Summary
In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Konjugation Algenarten aus einer natürlichen Wiese gesammelt.
Abstract
Es ist unentbehrlich, klonale Kulturen von Mikroalgen für den Einsatz in Studien mit verschiedenen Themen, wie Physiologie, Genetik, Taxonomie und Mikrobiologie. Daher ist es äußerst wichtig, die Entwicklung von Techniken zur klonale Kulturen zu schaffen. In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der conjugating Alge. Wasserproben werden aus dem Bereich gesammelt. Anschließend werden Zellen isoliert mit einer Kapillare Glaspipette, in Medien und Bedingungen geeignet zur Erzeugung einer klonalen Kultur angebaut.
Introduction
Konjugation von Algen (des Ordens Zygnematales), besetzen auch bekannt als Conjugatophytes, eine phylogenetische Schlüsselposition als die nächsten lebenden Verwandten der unmittelbaren Vorfahren des Land Pflanzen1,2. Etablierten klonale Kulturen von Algen führten zu einer Vielzahl von taxonomischen, physiologischen und genetischen Studien in den vergangenen Jahren. Die ISOLIERUNGSTECHNIKEN von Mikroorganismen aus einer natürlichen Wiese haben eine lange Tradition-3,-4. In den letzten Jahren etablierte automatisierte Isolierung, die Techniken mit Durchflusszytometrie auch gewesen5. Die am häufigsten verwendete Methode verwendet, um eine einzelne Zelle für die Errichtung einer klonalen Kultur zu erhalten ist die einzellige Isolierung mit einer Glas-Kapillare Pipette-6. Diese traditionelle Methode erfordert Geschick und eine präzise experimentelles Protokoll.
In diesem Artikel zeigen wir die Probenahme von Algen aus Feldproben und die Einrichtung von klonalen Kulturen von einzelligen Algen Konjugation, wie Gattung Closterium mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette. Eine Wasserprobe mit vegetativen Zellen wird von der Wiese (z.B., ein See, Teich oder Reisfeld) gesammelt. Die Zellen sind von der Wasserprobe mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette isoliert und dann gewaschen. Die Zellen sind in einem Reagenzglas mit Stickstoff ergänzt Medium (CA Medium) kultiviert, bei 24 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h dunkel Regime. Diese Methode eignet sich auch zur Isolierung von anderen Mikroalgen zur klonale Kulturen zu generieren.
Protocol
1. Erhebung einer Wasserprobe mit Algen
Hinweis: Einzellige Conjugatophytes wachsen in stagnierenden Binnengewässern wie Seen, Sümpfe und Reisfelder. Eine Algen-haltigen Wasserprobe wird von einer dieser Umgebungen, eine Kultur-Sorte zu produzieren gesammelt. Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor der Prozess: net Plankton, einer Einweg-Pipette, und eine Flasche oder ein 50 mL-Tube für das Sammeln von Wasserproben.
- Verwenden Sie net in einer See-Umgebung Plankton, um Algen aus dem Wasser zu sammeln. Verwenden Sie eine geeignete Netz, je nach Verwendungszweck.
Hinweis: Der obere Teil des Netzes ist durchlässig für Wasser. Die Algen, die durch das Netz gefangen sind in den unteren Behälter zum Plankton net konzentriert. Ein grobes Netz ermöglicht kleine Algen zu durchqueren. Ein feines Netz bekommt leicht verstopft. - Übertragen Sie das Wasser (ca. 50 mL) auf die 50 mL-Tube oder eine 100 mL PET-Flasche. Bringen Sie die konzentrierte Wasserprobe ins Labor.
- Einzelligen Conjugatophytes wachsen auch in Sümpfen oder Reisfelder. In diesen Bereichen Flachwasser kann Wasserprobe mit Algen mit einer Pipette direkt probieren. Übertragen Sie anschließend das Wasser (30-50 mL) 50 mL-Tube oder einer 50 mL Kunststoff-Flasche.
Hinweis: Das Wasser wird sorgfältig über der Bodenoberfläche abgetastet, so dass die Probe keinem Boden enthält.
2. Bestätigung der Algen
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich: eine Lupe oder portable Mikroskop und eine 60 mm Schale zur Beobachtung.
- Um zu bestätigen das Vorhandensein von Algen in der Probe, während es in der Einweg-Pipette ist, verwenden Sie die Lupe die Probe direkt zu beobachten.
Hinweis: Größere Zellen von ca. 400-1.000 µm in der Länge (z.B. Closterium Ehrenbergii) können problemlos beobachteten mit dieser Methode. - Um Algen unter dem portable Mikroskop bestätigen, Gießen Sie die Wasserprobe in einer Petrischale Kunststofflabor.
- Der innere Teil der oberen Hälfte die Probe (ca. 3 mL) aufsetzen (Deckel) der 60 mm Petrischale, dann legen Sie die untere Hälfte mit seinem Unterteil mit Blick auf den inneren Teil des Deckels an der Spitze.
Hinweis: Diese Methode verhindert, dass die Probe bewegt und die Beobachtung erleichtert.
- Der innere Teil der oberen Hälfte die Probe (ca. 3 mL) aufsetzen (Deckel) der 60 mm Petrischale, dann legen Sie die untere Hälfte mit seinem Unterteil mit Blick auf den inneren Teil des Deckels an der Spitze.
3. Vorbereitung der Kapillare Glaspipette aus einer Pasteurpipette für die Isolierung
Hinweis: Bevor Sie beginnen, sind folgende Elemente erforderlich: Pasteur Pipetten, ein Ständer für das Pasteur-Pipetten, Handschuhe, ein Gummiball, ein Geist-Lampe, Methanol für den Geist-Lampe, ein Feuerzeug, Pinzette, einen Mülleimer für Glas, sterilisiert und ein sauberes Zimmer oder blätterig Flow-Haube (falls erforderlich).
- Einen Alkohol-Brenner zu zünden.
- Um eine feine Kapillare Glaspipette für die Isolierung zu produzieren, stellen Sie sicher, dass die Flamme nicht flackern ist. Schärfen Sie die Flamme und schmelzen Sie die Pasteurpipette an der Spitze.
- Hitze eine sterile Glas Pasteurpipette auf der Flamme, gestützt auf der Seite der Gummiball von hand und auf der Seite der Spitze mit Pinzette.
- Nehmen Sie Pasteurpipette aus der Flamme und ziehen Sie es.
- Wenn das Glas schmelzen, der Pasteurpipette aus der Flamme schnell zu entfernen und dann ziehen.
Hinweis: In diesem Experiment wurde die Pasteurpipette von 15-20 cm. machen sicher erweitert, die die Pipette aus der Flamme während der Zugkraft ist.
- Wenn das Glas schmelzen, der Pasteurpipette aus der Flamme schnell zu entfernen und dann ziehen.
- Brechen Sie die Glas-Kapillare-Pipettenspitze auf die richtige Länge. Da die Verbeugung Teil vom feinsten ist, ist es ideal für den Tipp.
Hinweis: In dieser Studie wurde eine Kapillare Glaspipette mit einer Spitze von 5-10 cm vorbereitet.- Achten Sie darauf, die Kapillare nach schmilzt sie entsorgen, und bestätigen, dass die Flamme gelegt wird.
- Die Luftblasen aus den Kapillaren Glaspipette entlassen geben die Größe der Spitze öffnen. Wählen Sie die richtige Größe für die Zelle isoliert werden. Ca. 1 mm der Bläschen eignet sich für die Isolierung von Closterium Arten, mit Zellenbreite von 10-20 µm.
4. Single-Cell Isolation durch eine Kapillare Glaspipette
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor Sie beginnen: ein umgekehrtes Lichtmikroskop, Uhrengläser, einer Plastikschale und steril Gewinde Reagenzgläser, enthält CA Medium (Tabelle 1) oder mittlere CA7konditioniert.
- Bereiten Sie ein paar Uhrengläser (22 mm Durchmesser und 1 mm in der Tiefe), jeweils mit 1 mL steriles CA Medium.
- Isolieren einer Zielzelle aus der Wasserprobe im Bereich gesammelt.
- Gießen Sie die Wasserprobe (ca. 30-40 mL) mit den Zielzellen in die Plastikschale.
- Während der Beobachtung die Probe in die Plastikschale unter einem invertierten Lichtmikroskop abholen Einzelzellen mit Kapillare Glaspipette.
- Bringen Sie die Kapillare Glaspipette in der Nähe der Zelle das Streben der Zelle durch Kapillarwirkung zu erleichtern.
- Übertragen Sie die Zellen in einem Uhrglas, enthält 1 mL steriles CA Medium (Abbildung 1a).
- Wählen Sie die Zellen wieder mit einer neuen Kapillare Glaspipette aus dem sterilen CA Medium und überträgt es auf ein zweites Uhrglas mit sterilen CA Medium (Abbildung 1 b).
Hinweis: Dieser Vorgang wird wiederholt, bis eine einzelne Zelle in der spot Platte (Abbildung 1 c) isoliert ist. - Die einzelne Zelle mit einem neuen Kapillare Glaspipette abholen, und schließlich in ein Reagenzglas mit 14 mL CA Medium oder konditionierten CA Medium (Abbildung 1 d) übertragen. Inkubation die Probe bei 23 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen.
Hinweis: Die unbekannte wird für die Zellproliferation, die abgesondert sind, von der wachsenden Zellen in die Umgebung gehören konditionierten Mittel-und Zellteilung4zu erleichtern. Wenn eine klonale Kultur hergestellt wird, bereiten Sie die konditionierte CA Medium aus dem Kulturmedium4. Die Kultur wird im Erfolgsfall grün.
Representative Results
Eine Wasserprobe (Inba1) von 50 mL wurden von einer Entnahmestelle in See Inba-Numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) im Sakura-Shi, Chiba, Japan, am 25. Juni 2016. Die Wasserprobe wurde bei 4-8 ° c gelagert. Am nächste Tag nach der Sammlung, ein Exemplar von Closterium SP. wurde von der Wasserprobe mit vegetativen Zellen isoliert. Fünfzehn vegetativen Zellen der identische Morphologie (Inba1-1,-2-3-4,-5,-6, -7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, und-15) wurden isoliert von der Probe und dann mit der Pipette waschen Methode gewaschen. Fünfzehn isolierte Einzelzellen wurden in unabhängigen Reagenzgläser mit 15 mL konditionierten CA Medium kultiviert. Nach 2 Wochen Inkubation, Zellproliferation wurde in 9 Reagenzgläsern beobachtet [Inba1-1, -3,-4-5 (Abbildung 2a),-6,-9,-10,-12 (Abb. 2 b) und-13; Tabelle 2]. Neun klonale Kulturen entstanden aus der Inba1 Probe Isolate (Abbildung 3).
Abbildung 1 : Der Fluss der einzelligen Isolation. (ein) Übertragung der einzelnen Zielzelle Algen aus der ursprünglichen Wasserprobe auf der sterilen Medium in das erste Uhrglas. (b, c) Übertragen der Zelle wieder auf das nächste Uhrglas zu waschen. Dieses Verfahren sollte wiederholt werden, bis es keine anderen Zellen/Verunreinigungen als das Ziel in der Mitte gibt; drei Uhrengläser sind im Diagramm hier exemplarisch dargestellt. (d) schließlich übertragen die gewaschene Zelle in einem Teströhrchen das geeignete Medium für Wachstum. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Fotos von vegetativen Zellen des Closterium SP. (ein) Inba1-5) und (b) Inba1-12 werden hier gezeigt. Die Maßstabsleiste = 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Einrichtung einer klonalen Kultur aus der Probe Inba1. Die Reagenzgläser für 2 Wochen kultiviert wurden von unten fotografiert. Ein Sternchen gibt Zellproliferation. Die Maßstabsleiste = 2 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name des Mediums | Referenz | Kommentare | |
| CA | Bakumatsu und Watanabe12 | Ca (NO3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4Nr.3 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamin B12 | 0,01 μg | ||
| Biotin | 0,01 μg | ||
| Thiamin-HCl | 1 μg | ||
| PIV-Metalle | 0,1 mL | ||
| Fe (als EDTA; 1:1 Molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen | |||
| pH mit NaOH auf 7,2 einstellen | |||
| P IV Metalle | Provasoli und Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen | |||
| Fe (als EDTA; 1:1 Molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(also4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen | |||
| Konditionierte CA medium | Abe Et Al.7 | 14 – 20 Tage inkubieren Sie Zellen in frischen CA Medium. Sammeln der kultivierten Mediums durch Filtration mit qualitativen Filterpapier und Sterilisieren Sie die gefilterten Medium durch Autoklavieren (121 ° C für 15 min). | |
| * In den NIES ist 2,2 mg ZnSO4·7H2O. 1,04 mg ZnCl2 abgelöst. | |||
Tabelle 1: Formulierungen der in dieser Studie verwendeten Medien.
| Wasserprobe | Name der Zelle | Status nach Kultur | Stamm-name |
| Inba1 | -1 | Zellen vermehren | Inba1-1 |
| -2 | Nicht geändert | ||
| -3 | Zellen vermehren | inba1-3 | |
| -4 | Zellen vermehren | inba1-4 | |
| -5 | Zellen vermehren | inba1-5 | |
| -6 | Zellen vermehren | inba1-6 | |
| -7 | Nicht geändert | ||
| -8 | Nicht geändert | ||
| -9 | Zellen vermehren | inba1-9 | |
| -10 | Zellen vermehren | inba1-10 | |
| -11 | Nicht geändert | ||
| -12 | Zellen vermehren | inba1-12 | |
| -13 | Zellen vermehren | inba1-13 | |
| -14 | Nicht geändert | ||
| -15 | Nicht geändert |
Tabelle 2: Die Isolierung Studie Zusammenfassung.
Discussion
Mit der vorliegenden Methode entstanden 9 klonalen Kultur Stämme von Closterium SP. aus 15 Zellen isoliert von der Wasserprobe (Inba1), vertritt eine 60 % ige Erfolgsquote. Artenkenntnisse wird in Zukunft durch morphologische Beobachtung als auch DNA-Analysen, wie Molekulare phylogenetische Analyse8erfolgen.
In dem vorliegenden Verfahren ist die Frische der Wasserprobe wichtig, die Erfolgsquote. Es ist besser, die Zellen von Wasserproben so bald wie möglich nach der Feldauflistung zu isolieren. Obwohl die Zellen der Gattung Closterium (z. B. C. Ehrenbergii, C. Peracerosum-Strigosum-Littorale Komplex) in der Wasserprobe für ca. 7 d beibehalten werden können, indem es bei 4-8 ° C gespeichert, ist die Isolation der Zellen wünschenswert am Tag der Abholung oder am nächsten Tag. Es ist auch wichtig, sämtliche Verunreinigungen außer den Zielzellen, also die Zahl der Wiederholungen Waschen zu entfernen (d.h., > 3 X) kann eine Kontamination der Kulturen von Mikroorganismen im Boden und Zellen zu verhindern.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass die in diesem Protokoll (CA oder konditionierten CA Medium) verwendeten Nährmedien sind nicht immer geeignet für alle conjugating Algen. In einigen Fällen kann es notwendig zu prüfen, mit einem anderen Medium, sowie anderen Licht und Temperaturbedingungen sein. Auch, da es schwierig zu beweisen, ob eine Kultur von einer einzigen Zelle entwickelt hat, ist es notwendig nur 1 Zelle genau abholen, beim Übertragen von Zellen in einem Reagenzglas. Daher sollte die Übertragung mit einem neuen Kapillare Glaspipette jedes Mal durchgeführt werden.
Zur Gründung einer klonalen Kultur mit dieser Pipette waschen Methode ist eine klassische/Standard-Methode und ist die zuverlässigste Methode zu verwenden, um die gewünschten Zellen für eine Studie zu isolieren. Die klonalen Kulturen der Konjugation Algen verwendet in vielen Studien8,9,10,11 wurden gegründet, mit dem vorliegenden Verfahren. Es ist schwierig, Konjugation Algen ohne einer klonalen Kultur zu analysieren. Darüber hinaus in den letzten Jahren ganze Genomsequenzen de Novo wurde leicht zu beschaffen (z. B.durch die Verwendung des MinION Nanopore Sequencers) und zur Gründung klonaler Kulturen erleichtert weiter de Novo Sequenzierung. Das heißt, ist diese Methode der erste Schritt in die Zukunft studieren dieser Algen, ihre biologische Vielfalt besser zu verstehen.
Um eine stabile Kultur Belastung zu etablieren, ist es notwendig bestimmte kritische Schritte genau innerhalb des Protokolls. Der wichtigste Schritt ist die Vorbereitung der Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende um den Durchgang von nur einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Die Öffnung der Kapillare Glaspipette muss etwas mehr als die Länge der Nebenachse der Zelle von Interesse sein. Die optimale Kapillare Glaspipette kann eine einzelne Zelle durch Kapillarwirkung Aspirieren. Wenn der Durchmesser der Öffnung zu groß ist, wird die Kapillare in unbelebter Verunreinigung Materialien oder auch (eine) andere besonders, neben der Zielzelle auch zeichnen.
Um eine Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende zu erhalten, sind folgende Punkte zu beachten. Erstens muss die Säule der Flamme schmal sein, beim Erhitzen von Kapillaren Glaspipette. Als nächstes beim Pasteurpipette ziehen, muss es aus der Flamme entfernt werden; Andernfalls wird die Blende von der Pasteurpipette zusammenbrechen.
Die Ausrüstung und Container gezeigt in diesem Protokoll sind einfach und können geändert werden. Beispielsweise kann mithilfe von Multi-well-Platten anstelle von uhrgläser mit einem Brunnen, der Zelle waschen effizienter gestaltet werden. Darüber hinaus können die Container für andere ähnliche ersetzt werden. Durch eine einzelne Zelle auf dem Kulturmedium im letzten Schritt zu übertragen, kann eine klonale Kultur aufgebaut werden.
Vorbereitung eines sterilisierten Containers und arbeiten in einer Kapuze werden axenic (unbelasteten) Stämme etablieren. Um Verunreinigungen zu vermeiden, ist es notwendig die Waschschritt mit frischen Aliquote mehr als 3 X wiederholen. Manchmal sind Bakterien auch durch Zugabe von Antibiotika15sterilisiert.
Diese Methode konzentriert sich auf Desmid (Zygnematales) isoliert, aber ändern Sie die Größe der Blende Glas Kapillare Pipette, um die Isolation der unterschiedlich großen Plankton angewendet werden.
Acknowledgments
Wir danken Hisayoshi Nozaki (Universität Tokio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Frauen Universität) und Hiroyuki Sekimoto (Japan Joshi Daigaku). Wir möchten die Kritiken für ihre Beiträge danken. Diese Studie wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nr. 26440223 und 15 H 04413) von der Japan Society for Promotion of Science, Japan, und durch einen Zuschuss von der neuen Technologie Development Foundation, Yuki Tsuchikane unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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