Summary
במאמר זה נדגים הקמתה של תרבויות המשובטים המינים חד־תאיות conjugating אצה שנאספו מתוך אתר שדה טבעי.
Abstract
זה חיוני להקים תרבויות המשובטים microalgae לשימוש במחקרים של נושאים שונים, כגון פיזיולוגיה, גנטיקה, טקסונומיה, מיקרוביולוגיה. לכן, חשוב מאוד לפתח טכניקות כדי ליצור תרבויות המשובטים. במאמר זה נדגים הקמת המשובטים התרבויות אצה conjugating. דגימות מים נאספים מן השדה. לאחר מכן, תאים מבודדים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, מניחים בכלי התקשורת, גדלו בתנאים מתאימים ליצירת תרבות המשובטים.
Introduction
Conjugating אצות (על אף המסדר Zygnematales), הידוע גם בשם conjugatophytes, לכבוש את עמדת פילוגנטי מפתח כמו קרובי משפחה הקרובים ביותר חיים של אבות מיידית של קרקע צמחים1,2. תרביות המשובטים של אצות הובילו על מגוון רחב של מחקרים בטקסונומיה, הפיזיולוגית גנטית במהלך השנים האחרונות. הטכניקות בידוד מיקרואורגניזמים מתוך שדה טבעי יש מסורת ארוכה3,4. בשנים האחרונות, בידוד אוטומטי באמצעות cytometry זרימה טכניקות היו גם הקים5. השיטה הנפוצה ביותר והשיג תא בודד להקמתה של תרבות המשובטים הוא בידוד תא בודד באמצעות פיפטה נימי זכוכית6. שיטה מסורתית זו דורשת מיומנות, פרוטוקול נסיוני מדויק.
במאמר זה נדגים הדוגמאות של אצות מן השדה ודוגמאות הקמתה של תרבויות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו conjugating, כמו מינים Closterium , באמצעות פיפטה נימי של זכוכית. דגימת מים המכיל תאים וגטטיבי נאסף מתוך אתר שדה (למשל, אגם, בריכה או שדה אורז). התאים מבודד דגימת מים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, ואז לשטוף. התאים מתורבתים במבחנה המכילה חנקן-בתוספת בינוני (CA בינוני) ב 24 ° C תחת אור: 8 16-ה-h משטר אפל. שיטה זו מתאימה גם בידוד אחרים microalgae ליצור תרבויות המשובטים.
Protocol
1. אוסף של דגימת מים המכילים אצות
הערה: conjugatophytes חד־תאיות לגדול באזורים קיפאון מים מתוקים, כמו אגמים, ביצות ושדות אורז. דוגמה מים המכילים אצות נאסף מאחד סביבות אלה לייצר זן תרבות. הפריטים הבאים נדרשים לפני תחילת התהליך: פלנקטון נטו, על פיפטה חד פעמיות, ואת בקבוק או שפופרת 50 מ"ל. לאיסוף דגימות מים.
- משתמשים פלנקטון נטו בסביבת אגם לאיסוף אצות מן המים. השתמש של הרשת המתאים, בהתאם למטרה.
הערה: החלק העליון של הרשת הוא חדיר למים. האצות נתפס על ידי הרשת מרוכזים לתוך המיכל התחתון פלנקטון נטו. רשת גס מאפשר אצות קטן לעבור. רשת קנס מקבל סתומות בקלות. - להעביר את המים (כ- 50 מ"ל) ברכבת התחתית 50 מ ל או בקבוק פלסטיק 100 מ. להביא דגימת מים מרוכז המעבדה.
- Conjugatophytes חד־תאיות לגדול גם ביצות או שדות האורז. באזורים אלה מים רדודים, דגימת מים המכילים אצות ניתן לטעום ישירות עם טפי. לאחר מכן, להעביר את המים (30-50 מ"ל) ברכבת התחתית 50 מ ל או בקבוק פלסטיק 50 מל.
הערה: המים בזהירות שנדגמו מעל פני האדמה, כך המדגם אינו מכיל שום קרקע.
2. אישור של אצות
הערה: הפריטים הבאים נדרשים: עם זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ נייד ו- 60 מ"מ דיש להשגחה.
- כדי לאשר את הנוכחות של אצות במדגם בעוד הוא נמצא פיפטה חד פעמיות, להשתמש זכוכית מגדלת כדי לבחון את הדגימה ישירות.
הערה: תאים גדול יותר של 400-1, 000 מיקרומטר באורכו (למשל, Closterium ehrenbergii) יכולה בקלות להיות שנצפו בשיטה זו. - כדי לאשר אצות תחת המיקרוסקופ נייד, יוצקים דגימת מים בצלחת פלסטיק מעבדה.
- שים המדגם (בערך 3 מ ל) על החלק הפנימי של החצי העליון (מכסה) 60 מ מ פטרי, אז במקום החצי התחתון, עם חלקו התחתון מול החלק הפנימי של המכסה, על העליונה.
הערה: בשיטה זו מונע את הדגימה נע ומקל על התצפית.
- שים המדגם (בערך 3 מ ל) על החלק הפנימי של החצי העליון (מכסה) 60 מ מ פטרי, אז במקום החצי התחתון, עם חלקו התחתון מול החלק הפנימי של המכסה, על העליונה.
3. הכנה של פיפטה נימי זכוכית מ פיפטה פסטר הבידוד
הערה: לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים נדרשים: עיקור פיפטות פסטר, ארון תקשורת עבור מנורה רוח, מתנול עבור המנורה רוח, מצית, מלקחיים, פח אשפה לזכוכית, דרך הנורה גומי, כפפות, פיפטות פסטר את, חדר נקי או למינריות הוד זרימה (במקרה הצורך).
- להצית צורב אלכוהול.
- כדי לייצר פיפטה נימי זכוכית עבור הבידוד, ודא שהלהבה לא מהבהבת. לחדד את הלהבה, להמיס את פיפטה פסטר בקצהו.
- חום זכוכית סטריליים פסטר פיפטה על הלהבה, תמיכה בצד של הנורה גומי בעבודת יד, בצד קצה באמצעות מלקחיים.
- . קח את פיפטה פסטר את הלהבה ולמתוח אותו.
- כאשר הזכוכית נמס, להסיר במהירות את פיפטה פסטר מתחנת הלהבה ולאחר מכן משוך.
הערה: בניסוי זה, פיפטה פסטר הוארך על ידי 15-20 ס מ. ודא בטוח זה את הלהבה פיפטה במהלך הוצאת.
- כאשר הזכוכית נמס, להסיר במהירות את פיפטה פסטר מתחנת הלהבה ולאחר מכן משוך.
- לשבור את קצה פיפטה נימי זכוכית באורך המתאים. כיוון שחלק התקשתות הטובים ביותר, זה אידיאלי על הטיפ.
הערה: מחקר זה פיפטה נימי זכוכית עם טיפ של 5-10 ס מ הוכן.- הקפד לבטל את נימי לאחר נמס זה, וודא כי הלהבה יצא החוצה.
- הבועות שוחררו על פיפטה נימי זכוכית מציינים את הגודל של קצה פתיחת. בחר את גודל תקין של התא תהיה מבודדת. כ- 1 מ מ של בועות הוא הולם ניתוקה של מינים Closterium , עם תא רוחב של 10-20 מיקרומטר.
4. החד-תאיים בידוד באמצעות פיפטה נימי זכוכית
הערה: הפריטים הבאים נדרשים לפני שמתחילים: מיקרוסקופ אור הפוך, שעונים משקפיים, צלחת פלסטיק ו סטרילי משורשרות מבחנות המכילות בינוני CA (טבלה 1) או ממוזגים CA בינוני7.
- להכין לצפות כמה כוסות (22 מ מ בקוטר של 1 מ מ עומק), המכיל כל 1 מ"ל של אמצעי CA סטרילי.
- לבודד את תא היעד דגימת מים שנאספו בשטח.
- יוצקים את דגימת מים (בערך 30-40 מ"ל) המכיל תאי היעד לתוך קערה מפלסטיק.
- תוך כדי התבוננות המדגם בצלחת פלסטיק תחת מיקרוסקופ אור הפוך, לאסוף תאים בודדים באמצעות פיפטה נימי את הזכוכית.
- להביא את פיפטה נימי זכוכית ליד התא כדי להקל על השאיפה של התא על ידי נימיות.
- העבר את התאים לתוך כוס שעון המכיל 1 מ"ל של CA בבסיס, אמצעי סטרילי (איור 1 א').
- לאסוף את התאים שוב באמצעות חדש זכוכית נימי פיפטה של המדיום CA סטרילי, להעביר אותו זכוכית השעון השני המכיל אמצעי CA סטרילי (איור 1b).
הערה: תהליך זה חוזר על עצמו עד לתא בודד מבודד בצלחת ספוט (איור 1 c). - לאסוף את התא הבודד באמצעות פיפטה נימי זכוכית חדשה ולאחר לבסוף להעביר אותו למבחנה המכילה 14 מ של CA בינוני או CA ממוזגים בינוני (איור 1-d). דגירה המדגם ב 23 ° C תחת אור: 8 16-ה-h כהה מחזור בשבועיים הקרובים.
הערה: factor(s) לא ידוע על התפשטות תאים, אשר מופרשים מן גדל התאים לתוך הסביבה, כלולים המדיום ממוזגים כדי להקל על חלוקת התא4. אם נוצרת תרבות המשובטים, להכין האמצעי CA ממוזגים תרבות בינוני4. התרבות יהפוך לירוק אם מוצלחת.
Representative Results
דגימת מים (Inba1) של 50 מ ל נאסף מנקודת הדגימה אחד ב אגם ענבה-numa (pH 8.1, 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)-סאקורה-שי, צ'יבה, יפן, על יוני 25, 2016. דגימת מים היה מאוחסן ב 4-8 ° c למחרת אחרי האוסף, דוגמא של Closterium sp. הופרדה מרשת דגימת מים המכיל תאים וגטטיבי. חמש עשרה תאים וגטטיבי של מורפולוגיה זהה (Inba1-1,-2-3-4,-5,-6,-7, -8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, ו-15) הם בודדו אותנו מהמתרחש המדגם, ואז לשטוף בעזרת פיפטה של שטיפת בשיטה. חמש עשרה תאים בודדים מבודדת היו תרבותי במבחנות עצמאי המכיל 15 מ"ל של מדיום CA ממוזגים. לאחר 2 שבועות של דגירה, התפשטות תאים נצפתה במבחנות 9 [Inba1-1,-3,-4,-5 (איור 2 א),-6,-9,-10,-12 (איור 2b) ו-13; בטבלה 2]. תשע התרבויות המשובטים הוקמו מ מבודד מדגם Inba1 (איור 3).
איור 1 : הזרם של תא בודד בידוד. () העברת התא אצה יעד בודד מדגם המים המקורי סטרילי בינוני בכוס השעון הראשון. (b, c) להעביר את התא שוב אל הזכוכית השעון הבא כדי לשטוף. הליך זה יש לחזור עד ישנם אחרים תאים/חומציות מאשר המטרה בטווח הבינוני; שלושה כוסות שעונים מוצגים בתרשים כאן כדוגמה. (ד) בסופו של דבר, להעביר את התא שטף מבחנה של המדיום המתאים לצמיחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : צילומים של תאים וגטטיבי של Closterium sp. () Inba1-5 ו- (b) Inba1-12 מוצגות כאן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : הקמתה של תרבות המשובטים מדגם Inba1. צינורות הבדיקה תרבותי 2 שבועות צולמו מלמטה. כוכבית מציינת התפשטות תאים. סרגל קנה מידה = 2 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| השם של המדיה | הפניה | הערות | |
| CA | Ichimura ו ואטאנבי12 | Ca (3)2·4H2O | 2 מ ג |
| יודע3 | 10 מ ג | ||
| מלון NH43 | 5 מ"ג | ||
| Β – נה2glycerophosphate·5H2O | 3 מ"ג | ||
| MgSO4·7H2O | 2 מ ג | ||
| ויטמין B12 | 0.01 μg | ||
| ביוטין | 0.01 μg | ||
| תיאמין HCl | 1 μg | ||
| PIV מתכות | 0.1 מ"ל | ||
| Fe (כמו EDTA; טוחנת 1:1) | 0.1 מ"ל | ||
| HEPES | 40 מ ג | ||
| להוסיף מים כדי ליצור 100 מ | |||
| pH להסתגל עם NaOH 7.2 | |||
| P הרביעי מתכות | Provasoli ו- Pintner13 | נה2EDTA·2H2O | 100 מ ג |
| FeCl3·6H2O | 19.6 מ ג | ||
| MnCl2· 4H2O | 3.6 מ"ג | ||
| ZnCl2* | 1.04 mg | ||
| CoCl2·6H2O | 0.4 מ ג | ||
| נה2MoO4·2H2O | 0.25 מ ג | ||
| להוסיף מים כדי ליצור 100 מ | |||
| Fe (כמו EDTA; טוחנת 1:1) | Provasoli14 | Fe (NH4)2(כל4)2·6H2O, | 70.2 מ ג |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 מ ג | ||
| להוסיף מים כדי ליצור 100 מ | |||
| בינוני CA ממוזגים | אייב et al.7 | דגירה תאים במדיום CA טריים במשך 14 עד 20 ימים. לאסוף את המדיום בתרבית על ידי סינון באמצעות נייר סינון איכותי, לעקר את המדיום מסוננת על-ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות). | |
| * NIES, 1.04 מ"ג ZnCl2 מוחלף על ידי 2.2 מ ג ZnSO4·7H2O. | |||
טבלה 1: ניסוחים של המדיה השתמשו במחקר זה.
| דגימת מים | השם של תא | סטטוס לאחר תרבות | שם זן |
| Inba1 | -1 | תאים התרבו | Inba1-1 |
| -2 | לא השתנו | ||
| -3 | תאים התרבו | inba1-3 | |
| -4 | תאים התרבו | inba1-4 | |
| -5 | תאים התרבו | inba1-5 | |
| -6 | תאים התרבו | inba1-6 | |
| -7 | לא השתנו | ||
| -8 | לא השתנו | ||
| -9 | תאים התרבו | inba1-9 | |
| -10 | תאים התרבו | inba1-10 | |
| -11 | לא השתנו | ||
| -12 | תאים התרבו | inba1-12 | |
| -13 | תאים התרבו | inba1-13 | |
| -14 | לא השתנו | ||
| -15 | לא השתנו |
טבלה 2: בידוד משפט הסיכום.
Discussion
שימוש בשיטת ההווה, תרבות המשובטים 9 זנים של Closterium sp. הוקמו מתאי 15 מבודד דגימת מים (Inba1), המייצג את שיעור 60% הצלחה. לזן שיבוצע בעתיד על ידי התבוננות מורפולוגי, כמו גם ניתוח הדנ א, כגון ניתוח פילוגנטי מולקולרי8.
בשיטה הנוכחית, הרעננות של דגימת מים חשוב שיעור ההצלחה. עדיף לבודד את התאים מדגימות המים בהקדם האפשרי לאחר האוסף שדה. למרות תאים Closterium המינים (למשל, ehrenbergii ג, ג peracerosum-strigosum-littorale מורכבים) יכול להישמר במדגם מים במשך כ 7 d על-ידי אחסונם ב 4-8 ° C, הבידוד של התאים רצוי ביום של האוסף או למחרת. זה חשוב גם להסיר את כל מזהמים חוץ תאי היעד, אז להגדיל את מספר החזרות כביסה (קרי, > 3 x) עשוי למנוע זיהום של התרבויות על-ידי מיקרואורגניזמים קרקע, תאים.
מגבלה של טכניקה זו היא התקשורת תרבות בשימוש פרוטוקול זה (CA או ממוזגים בינוני CA) אינם תמיד מתאים כל האצות conjugating. במקרים מסוימים, ייתכן צורך לשקול שימוש באמצעי אחר, כמו גם בתנאי טמפרטורה ואור שונה. בנוסף, גם ככה קשה להוכיח אם תרבות גדל מ תא בודד, יש צורך במדויק לאסוף רק 1 התא בעת העברת תאים מבחנה. לכן, העברת צריך להיעשות עם פיפטה נימי זכוכית חדשה בכל פעם.
הקמת תרבות המשובטים עם זה פיפטה שטיפה שיטה היא שיטה קלאסית/תקן והיא השיטה האמינה ביותר לשימוש כדי לבודד את התאים הרצויים עבור מחקר. תרבויות המשובטים conjugating אצות בשימוש הרבה מחקרים8,9,10,11 הוקמו בשיטת ההווה. קשה לנתח conjugating אצות ללא תרבות המשובטים. יתר על כן, בשנים האחרונות, דה נובו רצפי הגנום כולו הפך קל להשיג (למשל, באמצעות הרצפים (sequencer) nanopore מיניון), הקמת המשובטים תרבויות נוספות יקל על רצף דה נובו . במילים אחרות, שיטה זו היא הצעד הראשון ללמוד בעתיד של אצות אלה כדי להבין טוב יותר את המגוון הביולוגי שלהם.
על מנת ליצור זן תרבות יציב, זה צורך לבצע שלבים קריטיים מסוימים במדויק בתוך הפרוטוקול. הצעד החשוב ביותר הוא הכנת פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי כדי לאפשר המעבר של תא בודד בלבד. הצמצם של פיפטה נימי הזכוכית בטח מעט יותר מאשר אורך ציר מינור של התא עניין. פיפטה נימי האופטימלית זכוכית ניתן תשאף תא בודד על-ידי נימיות. עם זאת, אם הקוטר של הצמצם הוא גדול מדי, נימי ימשוך גם חומרים שאינם חיים מזהם או אפילו (an) אחרים organism(s), בנוסף לתא המטרה.
כדי להשיג על פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי, הנקודות הבאות הן חשוב לציין. ראשית, התווך של להבה להיות צרים בעת חימום על פיפטה נימי זכוכית. בשלב הבא, בעת משיכת פיפטה של פסטר, יש להסיר הלהבה; אחרת, הצמצם של פיפטה פסטר תתמוטט
הציוד ואת מכולות שמוצג פרוטוקול זה פשוטים, שניתן לשנותם. לדוגמה, באמצעות לוחות רב טוב במקום שעונים משקפיים עם באר אחת, הכביסה תא שניתן יהיה יעיל יותר. בנוסף, המכולות הרבה מכדי האחרים דומים. על ידי העברת תא בודד למדיום תרבות-השלב האחרון, ניתן ליצור תרבות המשובטים.
הכנת במיכל מעוקר ועבודה בשכונה תקים זנים (מזוהמת) axenic. כדי למנוע זיהום, יש צורך חזור על השלב כביסה עם aliquots טריים יותר מ- 3 x. לפעמים, חיידקים גם סטריליים על-ידי הוספת אנטיביוטיקה15.
שיטה זו מתמקדת desmid בידוד (Zygnematales), אבל על ידי שינוי גודל הצמצם פיפטה נימי זכוכית, ניתן להחיל אותה את בידודה של פלנקטון בגודל שונה.
Acknowledgments
אנו מודים Hisayoshi Nozaki (אוניברסיטת טוקיו), טאקאשי Nakada (אוניברסיטת קיו), יוקה Marukawa השימוטו (אוניברסיטת של יפן נשים) ו הירויוקי Sekimoto (אונ' יפן לנשים). אנחנו רוצים להודות הבודקים להערות שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הסיוע למחקר מדעי (מס 26440223 ו- 15H 04413) מן האגודה יפן עבור קידום של המדע, יפן, על ידי מענק מטעם קרן פיתוח טכנולוגיה חדשה יוקי Tsuchikane.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japan | N-NO380T | Mesh size: 32 µm |
| Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE) | Nikon, Japan | JAN: 4960759 206725 | Magnification: 20× |
| Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier) | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan | 1985-20 | Magnification: 20× |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan | Sterile spuit No.4 | |
| 50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Bottle (100 mL Polycarbonate bottle) | AS ONE Corporation, Japan | 1-7403-01 | |
| 60 mm dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | 1010-060 | For observation of algae. 60 mm/non-treated dish |
| Preparation of a micropipette | |||
| Pasteur pipettes (cotton plugged 9” Pasteur Pipettes) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 × 225 mm |
| Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japan | 5-5669-01 | 10 × 40 mm |
| Stainless forceps | AS ONE Corporation, Japan | PT-09 | 110 mm |
| Single-cell isolation | |||
| Watch glass (Blood reaction board) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japan | F14-155-030 | to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth |
| Threaded test tubes | Fujimotorika, Co., Ltd, Japan | XX142 | 18 Ø × 170 mm |
| Inverted light microscope | Olympus, Tokyo, Japan | CKX41N | for isolation of algae. |
| Plastic dish | Asahi glass Co. Ltd., Japan | SH90-15E | 90 × 15 mm |
References
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119 (1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873 (2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
