Summary
في هذه المقالة، نبدي إنشاء ثقافات الاستنساخ من أنواع الطحالب التصريف أحادي الخلية التي تم جمعها من موقع حقل طبيعية.
Abstract
من الضروري إنشاء ثقافات الاستنساخ من الطحالب المجهرية لاستخدامها في الدراسات المتعلقة بمختلف المواضيع، مثل علم وظائف الأعضاء وعلم الوراثة، والتصنيف وعلم الأحياء المجهرية. وهكذا، أنها بالغة الأهمية لتطوير تقنيات إنشاء ثقافات الاستنساخ. في هذه المقالة، نبدي إنشاء ثقافات الاستنساخ طحلب التصريف. يتم جمع عينات المياه من الحقل. وفي وقت لاحق، خلايا معزولة زجاج ماصة شعرية، وضعت في وسائط الإعلام، ونمت تحت ظروف مناسبة لتوليد ثقافة الاستنساخ باستخدام.
Introduction
التصريف الطحالب (للنظام زيجنيماتاليس)، تعرف أيضا باسم كونجوجاتوفيتيس، تشغل موقعا النشوء والتطور رئيسية كأقرب الأقارب الذين يعيشون من أسلاف الفوري من الأراضي النباتات1،2. الثقافات الاستنساخ المتبعة من الطحالب أدت إلى طائفة واسعة من الدراسات التصنيفية والفسيولوجية والجينية على مدى السنوات الماضية. تقنيات عزل الكائنات الدقيقة من حقل طبيعية لها تقاليد عريقة في3،4. في السنوات الأخيرة، أنشأت العزل الآلي تقنيات استخدام التدفق الخلوي كما كانت5. الطريقة الأكثر شيوعاً المستخدمة للحصول على خلية واحدة لإنشاء ثقافة الاستنساخ عزل الخلايا المفردة باستخدام ماصة شعرية زجاج6. يتطلب هذا الأسلوب التقليدي المهارة وبروتوكول تجريبي دقيق.
في هذه المقالة، نبدي أخذ عينات الطحالب من عينات ميدانية وإنشاء ثقافات الاستنساخ من الطحالب التصريف أحادي الخلية، مثل الأنواع كلوستيريوم ، استخدام ماصة شعرية زجاج. يتم جمع عينة مياه التي تحتوي على الخلايا النباتية من موقع حقل (مثلاً، بحيرة، بركة، أو حقول الأرز). الخلايا المعزولة من عينات المياه باستخدام ماصة شعرية زجاج وثم غسلها. هي الخلايا المستزرعة في أنبوب اختبار يحتوي على تكملة النيتروجين المتوسطة (CA المتوسطة) في 24 درجة مئوية تحت ضوء: 8 16-ح-ح نظام الظلام. هذا الأسلوب أيضا مناسبة لعزل الطحالب المجهرية الأخرى لتوليد الثقافات الاستنساخ.
Protocol
1-جمع عينة المياه التي تحتوي على الطحالب
ملاحظة: كونجوجاتوفيتيس أحادي الخلية تنمو في مناطق المياه العذبة الراكدة، مثل البحيرات والمستنقعات وحقول الأرز. تجمع عينة مياه التي تحتوي على طحالب من واحدة من هذه البيئات لإنتاج سلالة ثقافة. العناصر التالية ضرورية قبل البدء في العملية: العوالق صافي، ماصة المتاح، وزجاجة أو أنبوب 50 مل لجمع عينات من المياه.
- استخدم من العوالق صافية في بيئة بحيرة لجمع الطحالب من المياه. استخدم شبكة مناسبة، تبعاً للغرض.
ملاحظة: الجزء العلوي من الشبكة نفاذية المياه. الطحالب يتم صيدها بواسطة الصافي تتركز في الوعاء السفلي من العوالق الصافية. يسمح شبكة خشنة الطحالب الصغيرة بالمرور. يحصل انسداد شبكة غرامة بسهولة. - نقل المياه (حوالي 50 مل) إلى أنبوب 50 مل أو زجاجة بلاستيكية 100 مل. جلب عينة المياه مركزة للمختبر.
- كونجوجاتوفيتيس أحادي الخلية تنمو أيضا في المستنقعات أو حقول الأرز. في هذه المياه الضحلة، يمكن تذوق عينات المياه التي تحتوي على الطحالب مباشرة مع قطارة. ثم قم بنقل المياه (30-50 مل) إلى أنبوب 50 مل أو زجاجة بلاستيكية 50 مل.
ملاحظة: الماء هو بعناية عينات من فوق سطح التربة حيث أن العينة لا تحتوي على أي التربة.
2-تأكيدا للطحالب
ملاحظة: العناصر التالية مطلوبة: طبق العدسة أو المجهر المحمولة ومن 60 مم للمراقبة.
- لتأكيد وجود الطحالب في العينة في حين أنها في ماصة المتاح، استخدام العدسة لمراقبة العينة مباشرة.
ملاحظة: الخلايا أكبر من حوالي 400-1,000 ميكرومتر في الطول (مثلاً، اهرينبيرجي كلوستيريوم) يمكن بسهولة أن ملاحظتها باستخدام هذا الأسلوب. - للتأكد من الطحالب تحت المجهر المحمولة، صب العينة الماء في طبق مختبر بلاستيكية.
- وضع العينة (حوالي 3 مل) على الجزء الداخلي من النصف العلوي (الغطاء) من 60 مم طبق بيتري، ثم ضع النصف السفلي، بجانبها السفلي يواجه الجزء الداخلي من الغطاء، وعلى أعلى.
ملاحظة: هذا الأسلوب يحتفظ العينة من الانتقال ويسهل المراقبة.
- وضع العينة (حوالي 3 مل) على الجزء الداخلي من النصف العلوي (الغطاء) من 60 مم طبق بيتري، ثم ضع النصف السفلي، بجانبها السفلي يواجه الجزء الداخلي من الغطاء، وعلى أعلى.
3-إعداد ماصة الشعرية الزجاج من ماصة باستور عزلة
ملاحظة: قبل البدء في العملية، العناصر التالية ضرورية: تعقيم باستور الممصات، حامل الماصات باستور، قفازات، لمبة مطاطية، ومصباح الروح، الميثانول لمصباح الروح، وأخف وزنا، الملقط، سلة المهملات للزجاج، وغرفة نظيفة أو طبقية تدفق هود (إذا لزم الأمر).
- إشعال الشعلة الكحول.
- لإنتاج زجاج غرامة ماصة شعرية للعزلة، تأكد من اللهب لا تصدر وميضاً. شحذ اللهب وتذوب ماصة باستور في طرفها.
- الحرارة زجاج معقمة ماصة باستور في اللهب، أيد على جانب لمبة المطاط من جهة وعلى الجانب تلميح باستخدام الملقط.
- ماصة باستور قبالة اللهب ويتمدد.
- عندما يذوب الزجاج، بسرعة إزالة ماصة باستور من اللهب وسحب ثم.
ملاحظة: في هذه التجربة، ماصة باستور مددت قبل 15-20 سم. جعل بالتأكيد الماصة هو إيقاف الشعلة خلال سحب.
- عندما يذوب الزجاج، بسرعة إزالة ماصة باستور من اللهب وسحب ثم.
- كسر طرف الماصة الشعرية الزجاج بالطول المناسب. نظراً لأن الجزء الركوع أفضل، أنها مثالية لهذه المعلومة.
ملاحظة: في هذه الدراسة، أعد زجاج ماصة شعرية مع تلميح من 5-10 سم.- يجب التأكد من تجاهل شعري بعد ذوبان، والتأكد من أن يتم إخماد اللهب.
- فقاعات أطلق سراحهم من الماصة الشعرية الزجاج تشير إلى حجم تلميح فتح. تحديد الحجم المناسب للخلية لتكون معزولة. حوالي 1 مم فقاعات المناسب لعزل الأنواع كلوستيريوم ، مع عرض الخلية من 10-20 ميكرومتر.
4-خلية واحدة العزل بواسطة ماصة شعرية الزجاج
ملاحظة: العناصر التالية ضرورية قبل البدء: مجهر مقلوب خفيفة ومشاهدة النظارات وطبق بلاستيك وأنابيب الاختبار الخيوط العقيمة التي تحتوي على المرجع المصدق المتوسطة (الجدول 1) أو مكيفة CA متوسطة7.
- إعداد قليلة مشاهدة النظارات (22 ملم وقطرها 1 ملم في العمق)، كل 1 مل يحتوي على معقم CA المتوسطة.
- عزل خلية هدف من عينة المياه التي تم جمعها في الميدان.
- صب الماء العينة (حوالي 30-40 مل) الذي يحتوي على الخلايا الهدف إلى الطبق البلاستيك.
- مع ملاحظة العينة في الطبق البلاستيك تحت مجهر خفيفة مقلوب، تلتقط الخلايا المفردة باستخدام الماصة الشعرية الزجاج.
- إحضار الماصة الشعرية الزجاج قرب الخلية لتسهيل تطلع الخلية بعمل شعري.
- نقل الخلايا إلى مشاهدة زجاج الذي يحتوي على 1 مل من العقيمة CA المتوسطة (الشكل 1a).
- تلتقط الخلايا مرة أخرى باستخدام ماصة شعرية زجاج جديد من المتوسطة CA العقيمة وتحويلها إلى زجاج يشاهد ثاني يحتوي على معقم CA المتوسطة (الشكل 1b).
ملاحظة: يتم تكرار هذه العملية حتى يتم عزل خلية واحدة في لوحة بقعة (الشكل 1 ج). - التقاط خلية مفردة باستخدام ماصة شعرية جديدة من زجاج، وأنه نقل أخيرا إلى أنبوب اختبار يحتوي على 14 مل من CA المتوسطة أو مكيفة CA المتوسطة (الشكل 1 د). احتضان العينة في 23 درجة مئوية تحت ضوء: 8 16-ح-ح الظلام دورة لمدة أسبوعين.
ملاحظة: يتم تضمين factor(s) غير معروف لتكاثر الخلايا، التي هي يفرز من زراعة الخلايا في البيئة المحيطة بها، في الأجل المتوسط مكيفة لتسهيل انقسام الخلية4. إذا كان يتم تأسيس ثقافة الاستنساخ، إعداد متوسطة CA مكيفة من الثقافة المتوسطة4. الثقافة سوف يتحول إلى اللون الأخضر إذا كانت ناجحة.
Representative Results
وجمعت عينة مياه (Inba1) من 50 مل من نقطة أخذ العينات في بحيرة Inba-نوما (الرقم الهيدروجيني 8.1، 24.7 درجة مئوية؛ 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) في ساكورا-شي، تشيبا، اليابان، في 25 يونيو 2016. تم تخزين عينات المياه في 4-8 درجات مئوية. وكان اليوم التالي بعد جمع، عينة من sp. كلوستيريوم المعزولة من عينات المياه التي تحتوي على الخلايا النباتية. الخلايا النباتية خمسة عشر مورفولوجيا متطابقة (Inba1-1،-2،-3،-4،-5،-6،-7،-8،-9،-10،-11،-12،-13،-14، و-15) كانت معزولة من العينة وغسلها ثم استخدام ماصة الغسيل الأسلوب. كانت مثقف خمسة عشر خلايا مفردة معزولة في أنابيب الاختبار المستقلة التي تحتوي على 15 مل من مكيفة CA المتوسطة. بعد أسبوعين حضانة، وقد لوحظ انتشار الخلايا في أنابيب الاختبار 9 [Inba1-1،-3،-4-5 (الشكل 2a)،-6،-9-10،-12 (الشكل 2)، و-13؛ الجدول 2]. وأنشئت تسع ثقافات الاستنساخ من يعزل عينة Inba1 (الشكل 3).
الشكل 1 : تدفق عزل الخلايا المفردة. () نقل الخلية الطحلبية هدف واحد من عينة المياه الأصلية العقيمة المتوسطة في الزجاج يشاهد الأول. (ب، ج) نقل الخلية مرة أخرى للزجاج يشاهد القادم لغسل. وينبغي تكرار هذا الإجراء حتى هناك لا خلايا/الملوثات الأخرى من الهدف في الأجل المتوسط؛ وترد ثلاثة مشاهدة النظارات في المخطط هنا كمثال. (د) وأخيراً، نقل الخلية غسلها إلى أنبوب اختبار الوسيلة الملائمة للنمو. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : صور فوتوغرافية للخلايا النباتية من كلوستيريوم sp. () Inba1-5) و (ب) Inba1-12 وترد هنا. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إنشاء ثقافة الاستنساخ من العينة Inba1. تم تصوير أنابيب الاختبار مثقف لمدة أسبوعين من الجزء السفلي. تشير العلامة نجمية إلى تكاثر الخلايا. شريط المقياس = 2 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم الوسائط | مرجع | تعليقات | |
| CA | إيتشيمورا وواتانابي12 | Ca (لا3)2·4H2س | 2 ملغ |
| كنو3 | 10 ملغ | ||
| NH4لا3 | 5 ملغ | ||
| O β – نا2glycerophosphate·5H2 | 3 ملغ | ||
| مجسو4·7H2س | 2 ملغ | ||
| فيتامين ب 12 | 0.01 ميكروغرام | ||
| بيوتين | 0.01 ميكروغرام | ||
| الثيامين هيدروكلورايد | 1 ميكروغرام | ||
| المعادن PIV | 0.1 مل | ||
| الحديد (يدتا؛ المولى 1:1) | 0.1 مل | ||
| حبيس | 40 ملغ | ||
| إضافة الماء لجعل 100 مل | |||
| ضبط الأس الهيدروجيني مع هيدروكسيد الصوديوم إلى 7.2 | |||
| رابعا ف المعادن | بروفاسولي وبينتنير13 | Na2EDTA·2H O2 | 100 ملغ |
| فيكل3·6H2س | مغ 19.6 | ||
| ·2الحركة س 4 ح2 | 3.6 ملغ | ||
| زنكل2* | مغ 1.04 | ||
| كوكل2·6H2س | 0.4 ملغ | ||
| غ2مو4·2H2س | 0.25 مغ | ||
| إضافة الماء لجعل 100 مل | |||
| الحديد (يدتا؛ المولى 1:1) | بروفاسولي14 | الحديد (NH4)2(حتى4)2·6H2س، | مغ 70.2 |
| Na2EDTA·2H2O، | 66 ملغ | ||
| إضافة الماء لجعل 100 مل | |||
| مكيفة CA المتوسطة | أبي et al.7 | احتضان خلايا جديدة CA المتوسطة لمدة 14 – 20 يوما. جمع المتوسطة مثقف عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح النوعي وتعقيم المتوسطة التي تم تصفيتها بالتعقيم (121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة). | |
| * في الاقتصادات الحديثة التصنيع، يتم استبدال 1.04 ملغ زنكل2 2.2 ملغ زنسو4·7H2أ. | |||
الجدول 1: تركيبات الوسائط المستخدمة في هذه الدراسة.
| عينة الماء | اسم الخلية | الوضع بعد الثقافة | اسم السلالة |
| Inba1 | -1 | انتشرت الخلايا | Inba1-1 |
| -2 | لم تتغير | ||
| -3 | انتشرت الخلايا | inba1-3 | |
| -4 | انتشرت الخلايا | inba1-4 | |
| -5 | انتشرت الخلايا | inba1-5 | |
| -6 | انتشرت الخلايا | inba1-6 | |
| -7 | لم تتغير | ||
| -8 | لم تتغير | ||
| -9 | انتشرت الخلايا | inba1-9 | |
| -10 | انتشرت الخلايا | inba1-10 | |
| -11 | لم تتغير | ||
| -12 | انتشرت الخلايا | inba1-12 | |
| -13 | انتشرت الخلايا | inba1-13 | |
| -14 | لم تتغير | ||
| -15 | لم تتغير |
الجدول 2: عزل المحاكمة الموجز.
Discussion
باستخدام هذا الأسلوب، تم إنشاء ثقافة الاستنساخ 9 سلالات كلوستيريوم sp. من 15 الخلايا المعزولة من عينة المياه (Inba1)، الذي يمثل نسبة نجاح 60%. تحديد الأنواع ستنفذ في المستقبل بالملاحظة المورفولوجية، فضلا عن إجراء تحاليل الحمض النووي، مثل تحليل النشوء والتطور الجزيئي8.
في هذا الأسلوب، المهم نضارة عينة المياه معدل النجاح. فمن الأفضل لعزل الخلايا من عينات المياه وقت ممكن بعد الجمع الميداني. على الرغم من أن يمكن الحفاظ على خلايا الأنواع كلوستيريوم (مثلاً، اهرينبيرجي جيم، جيم-بيراسيروسوم-ستريجوسوم-littorale المعقدة) في عينة المياه لحوالي 7 د بتخزينها في 4-8 درجة مئوية، عزل الخلايا أمر مرغوب فيه في اليوم لجمع أو في اليوم التالي. من المهم أيضا لإزالة أي ملوثات عدا الخلايا الهدف، لذلك زيادة عدد التكرار الغسل (أي، > 3 x) قد منع تلوث من الثقافات بالكائنات الدقيقة في التربة وخلايا.
وجود قيود على هذا الأسلوب أن ثقافة الوسائط المستخدمة في هذا البروتوكول (CA أو مكيفة CA المتوسطة) ليست دائماً مناسبة لجميع الطحالب التصريف. في بعض الحالات، قد يكون من الضروري النظر في استخدام أية وسيلة أخرى، فضلا عن ضوء مختلف وظروف الحرارة. أيضا، كما أنه يصعب إثبات ما إذا كانت ثقافة نمت من خلية واحدة، من الضروري أن دقة انتقاء الخلية 1 فقط عند نقل الخلايا إلى أنبوب اختبار. ولذلك نقل ينبغي أن يتم مع ماصة شعرية جديدة زجاج في كل مرة.
إرساء ثقافة الاستنساخ مع ماصة هذا الغسيل الأسلوب هو أسلوب الكلاسيكية/قياسي وهو الأسلوب الأكثر موثوقية لاستخدام لعزل الخلايا المطلوبة لدراسة. تم إنشاء ثقافات الاستنساخ التصريف الطحالب المستخدمة في العديد من الدراسات8،،،من910،11 باستخدام هذا الأسلوب. من الصعب تحليل الطحالب التصريف دون ثقافة الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، في السنوات الأخيرة، تسلسل الجينوم كله حيثياته أصبح من السهل الحصول على (مثلاً، باستخدام جهاز التسلسل نانوبوري العميل)، وإنشاء ثقافات الاستنساخ سيزيد من تسهيل تسلسل حيثياته . وبعبارة أخرى، أن هذا الأسلوب الخطوة الأولى في المستقبل دراسة لهذه الطحالب فهم أفضل للتنوع البيولوجي.
من أجل إقامة سلالة ثقافة مستقرة، من الضروري القيام ببعض الخطوات الحاسمة بدقة ضمن البروتوكول. أهم خطوة هي إعداد ماصة الشعرية الزجاج مع فتحه أمثل للسماح بمرور من خلية مفردة فقط. يجب أن تكون فتحه الماصة الشعرية الزجاج أكثر قليلاً من طول المحور طفيفة الخلية للفائدة. يمكن نضح الماصة الشعرية الزجاج الأمثل خلية واحدة بعمل شعري. إذا كانت قطر الفتحة كبيرة جداً، بيد سوف أيضا رسم شعري في المواد غير الحية الملوث أو حتى (an) أخرى organism(s)، بالإضافة إلى الخلية الهدف.
للحصول على زجاج ماصة شعرية مع فتحه أمثل، النقاط التالية من المهم ملاحظة. أولاً، يجب أن تكون الدعامة للهب ضيقة عند تدفئة الماصة الشعرية الزجاج. بعد ذلك، عندما سحب ماصة باستور، لديها المراد إزالتها من اللهب؛ وإلا فسوف تنهار فتحه ماصة باستور.
المعدات وحاويات المبينة في هذا البروتوكول هي الأساسية ويمكن تعديلها. على سبيل المثال، باستخدام لوحات متعددة جيدا بدلاً من مشاهدة النظارات مع بئر واحدة، الغسيل خلية يمكن إجراء أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون بديلاً الحاويات لمماثلة أخرى. بنقل خلية واحدة إلى المتوسطة الثقافة في الخطوة الأخيرة، يمكن تأسيس ثقافة الاستنساخ.
وستنشئ إعداد حاوية معقمة والعمل في غطاء سلالات (غير ملوثة) أكسينيك. لمنع التلوث، من الضروري تكرار الخطوة الغسيل مع مختبرين الطازجة أكثر من 3 س. في بعض الأحيان، كما يجري تعقيم البكتيريا بإضافة15من المضادات الحيوية.
يركز هذا الأسلوب على ديسميد العزلة (زيجنيماتاليس)، ولكن عن طريق تغيير حجم الفتحة الشعرية الماصة الزجاجية، ويمكن تطبيقها لعزل العوالق الحجم بشكل مختلف.
Acknowledgments
ونشكر هيسايوشي نوزاكي (جامعة طوكيو)، تاكاشي ناكادا (جامعة كيو)، يوكا ماروكاوا هاشيموتو (جامعة "المرأة" في اليابان)، وهيرويوكي سيكيموتو (جامعة "المرأة" في اليابان). نود أن نشكر المراجعين لإبداء تعليقاتها عليها. كان يؤيد هذه الدراسة معونات "البحث العلمي" (رقم 26440223 و 15 ح 04413) من "الجمعية اليابانية" "تعزيز العلوم"، اليابان، ومنحة من "مؤسسة تنمية التكنولوجيا الجديدة" إلى يوكي تسوتشيكاني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
