Summary
Dans cet article, nous démontrons la mise en place de cultures clonales des unicellulaires conjugaison espèces d’algues prélevés dans un site naturel.
Abstract
Il est essentiel d’établir des cultures clonales des microalgues pour utilisation dans l’étude de divers sujets, comme la physiologie, la génétique, la taxonomie et microbiologie. Ainsi, il est extrêmement important de développer des techniques pour mettre en place des cultures clonales. Dans cet article, nous démontrons la mise en place de cultures clonales d’une algue de conjugaison. Échantillons d’eau sont prélevés sur le terrain. Par la suite, les cellules sont isolées à l’aide d’une pipette capillaire de verre, placé dans les médias et cultivé dans des conditions appropriées pour générer une culture clonale.
Introduction
Conjugaison des algues (de l’ordre de Zygnematales), également connu sous le nom de conjugatophytes, occupent une position phylogénétique clée comme les plus proches parents vivants des ancêtres immédiats de terre plantes1,2. Établi des cultures clonales d’algues ont conduit à une grande variété d’études taxonomiques, physiologiques et génétiques au cours des années passées. Les techniques d’isolement des micro-organismes d’un champ naturel ont une longue tradition3,4. Ces dernières années, isolement automatisé des techniques utilisant l’écoulement cytometry ont également été mis en place5. La méthode la plus courante utilisée pour obtenir une cellule unique pour la mise en place d’une culture clonale est unicellulaire isolement à l’aide d’une pipette capillaire de verre6. Cette méthode traditionnelle exige des compétences et un protocole expérimental précis.
Dans cet article, nous démontrons l’échantillonnage des algues d’échantillons sur le terrain et la mise en place de cultures clonales de conjugaison des algues unicellulaires, comme les espèces Closterium , à l’aide d’une pipette capillaire de verre. Un site de champ (par exemple, un lac, étang ou rizière) prélevé un échantillon d’eau contenant des cellules végétatives. Les cellules sont isolées de l’échantillon d’eau à l’aide d’une pipette capillaire de verre et ensuite lavés. Les cellules sont cultivées dans un tube à essai contenant le support additionnés d’azote (CA médium) à 24 ° C, sous une lumière de 16 h : 8-h régime sombre. Cette méthode convient également pour isoler les autres microalgues pour générer des cultures clonales.
Protocol
1. la collecte d’un échantillon d’eau contenant des algues
Remarque : Conjugatophytes unicellulaires poussent dans les zones d’eau douce stagnantes, tels que des lacs, des marais et des rizières. Un échantillon d’eau contenant des algues est récolté dans un de ces environnements pour produire une variété de culture. Les éléments suivants sont nécessaires avant de commencer le processus : un filet à plancton, une pipette à usage unique et une bouteille ou un tube de 50 mL pour la collecte des échantillons d’eau.
- Utilisez un filet dans un environnement de lac à plancton pour collecter les algues de l’eau. Utilisez un filet approprié, selon le but.
Remarque : La partie supérieure du filet est perméable à l’eau. Les algues capturés par le net sont concentrés dans le récipient bas du filet à plancton. Un maillage grossier permet de petites algues à traverser. Une maille fine du colmatage facilement. - Transfert de l’eau (50 mL environ) le tube de 50 mL ou une bouteille en plastique de 100 mL. Amener l’échantillon d’eau concentrée au laboratoire.
- Conjugatophytes unicellulaires poussent également dans les marais ou les rizières. Dans ces zones peu profondes, l’échantillon d’eau contenant des algues peut être dégustée directement avec un compte-gouttes. Ensuite, transférer l’eau (30 à 50 mL) le tube de 50 mL ou une bouteille en plastique de 50 mL.
Remarque : L’eau est échantillonné avec précaution au-dessus de la surface du sol afin que l’échantillon ne contient pas de n’importe quel sol.
2. confirmation d’algues
Remarque : Les éléments suivants sont requis : une loupe ou microscope portable et un 60 mm plat pour l’observation.
- Pour confirmer la présence d’algues dans l’échantillon, bien qu’il soit dans la pipette à usage unique, utilisez la loupe pour observer l’échantillon directement.
Remarque : Les cellules plus grandes d’environ 400-1 000 µm de longueur (par exemple, Closterium ehrenbergii) peut facilement être observées à l’aide de cette méthode. - Pour confirmer les algues sous le microscope portable, verser dans un plat en plastique de laboratoire, l’échantillon d’eau.
- Mettre l’échantillon (environ 3 mL) sur la partie intérieure de la moitié supérieure (couvercle) de la boîte de Pétri de 60 mm, puis placer la partie inférieure, avec sa partie inférieure, face à la partie intérieure de la paupière, sur le dessus.
Remarque : Cette méthode empêche l’échantillon de mouvement et facilite l’observation.
- Mettre l’échantillon (environ 3 mL) sur la partie intérieure de la moitié supérieure (couvercle) de la boîte de Pétri de 60 mm, puis placer la partie inférieure, avec sa partie inférieure, face à la partie intérieure de la paupière, sur le dessus.
3. Elaboration d’une Pipette capillaire d’une Pipette Pasteur en verre pour l’Isolation
Remarque : Avant de commencer le processus, les éléments suivants sont requis : stérilisé pipettes Pasteur, un rack pour les pipettes Pasteur, gants, une poire en caoutchouc, une lampe de l’esprit, méthanol pour le feu de l’esprit, un briquet, forceps, une poubelle pour le verre et une salle blanche ou laminaire hotte à flux (si nécessaire).
- Allumer une lampe à alcool.
- Pour produire une pipette capillaire de verre pour l’isolation, veillez à ce que la flamme ne clignote pas. Aiguiser la flamme et faire fondre la pipette Pasteur à son extrémité.
- Chauffer un stérile pipette Pasteur en verre sur la flamme, pris en charge sur le côté de la poire en caoutchouc à la main et du côté de la pointe à l’aide de pinces.
- Prenez la pipette Pasteur éteint la flamme et l’étirer.
- Lorsque le verre est fondante, la pipette Pasteur rapidement retirer la flamme et puis tirez.
Remarque : Dans cette expérience, la pipette Pasteur a été prolongée de 15 à 20 cm. Make sûr que la pipette est éteint la flamme lors de la traction.
- Lorsque le verre est fondante, la pipette Pasteur rapidement retirer la flamme et puis tirez.
- Casser l’embout de la pipette capillaire de verre à la bonne longueur. Parce que la partie de l’archet est la plus belle, elle est idéale pour l’astuce.
NOTE : Dans cette étude, une pipette capillaire de verre avec une pointe de 5-10 cm a été établie.- N’oubliez pas de jeter le tube capillaire après fonte il et confirmer que la flamme est éteint.
- Les bulles de la pipette capillaire de verre indiquent la taille de la pointe d’ouverture. Sélectionnez la taille appropriée pour la cellule d’isolement. Environ 1 mm de bulles est appropriée pour l’isolement des espèces Closterium , avec des largeurs de cellule de 10 à 20 µm.
4. unicellulaires isolement par une Pipette capillaire en verre
Remarque : Les éléments suivants sont requis avant de commencer : un microscope inversé léger, verres de montre, un plat en plastique et stériles filetés tubes à essai contenant le milieu de CA (tableau 1) ou conditionné CA moyen7.
- Préparer quelques verres de montre (22 mm de diamètre et 1 mm de profondeur), chacune contenant 1 mL de milieu stérile de CA.
- Isoler une cellule cible à partir de l’échantillon d’eau recueillie sur le terrain.
- Verser l’échantillon d’eau (environ 30 à 40 mL) contenant les cellules cibles dans le plat en plastique.
- Tout en observant l’échantillon dans le plat en plastique sous un microscope inversé léger, ramasser des cellules individuelles à l’aide de la pipette capillaire de verre.
- Mettre la pipette capillaire de verre près du capteur pour faciliter l’aspiration de la cellule par capillarité.
- Transférer les cellules dans un verre de montre contenant 1 mL de milieu stérile de CA (Figure 1 a).
- Ramasser les cellules à l’aide une nouvelle pipette capillaire en verre du milieu CA stérile et transférez-le vers un deuxième verre de montre contenant stérile CA médium (Figure 1 b).
Remarque : Ce processus est répété jusqu'à ce qu’une seule cellule est isolée dans la plaque en place (Figure 1C). - Ramasser la cellule unique à l’aide d’une nouvelle pipette capillaire de verre et enfin le transférer dans un tube à essai contenant 14 mL de milieu de CA ou milieu conditionné de CA (Figure 1D). Incuber les échantillons à 23 ° C, sous une lumière de 16 h : 8-h d’obscurité cycle pendant 2 semaines.
NOTE : Le facteur inconnu pour la prolifération des cellules, qui est sécrétées par les cellules en croissance dans le milieu environnant, est incluses dans le milieu conditionné pour faciliter la division cellulaire4. Si une culture clonale est mis en place, préparer le milieu conditionné de CA depuis le milieu de culture4. La culture devient verte si l’opération réussit.
Representative Results
Un échantillon d’eau de 50 mL (Inba1) on a prélevé un point de prélèvement dans le lac Inba-numa (pH 8,1, 24,7 ° C ; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) à Sakura-shi, Chiba, Japon, le 25 juin 2016. L’échantillon d’eau a été stocké à 4 à 8 ° C. Au lendemain de la collection, un spécimen de Closterium SP a été isolé de l’échantillon d’eau contenant des cellules végétatives. Quinze des cellules végétatives de morphologie identique (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 et -15) ont été isolés à partir de l’échantillon et ensuite lavé à l’aide de la pipette méthode de lavage. Quinze monocellules isolées ont été cultivés dans des éprouvettes indépendants contenant 15 mL de milieu conditionné de CA. Après 2 semaines d’incubation, la prolifération cellulaire a été observée dans des tubes à essai 9 [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figure 2 a), -6, -9, -10, -12 (Figure 2 b) et -13 ; Tableau 2]. Neuf cultures clonales ont été établies depuis les isolats d’échantillon Inba1 (Figure 3).
Figure 1 : Le flux d’isolement monocellulaires. (a) transfert la cellule algale cible unique sur l’échantillon original de l’eau à la stérile milieu dans le premier verre de montre. (b, c) Transférer à nouveau la cellule pour le prochain verre de montre pour laver. Cette procédure doit être répétée jusqu'à ce qu’il n’y a pas des autres cellules/contaminants que la cible dans le milieu ; trois verres de montre sont indiquées dans le diagramme ici à titre d’exemple. (d) Enfin, transférer les cellules lavées dans une éprouvette du milieu approprié pour la croissance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Photographies de cellules végétatives de Closterium SP. (a) Inba1-5) et (b) Inba1-12 sont indiqués ici. La barre d’échelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Mise en place d’une culture clonale de l’échantillon Inba1. Les tubes à essai cultivés pendant 2 semaines ont été photographiés par le bas. L’astérisque indique la prolifération cellulaire. La barre d’échelle = 2 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom du média | Référence | Commentaires | |
| CA | Ichimura et Watanabe12 | Ca (pas3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4pas3 | 5 mg | ||
| Β – Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamine B12 | 0,01 μg | ||
| Biotine | 0,01 μg | ||
| Thiamine HCl | 1 μg | ||
| Métaux PIV | 0,1 mL | ||
| Fe (comme l’EDTA ; molaire de 1:1) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Ajouter de l’eau pour faire 100 mL | |||
| pH ajuster avec du NaOH à 7,2 | |||
| Métaux P IV | Provasoli et Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Ajouter de l’eau pour faire 100 mL | |||
| Fe (comme l’EDTA ; molaire de 1:1) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(SO4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Ajouter de l’eau pour faire 100 mL | |||
| Milieu conditionné CA | Abe et al.,7 | Incuber les cellules dans un milieu frais CA pendant 14 à 20 jours. Recueillir le milieu cultivé par filtration à l’aide de papier-filtre qualitatif et stériliser le milieu filtré par autoclavage (121 ° C pendant 15 min). | |
| * Dans les NEI, 1,04 mg ZnCl2 est remplacé par 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tableau 1 : Formulations des médias utilisés dans cette étude.
| Échantillon d’eau | Nom de cellule | Situation après la culture | Nom de la souche |
| Inba1 | -1 | Les cellules ont proliféré | Inba1-1 |
| -2 | Pas changé | ||
| -3 | Les cellules ont proliféré | inba1-3 | |
| -4 | Les cellules ont proliféré | inba1-4 | |
| -5 | Les cellules ont proliféré | inba1-5 | |
| -6 | Les cellules ont proliféré | inba1-6 | |
| -7 | Pas changé | ||
| -8 | Pas changé | ||
| -9 | Les cellules ont proliféré | inba1-9 | |
| -10 | Les cellules ont proliféré | inba1-10 | |
| -11 | Pas changé | ||
| -12 | Les cellules ont proliféré | inba1-12 | |
| -13 | Les cellules ont proliféré | inba1-13 | |
| -14 | Pas changé | ||
| -15 | Pas changé |
Tableau 2 : L’isolement du procès sommaire.
Discussion
À l’aide de la méthode actuelle, souches 9 culture clonale de Closterium SP ont été établies à partir 15 cellules isolées de l’échantillon d’eau (Inba1), ce qui représente un taux de réussite de 60 %. Identification des espèces s’effectuera à l’avenir par l’observation morphologique ainsi que des analyses d’ADN, comme l’analyse phylogénétique moléculaire8.
Dans la présente méthode, la fraîcheur de l’échantillon d’eau est importante pour le taux de réussite. Il est préférable d’isoler les cellules de l’échantillon de l’eau dès que possible après la collecte sur le terrain. Bien que les cellules de l’espèce Closterium (p. ex., ehrenbergii c., c. peracerosum-strigosum-littorale complexe) peuvent être maintenues dans l’échantillon d’eau pendant environ 7 jours en le stockant à 4-8 ° C, l’isolement des cellules est souhaitable le jour de la collection ou le lendemain. Il est également important d’éliminer tous les contaminants autres que les cellules cibles, augmentant ainsi le nombre de répétitions de lavage (c.-à-d., > 3 x) peut empêcher une contamination des cultures par des microorganismes dans le sol et les cellules.
Une limitation de cette technique est que les milieux de culture utilisé dans le présent protocole (CA ou milieu conditionné de CA) ne sont pas toujours appropriées pour toutes les algues de conjugaison. Dans certains cas, il peut être nécessaire d’envisager d’utiliser un autre support, ainsi que de lumière différente et de température. Aussi, comme il est difficile de prouver qu’une culture est passée d’une seule cellule, il faut ramasser exactement de 1 seule cellule lors du transfert de cellules dans une éprouvette. Donc, le transfert devrait être fait avec une nouvelle pipette capillaire de verre chaque fois.
Établir une culture clonale avec cette pipette méthode de lavage est une méthode classique/standard et est la méthode la plus fiable d’utiliser pour isoler les cellules souhaitées pour une étude. Les cultures clonales de conjugaison des algues utilisées dans nombreuses études8,9,10,,11 ont été établies à l’aide de la méthode actuelle. Il est difficile d’analyser les algues conjugaison sans une culture clonale. De plus, ces dernières années, des séquences du génome entier de novo est devenu faciles à obtenir (par exemple, en utilisant le séquenceur de nanopore MinION) et établir les cultures clonales facilitera davantage le séquençage de novo . En d’autres termes, cette méthode est la première étape étudier à l’avenir de ces algues pour mieux comprendre leur biodiversité.
Afin d’établir une souche stable de la culture, il est nécessaire d’effectuer certaines étapes critiques avec précision dans le protocole. L’étape la plus importante est la préparation d’une pipette capillaire de verre avec une ouverture optimale pour permettre le passage d’une seule cellule seulement. L’ouverture de la pipette capillaire de verre doit être légèrement supérieure à la longueur du petit axe de la cellule d’intérêt. La pipette capillaire de verre optimale peut aspirer à une seule cellule par capillarité. Toutefois, si le diamètre de l’ouverture est trop grand, le capillaire attirera également en matériaux de contaminants non vivants ou (même un) autre ou des organismes, en plus de la cellule cible.
Pour obtenir une pipette capillaire de verre avec une ouverture optimale, les points suivants sont importants à noter. Tout d’abord, le pilier de flamme doit être étroit lorsque vous réchauffez la pipette capillaire de verre. Ensuite, lorsque vous tirez la pipette Pasteur, il doit être retiré de la flamme ; dans le cas contraire, l’ouverture de la pipette Pasteur va s’effondrer.
Les équipements et les conteneurs indiqués dans le présent protocole sont à la base et peuvent être modifiés. Par exemple, en utilisant des plaques multipuits au lieu de verres de montre avec un puits, le lavage de la cellule peut être rendu plus efficace. En outre, les récipients peuvent être remplacés pour autres similaires. En transférant une cellule unique dans le milieu de culture à la dernière étape, une culture clonale peut être établie.
Préparer un récipient stérilisé et travailler sous une hotte établira axéniques souches (non contaminées). Pour prévenir la contamination, il est nécessaire de répéter l’étape de lavage avec aliquotes frais plus de 3 x. Parfois, les bactéries sont également stérilisés en ajoutant des antibiotiques15.
Cette méthode axée sur les desmidiées isolement (Zygnematales), mais en changeant la taille de l’ouverture de la pipette capillaire de verre, il peut être appliqué à l’isolement de plancton taille différemment.
Acknowledgments
Nous remercions Hisayoshi Nozaki (Université de Tokyo), Takashi Nakada (Université de Keio), Yuka Marukawa Hashimoto (Université de Japon féminine) et Hiroyuki Sekimoto (Université de Japon féminine). Nous tenons à remercier les évaluateurs pour leurs commentaires. Cette étude a été financée par une subvention pour la recherche scientifique (n ° 26440223 et 15H 04413) de la société japonaise pour la Promotion de la Science, au Japon et par une subvention de la Fondation de développement de technologie nouvelle à Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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