Summary
En este artículo, nos demuestran el establecimiento de culturas clonales de especies de algas Conjugación unicelulares recogidas desde un sitio de campo natural.
Abstract
Es indispensable establecer cultivos clonales de microalgas para su uso en estudios de diversos temas, tales como microbiología, fisiología, genética y taxonomía. Por lo tanto, es sumamente importante desarrollar técnicas para establecer cultivos clonales. En este artículo, nos demuestran el establecimiento de cultivos clonales de un alga conjugación. Se recogen muestras de agua del campo. Posteriormente, las células son aisladas con una pipeta capilar de vidrio, coloca en un medio y bajo condiciones adecuadas para generar una cultura clónica.
Introduction
Conjugando las algas (de la orden Zygnematales), también conocido como conjugatophytes, ocupan una posición filogenética clave como los parientes vivos más cercanos de los antepasados inmediatos de tierra plantas1,2. Establecido cultivos clonales de algas han conducido a una amplia variedad de estudios taxonómicos, fisiológicos y genéticos en los últimos años. Las técnicas de aislamiento de microorganismos a partir de un campo natural tienen una larga tradición3,4. En los últimos años, el aislamiento automatizado técnicas mediante citometría de flujo han sido establecido5. El método más común utilizado para obtener una sola celda para el establecimiento de una cultura clónica es unicelular aislamiento utilizando una pipeta capilar de vidrio6. Este método tradicional requiere habilidad y un protocolo experimental precisa.
En este artículo demostramos el muestreo de algas de muestras de campo y el establecimiento de cultivos clonales de algas unicelulares de la conjugación, como la especie de Closterium , utilizando una pipeta capilar de vidrio. Se recoge una muestra de agua que contienen las células vegetativas de un sitio de campo (por ejemplo, un lago, estanque o arrozal). Las células son aisladas de la muestra de agua mediante el uso de una pipeta capilar de vidrio y luego se lava. Las células son cultivadas en un tubo de ensayo que contiene nitrógeno suplido (CA medio) a 24 ° C bajo una luz: 8 de 16-h-h régimen oscuro. Este método también es conveniente para el aislamiento de otras microalgas para generar cultivos clonales.
Protocol
1. recogida de una muestra de agua que contienen las algas
Nota: Conjugatophytes unicelulares crecen en zonas de agua dulce estancadas, como lagos, pantanos y arrozales. Una muestra de agua que contienen las algas se obtiene de uno de estos ambientes para producir una variedad de cultura. Los siguientes elementos son necesarios antes de iniciar el proceso: una red de plancton, una pipeta desechable y una botella o un tubo de 50 mL para recolección de muestras de agua.
- Utilice un plancton de red en un entorno de lago para recoger las algas del agua. Utilice una red adecuada, dependiendo de la finalidad.
Nota: La parte superior de la red es permeable al agua. Las algas atrapadas por la red se concentran en el recipiente inferior de la red de plancton. Una malla gruesa permite pequeñas algas pasar a través. Una malla fina se obstruye fácilmente. - Transferir el agua (aproximadamente 50 mL) el tubo de 50 mL o una botella de plástico de 100 mL. Traer la muestra de agua concentrada en el laboratorio.
- Conjugatophytes unicelulares también crecen en los pantanos o los arrozales. En estas áreas de aguas poco profundas, muestra de agua que contienen las algas se puede degustar directamente con un gotero. Luego, se transfieren al agua (30-50 mL) el tubo de 50 mL o una botella de plástico de 50 mL.
Nota: El agua se muestrea con cuidado sobre la superficie del suelo para que la muestra no contiene cualquier tipo de suelo.
2. confirmación de algas
Nota: Se requiere lo siguiente: una lupa o microscopio portátil y un 60 mm plato para observación.
- Para confirmar la presencia de algas en la muestra mientras se la pipeta desechable, utilizar la lupa para observar la muestra directamente.
Nota: Las celdas más grandes de aproximadamente 400-1.000 μm de longitud (p. ej., Closterium ehrenbergii) pueden ser fácilmente observadas con este método. - Para confirmar las algas bajo el microscopio portable, vierta la muestra de agua en un plato de plástico de laboratorio.
- Coloca la muestra (aproximadamente 3 mL) en la parte interior de la mitad superior (tapa) de 60 mm plato de Petri, luego coloque la mitad inferior, con su parte inferior hacia la parte interna de la tapa, en la parte superior.
Nota: Este método impide que la muestra movimiento y facilita la observación.
- Coloca la muestra (aproximadamente 3 mL) en la parte interior de la mitad superior (tapa) de 60 mm plato de Petri, luego coloque la mitad inferior, con su parte inferior hacia la parte interna de la tapa, en la parte superior.
3. preparación de una pipeta capilar de vidrio de una pipeta Pasteur para el aislamiento
Nota: Antes de iniciar el proceso, se necesitan los siguientes elementos: esterilizar Pipetas Pasteur, un rack para las pipetas de Pasteur, un bulbo de goma, guantes, una lámpara de alcohol, metanol para la lámpara de alcohol, un encendedor, pinzas, un bote de basura para el vidrio y un cuarto limpio o laminar campana de flujo (si es necesario).
- Encender un quemador de alcohol.
- Para producir una pipeta capilar de vidrio fino para el aislamiento, asegúrese de que la llama no parpadea. Enfocar la llama y la pipeta de Pasteur en la punta del derretimiento.
- Calor un vaso estéril, pipeta Pasteur en la llama, apoyada en el lado de la pera de goma con la mano y en el lado de punta mediante el uso de fórceps.
- Tomar la pipeta Pasteur de la llama y estirarlo.
- Cuando el vidrio se derrite, rápidamente Retire la pipeta Pasteur de la llama y después.
Nota: En este experimento, la pipeta de Pasteur se extendió por 15-20 cm. hacer seguro que la pipeta está apagado la llama durante la tracción.
- Cuando el vidrio se derrite, rápidamente Retire la pipeta Pasteur de la llama y después.
- Romper la punta de la pipeta capilar de vidrio a la longitud adecuada. Porque la inclinación es la mejor, es ideal para la punta.
Nota: En este estudio, se elaboró una pipeta capilar de vidrio con una punta de 5 a 10 cm.- Asegúrese de descartar el tubo capilar después de derretirlo y confirmar que la llama se pone hacia fuera.
- Las burbujas de la pipeta capilar de vidrio indican el tamaño de la punta del apertura. Seleccione el tamaño adecuado de la celda de aislamiento. Aproximadamente 1 mm de burbujas es adecuado para el aislamiento de especies de Closterium , 10-20 μm de anchura de la célula.
4. sola celda aislamiento por una pipeta capilar de vidrio
Nota: Los siguientes elementos son necesarios antes de comenzar: un microscopio de luz invertido, vidrios de reloj, un plato de plástico y estériles roscados tubos de ensayo que contiene medio de CA (tabla 1) o acondicionado CA medio7.
- Preparar unos vidrios de reloj (22 mm de diámetro y 1 mm de profundidad), cada uno conteniendo 1 mL de medio estéril de CA.
- Aislar una célula de la blanco de la muestra de agua recogida en el campo.
- Vierta la muestra de agua (aproximadamente 30-40 mL) que contiene las células blanco en el plato de plástico.
- Mientras observa la muestra en el plato de plástico debajo de un microscopio de luz invertido, recoger las células utilizando la pipeta capilar de vidrio.
- Traer la pipeta capilar de vidrio cerca de la célula para facilitar la aspiración de la célula por la acción capilar.
- Transferir las células a un vidrio de reloj que contenga 1 mL de medio estéril de CA (Figura 1a).
- Recoger las células otra vez utilizando una nueva pipeta capilar de vidrio de medio CA estéril y transferir a un segundo vidrio de reloj que contiene el medio estéril de CA (Figura 1b).
Nota: Este proceso se repite hasta que una sola célula es aislada en la placa de punto (figura 1C). - Recoger la célula utilizando una nueva pipeta capilar de vidrio y finalmente transferirlo a un tubo de ensayo que contiene 14 mL de medio de CA o medio condicionado de CA (figura 1 d). Incubar la muestra a 23 ° C bajo una luz: 8 de 16 h-ciclo de h oscuro por 2 semanas.
Nota: Los factores desconocidos para la proliferación celular, que se secretan de las células de crecimiento en el entorno, están incluidos en el medio condicionado para facilitar la división celular4. Si se establece un cultivo clonal, preparar el medio condicionado de CA desde el medio de cultivo4. La cultura se vuelve verde si es correcto.
Representative Results
Una muestra de agua (Inba1) de 50 mL fue recopilada de un punto de muestreo en el lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C, 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) en Sakura-shi, Chiba, Japón, el 25 de junio de 2016. La muestra de agua fue almacenada a 4-8 ° C. Al día siguiente después de la colección, un ejemplar de Closterium SP fue aislado de la muestra de agua conteniendo células vegetativas. Quince células vegetativas de morfología idéntica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 y -15) fueron aislados de la muestra y luego se lava con la pipeta de lavado. Quince células individuales aisladas fueron cultivadas en tubos de prueba independiente que contiene 15 mL de medio condicionado de CA. Después de 2 semanas de incubación, se observó proliferación celular en 9 tubos de ensayo [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (figura 2b) y -13; Tabla 2]. Se establecieron nueve culturas clonales de los aislamientos de muestras de Inba1 (figura 3).
Figura 1 : El flujo de aislamiento unicelular. (a) transferencia de las células de algas solo objetivo de la muestra original de agua a la estéril mediano en el primer vidrio de reloj. (b, c) Transferencia de la célula otra vez al vidrio de reloj siguiente para lavar. Este procedimiento debe repetirse hasta que no haya ninguna células/contaminantes que la meta en el medio; tres vidrios de reloj se muestran en el diagrama aquí como un ejemplo. (d) finalmente, transferencia de la célula de lavado para un tubo de ensayo del medio apropiado para el crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Fotografías de células vegetativas de Closterium SP. (a) Inba1-5) y (b) Inba1-12 se muestran aquí. La barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Establecimiento de una cultura clónica de la muestra de Inba1. Las probetas que se cultivan para 2 semanas fueron fotografiadas desde la parte inferior. Un asterisco indica que la proliferación celular. La barra de escala = 2 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre de los medios de comunicación | Referencia | Comentarios | |
| CA | Ichimura y Watanabe12 | CA (NO3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4NO3 | 5 mg | ||
| Β – Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamina B12 | 0,01 μg | ||
| Biotina | 0,01 μg | ||
| Tiamina HCl | 1 μg | ||
| Metales PIV | 0,1 mL | ||
| Fe (como EDTA; 1:1 molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Añadir agua para completar 100 mL | |||
| ajustar el pH con NaOH a 7.2 | |||
| Metales P IV | Provasoli y Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FECLAS3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3.6 mg | ||
| Vivencias2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 mg | ||
| Añadir agua para completar 100 mL | |||
| Fe (como EDTA; 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(asi4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Añadir agua para completar 100 mL | |||
| Medio condicionado de CA | Abe et al7 | Incubar las células en medio fresco de CA de 14 – 20 días. Recoge el medio de cultivo por filtración utilizando papel de filtro cualitativo y esterilizar el medio de filtrado en autoclave (121 ° C durante 15 min). | |
| * En las Nei, 1,04 mg vivencias2 se sustituye por 2.2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabla 1: Formulaciones de los medios utilizados en este estudio.
| Muestra de agua | Nombre de la célula | Estado después de la cultura | Nombre de la cepa |
| Inba1 | -1 | Las células proliferaron | Inba1-1 |
| -2 | No cambiado | ||
| -3 | Las células proliferaron | inba1-3 | |
| -4 | Las células proliferaron | inba1-4 | |
| -5 | Las células proliferaron | inba1-5 | |
| -6 | Las células proliferaron | inba1-6 | |
| -7 | No cambiado | ||
| -8 | No cambiado | ||
| -9 | Las células proliferaron | inba1-9 | |
| -10 | Las células proliferaron | inba1-10 | |
| -11 | No cambiado | ||
| -12 | Las células proliferaron | inba1-12 | |
| -13 | Las células proliferaron | inba1-13 | |
| -14 | No cambiado | ||
| -15 | No cambiado |
Tabla 2: El resumen del ensayo aislamiento.
Discussion
Utilizando el presente método, las cepas 9 cultura clónica de Closterium SP. fueron establecidas de 15 células aisladas de la muestra de agua (Inba1), que representa una tasa de éxito del 60%. Identificación de especies se llevará a cabo en el futuro por la observación morfológica así como el análisis de ADN, tales como análisis filogenética molecular8.
En el presente método, la frescura de la muestra de agua es importante a la tasa de éxito. Es mejor aislar las células de las muestras de agua tan pronto como sea posible después de la recolección de campo. Aunque las células de la especie de Closterium (p. ej., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale complejo) se pueden mantener en la muestra de agua de unos 7 d por almacenar a 4-8 ° C, el aislamiento de las células es deseable en el día de la colección o al día siguiente. También es importante eliminar cualquier contaminante que no sea de las células diana, aumentando así el número de repeticiones de lavado (es decir, > 3 x) puede prevenir una contaminación de los cultivos de microorganismos en el suelo y las células.
Una limitación de esta técnica es que los medios de cultivo utilizados en el presente Protocolo (CA o medio CA condicionado) no siempre son apropiadas para todas las algas conjugación. En algunos casos, puede ser necesario utilizar otro medio, así como condiciones de temperatura y luz diferente. También, como es difícil de probar si un cultivo ha crecido de una sola célula, es necesario recoger con exactitud solo 1 célula al transferir las células a un tubo de ensayo. Por lo tanto, la transferencia debe hacerse con una nueva pipeta capilar de vidrio cada vez.
Establecer un cultivo clonal con esta pipeta método de lavado es un método clásico estándar y es el método más confiable para utilizar para aislar las células deseadas para un estudio. Se establecieron las culturas clonales de conjugar las algas utilizadas en muchos estudios8,9,10,11 utilizando el presente método. Es difícil analizar las algas Conjugación sin una cultura clónica. Además, en los últimos años, secuencias de genoma de novo se convirtió en fáciles de obtener (por ejemplo, utilizando el secuenciador de nanopore súbdito), y establecer cultivos clonales más facilitará la secuenciación de novo . En otras palabras, este método es el primer paso en el futuro el estudio de estas algas para entender mejor su biodiversidad.
Para establecer una tensión estable de la cultura, es necesario realizar algunos pasos críticos con precisión dentro del protocolo. El paso más importante es la preparación de una pipeta capilar de vidrio con una abertura óptima para permitir el paso de sólo una sola celda. La abertura de la pipeta capilar de vidrio debe ser ligeramente mayor que la longitud del eje menor de la célula de interés. La pipeta capilar de vidrio óptimo puede aspirar una sola célula por la acción capilar. Sin embargo, si el diámetro de la abertura es demasiado grande, el capilar también sacarán en inertes los materiales contaminantes o incluso (un) otros microorganismos, además de la célula diana.
Para obtener una pipeta capilar de vidrio con una abertura óptima, los siguientes puntos son importantes tener en cuenta. En primer lugar, el pilar de la llama debe ser estrecho al calentar la pipeta capilar de vidrio. Luego, al retirar la pipeta Pasteur, tiene que ser eliminado de la llama; de lo contrario, la abertura de la pipeta de Pasteur se derrumbará.
El equipo y los recipientes que se muestra en este protocolo son básicas y pueden modificarse. Por ejemplo, usando placas de varios pocillos en lugar de vidrios de reloj con un pozo, el lavado de la celda puede hacerse más eficiente. Además, los contenedores pueden sustituirse por otras similares. Por una sola célula de transferencia al medio de cultivo en el último paso, se puede establecer un cultivo clonal.
Preparar un recipiente esterilizado y trabajar en una campana establecerá axénicos (sin contaminar) cepas. Para evitar la contaminación, es necesario repetir el lavado con alícuotas frescas x más de 3. A veces, las bacterias también son esterilizadas mediante la adición de antibióticos15.
Este método había centrado en desmid (Zygnematales) aislamiento, pero cambiando el tamaño de la abertura de la pipeta capilar de vidrio, puede ser aplicada al aislamiento de plancton diferente tamaño.
Acknowledgments
Agradecemos a Hisayoshi Nozaki (Universidad de Tokio), Takashi Nakada (Universidad de Keio), Yuka Marukawa Hashimoto (Japón Femenil Universidad) y Hiroyuki Sekimoto (Universidad de la mujer de Japón). Queremos agradecer a los revisores por sus comentarios. Este estudio fue apoyado por subvenciones para la investigación científica (no. 26440223 y 15H 04413) de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia, Japón y por una beca de la Fundación de desarrollo de tecnología nueva de Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
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