Summary
I den här artikeln visar vi inrättandet av klonala kulturer av encelliga konjugera alger arter som samlats in från en naturlig plats.
Abstract
Det är viktigt att etablera klonal kulturer av mikroalger för användning i studier av olika ämnen, såsom fysiologi, genetik, taxonomi och mikrobiologi. Det är således mycket viktigt att utveckla metoder för att fastställa klonal kulturer. I den här artikeln visar vi inrättandet av klonala kulturer av en konjugera alga. Vattenprover samlas in från fältet. Därefter isoleras celler med glas kapillär pipett, placeras i media, och odlas under förhållanden lämpliga för att generera en klonal kultur.
Introduction
Konjugera alger (för Zygnematales), upptar även känd som conjugatophytes, en viktig fylogenetiska position som trastliknande av omedelbar förfäderna av mark växter1,2. Etablerade klonal kulturer av alger har lett till en mängd olika taxonomiska, fysiologiska och genetiska studier de senaste åren. Isolering teknikerna av mikroorganismer från naturligt har en lång tradition3,4. Under de senaste åren etablerat automatiserade isolering metoder med flödescytometri har också5. Den vanligaste metoden som används för att få en enda cell för inrättandet av en klonal kultur är encelliga isolering använder ett glas kapillär pipett6. Denna traditionella metod kräver skicklighet och en exakt experimentellt protokoll.
I den här artikeln visar vi provtagning av alger från fältprov och inrättandet av klonala kulturer av encelliga konjugera alger, såsom Closterium arten, med glas kapillär pipett. Vattenprov som innehåller vegetativa celler samlas in från en plats (t.ex., en sjö, damm eller risfält). Cellerna är isolerade från vatten provet genom att använda glas kapillär pipett och sedan tvättas. Cellerna odlas i ett provrör innehållande kväve-kompletteras medium (CA medium) vid 24 ° C under en 16-h ljus: 8-h mörka regim. Denna metod passar även isolera andra mikroalger för att generera klonal kulturer.
Protocol
1. insamling av vattenprov som innehåller alger
Obs: Encelliga conjugatophytes växer i stillastående sötvatten områden, såsom sjöar, myrar och risfält. En som innehåller alger vattenprov som samlas in från en av dessa miljöer att producera en kultur stam. Följande behövs innan du startar processen: en plankton netto, disponibel pipett och en flaska eller en 50 mL tub för att samla vattenprover.
- Använda en plankton netto i sjön miljö för att samla alger från vattnet. Använd en lämplig netto, beroende på syftet.
Obs: Den övre delen av nätet är genomsläpplig för vatten. Algerna fångas av nätet är koncentrerade i behållaren botten av plankton netto. Ett grovt nät tillåter små alger att passera. En finmaskig blir igensatt enkelt. - Överföra vatten (ca 50 mL) till 50 mL röret eller en 100 mL plastflaska. Ta den koncentrerade vattenprov till laboratoriet.
- Encelliga conjugatophytes också växa i kärr eller risfält. I dessa områden med grunt vatten, kan vattenprov som innehåller alger avnjutas direkt med en pipett. Överför sedan vattnet (30-50 mL) till 50 mL röret eller en 50 mL plastflaska.
Obs: Vattnet samplas noggrant ovanför jordytan så att provet inte innehåller någon jord.
2. bekräftelse av alger
Anmärkning: Följande behövs: en lupp eller bärbar Mikroskop och en 60 mm maträtt för observation.
- Bekräfta förekomsten av alger i provet medan det i disponibel pipetten, använda luppen för att iaktta provet direkt.
Obs: Större celler på cirka 400-1000 µm i längd (t.ex., Closterium ehrenbergii) lätt kan observeras med den här metoden. - För att bekräfta alger under bärbara mikroskopet, häll vatten provet i en plast laboratorium maträtt.
- Sätta i provet (ca 3 mL) på den inre delen av den övre halvan (lock) av 60 mm petriskål, sedan placera den nedre halvan, med sin nedre del inför den inre delen av locket, på toppen.
Obs: Denna metod håller provet från flyttar och gör observation lättare.
- Sätta i provet (ca 3 mL) på den inre delen av den övre halvan (lock) av 60 mm petriskål, sedan placera den nedre halvan, med sin nedre del inför den inre delen av locket, på toppen.
3. beredning av glas kapillär pipett från en Pasteur-pipett för isolering
Obs: Innan du börjar, följande behövs: steriliseras Pasteur-pipetter, ett rack för de Pasteur-pipetterna, handskar, en gummi lampa, en ande lampa, metanol för lampan Ande, en tändare, pincett, en papperskorg för glas, och ett rent rum eller laminär flöde huva (om nödvändigt).
- Antända en spritbrännaren.
- För att producera fina glas kapillär pipett för isolering, se till att lågan inte flimrar. Vässa lågan och smälta den Pasteur-pipetten på sin spets.
- Värme ett sterilt glas Pasteur-pipett på flamman, stöds på sidan av gummi lampan för hand och på tip sida med hjälp av tången.
- Ta den Pasteur-pipetten av lågan och sträcka ut den.
- När glaset smälter, snabbt avlägsna den Pasteur-pipetten från lågan och sedan dra.
Obs: I detta experiment, den Pasteur-pipetten förlängdes av 15-20 cm. göra säker att pipetten är avstängd lågan under dra.
- När glaset smälter, snabbt avlägsna den Pasteur-pipetten från lågan och sedan dra.
- Bryta spetsen av glas kapillär pipetten till rätt längd. Eftersom den bugande delen är den finaste, är den idealisk för tipset.
Obs: I denna studie utarbetades glas kapillär pipett med en spets på 5-10 cm.- Tänk på att kassera kapillären efter smälta det och bekräfta att lågan sätts ut.
- Bubblorna frigörs från glas kapillär pipetten ange storleken på spetsen öppning. Välj rätt storlek för cellen att isoleras. Ca 1 mm av bubblor är lämplig för isolering av Closterium arter, med cellbredder 10-20 µm.
4. single-cell isolering av glas kapillär pipett
Obs: Följande behövs innan du börjar: ett inverterat ljusmikroskop, watch Glasögon, en plast skål och sterila gängade provrör innehållande CA medium (tabell 1) eller luftkonditionerade CA medium7.
- Förbereda ett par watch glas (22 mm i diameter och 1 mm på djupet), varje innehållande 1 mL steril CA medium.
- Isolera en målcell från vatten provet samlas in i fältet.
- Häll vatten provet (ca 30-40 mL) som innehåller målceller i plast skålen.
- Medan du observerar provet i plast skålen under ett inverterat ljusmikroskop, plocka upp enstaka celler använder glas kapillär pipetten.
- Ta glas kapillär pipetten nära cellen att underlätta strävan av cellen genom kapillärkraft.
- Överföra cellerna i ett urglas innehållande 1 mL steril CA medium (figur 1a).
- Plocka upp cellerna igen med nya glas kapillär pipett från steril CA medium och överföra den till en andra urglas som innehåller steril CA medium (figur 1b).
Obs: Denna process upprepas tills en enda cell är isolerade i spot plattan (figur 1 c). - Plocka upp den enda cellen med nya glas kapillär pipett, och slutligen överföra det till ett provrör innehållande 14 mL CA medium eller luftkonditionering CA medium (figur 1 d). Inkubera provet vid 23 ° C under en 16-h ljus: 8-h mörka cykel i 2 veckor.
Obs: De okända faktorer för cellproliferation, som utsöndras från växande celler in i den omgivande miljön, ingår i konditionerat mediet att underlätta cell division4. Om en klonal kultur är etablerad, förbereda luftkonditionerade CA medium från odlingssubstratet4. Kulturen blir grön om framgångsrika.
Representative Results
Vattenprov (Inba1) 50 ml samlades in från en provtagningspunkt i sjön Inba-numa (pH 8,1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) på Sakura-shi, Chiba, Japan, 25 juni 2016. Vatten provet var lagras vid 4-8 ° C. Nästa dag efter samlingen, ett exemplar av Closterium sp. isolerades från vatten provet som innehåller vegetativa celler. Femton vegetativa celler identiska morfologi (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14, och -15) var isolerade från provet och sedan tvättas med pipetten tvätt metod. Femton isolerade enstaka celler odlades i oberoende provrör innehållande 15 mL av konditionerat CA medium. Efter 2 veckors ruvning, cellproliferation observerades i 9 provrör [Inba1-1, -3, -4, -5 (figur 2a), -6, -9, -10, -12 (figur 2b) och -13; Tabell 2]. Nio klonal kulturer var etablerat från Inba1 prov isolaten (figur 3).
Figur 1 : Flödet av single-cell isolering. (en) enda algblomningar målcellen överföring från den ursprungliga vattenprov den sterila medium i den första urglas. (b, c) Överföra cellen igen till den nästa urglas att tvätta. Proceduren upprepas tills det finns inga andra celler/föroreningar än målet på medellång; tre klocka glas visas i diagrammet här som ett exempel. (d) Slutligen överföra tvättade cellen till ett provrör av lämpligt medium för tillväxt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Fotografier av vegetativa celler av Closterium sp. (en) Inba1-5 och (b), Inba1-12 visas här. Skalstapeln = 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Inrättandet av en klonal kultur från Inba1 provet. Provrören odlade i 2 veckor fotograferades från botten. En asterisk anger cellproliferation. Skalstapeln = 2 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Namn i media | Referens | Kommentarer | |
| CA | Ichimura och Watanabe12 | Ca (nr3)2·4H2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4nr3 | 5 mg | ||
| Β-Na2glycerophosphate·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO4·7H2O | 2 mg | ||
| Vitamin B12 | 0,01 μg | ||
| Biotin | 0,01 μg | ||
| Tiamin HCl | 1 μg | ||
| PIV metaller | 0,1 mL | ||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | 0,1 mL | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Tillsätt vatten för att göra 100 mL | |||
| pH justera med NaOH till 7,2 | |||
| P IV metaller | Provasoli och Pintner13 | Na2EDTA·2H2O | 100 mg |
| FeCl3·6H2O | 19,6 mg | ||
| MnCl2· 4H2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl2* | 1,04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Tillsätt vatten för att göra 100 mL | |||
| Fe (som EDTA; 1:1 molar) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(så4)2·6H2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Tillsätt vatten för att göra 100 mL | |||
| Luftkonditionering CA medium | Abe et al.7 | Inkubera cellerna i färsk CA medium i 14 – 20 dagar. Samla det odlade mediet genom filtrering med kvalitativt filtrerpapper och sterilisera det filtrerade mediet i autoklav (121 ° C under 15 minuter). | |
| * I NIES ersättas 1,04 mg ZnCl2 med 2,2 mg ZnSO4·7H2O. | |||
Tabell 1: Formuleringar av media som används i denna studie.
| Vattenprov | Namnet på cell | Status efter kultur | Stam namn |
| Inba1 | -1 | Celler frodats | Inba1-1 |
| -2 | Inte förändrats | ||
| -3 | Celler frodats | inba1-3 | |
| -4 | Celler frodats | inba1-4 | |
| -5 | Celler frodats | inba1-5 | |
| -6 | Celler frodats | inba1-6 | |
| -7 | Inte förändrats | ||
| -8 | Inte förändrats | ||
| -9 | Celler frodats | inba1-9 | |
| -10 | Celler frodats | inba1-10 | |
| -11 | Inte förändrats | ||
| -12 | Celler frodats | inba1-12 | |
| -13 | Celler frodats | inba1-13 | |
| -14 | Inte förändrats | ||
| -15 | Inte förändrats |
Tabell 2: Isolering rättegång sammanfattningen.
Discussion
Med nuvarande metod, var 9 klonal kultur stammar av Closterium sp. etablerat från 15 celler isolerade från vatten provet (Inba1), som representerar en 60% framgång. Artbestämning kommer att utföras i framtiden av morfologiska observation samt DNA-analyser, såsom molekylär fylogenetisk analys8.
I denna metod är friskhet av vatten provet viktigt att framgång. Det är bättre att isolera cellerna från vattenprover så snart som möjligt efter fältuppsättningen. Även om cellerna av Closterium arter (t.ex., C. ehrenbergii, C. peracerosum-strigosum-littorale komplexa) kan bibehållas i vatten provet för ca 7 d genom att förvara det på 4-8 ° C, är isolering av cellerna önskvärt dag samlingen eller nästa dag. Det är också viktigt att ta bort eventuella föroreningar än målceller, så ökar antalet tvätt repetitioner (dvs, > 3 x) kan hindra en förorening av kulturer av mikroorganismer i marken och celler.
En begränsning av denna teknik är att det odlingssubstrat som används i detta protokoll (CA eller luftkonditionering CA medium) inte är alltid lämpliga för alla konjugera alger. I vissa fall kan det vara nödvändigt att överväga att använda ett annat medium, samt olika ljus och temperatur. Också, eftersom det är svårt att bevisa om en kultur har vuxit från en enda cell, det är nödvändigt att noggrant plocka upp endast 1 cell när du överför celler till ett provrör. Därför ska överföring göras med nya glas kapillär pipett varje gång.
Upprätta en klonal kultur med denna pipett tvätt metod är en klassisk/standard metod och är den mest tillförlitliga metoden att använda för att isolera de önskade cellerna för en studie. Klonal kulturer konjugera alger används i många studier8,9,10,11 fastställdes med hjälp av denna metod. Det är svårt att analysera konjugera alger utan en klonal kultur. Dessutom under de senaste åren, de novo hela genomet sekvenser blev lätt att få (t.ex., med hjälp av MinION nanopore sequencer) och om inrättande av klonala kulturer kommer att ytterligare underlätta de novo sekvensering. Med andra ord, är denna metod det första steget i framtiden studie av dessa alger att bättre förstå deras biologiska mångfald.
För att fastställa en stabil kultur stam, är det nödvändigt att utföra vissa kritiska steg exakt inom protokollet. Det viktigaste steget är utarbetandet av glas kapillär pipett med en optimal bländare att tillåta passage av en enda cell endast. Bländaren på glas kapillär pipetten måste vara något mer än lillaxeln längden på cellen av intresse. Optimal glas kapillär pipetten kan aspirera en enda cell av kapillärkraften. Dock om diametern på bländaren är för stor, kommer kapillären också dra i icke-levande främmande material eller ens (en) andra organismer, förutom målcellen.
För att få ett glas kapillär pipett med en optimal bländare, är följande punkter viktiga att notera. Först, pelaren i lågan måste vara smala när uppvärmning glas kapillär pipetten. Nästa, när du drar den Pasteur-pipetten, det måste tas bort från lågan; annars kommer att bländaren på Pasteur pipetten kollapsa.
Den utrustning och de behållare som visas i detta protokoll är grundläggande och kan ändras. Exempelvis genom att använda plattor med flera istället för watch glasögon med en brunn, kan cell tvätt göras effektivare. Dessutom kan andra liknande de ersätta behållarna. Genom att överföra en enda cell till odlingsmediet på det sista steget, kan en klonal kultur fastställas.
Förbereda en steriliserad behållare och arbetar i en huva upprättar axenic (oförorenad) stammar. För att förhindra förorening, är det nödvändigt att upprepa steget tvätt med färska portioner mer än 3 x. Ibland kan steriliseras bakterier också genom att lägga till antibiotika15.
Denna metod fokuserar på desmid (Zygnematales) isolering, men genom att ändra storleken på glas kapillär pipett bländare, det kan användas till isolering av olika stora plankton.
Acknowledgments
Vi tackar Hisayoshi Nozaki (University of Tokyo), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan kvinnors universitet) och Hiroyuki Sekimoto (Japan kvinnors University). Vi vill tacka granskarna för deras kommentarer. Här studien har finansierats genom ett bidrag till vetenskaplig forskning (nr 26440223 och 15H 04413) från Japan Society för främjande av vetenskap, Japan, och genom ett anslag från Stiftelsen för utveckling av ny teknik att Yuki Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
