genereren van een klonale cultuur geteeld.
Introduction
Conjugating algen (van de orde Zygnematales), bezetten ook bekend als conjugatophytes, een fylogenetische sleutelpositie als de nauwste levende verwanten van de directe voorouders van land planten1,2. Gevestigde klonale culturen van algen hebben geleid tot een grote verscheidenheid van taxonomische, fysiologische en genetische studies in het afgelopen jaar. De isolatie technieken van micro-organismen uit een natuurlijke veld hebben een lange traditie3,4. In de afgelopen jaren vastgesteld geautomatiseerde isolatie technieken met behulp van stroom cytometry ook geweest5. De meest voorkomende methode gebruikt voor het verkrijgen van een enkele cel voor de oprichting van een klonale cultuur is één cel isolatie via een glazen capillaire Pipetteer6. Deze traditionele methode vereist vaardigheid en een exacte experimenteel protocol.
In dit artikel tonen we de bemonstering van algen van veldmonsters en de oprichting van klonen culturen van eencellige conjugating algen, zoals de Closterium -soorten, met behulp van een glazen capillaire pipet. Een watermonster met vegetatieve cellen wordt verzameld uit een veld-site (bijvoorbeeld, meer, vijver of Sawa). De cellen zijn geïsoleerd uit het watermonster met behulp van een glazen capillaire pipet en vervolgens gewassen. De cellen worden gekweekt in een reageerbuis met stikstof-aangevuld medium (CA medium) bij 24 ° C onder een licht: 8 van de 16-h-h donkere regime. Deze methode is ook geschikt voor het isoleren van andere microalgen voor het genereren van klonen culturen.
Protocol
1. verzameling van een watermonster met algen
Opmerking: Eencellige conjugatophytes groeien in stilstaand zoet water gebieden, zoals moerassen, meren en rijstvelden. Een watermonster algen-bevattende wordt verzameld uit een van deze omgevingen tot een cultuur-stam. De volgende items nodig zijn voordat het proces: een netto plankton, een wegwerp Pipet, en een fles of een tube van 50 mL voor het verzamelen van watermonsters.
- Gebruik een net in een omgeving met meer plankton voor het verzamelen van algen uit het water. Gebruik maken van een juiste netto, afhankelijk van het doel.
Opmerking: Het bovenste deel van het net is permeabel voor water. De algen die gevangen door het net zijn geconcentreerd in de container van de onderkant van de netto plankton. Een grof gaas kunt kleine algen te passeren. Een fijn gaas krijgt gemakkelijk verstopt. - Het water (ongeveer 50 mL) overbrengen op de tube van 50 mL of een plastic fles van 100 mL. De geconcentreerde watermonster naar het laboratorium brengen.
- Eencellige conjugatophytes groeien ook in moerassen of rijstvelden. Op deze gebieden ondiep water kan watermonster met algen rechtstreeks worden bemonsterd met een druppelaar. Vervolgens overbrengen in het water (30-50 mL) de tube van 50 mL of een 50 mL plastic fles.
Opmerking: Het water is zorgvuldig bemonsterd boven het bodemoppervlak zodat het monster geen bodem bevat.
2. bevestiging van algen
Opmerking: De volgende items zijn vereist: een loep of Verplaatsbaar Microscoop en een 60 mm schotel voor observatie.
- Controleer de aanwezigheid van algen in de steekproef terwijl het in de Wegwerp pipet, gebruiken de loupe te nemen van het monster rechtstreeks
Opmerking: Grotere cellen van ongeveer 400-1000 µm lang (b.v. Closterium ehrenbergii) kan gemakkelijk worden waargenomen met behulp van deze methode. - Giet het watermonster in een schotel van plastic laboratorium om te bevestigen algen onder de draagbare Microscoop.
- Het monster (ongeveer 3 mL) zetten het binnenste deel van de bovenste helft (deksel) van de 60 mm petrischaal, plaats dan de onderste helft, met de onderste gedeelte tegenover het binnenste deel van het deksel, op de top.
Opmerking: Deze methode houdt het monster verplaatsen en de observatie vergemakkelijkt.
- Het monster (ongeveer 3 mL) zetten het binnenste deel van de bovenste helft (deksel) van de 60 mm petrischaal, plaats dan de onderste helft, met de onderste gedeelte tegenover het binnenste deel van het deksel, op de top.
3. bereiding van een glazen capillaire Pipet van Pasteur Pipetteer voor de isolatie
Opmerking: Voordat u begint het proces, zijn de volgende items nodig: gesteriliseerd Pasteur pipetten, een rek voor de Pasteur pipetten, handschoenen, een rubber lamp, een geest-lamp, methanol voor de geest-lamp, een aansteker, pincet, een prullenbak voor glas, en een schone kamer of laminaire flow hood (indien nodig).
- Ontsteken van de brander van een alcohol.
- Voor de productie van een mooie glazen capillaire pipet voor de isolatie, door ervoor te zorgen dat de vlam is niet flikkeren. Verscherpen van de vlam en smelten van de Pipet van Pasteur op de tip.
- Verwarm een steriele glazen pipet van Pasteur op de vlam, ondersteund aan de zijkant van de rubber lamp met de hand en aan de kant van het uiteinde met behulp van de verlostang.
- De Pipet van Pasteur van het vuur nemen en uitrekken.
- Wanneer het glas smelt, snel het verwijderen van de Pipet van Pasteur van de vlam en trek.
Opmerking: In dit experiment, de Pipet van Pasteur werd uitgebreid door 15-20 cm. Maak zeker dat de pipet buiten de vlam tijdens het trekken.
- Wanneer het glas smelt, snel het verwijderen van de Pipet van Pasteur van de vlam en trek.
- Het puntje van de glazen capillaire pipet met de juiste lengte verbreken. Omdat het deel buigen de beste is, is het ideaal voor naar de wenk.
Opmerking: In deze studie, een glazen capillaire pipet met een tip van 5-10 cm opgesteld.- Zorg ervoor dat het capillair negeren na het smelten, en bevestigen dat de vlam is stak.
- De bubbels vrijgelaten uit de glazen capillaire pipet geven de grootte van de tip openen. Selecteer de juiste grootte voor de cel worden geïsoleerd. Ongeveer 1 mm van bubbels is goed voor de isolatie van de Closterium soorten, met celbreedten van 10-20 µm.
4. eencellige isolatie door een glazen capillaire pipet
Opmerking: De volgende items nodig zijn voordat u begint: een omgekeerde licht microscope, horloge glazen, een kunststof schotel en steriele schroefdraad reageerbuisjes bevatten CA medium (tabel 1) of geconditioneerd CA middellange7.
- Bereid een paar horloge glazen (22 mm in diameter en 1 mm in diepte), elk met 1 mL steriele CA voedingsbodem.
- Isoleren van een doelcel uit het watermonster verzameld in het veld.
- Giet het watermonster (ongeveer 30-40 mL) met de doelcellen in de kunststof schotel.
- Met inachtneming van het monster in de kunststof schotel onder een omgekeerde lichte Microscoop, pick-up enkele cellen met behulp van de glazen capillaire pipet.
- Breng de glazen capillaire pipet in de buurt van de cel om het streven van de cel door capillaire werking.
- Breng de cellen in een horlogeglas met 1 mL steriele CA voedingsbodem (Figuur 1a).
- Pak de cellen weer met behulp van een nieuwe glazen capillaire Pipet uit het steriele CA medium en overbrengen naar een tweede horlogeglas met steriele CA medium (Figuur 1b).
Opmerking: Dit proces wordt herhaald totdat een eencellige is geïsoleerd in de plek plaat (Figuur 1 c). - Een enkele cel met behulp van een nieuwe glazen capillaire pipet halen, en ten slotte het overbrengen in een reageerbuis met 14 mL CA medium of geconditioneerde CA medium (Figuur 1 d). Incubeer het monster bij 23 ° C onder een licht: 8 van de 16-h-h donker cyclus voor 2 weken.
Opmerking: De onbekende factor(en) voor celproliferatie, die worden uitgescheiden door de groeiende cellen in de omgeving, zijn opgenomen in de geconditioneerde middellange tot celdeling4vergemakkelijken. Als een klonale cultuur is ontstaan, voor te bereiden het geconditioneerde CA medium van het kweekmedium4. De cultuur zal groen worden als succesvol.
Representative Results
Een watermonster (Inba1) van 50 mL werd bijeengezocht uit één monsterpunt in Lake Inba-numa (pH 8.1, 24.7 ° C en 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) op Sakura-shi, Chiba, Japan, op 25 juni 2016. Het watermonster zich bevond bij 4-8 ° C. De volgende dag na de collectie, een exemplaar van Closterium sp. werd geïsoleerd uit het watermonster met vegetatieve cellen. Vijftien vegetatieve cellen van identieke morfologie (Inba1-1, -2 -3 -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12,-13,-14, en -15) werden geïsoleerd uit de steekproef en vervolgens gewassen met behulp van de pipet wassen methode. Vijftien geïsoleerde afzonderlijke cellen werden gekweekt in onafhankelijke reageerbuisjes met 15 mL van geconditioneerde CA medium. Na 2 weken van incubatie, celproliferatie werd waargenomen in proefbuizen 9 [Inba1-1-3, -4 -5 (Figuur 2a), -6, -9, -10, -12 (Figuur 2b) en-13; Tabel 2]. Negen klonale culturen ontstonden uit de Inba1 monster isolaten (Figuur 3).
Figuur 1 : De stroom van eencellige isolatie. (een) overdracht de enkele algen doelcel van de oorspronkelijke watermonster naar de steriele medium in de eerste horlogeglas. (b, c) Overbrengen in de cel weer de volgende horlogeglas te wassen. Deze procedure moet worden herhaald zolang er niet geen andere cellen/verontreinigingen dan de doelstelling op de middellange zijn; drie horloge glazen staan in het diagram hier als voorbeeld. (d) de gewassen cel ten slotte overbrengen in een reageerbuis van het juiste medium voor groei. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Foto's van vegetatieve cellen van Closterium sp. (een) Inba1-5 en (b) Inba1-12 worden hier getoond. De schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Oprichting van een klonale cultuur uit het monster Inba1. De reageerbuisjes gekweekt voor 2 weken werden gefotografeerd vanaf de onderkant. Een asterisk geeft aan celproliferatie. De schaal balk = 2 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam van de media | Referentie | Opmerkingen | |
| CA | Bauer en Watanabe12 | CA (3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH43 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamine B12 | 0,01 μg | ||
| Biotine | 0,01 μg | ||
| Thiamine HCl | 1 μg | ||
| PIV metalen | 0,1 mL | ||
| Fe (als EDTA; 1:1 molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Voeg water tot 100 mL | |||
| pH aanpassen met NaOH aan 7.2 | |||
| P IV metalen | Provasoli en Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19.6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3.6 mg | ||
| ZnCl2* | 1.04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0.4 mg | ||
| NB2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Voeg water tot 100 mL | |||
| Fe (als EDTA; 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(zo4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Voeg water tot 100 mL | |||
| Geconditioneerde CA medium | Abe et al.7 | Incubeer cellen in verse CA medium voor 14-20 dagen. Het gekweekte medium door filtratie met behulp van kwalitatief filtreerpapier verzamelen en het gefilterde medium steriliseren in autoclaaf (121 ° C gedurende 15 minuten). | |
| * In de NIES, wordt 1.04 mg ZnCl2 vervangen door 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabel 1: Formuleringen van de media die worden gebruikt in deze studie.
| Watermonster | Naam van de cel | Status na cultuur | De naam van de stam |
| Inba1 | -1 | Cellen zich verspreid | Inba1-1 |
| -2 | Niet gewijzigd | ||
| -3 | Cellen zich verspreid | inba1-3 | |
| -4 | Cellen zich verspreid | inba1-4 | |
| -5 | Cellen zich verspreid | inba1-5 | |
| -6 | Cellen zich verspreid | inba1-6 | |
| -7 | Niet gewijzigd | ||
| -8 | Niet gewijzigd | ||
| -9 | Cellen zich verspreid | inba1-9 | |
| -10 | Cellen zich verspreid | inba1-10 | |
| -11 | Niet gewijzigd | ||
| -12 | Cellen zich verspreid | inba1-12 | |
| -13 | Cellen zich verspreid | inba1-13 | |
| -14 | Niet gewijzigd | ||
| -15 | Niet gewijzigd |
Tabel 2: De isolatie proef samenvatting.
Discussion
Met de huidige methode werden 9 klonale cultuur stammen van Closterium sp. uit 15 cellen geïsoleerd uit het watermonster (Inba1), die vertegenwoordigt een 60% slagingspercentage opgericht. In de toekomst zal door morfologische observatie evenals DNA-analyses, zoals moleculaire fylogenetische analyse8soorten identificatie worden uitgevoerd.
In de huidige methode is de versheid van het watermonster belangrijk om het slagingspercentage. Het is beter om te isoleren van de cellen van de watermonsters zo spoedig mogelijk na de veld-collectie. Hoewel cellen van de Closterium -soorten (bijvoorbeeld C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale complexe) kunnen worden gehandhaafd in het watermonster voor ongeveer 7 d door het op te slaan op 4-8 ° C, is het isolement van de cellen wenselijk op de dag van de collectie of de volgende dag. Het is ook belangrijk voor het verwijderen van eventuele verontreinigingen dan de doelcellen, dus verhoging van het aantal herhalingen van wassen (d.w.z., > 3 x) kan een besmetting van de culturen van micro-organismen in de bodem en de cellen.
Een beperking van deze techniek is dat de cultuur-media gebruikt in dit protocol (CA of geconditioneerde CA drager) zijn niet altijd geschikt voor alle conjugating algen. In sommige gevallen kan het nodig te overwegen met behulp van een ander medium, evenals verschillende licht en temperatuur zijn. Ook, aangezien het moeilijk is om te bewijzen of een cultuur is gegroeid uit een enkele cel, is het noodzakelijk te nauwkeurig halen slechts 1 cel bij het overbrengen van cellen naar een reageerbuis. Dus, de overdracht moet worden gedaan met een nieuwe glazen capillaire pipet telkens.
Tot oprichting van een klonale cultuur met deze pipet wassen methode is een klassieke/standaard-methode en is de meest betrouwbare methode te gebruiken om te isoleren van de gewenste cellen voor een studie. De klonen culturen van algen gebruikt in vele studies8,9,10,11 conjugating werden opgericht met de huidige methode. Het is moeilijk om te analyseren conjugating algen zonder een klonale cultuur. Bovendien, in de afgelopen jaren DOVO hele genoom sequenties werd gemakkelijk te verkrijgen (bijvoorbeeldmet behulp van de MinION nanopore sequencer), en tot vaststelling van klonen culturen zal verder te vergemakkelijken DOVO sequencing. Met andere woorden, is deze methode de eerste stap in de toekomst studie van deze algen hun biodiversiteit beter te begrijpen.
Teneinde een cultuur van stabiele spanning, is het noodzakelijk bepaalde kritische stappen nauwkeurig in het protocol uit te voeren. De belangrijkste stap is de voorbereiding van een glazen capillaire pipet met een optimaal diafragma om de passage van een enkele cel alleen mogelijk te maken. De opening van de glazen capillaire pipet moet iets meer dan de lengte van de kleine as van de cel van belang. De optimale glazen capillaire pipet kan één cel gecombineerd door capillaire werking. Echter, als de diameter van het diafragma te groot is, het capillair zal ook trekken in niet-levende verontreinigingen materialen of zelfs (een) andere organisme, naast de doelcel.
Voor het verkrijgen van een glazen capillaire pipet met een optimaal diafragma, zijn de volgende punten belangrijk op te merken. Ten eerste moet de pijler van de vlam de smalle wanneer de glazen capillaire pipet Verwarming. Vervolgens bij het trekken van de Pipet van Pasteur, moet worden verwijderd uit de vlam; anders, de opening van de Pipet van Pasteur zal instorten.
De apparatuur en de containers weergegeven in dit protocol vormen de basis en kunnen worden gewijzigd. Bijvoorbeeld met behulp van multi goed platen in plaats van horloge glazen met een waterput, kan het wassen van de cel efficiënter worden gemaakt. Daarnaast kunnen de containers voor andere soortgelijke projecten worden vervangen. Door de overdracht van een enkele cel aan het kweekmedium bij de laatste stap, kan een klonale cultuur worden vastgesteld.
Voorbereiding van een gesteriliseerde container en werken in een zuurkast zal het oprichten van een (niet-verontreinigde) stammen. Voorkom besmetting en is het noodzakelijk de wassen om stap te herhalen met vers aliquots meer dan 3 x. Bacteriën zijn soms ook gesteriliseerd door antibiotica15toe te voegen.
Deze methode gericht op desmid (Zygnematales) isolatie, maar door het veranderen van de grootte van de glazen capillaire Pipetteer diafragma, het kan worden toegepast op de isolatie van verschillend formaat plankton.
Acknowledgments
Wij danken Hisayoshi Nozaki (Universiteit van Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Women's University) en Hiroyuki Sekimoto (Japan Women's University). Wij willen bedanken de revisoren voor hun opmerkingen. Deze studie werd ondersteund door een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek (nr. 26440223 en 15H 04413) van de vereniging van Japan voor de bevordering van wetenschap, Japan, en door een subsidie van de nieuwe technologie Development Foundation voor Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
